WO2005039380A2 - 悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤 - Google Patents

悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤 Download PDF

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Yasuharu Nishimura
Tetsuya Nakatsura
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Kumamoto Tech & Ind Found
Yasuharu Nishimura
Tetsuya Nakatsura
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/5743—Specifically defined cancers of skin, e.g. melanoma

Definitions

  • the present invention relates to a diagnostic agent and a diagnostic kit for malignant melanoma (melanoma), and a method for diagnosing malignant melanoma (melanoma).
  • Melanoma is a type of skin cancer called melanoma. Although the types of skin cancer vary, melanoma is the most aggressive skin cancer. Some of the cells that make up the skin are cells that produce melanin pigment. These cells are called pigment cells (melanocytes), and the cells that become cancerous are melanomas.
  • the incidence of melanoma in Japan is around 1.5 to 2 per 100,000 population, and it is estimated that around 1500 to 20000 people occur in Japan annually.
  • Europe and the United States it is said that the incidence rate is more than 10 per 100,000 people, and in Australia, it is said that the incidence rate is more than 20 per 100,000 people in the world with the highest incidence rate. That is why people in Europe, the United States and Australia are interested in melanoma and are paying attention to the occurrence of melanoma.
  • the incidence of melanoma is increasing every year both in foreign countries and in Japan. According to a recent survey, the annual death toll from this disease in Japan is around 450.
  • Melanoma can occur in people of any age, but more often in people over the age of 40, with those in the 60s to 70s being the most common. Although the incidence of children is very low, it is not that it does not occur, and the incidence of young people in the 20- to 30-year-olds tends to increase recently. There is no tendency for gender, especially in either case, and it occurs in both sexes.
  • the area where Japanese people are most likely to develop melanoma is the plantar (back of the foot), which accounts for about 30%.
  • One of the characteristics of Japanese people is that they can do much for the toes and toenails. In addition, it occurs on any skin, including the body, hands, feet, face, and head, as in Westerners.
  • Serum LDH and 5-S-cysteinyldopa have been known to be useful as tumor markers for melanoma, but recently, S-100 / 3 protein and melanoma inhibitory activity (MIA) has been reported as a more sensitive marker.
  • MIA melanoma inhibitory activity
  • 5-S-CD is widely used as a tumor marker for melanoma.
  • none of the tumor markers become positive unless they are highly advanced, such as Stage IV, and their usefulness is limited in terms of melanoma diagnosis and early detection of postoperative recurrence. Les ,.
  • HCC primary hepatocellular carcinomas
  • GPC3 embryonic stage Glypican-3
  • glypican-3 glypican-3; GPC3
  • GPC3 is a secretory protein that can detect dalipican-3 (glypican-3; GPC3) in the serum of 40% of HCC patients by ELISA. This was reported to be useful as a new tumor marker for HCC (Nakatsura, T. et al., Et al., Biochem. Biophys. Res. Co. n. 306, 16-25 (2003)).
  • SGBS glypican-3
  • GPC3 glypican-3
  • SGBS is an X-linked disorder characterized by prenatal overgrowth and a wide range of clinical manifestations in female carriers, ranging from an always mild phenotype to fatal symptoms in male infants
  • SGBS may be impaired by functional GPC3 protein deficiencies and other genetic factors associated with intra- and inter-family phenotypes.
  • Hughes-Benzie, RM et al., Am. J. Med. Genet. 66, 227-234 (1996) and studies of GPC3-deficient mice support this hypothesis. Obtained (Cano-Gauci, DF et al., J. Cell Biol. 146, 255-264 (1999)) 0
  • These mice are capable of reducing the overgrowth, cystic and dysplastic kidneys seen in SGBS patients. It has some of the anomalies including.
  • GPC 3 is an inhibitor of cell proliferation and can induce apoptosis in certain tumor cells (Cano-Gauci, DF et al., J. Cell Biol. 146, 255-264 (1999); ⁇ Duenas Gonzales, A. et al., J. Cell Biol. 141, 1407-1414 (1998)), reports that GPC3 expression is down-regulated in tumors of various origins. Lin et al. Have shown that GPC3 is expressed in normal ovaries but is not detectable in certain ovarian cancer cell lines (Lin, H. et al., Cancer Res. 59, 807-810 (1999)). ).
  • GPC3 promoter was hypermethylated, had no mutations in the coding region, and GPC3 expression was restored by treatment with the demethylating agent.
  • ectopic expression of GPC3 has been reported to inhibit colony forming activity in several ovarian cancer cell lines.
  • Other data linking GPC 3 to cancer include those obtained from differential mRNA display studies on normal rat mesothelial cells and mesothelioma cell lines (Murthy, SS et al., Oncogene 19, 410-416). (2000)) 0 in this study, GPC 3 was found to have been constantly downregulated in tumor cell lines.
  • GPC3 was not expressed in human breast cancer (Xiang, YY et al., Oncogene 20, 7408-7412 (2001)). These data suggest that GPC3 may act as a negative regulator of growth in these cancers. That is, GPC3 expression is reduced during tumor progression in cancers arising from adult GPC3-positive tissues, and this reduction appears to play a role in the development of the malignant phenotype.
  • HSPG parane sulfate proteodalican
  • Glypican is one of a family of GPI-anchored cell surface HSPGs, and this tissue-specific difference in the relationship between tumorigenesis and GPC3 expression levels indicates that GPC3 is a growth and survival factor in each tissue. It is speculated that this is due to different adjustments. GPC3 appears to function as an oncofetal protein in at least these organs. In general, oncofetal proteins have not been identified as having an important role in the development of B-severe ulcers, but have been used as tumor markers or targets for immunotherapy (Coggin, JH Jr., CRC Critical Reviews in Oncology / Hematology 5, 37-55 (1992); and Matsuura, H. and Hakomori S. -I., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6517-6521 (1985)). Whether the oncofetal behavior of GPC 3 can be exploited for clinical use and whether re-expression of this dalippican is important in the progression of HCC remains for further study. Disclosure of the invention
  • Serum LDH, 5-S-cysteinyldopa (5-S-CD), which is widely used in Japan, and S-100) 3 protein, which has recently been reported as a more sensitive marker, are used as melanoma tumor markers.
  • MIA melanoma inhibitory activity
  • Stage IV melanoma inhibitory activity
  • Early diagnosis of melanoma requires other useful tumor markers. That is, an object of the present invention is to provide a novel and clinically useful diagnostic agent for malignant melanoma (melanoma).
  • the present inventors previously identified dalibican 3 (GPC3) as a novel oncofetal protein specifically overexpressed in human hepatocellular carcinoma based on cDNA microarray, and Detecting soluble GPC3 protein in it revealed that GPC3 could be a new tumor marker for HCC.
  • the present inventors have now discovered for the first time that GPC3 is expressed in the mouse melanoma cell line B16, and GPC3 is highly expressed in melanoma as well as HCC, and may be a useful tumor marker. I thought it might be. Therefore, the present inventors conducted an experiment for confirmation, and as a result, GPC 3 was found in melanoma at an earlier stage than in the past. Was found to be a tumor marker that could be determined.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • the present invention provides the following (1) to (6).
  • a diagnostic agent for malignant melanoma comprising an antibody against GPC3 or a probe or primer capable of detecting the expression of GPC3.
  • a kit for diagnosing malignant melanoma comprising an antibody against GPC3 or a probe or primer capable of detecting GPC3 expression.
  • a method for diagnosing malignant melanoma comprising detecting or measuring GPC 3 in a sample.
  • FIG. 1 shows the expression of GPC3 mRNA.
  • Lane 1 EL4, 2: Colon26, 3: B16, 4: MH129F, 5: MH129P, 6: MH134
  • EL4, Colon26, MH129F , MH129P and MH134 did not show such expression.
  • Lane 1 164, 2: 888mel, 3: Ihara, 4: CRL1579, 5: 526mel, 6: G361, 7: MeWo,
  • Lane 1 normal skin
  • 2 primary Pt 1 melanoma
  • 3 primary Pt 2 melanoma
  • 4 Pt 2 melanoma lymph node metastasis
  • 5 primary Pt 3 melanoma
  • 6 primary Pt 4 melanoma
  • Primary lesion 7: Congenital pigmented nevus case 1
  • 8 Congenital pigmented nevus case 2
  • GPC3 mRNA was not expressed in normal skin, but GPC3 was found in most melanoma tissues. mRNA expression was observed. On the other hand, expression of GPC3 mRNA was also observed in congenital pigmented nevus.
  • FIG. 2 shows the expression of GPC3 protein in melanocytic pigmented nevus by immunohistochemical analysis.
  • GPC3 protein was rarely expressed in normal skin, whereas GPC3 protein was highly expressed in melanoma cells and pigmented nevus.
  • FIG. 3A shows the results of ELISA quantification of GPC3 protein secreted into the culture supernatant of the melanoma cell line.
  • GPC3 protein was detected in five of the five culture supernatants out of one melanoma cell line.
  • FIG. 3B shows the presence of soluble GPC3 protein in melanoma patient serum.
  • Figure 3B No GPC3 protein was detected in the blood blue of 60 110 or 5 patients with giant congenital pigmented nevus. 39.6% of 91 melanoma patients
  • FIG. 4A shows the presence of soluble GPC3 protein by stage in sera of melanomas patients. (+) Indicates preoperative patients, and (-) indicates postoperative patients who do not seem to have melanoma. N is the number of cases.
  • FIG. 4B shows 5-S-CD by stage in serum of melanoma patients.
  • Fig. 4 shows 5-S-CD (nmol / L) of the same case as Fig. 4A.
  • the cutoff value was set at 10 (nmol / L).
  • FIG. 4C shows the MIA of each stage in the serum of a melanoma patient.
  • the MIA (ng / ml) of the same case as in FIG. 4A is shown.
  • the cut-off value was set at 17 (ng / ml).
  • glypican 3 can be used for early diagnosis of melanoma. It was found to be a useful serum tumor marker.
  • the amino acid sequence of the human GPC3 protein is known, and is registered, for example, in GenBank's protein database as Accession No. NP 004475, and can be easily obtained by those skilled in the art.
  • the present invention provides a diagnostic agent for malignant melanoma (melanoma), comprising an antibody against GPC3, or a probe or primer capable of detecting GPC3 expression.
  • An antibody against GPC3 can be prepared by a method known to those skilled in the art (for example, see “Shinsei Kagaku Jikken Kozai 1, Protein 1,389-406, Tokyo Kagaku Dojin”).
  • the GPC protein has a known amino acid sequence as described above, and can be produced based on the amino acid sequence using ordinary protein expression techniques, or a commercially available GPC protein (Santa Cruz, CA) can be used. is there.
  • SDS-OutTM Sodium Dodecyl Sulfate Precipitation Reagent; purchased from PIERCE, Rockford, IL
  • the partial peptide of GPC 3 can be produced by selecting an appropriate partial sequence from the amino acid sequence of GPC 3 and using ordinary peptide synthesis techniques.
  • a polyclonal antibody for example, an appropriate amount of GPC3 protein or a partial peptide thereof is administered to animals such as egrets, guinea pigs, mice, and chicks. Administration may be with an adjuvant (FIA or FCA) that promotes antibody production. The dose is usually given every few weeks. By performing immunization multiple times, the antibody titer can be increased. After the final immunization, an antiserum can be obtained by collecting blood from the immunized animal.
  • a polyclonal antibody can be prepared by subjecting this antiserum to, for example, ammonium sulfate precipitation, fractionation by anion chromatography, or abundant purification using protein A or immobilized antigen.
  • a monoclonal antibody for example, an animal is immunized with the GPC3 protein or a partial peptide thereof as described above, and after the final immunization, the spleen or lymph node is collected from the immunized animal.
  • the antibody-producing cells and myeloma cells contained in the spleen or lymph node are fused using polyethylene glycol or the like to prepare a hybridoma.
  • a desired hybridoma is screened, cultured, and a monoclonal antibody can be prepared from the culture supernatant.
  • the monoclonal antibody can be purified by, for example, ammonium sulfate precipitation or fractionation by anion chromatography, or affinity purification using protein A or immobilized antigen.
  • the antibody may recognize any epitope of GPC3.
  • the antibody used in the present invention may use the immunoglobulin fraction prepared as described above, but may also be used to separate F (ab ') 2 , Fab', Fab, etc. from which only the binding site to the GPC3 protein has been separated. A picture can also be used.
  • the antibody is preferably a humanized antibody or a human antibody.
  • a human-type antibody for example, in the case of a mouse-human chimeric antibody, an antibody gene is isolated from a mouse cell that produces an antibody against the GPC3 protein, and the H chain constant region is recombined into a human IgE H chain constant region gene. Introduce into mouse myeloma cells Can be prepared.
  • human antibodies can be prepared by immunizing mice whose immune system has been replaced with humans with the GPC3 protein.
  • the concentration of antibodies in diagnostic agent of the present invention is not particularly limited, it can be used, for example 0.1 from a concentration of 1 0 ⁇ g / ml.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or the like can be appropriately contained in the diagnostic agent as needed.
  • the present invention further provides a method for diagnosing melanomas, comprising detecting or measuring GPC3 in a sample.
  • GPC3 in a sample can be detected or measured by contacting the sample with an antibody against GPC3.
  • the sample in the present invention include serum, body fluids such as saliva or urine, and skin tissue sections obtained from a subject who may be suffering from melanoma, and serum is particularly preferred.
  • the contact between the sample and the above antibody may be performed based on a method generally used in the art, and is not particularly limited.
  • a tissue section of an organ prepared according to a conventional method is immunostained using an antibody against GPC3 to check for the presence or absence of GPC3. ) Can be determined.
  • a sample is a body fluid such as serum
  • the specific binding between GPC3 and the antibody which may be present in the sample, is determined by using a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme, etc. Quantitative detection using a secondary antibody or the like labeled with.
  • the sample in order to detect or measure GPC 3 in a sample by the method of the present invention, the sample may be reacted with an antibody against GPC 3, and a complex which is a reaction product may be detected.
  • a label such as an enzyme, a radioactive substance, or a fluorescent substance
  • a complex that is a reaction product.
  • a melanoma malignant melanoma
  • a known measurement method such as a sandwich method, a competition method, an aggregation method, or a Western blotting method. Diagnosis of melanoma is possible.
  • the reaction for diagnosis may be performed in a liquid phase such as a well, or may be performed on a solid support on which an antibody against PC3 is immobilized.
  • whether the measured value is positive for melanoma by comparing it with a standard value prepared in advance using a normal sample without melanoma or a sample known to be melanoma Can be determined.
  • it is preferable to set the cut-off value by measuring the amount of GPC3 in the serum of many melanoma patients and healthy subjects.
  • the diagnostic method of the present invention can be used for diagnosis of whether or not a person has melanoma, and can also be performed over time to confirm the effect of treatment for melanoma.
  • GPC3 when GPC3 is detected or measured in the diagnosis of malignant melanoma (melanoma) of the present invention, not only the method of detecting GPC3 as a protein but also the method of detecting mRNA of GPC3 may be used. That is, DNA or RNA capable of hybridizing with GPC3 niRNA may be reacted with a sample, and a hybridization product of GPC3 mRNA and DNA or RNA in the sample may be detected.
  • Methods for detecting mRNA include, for example, the insitu hybridization method, the Northern blotting method, and the RT-PCR method.
  • a diagnostic agent for evil or melanoma comprising a probe or primer capable of detecting the expression of GPC3.
  • the above-mentioned probe or primer can be appropriately obtained by a person skilled in the art based on the amino acid sequence of a known human GPC3 protein (for example, Accession No. NP 004475 of GenBank protein database).
  • the present invention further provides a kit for diagnosing malignant melanoma (melanoma), comprising an antibody against GPC3, or a probe or a primer capable of detecting the expression of GPC3.
  • a kit for diagnosing malignant melanoma comprising an antibody against GPC3, or a probe or a primer capable of detecting the expression of GPC3.
  • examples of the kit of the present invention include kits containing reagents necessary for analysis such as a sandwich method, a competition method, an agglutination method, and a western blotting method.
  • GPC When a probe or primer capable of detecting the expression of 3 is used, a kit containing a reagent necessary for performing an analysis such as an in situ hybridization method, a Northern blotting method, or an RT-PCR method may be mentioned.
  • the present invention further relates to the use of GPC3 as a tumor marker for malignant melanoma (melanoma).
  • the method encompasses all methods of diagnosing malignant melanoma (melanoma) by using GPC3 as a tumor marker for melanoma, and its embodiment is not limited.
  • Specific examples of the use of GPC3 as a marker for B swelling of malignant black heavy S (melanoma) include GPC3 in a sample using an antibody against GPC3, for example, sandwich method, competition method, and aggregation.
  • GPC 3 mRNA expression was examined using reverse transcription-PCR (RT-PCR).
  • the mouse cell lines MH129F, MH129P and MH134 were obtained from the Medical Cell Resource Center, Tohoku University Institute for Aging Medicine.
  • EL4, Colon26, B16 were provided by Dr. Ogawa of Kumamoto University.
  • RT-PCR was performed according to a known method (for example, Nakat sura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Coramun. 281, 936-944 (2001)).
  • a mouse GPC3 gene-specific PCR primer was designed to amplify a 500 bp fragment, and was used with RT- consisting of 94 ° (5 minutes initial denaturation, and 30 amplification cycles at an annealing temperature of 58 ° C).
  • a PCR reaction was performed.
  • the GPC3 PCR primer sequences used are: sense: 5'-ACGGGATGGTGAAAGTGAAGA-3 '(SEQ ID NO: 1) and antisense: 5'-GAAAGAGAAAAGAGGGAAACA-3' (SEQ ID NO: 2).
  • GPC3 mRNA The expression of GPC3 mRNA in mouse cell lines was compared. As a result, strong expression of GPC 3 mRNA was shown in the B16 melanoma cell line, but such expression was not found in EL4, Colon26, MH129F, MH129P, and MH13 (FIG. 1A).
  • GPC 3 mRNA expression using reverse transcription-PCR was examined.
  • the melanoma cell lines G361, CRL1579, SK-MEL-28, HMV-1 and HMV-II were obtained from the Center for Medical Cell Resources, Institute of Aging Medicine, Tohoku University. 526mel and 888mel were provided by Dr. Y. Kawakami of Keio University. Ihara, MeWo, colo38 were provided by Dr. T. Kageshita of Kumamoto University.
  • cultured human epidermal melanocytes HEMa were purchased from Kurabo Industries (Kurashiki Boseki Co., Ltd.).
  • RT-PCR was performed according to a known method (for example, Nakatsura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 936-944 (2001)).
  • RT-PCR reaction was performed.
  • the GPC3 PCR primer sequences used were: sense: 5'-GTTACTGCAATGTGGTCATGC-3 '(SEQ ID NO: 3) and antisense: 5'-CTGGTGCCCAGCACATGT-3' (SEQ ID NO: 4).
  • sequence of the / 3 -actin PCR primer for the following is sense: 5, -CCTCGCCTTTGCCGATCC-3 '(SEQ ID NO: 5), antisense: 5' -GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3 '(SEQ ID NO: 6).
  • GPC3 mRNA expression in human normal skin, human melanoma, and human pigmented nevus tissues was examined. Specimens were provided by Dr. T. Kageshita, who had obtained informed consent, which had been treated at the Kumamoto University School of Medicine dermatology course. As a result, GPC 3 mRNA was not expressed in normal skin, but GPC 3 mRNA was expressed in most melanoma tissues. On the other hand, expression of GPC 3 mRNA was also observed in congenital chromogenic nevus.
  • GPC3 protein As shown in FIGS. 2A and 2B, in both cases of melanoma, GPC3 protein was hardly expressed in normal skin, whereas GPC3 protein was highly expressed in melanoma cells. On the other hand, as shown in FIG. 2C, GPC 3 protein / protein was also highly expressed in pigmented nevus. 21 cases out of 1 7 cases of melanoma (8 1.0%) Oyopi dye 'GPC 3 protein in 10 of 11 cases of I 1 real mother plaques was highly expressed.
  • Example 5 Presence of soluble GPC3 protein in culture supernatant of melanomeric cell line and serum of melanoma patient FluoReporter Mini-Biotin—XX Protein Labeling for the anti-GPC3 ⁇ sagi polyclonal monoclonal antibody (Santa Cruz, California) for biotinization of the recombinant protein corresponding to the amino acid of GPC3303-464 Kit (F-6347) (Molecular Probes, Inc., Eugene) was used. A 96-well ELISA plate (Nunc, Denmark) was coated overnight at 4 ° C with 0.1 gZ-well of anti-human GPC 3303-464 (Santa Cruz) in PBS, pH 7.4.
  • Block Ace Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Block Ace Diluted patient serum was added together with biotinylated anti-GPC3 antibody and incubated for 2 hours at room temperature. After washing three times with PBS, HRP-conjugated streptavidin (END0GEN, Woburn) was added to each well. After 30 minutes of incubation, the plate was washed three times with PBS and TMB substrate solution (END0GEN) was added.
  • An ELISA reader Model 550, Bio-Rad was used at 405 nm for analysis.
  • GPC 3 is a GPI-anchored membrane protein and has been reported to be a secreted protein (Filimis J., Glycobiology 11, 19R-23R (2001)). The present inventors have previously described this Daribican 3
  • glypican-3; GPC 3 A 1S secreted protein that can detect glypican 3 (glypican-3; GPC 3) in the serum of 40% of HCC patients by ELISA, Reported to be useful as a new tumor marker
  • Detection was performed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-GPC3 303-464 antibody and biotinylated anti-GPC3 antibody. Accuracy of GPC 3 quantification in ELISA using commercially available recombinant protein corresponding to GPC 3 303-464 It was confirmed. A serial curve of HepG2 culture supernatant was used to evaluate a standard curve for quantifying GPC3 protein based on OD data. The concentration of GPC3 protein in the culture supernatant lm1 after 1 ⁇ 10 5 HepG2 cells were cultured for 24 hours was defined as 1 UZm1.
  • GPC 3 protein was detected in five of the culture supernatant. In addition, GPC3 protein was not detected in the culture supernatant of cultured melanocytes (Fig. 3A).
  • Fig. 3B Blood samples were collected from 91 preoperative melanoma patients, and patient profiles were collected from medical records to determine the clinical stage based on the TNM classification. 9 The amount of GPC3 protein in the serum of one melanoma patient, five patients with giant congenital pigmented nevus, and 60 healthy donors (HD) was evaluated by ELISA ( Figure 3). B). No GPC3 protein was detected in the sera of 60 HD and 5 patients with giant congenital pigmented nevus.
  • Figs. 4A, B, and C Identical-Significantly higher values than others in the clinical stage group are underlined.
  • the conventional melanoma tumor marker, 5-S-CD (Fig. 4B), and the recently attracted MIA (Fig. 4C) Is also useful only in advanced stage III and IV melanomas, but GPC 3 (Fig. 4A) is effective for the diagnosis of melanoma even in the early stages of stages 0, I and II and is useful as a novel tumor marker for melanoma It became clear.
  • the MIA was measured using a MIA ELISA kit from Roche, Germany.
  • Table 2 shows soluble GPC3 in sera of melanomas patients by melanomas macroscopic classification.
  • GPC3 is useful as a tumor marker capable of diagnosing melanoma at an early stage.
  • the use of GPC3 as a tumor marker for melanoma according to the present invention enables early and easy diagnosis of whether or not a person has melanoma.
  • GPC3 is very useful for use in cancer diagnosis for many melanoma patients worldwide.

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Abstract

　本発明の目的は、悪性黒色腫（メラノーマ）の新規かつ臨床的に有用な診断剤を提供することである。本発明によれば、ＧＰＣ３に対する抗体、又はＧＰＣ３の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、悪性黒色腫（メラノーマ）の診断剤が提供される。

Description

明細書
悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断剤 技術分野
本発明は、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断剤及ぴ診断キット、 並びに悪性黒 色腫 （メラノ マ） の診断方法に関する。 背景技術
メラノーマは悪†生黒色腫と呼ばれる皮膚がんの一種である。 皮膚がんの種類は 多様であるが、 メラノーマは最も悪性度が高い皮膚がんである。 皮膚を構成して いる細胞のなかにメラニン色素を産生する細胞があり、 これを色素細胞 （メラノ サイト） と呼ぶが、 この細胞ががん化したものがメラノーマである。
日本におけるメラノーマの発生数は人口 1 0万人当たり 1 . 5〜 2人程度であ り、 日本では年間 1 5 0 0人〜 2 0 0 0人程度発生していると推測されている。 欧米では人口 1 0万人あたり 1 0数人以上の発生率と言われ、 オーストラリアで は人口 1 0万人あたり 2 0数人以上の発生率で世界一発生数が高いと言われてい る。 それだけに欧米やオーストラリアの人々はメラノーマに関心を持ち、 メラノ 一マの発生に注意をしている。 また、 驚くことに、 外国でも日本でもメラノーマ の発生数は年々増加傾向が認められている。 最近の調査では、 日本におけるこの 病気による年間死亡者数は 4 5 0人前後もいる。 メラノーマは何歳の人でも発生 しているが、 特に 4 0歳以上になると発生が多くなり、 6 0歳〜 7 0歳台が最も 多くなつている。 小児の発生は非常に少ないが、 発生しないということはなく、 最近 2 0〜3 0歳台の若年者の発生が多くなつている傾向がある。 性別では特に どちらかに多いとレ、う傾向はなく、 男女どちらにも発生する。 日本人のメラノ一 マが発生しやすい部位は、 足底 （足のうら） が最も多く、 約 3割程度を占めてい る。 足や指の爪のき分にも多くできることが、 日本人の特徴である。 そのほか、 欧米人と同様に体、 手、 足、 顔、 頭など、 どこの皮膚にも発生する。 一方、 血清腫瘍マーカーの測定は、 メラノーマの診断のみならず、 術後症例に おける再発の早期発見と、 進行期例の治療効果の判定に重要である。 メラノーマ の腫瘍マーカーとしては、 これまでに血清の L DHや 5- S- cysteinyldopa (5- S - CD)の有用性が知られていたが、 さらに近年、 S - 100/3蛋白および melanoma inhibitory activity (MIA)がより鋭敏なマーカーとして報告されている。 日本に おいては、 メラノーマの腫瘍マーカーとしては、 5- S - CD が広く用いられている。 しかし、 いずれの腫瘍マーカーも、 Stage IVといったかなり進行したものでない と陽性にならず、 メラノーマの診断や、 術後再発の早期発見という面では、 有用 性は限られているといわざるを得なレ、。
本発明者等は先に、 23, 040種の遺伝子を含むゲノムワイドの cDNAマイクロ アレイの使用によって、 20種の原発性肝細胞癌 （HCC) および胎生期を含む 様々な正常臓器におけるこれらの遺伝子の発現プロファイルを検討し、 ダリ ピカ ン 3 (glypican- 3； GPC 3) 力 胎生期の肝臓、 腎臓、 肺に発現し、 成人の正 常臓器では胎盤以外ほとんど発現しないのに対し、 〖まとんどの H C Cで高発現す ることを見いだした。 さらに、 このグリピカン 3 (glypican-3； G P C 3 ) 力 分泌蛋白であり、 ELISA法を用いて 40 %の HCC患者の血清中にダリピカン 3 (glypican-3； GP C 3) を検出することができ、 これが、 HCCの新しい腫瘍 マーカーとして有用であることを報告した （Nakatsura, T.ら， ら， Biochem. Biophys. Res. Co薩 n. 306, 16-25 (2003))。
1996年、 Pilia らは、 グリビカンファミリーのメンバーの 1種をコードす るグリピカン 3 (glypican-3； GPC 3) 力 Simpson- Golabi-Behmel症候群 ( S GB S)患者において変異していることを報告した（Pilia, G.ら， Nat. Genet. 12, 241-247 (1996))。 S G B Sは出生前後の過成長、及ぴ女性キヤリァにおける ^^常 に軽い表現型から男性乳児の致死的症状までの幅広い臨床的発現によって特徴付 けられる X連鎖障害である（Neri, G.ら， Am. J. Med. Genet. 79, 279-283 (1998) )0 SGB Sの臨床的特徴としては、 特徴的な顔貌 （distinct facial appearance) , 口蓋裂、 合指、 多指、 副乳、 嚢胞性及び異形成腎、 先天性心欠陥等が挙げられる (Behmel, A.ら， Hum. Genet. 67, 409 - 413 (1984) ； Garganta, C丄及び Bodurtha, J. N. , Am. J. Med. Genet. 44, 129 - 135 (1992) ； Golabi, M.及ぴ Rosen, L.， Am. J. Med. Genet. 17, 345-358 (1984) ；及ぴ Gurrieri, F.ら， Am. J. Med. Genet. 44, 136-137 (1992) )0 G P C 3変異のほとんどは点突然変異またはェクソンを含 む数塩基の欠失であると報告されている （Hughes - Benzie, R.M.ら， Am. J. Med. Genet. 66, 227-234 (1996)； Lindsay, S.ら， J. Med. Genet. 34, 480-483 (1997) ； Veugelers. M.ら， Hum. Mol. Genet. 9, 1321-1328 (2000) ；及び Xuan, J.Y.ら， J. Med. Genet. 36, 57-58 (1999))。 また、 患者の表現型と変異の位置に相関性 がないことから、 SGB Sは機能的 GPC 3タンパク質の欠損と、 ファミリー内 及びファミリ一間の表現型の際に関連する他の遺伝的要因によって引き起こされ る可能性が挙げられており （Hughes-Benzie, R.M.ら， Am. J. Med. Genet. 66, 227-234 (1996))、 G P C 3欠損マウスの研究からも、 この仮説に対する支持が得 られている （Cano-Gauci， D.F.ら， J. Cell Biol. 146， 255-264 (1999) )0 これ らのマウスは SGB S患者に見られる、 過成長、 嚢胞性及ぴ異形成腎を含む異常 のいくつかを有している。
ノーザンブロット解析を用いた研究から、 GPC 3 InRNAはHCC、 胎盤、 胎児肝臓、胎児肺、胎児腎臓で過剰発現していることが報告されている（Zhu, Z. W. ら， Gut 48, 558-564 (2001) ； Hsu. H. C.ら， Cancer Res. 57, 5179 - 5184 (1997) ； 及び Pellegrini, M.ら， Dev Dyn. 213, 431 - 439 (1998) )0
また、 GPC 3は細胞増殖の阻害剤であり、 ある種の腫瘍細胞においてアポト 一シスを誘導し得るため （Cano- Gauci, D.F.ら， J. Cell Biol. 146, 255-264 (1999) ；及ぴ Duenas Gonzales, A.ら， J. Cell Biol. 141, 1407-1414 (1998))、 GPC 3発現が種々の起源の腫瘍においてダウンレギュレートされているという 報告がある。 Lin らは、 GPC 3は正常な卵巣で発現しているが、 ある種の卵巣 癌細胞系においては検出できないことを示した （Lin， H.ら， Cancer Res. 59, 807-810 (1999))。 G P C 3発現が見られない全てのケースにおいて、 GPC3プ 口モーターが過度にメチル化されており、 コード領域における変異はなく、 また 脱メチル化剤で処理することによって G PC 3発現は回復した。 更に、 GPC 3 の異所性発現は数種の卵巣癌細胞系においてコロニー形成活性を阻害することが 報告されている。 GPC 3と癌を関連付ける他のデータとしては、 正常なラット 中皮細胞及び中皮腫細胞系に関するディファレンシャル mRN Aディスプレイ研 究から得られたものがある （Murthy, S. S.ら， Oncogene 19, 410 - 416 (2000) )0 この研究において、 GPC 3は腫瘍細胞系において絶えずダウンレギュレートさ れていることが見出された。 更に、 同様のダウンレギュレーションは原発性ラッ ト中皮腫及ぴヒトの中皮腫由来の細胞系においても見られている。 卵巣癌と同様 に、 GPC 3コード配列中に変異は見出されていないが、 ほとんどの細胞系で G PC 3プロモーター領域に異常なメチル化が見られている。 報告されているよう に (Duenas Gonzales, A.ら， J. Cell Biol. 141, 1407-1414 (1998))、 中皮 B重細 胞系における G P C 3の異所性発現はコ口ニー形成活性を阻害することが示され た。 更に最近、 Xiang らは、 GPC 3がヒトの乳癌においても発現していないこ とを報告した （Xiang, Y.Y.ら， Oncogene 20， 7408-7412 (2001))。 これらのデー タから、 GP C 3がこれらの癌における成長の負のレギュレーターとして作用し 得ることが示唆される。 すなわち、 GPC 3の発現は成人の GPC 3陽性組織か ら生じる癌における腫瘍の進行の間に低減し、 この低減が悪性の表現型の発生に おいて何らかの役割を果たしているように思われる。
反対に、 HCCの場合、 腫瘍は胎児においてのみ GPC 3を発現する肝臓組織 から生じ、 GPC 3発現は悪性への形質転換において再び現れる傾向がある。 G PC 3の再発現がこれらの腫瘍の進行において重要であるか否かは明らかでない。 ここ数年の間に、 細胞表面へパラン硫酸プロテオダリカン （HSPG) が線糸隹芽 細胞増殖因子 （FGF) 及び Wnt等のへパリン結合性成長因子の最適活性に必要 であることが明らかとなった （Yayon, A.ら， Cell 64, 841-848 (1991) ；及ぴ Schlessinger, J.ら， Cell 83, 357 - 360 (1995))。 グリピカンは G P Iアンカー 型細胞表面 H SPGのファミリ一であり、 腫瘍形成と G P C 3の発現レベルの関 係におけるこの組織特異的な差異は、 G P C 3が各組織において成長と生存因子 を異なって調節しているためではないかと推測される。 GPC 3は少なくともこ れらの臓器において癌胎児性タンパク質として働いているように思われる。 一般 に、 癌胎児性タンパク質は B重瘍の進行において重要な役割を持つとはされていな いが、 腫瘍マーカーまたは免疫治療の標的として使用されてきた （Coggin, J.H. Jr. , CRC Critical Reviews in Oncology/Hematology 5, 37 - 55 (1992) ；及ぴ Matsuura, H.及ぴ Hakomori S. -I. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82， 6517-6521 (1985))。 GPC 3の癌胎児性挙動が臨床的用途に利用し得るか否力、 このダリピ カンの再発現が HCCの進行において重要であるか否かは、 更に研究の余地があ る。 発明の開示
メラノーマの腫瘍マーカーとしては、 血清の LDHや日本で広く用いられてい る 5 - S- cysteinyldopa (5 - S- CD)、 さらに近年、 より鋭敏なマーカーとして報告さ れている S- 100)3蛋白おょぴ melanoma inhibitory activity (MIA)があるが、 い ずれの腫瘍マーカーも、 Stage IVといったかなり進行したものでないと陽性にな らず、 メラノーマの早期診断や、 術後再発の早期発見という面では、 有用性は限 られているといわざるを得ない。 メラノーマの早期診断には他に有用な腫瘍マー カーが必要である。 即ち、 本発明は、 悪性黒色腫 (メラノーマ) の新規かつ臨床 的に有用な診断剤を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者等は、 先に、 c DNAマイクロアレイに基づいてヒト肝細胞癌におい て特異的に過剰発現している新規な癌胎児性タンパク質としてダリビカン 3 (G PC 3) を同定し、 HCC患者血清中に可溶性 GPC 3タンパク質を検出し、 G PC 3は HC Cの新たな腫瘍マーカーとなり得ることを明らかにした。 本発明者 等は今回、 マウスメラノーマ細胞株 B 16に GPC 3が発現することを初めて発 見し、 GPC 3がメラノーマにおいても HCCと同様に高発現しており、 有用な 腫瘍マーカーになりうるのではないかと考えた。 そこで本発明者等は、 確認のた めの実験を行った結果、 GPC 3がメラノーマにおいて今までになかった早期診 断のできる腫瘍マーカーであることを見いだした。 本発明はこれらの知見に基づ いて完成したものである。
すなわち、 本発明は、 以下の （1) 〜 （6) を提供する。
(1) GPC 3に対する抗体、 又は GPC 3の発現を検出できるプローブ若し くはプライマーを含む、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断剤。
(2) GPC3に対する抗体、 又は GPC 3の発現を検出できるプローブ若し くはプライマーを含む、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断のためのキット。
(3) サンプル中の GPC 3を検出又は測定することを含む、 悪性黒色腫 （メ ラノーマ) の診断方法。
(4) サンプルと GPC 3に対する抗体とを接触させることを含む、 （3) に言己 載の診断方法。
(5) サンプル中の GPC 3を定量することを含む、 （3) 又は （4) に記載の 診断方法。
(6) 悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとして G PCを使用する方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 GPC3 mRNAの発現を示す。
A：マウス細胞系における GPC 3 mRNAの発現
レーン 1: EL4, 2： Colon26, 3： B16, 4： MH129F, 5： MH129P, 6: MH134 その結果、 B16 メラノーマ細胞系において GP C 3 mRNAの強い発現が示さ れたが、 EL4， Colon26, MH129F, MH129P, MH134 ではそのような発現は見られな かった。
B ： ヒトメラノーマ細胞株における GPC 3 mRNAの発現
レーン 1: 164, 2: 888mel, 3： Ihara, 4： CRL1579, 5： 526mel, 6： G361, 7： MeWo,
8： SK - MEL— 28, 9： SK— MEL— 19， 10: Colo38， 11: HMV-I, 12： HEMn (melanocyte) 164, 888mel, Ihara, CRL1579, MeWoメラノーマ細胞系において G P C 3 mR
NAの強い発現が示され、 526mel, G361, SK- MEL- 28細胞系において中程度の努 現が示されたが、 SK-MEL-19, Colo38, HMV - 1ではそのような発現は見られなかつ た （図 1 B)。 尚、 培養メラノサイトにも若干発現がみられた。
C： ヒトメラノーマ組織における GPC 3 mRNAの発現
レーン 1: 正常皮膚， 2: P t 1メラノーマ原発巣， 3: P t 2メラノーマ原発 巣， 4: P t 2メラノーマリンパ節転移巣， 5: P t 3メラノーマ原発巣， 6: P t 4メラノーマ原発巣， 7: 先天性色素性母斑症例 1， 8： 先天性色素性母斑症例 2 正常皮膚には G PC 3 mRNAの発現は認めなかったが、ほとんどのメラノ一 マ組織で G PC 3 mRNAの発現を認めた。一方、先天性色素性母斑でも G P C 3 mRNAの発現を認めた。
図 2は、 免疫組織化学分析によるメラノ一マおょぴ色素性母斑における G P C 3タンパクの発現を示す。
A: (P t 6) X100 GPC3 メラノーマ癌部非癌部境界部， B: (P t 7) X200 GPC3 メラノーマ癌部， C: 色素性母斑症例 3 X100 GPC3
正常皮膚には GPC 3タンパクがほとんど発現しないのに対し、 メラノーマ細 胞および色素性母斑では、 G P C 3タンパクが高発現していた。
図 3A はメラノーマ細胞系の培養上清中に分泌される GPC 3タンパク質の E L I S Aによる定量の結果を示す。 HePG2細胞 1 X 105個の 24時間培養後の培 養上清 lml中の GPC 3タンパク質の濃度を lUZmlと規定した。 HepG2培 養上清中の GPC 3タンパク質の量よりは少ないが、 1 1種類のメラノーマ細胞 株のうち、 5種類の培養上清中に GPC 3タンパクが検出された。
図 3B はメラノーマ患者血清中の可溶性 GPC 3タンパク質の存在を示す。 9 1名の術前メラノーマ患者、 5名の巨大先天性色素性母斑患者、 及び 6 0名の健 康なドナー （HD) の血清中の GPC 3タンパク質の量を EL I SAによって評 価した （図 3B)。 60名の110、 5名の巨大先天性色素性母斑患者の血青中には GPC 3タンパク質は全く検出されなかった。 91名のメラノーマ患者の 39.6%
(36/91)、 5名の巨大先天性色素性母斑患者の 0% (0/5)、 HDの 0% (0/60) が GPC 3タンパク質陽性であった。 さらに、 そのうち、 術後の経過をおうこと ができた 14例すべてにおいて、 摘出手術後には血清中に GPC 3タンパクが横 出されなくなった。
図 4 Aはメラノ一マ患者血清中の Stage別可溶性 G P C 3タンパク質の存在を 示す。 （+)は術前患者、 （-）は術後で患者さんにメラノーマが存在しないと思われ る症例。 Nは症例数。
図 4Bはメラノーマ患者血清中の Stage別 5- S- CDを示す。
図 4A と同じ症例の 5- S- CD(nmol/L)を示す。 カットオフ値を 10 (nmol/L) に設定した。
図 4 Cはメラノ一マ患者血清中の Stage別 MIAを示す。
図 4Aと同じ症例の MIA(ng/ml)を示す。カツトオフ値を 1 7 (ng/ml)に設定した。 発明を実施するための最良の形態
本発明者等は、 （Nakatsura, T.ら， Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, 16—25 (2003) ) に記載の方法を用い、 グリピカン 3 (GPC 3) がメラノーマの早期診 断に有用な血清腫瘍マーカーであることを見いだした。
ヒト G P C 3タンパク質のァミノ酸配列は公知であり、 例えば GenBankのタン パク質データベースに Accession No. NP 004475として登録されており、 当業者 であれば容易に入手することができる。
本発明は、 GPC 3に対する抗体、 又は GPC 3の発現を検出できるプローブ 若しくはプライマーを含む、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断剤を提供する。
GPC 3に対する抗体は、当業者に公知の方法（例えば、「新生化学実験講座 1 , タンパク質 1,389 - 406，東京化学同人」 参照） により調製することが可能である。 G P Cタンパク質はァミノ酸配列が前記のように公知であり、 該ァミノ酸配列に 基づいて通常のタンパク質発現技術を用いて製造でき、 また市販のもの （Santa Cruz, CA) を利用することも可能である。 市販の GPC 3を用いる場合は、 必要 に応じて SDS- OutTM (Sodium Dodecyl Sulfate Precipitation Reagent； PIERCE, Rockford, ILより購入） を用いて SDSを除いて使用することが好ましい。 また G P C 3の部分ぺプチドは、 G P C 3のァミノ酸配列から適当な部分配列を選択 し、 通常のペプチド合成技術を用いて製造できる。
ポリクローナル抗体の調製は、 例えば、 ゥサギ、 モルモット、 マウス、 ニヮト リなどの動物に適量の G P C 3タンパク質またはその部分ペプチドを投与する。 投与は、抗体産生を促進するアジュバント （FIAや FCA) と共に行ってもよい。 投 与は、 通常、 数週間ごとに行う。 免疫を複数回行うことにより、 抗体価を上昇さ せることができる。 最終免疫後、 免疫動物から採血を行うことにより抗血清が得 られる。 この抗血清に対し、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿や陰イオンクロマト グラフィ一による分画、 プロテイン Aや固定化抗原を用いたアブイ-ティー精製 を行うことにより、 ポリクローナル抗体を調製することができる。 一方、 モノク ローナル抗体の調製は、 例えば、 G P C 3タンパク質もしくはその部分ぺプチド を、 上記と同様に動物に免疫し、 最終免疫後、 この免疫動物から脾臓またはリン パ節を採取する。 この脾臓またはリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ 細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、 ハイプリ ドーマを調製す る。 目的のハイプリ ドーマをスクリーニングし、 これを培養し、 その培養上清か らモノクロ一ナル抗体を調製することができる。 モノクローナル抗体の精製は、 例えば、 硫酸アンモニゥム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、 プロ ティン Aや固定化抗原を用いたァフィニティ一精製により行うことができる。尚、 本発明の目的のためには、 抗体は G P C 3のいかなるェピトープを認識するもの であっても良い。
本発明で使用する抗体は、 上記の通り調製したィムノグロプリン分画を使用し てもよいが、 さらに G P C 3タンパク質との結合部位のみを分離した F (ab' ) 2， Fab' , Fab などの分画を使用することもできる。
診断剤としての正確性のためには、 抗体はヒト型抗体もしくはヒト抗体である ことが好ましい。 ヒト型抗体は、 例えば、 マウス-ヒトキメラ抗体であれば、 G P C 3タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、 そ の H鎖定常部をヒト IgE H鎖定常部遺伝子に組換え、 マウス骨髄腫細胞に導入す ることにより調製できる。 また、 ヒト抗体は、 免疫系をヒトと入れ換えたマウス に G P C 3タンパク質を免疫することにより調製することが可能である。
本発明の診断剤における抗体の濃度は特に限定されないが、 例えば 0 . 1から 1 0 β g/mlの濃度で用いることができる。診断剤には上記 G P C 3に対する抗体 の他に、必要に応じて薬学的に許容される担体等を適宜含有させることができる。 本発明は更に、 サンプル中の G P C 3を検出又は測定することを含む、 メラノ 一マの診断方法を提供する。 例えば、 サンプルと G P C 3に対する抗体を接触さ せることによって、 サンプル中の G P C 3を検出又は測定することができる。 本 発明におけるサンプルとしては、 メラノーマに罹患しているおそれのある被験者 から得られる血清、 唾液又は尿などの体液、 あるいは皮膚組織切片等が挙げられ るが、 特に好ましくは血清である。 サンプルと上記抗体との接触は、 当分野にお いて通常行われている方法に基づいて行えばよく、 特に限定するものではない。 皮膚組織切片をサンプルとする場合は、 常法に従って作製した臓器の組織切片 を G P C 3に対する抗体を用いて、 免疫染色を行い、 G P C 3の発現の有無を見 ることによって、 悪性黒色腫 （メラノーマ） が生じているかどうかを判定するこ とができる。
また、 血清などの体液をサンプルとする場合には、 例えばサンプルと上記抗体 との接触の後、 サンプル中に存在し得る G P C 3と抗体との特異的結合を、 蛍光 物質や発光物質、 酵素等で標識した二次抗体等を使用して定量的に検出すること により行うことができる。
即ち、 本発明の方法によりサンプル中の G P C 3を検出又は測定するためには、 サンプルと G P C 3に対する抗体とを反応させ、 反応生成物である複合体を検出 すればよい。 酵素、 放射性物質、 蛍光物質などの標識をあらかじめ抗体に結合さ せておくことにより、 反応生成物である複合体を検出することが可能になる。 具 体的には、 G P C 3に対する抗体を用いて、 例えばサンドイッチ法、 競合法、 凝 集法、 またウェスタンブロッティング法などの公知の測定法により G P C 3を検 出又は測定することによって悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断が可能である。 また、 診断のための反応をゥエル等の液相中で行ってもよく、 あるいは PC 3に対する抗体を固定した固相支持体上で行ってもよい。 この場合、 メラノーマ に罹患していない正常なサンプル、 あるいはメラノーマであることが判明してい るサンプルを用いて予め作製した標準値と比較することによって、 測定された値 がメラノーマ陽性であるか否かを判定することができる。 また、 診断の際には、 多数のメラノーマ患者と健常人の血清中 GPC 3量を測定して、 カツトオフ値を 設定することが好ましい。
本発明の診断方法は、 メラノーマに罹患しているか否かの診断に用いることが できる他、 メラノーマに対する治療の効果を確認するために経時的に行うことも できる。
さらに本発明の悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断において GPC 3を検出又は 測定する場合、 GPC 3を蛋白質として検出するだけではなく、 GPC 3の mR NAを検出する方法を用いてもよい。 即ち、 GPC 3の niRNAとハイブリダィ ズしうる DNAまたは RNAを試料と反応させ、試料中の GPC 3の mRNAと、 DNAまたは RNAとのハイブリダィゼーシヨン生成物を検出すればよい。 mR NAを検出する方法としては、 例えば i n s i t uハイブリダィゼーシヨン法、 ノーザンブロッテイング法、 RT- PC R法などが挙げられる。即ち、本発明によ れば、 GPC 3の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを含む、 悪や生黒 色腫（メラノーマ）の診断剤が提供される。上記プローブ若しくはプライマーは、 公知のヒト GPC 3タンパク質のアミノ酸配列 （例えば GenBankのタンパク質デ ータベースの Accession No. NP 004475) に基づいて当業者であれば適宜設言十及 ぴ入手することができる。
本発明はさらに、 GPC 3に対する抗体、 又は GPC 3の発現を検出できるプ ローブ若しくはプライマーを含む、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断のためのキ ットを提供する。 本発明のキットとしては、 GPC 3に対する抗体を用いる場合 には、 例えば、 サンドイッチ法、 競合法、 凝集法、 またウェスタンブロッテイン グ法などの分析を行うのに必要な試薬を含むキットが挙げられる。 また、 GPC 3の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを用いる場合には、 i n s i t uハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンブロッテイング法、 RT- PCR法など の分析を行うのに必要な試薬を含むキットが挙げられる。
本発明はさらに、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の腫瘍マーカーとして GPC 3を 使用する方法にも関する。 該方法は、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の腫瘍マーカー として GPC 3を使用することによって悪性黒色腫 （メラノーマ） を診断する方 法の全てを包含するものであり、 その態様が限定されない。 悪性黒色 S重 （メラノ 一マ） の B重瘍マーカーとして GPC 3を使用する方法の具体例としては、 GPC 3に対する抗体を用いてサンプル中の GPC 3を、 例えば、 サンドイッチ法、 競 合法、 凝集法、 またウェスタンブロッテイング法などにより検出又は測定する方 法、 並びに、 GPC 3の発現を検出できるプローブ若しくはプライマーを用いる ことによって、サンプル中の GPC 3の発現を i n s i t uハイブリダィゼーシ ヨン法、ノーザンブロッテイング法、 RT- PC R法などにより検出又は測定する 方法が包含される。
以下、 実施例を挙げて本発明を更に説明するが、 本発明はこれら実施例に限定 されるものではない。 実施例
[実施例 1] マウス細胞株における GPC 3 mRNAの発現
逆転写 -PCR (RT-P CR) を用いた GPC 3 mRNA発現を検討した。マ ウス細胞系である MH129F, MH129P及ぴ MH134は東北大学加齢医学研究所医用細胞 資源センターから入手した。 EL4, Colon26, B16は熊本大学の Μ· Ogawa博士より ご供与頂いた。
RT— PCRは公知の方法 （例えば Nakat sura, T.ら， Biochem. Biophys. Res. Coramun. 281, 936-944 (2001)) に従って行った。 500bpの断片を増幅するマウス GPC 3遺伝子特異的 PCRプライマーを設計し、 これを用いて 94° (、 5分の 初期変性、 及び 58 °Cのァニーリング温度での 30増幅サイクルからなる RT - P CR反応を行った。 用いた GPC 3 PCRプライマー配列は、 センス ： 5' -ACGGGATGGTGAAAGTGAAGA-3' (配 列 番 号 1 ) 、 ア ン チ セ ン ス ： 5' -GAAAGAGAAAAGAGGGAAACA-3' (配列番号 2) である。
マウス細胞系における GPC 3 mRNAの発現を比較した。その結果、 B16 メ ラノーマ細胞系において G P C 3 mRNAの強い発現が示されたが、 EL4, Colon26, MH129F, MH129P, MH13 ではそのような発現は見られなかった（図 1 A)。
[実施例 2] ヒトメラノーマ細胞株における GPC 3 mRNAの発現
逆転写一 PC R (RT-PCR) を用いた GPC 3 mRNA発現を検討した。 メ ラノーマ細胞系である G361， CRL1579, SK-MEL-28, HMV - 1及ぴ HMV-IIは東北大 加齢医学研究所医用細胞資源センターから入手した。 526mel， 888melは慶応大 の Y. Kawakami博士よりご供与頂いた。 また、 Ihara、 MeWo, colo38は熊本大学 の T. Kageshita博士よりご供与頂いた。 さらに、培養ヒト表皮メラニン細胞 HEMa は、 クラボウ （倉敷紡績株式会社） より購入した。
RT— PCRは公知の方法 （例えば Nakatsura, T.ら， Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 936-944 (2001)) に従って行った。 939bpの断片を増幅するヒ ト G PC 3遺伝子特異的 PCRプライマーを設計し、 これを用いて 94°C、 5分の初 期変性、及ぴ 58°Cのァニーリング温度での 30増幅サイクルからなる RT-P C R反応を行った。 用いた G P C 3 P C Rプライマー配列は、 センス ： 5' -GTTACTGCAATGTGGTCATGC-3' (配 列 番 号 3 ) 、 ア ン チ セ ン ス ： 5' -CTGGTGCCCAGCACATGT-3' (配列番号 4 ) であり、対照実験のための /3 -ァクチン P C Rプライマ一配列は、センス ： 5， -CCTCGCCTTTGCCGATCC-3' (配列番号 5 )、 ァ ンチセンス ： 5' -GGATCTTCATGAGGTAGTCAGTC-3' (配列番号 6 ) である。
対照である /3 -ァクチン m R N Aによる標準化の後、メラノ一マ細胞系における GPC 3 mRNAの発現を比較した。 その結果、 164， 888mel, Ihara, CRL1579, MeWoメラノーマ細胞系において GPC 3 mRNAの強い発現が示され、 526rael, G361, SK- MEL- 28細胞系において中程度の発現が示されたが、 SK- MEL- 19， Colo38, HMV- 1ではそのような発現は見られなかった （図 1 B)。 尚、 培養メラノサイトに も若干発現がみられた。
[実施例 3] ヒトメラノーマ組織における GPC 3 mRNAの発現
同様に、 ヒト正常皮膚、 ヒトメラノーマ、 ヒト色素性母斑組織における GPC 3 mRNAの発現を調べた。検体は、熊本大学医学部皮膚科学講座にぉレ、て治療 されたインフォームドコンセントの得られたものを、 T.Kageshita博士より御供 与頂いた。 その結果、 正常皮膚には GPC 3 mRNAの発現は認めなかったが、 ほとんどのメラノーマ組織で GPC 3 mRNAの発現を認めた。一方、先天性色 素性母斑でも GPC 3 mRNAの発現を認めた。
[実施例 4] メラノーマにおける GPC 3タンパク質の発現
21名のメラノーマ患者から切除したメラノーマ組織周辺のメラノーマ及ぴ非 癌性領域および 1 1名の色素性母斑患者から切除した色素性母斑組織周辺の色素 性母斑及ぴ正常皮膚領域における G PC 3の免疫組織化学分析を行った。
免疫組織化学分析は、当分野において公知の方法に従って行った（Nakatsura, T. ら， Biochem. Biophys. Res. Commun. 281， 936-944 (2001))。 ホルマリン固定し てパラフィン包埋した厚さ 4 μ mの組織サンプル切片を 1 : 200に希釈した抗- GPC 3抗体と共に染色した。 代表的な結果を図 2に示す。
図 2A， Bに示すように、 メラノーマ 2例とも、 正常皮膚には GPC 3タンパク がほとんど発現しないのに対し、 メラノーマ細胞では、 GPC 3タンパクが高発 現していた。 一方、 図 2C に示すように、 色素性母斑でも GPC 3タン /、°クは高 発現していた。 メラノーマの 21例中 1 7例 （8 1. 0%) およぴ色素' I1生母斑の 11例中 10例で GPC 3タンパクは高発現していた。
[実施例 5] メラノ一マ細胞系の培養上清及ぴメラノ一マ患者血清中の可溶性 G PC 3タンパク質の存在 GPC 3 303-464 のアミノ酸に対応する組換えタンパク質に対して作製さ; た抗- G PC 3ゥサギポリク口ーナル抗体 （Santa Cruz, California) のビォチン ィ匕のために FluoReporter Mini - Biotin—XX Protein Labeling Kit (F-6347) (Molecular Probes, Inc. , Eugene) を使用した。 96ゥエルの E L I S Aプレ 一ト （Nunc, Denmark) を 4 °Cで一晩、 P B S、 p H7.4中 0.1 gZゥエルの抗ー ヒ ト GPC 3 303-464 (Santa Cruz) でコートした。 次いで、 100%ブロック エース （大日本製薬株式会社） を用い、 室温で 1時間、 プレートをブロッキング した。 陽性対照の標準サンプル及び培養上清、 10%ブロックエースで 200倍： 希釈した患者血清をビォチン化抗- G P C 3抗体と共に添加し、室温で 2時間ィン キュベーションした。 PB Sで 3回洗浄した後、各ゥエルに HRP-コンジユゲー トストレプトァビジン （END0GEN, Woburn) を添加した。 30分のィンキュベーン ヨンの後、 プレートを PB Sで 3回洗浄し、 TMB基質溶液 （END0GEN) を添加し た。 解析のために EL I S Aリーダー （モデル 550、 Bio-Rad) を 405 nmで用 レ、た。
ィンフォームドコンセントを得た後、 熊本大学医学部皮膚科学講座において洽 療を受けたメラノーマ患者から血清サンプルを得た。 GPC 3は GP I-アンカー 型膜タンパク質であり、 分泌タンパク質である可能性が報告されている （Filimis J., Glycobiology 11, 19R-23R (2001))。 本発明者らは先に、 このダリビカン 3
(glypican-3； G P C 3 ) 1S 分泌蛋白であり、 ELISA法を用いて 40 %の H C C 患者の血清中にグリピカン 3 (glypican-3； G P C 3 ) を検出することができ、 これが、 HC Cの新しい腫瘍マーカーとして有用であることを報告した
(Nakatsura, T.ら， Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, 16-25 (2003))。 そ こで、 今回、 メラノーマにおいても GPC 3タンパク質が分泌されるかどうかの 検出を試みた。
抗- GP C 3 303-464抗体及びビォチン化抗- G P C 3抗体を用いて酵素結合 免疫吸着検査法 （EL I SA) による検出を行った。 GPC 3 303- 464に対応す る市販の組換えタンパク質を用い、 EL I S A系における GPC 3の定量の精度 を確認した。 HepG2培養上清の連続希釈を用い、 ODデータに基づいて GP C 3 タンパク質を定量する標準曲線を評価した。 1 X 105個の HepG2細 S包を 24時 間培養した後の培養上清 lm 1中の GPC 3タンパク質の濃度を 1 UZm 1 と規 定した。 HePG2培養上清中の GPC 3タンパク質の量よりは少ないが、 1 1種類 のメラノーマ細胞株のうち、 5種類の培養上清中に GPC 3タンパクが検出され た。 また、 培養メラノサイトの培養上清中には GPC3タンパクは検出されなか つた （図 3A)。
次に、 メラノーマ患者血清中の可溶性 GPC 3タンパク質の検出を行った （図 3B)。 91名の術前メラノーマ患者から血液サンプルを採取し、 医療記録から患 者のプロファイルを集めて TNM分類に基づいて臨床段階を決定した。 9 1名のメ ラノ一マ患者、 5名の巨大先天性色素性母斑患者、及び 60名の健康なドナー（H D)の血清中の GPC 3タンパク質の量を EL I S Aによって評価した（図 3 B)。 60名の HDおよび 5名の巨大先天性色素性母斑患者の血清中には GP C 3タン パク質は全く検出されなかった。 91名のメラノーマ患者の 39.6% (36/91)、 5 名の巨大先天性色素性母斑患者の 0% (0/5)、 HDの 0% (0/60) が G PC 3タ ンパク質陽性であった。 さらに、 そのうち、 術後の経過をおうことができた 14 例すべてにおいて、 摘出手術後には血清中に GPC 3タンパクが検出されなくな つた。 表 1は、 メラノーマ患者血清中の可溶性 G PC 3， 5-S-CD, MIA を示 す。
表 1
stage GPC3 5-S-CD Ml A
0 4/9 i44.4%)a 0/ 9 (0.0%) 1/9 (1 1 .1 %)
I 10/25 (40.0%) 2/25 (8.0%) 5/25 (20.0%)
II 10/21 (47.6%) 2/20 (10.0%) 1 /21 (4.8%)
III 7/18 (38.9%) 5/18 (27.8%) 3/18 (16.7%)
IV 5/18 (27.8%) 15/18 (83.3%) 9/18 (50.0%)
i ifes十 36/91 (39.6%) 24/90 (26.7%) 19/91 (20.9%)
a ：同一 -の臨床ステージ群の他より有意に高い値は下線で示す。 図 4 A， B, C, 並びに表 1の結果から明らかなように、 従来のメラノーマの腫瘍 マーカー、 5- S- CD (図 4 B)、最近注目されている MIA (図 4 C)はいずれも Stage III， IVの進行したメラノーマでしか有用でないが、 G P C 3 (図 4 A) は Stage 0， I, IIの早期でもメラノーマの診断に有効で、メラノーマの新規な腫瘍マーカーとし て有用であることが明らかとなった。 なお、 MIAの測定には、 ドイツ Roche社の MIA ELISAキットを用いた。
表 2は、メラノ一マ肉眼分類別のメラノ一マ患者血清中可溶性 G P C 3を示す。 表 2
型 血清中の GPC3の陽性率
ALM (末端黒子型） 15/44 (34.1 %)
SSM (表在拡大型） 9/16 (56.3%)
LMM/LM (悪性黒子型） 4/ 9 (44.4%)
NM (結節型） 21 5 (40.0%)
Mucous (粘膜型） 3/12 (25.0%)
総計 33/86 (38.4%) 表 2の結果は、 日本人に多い足の裏にできる末端黒子型よりもむしろ欧米人に 多くみられる表在拡大型や悪性黒子型の診断に若干強いことが示唆され、 日本だ けでなく、 世界中のメラノ一マの診断に十分寄与すると考えられた。 産業上の利用可能性
本発明により、 G P C 3がメラノーマを早期に診断できる腫瘍マーカーとして 有用であることが実証された。 本発明によりメラノーマの腫瘍マーカーとして G P C 3を使用することによって、 メラノーマに罹患しているか否かを早期かつ簡 便に診断することが可能になる。 G P C 3は、 世界中の多くのメラノーマ患者に 対する癌診断における用途に対して非常に有用である。

Claims

請求の範囲
1. GPC 3に対する抗体、 又は GPC 3の発現を検出できるプローブ若し くはプライマーを含む、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断剤。
2. GPC 3に対する抗体、 又は GPC 3の発現を検出できるプローブ若し くはプライマーを含む、 悪性黒色腫 （メラノーマ） の診断のためのキット。
3. サンプル中の GPC 3を検出又は測定することを含む、 悪性黒色腫 （メ ラノーマ) の診断方法。
4. サンプルと GPC 3に対する抗体とを接触させることを含む、 請求項 3 に記載の診断方法。
5. サンプル中の GPC 3を定量することを含む、 請求項 3又は 4に記載の 診断方法。
6. 悪性黒色腫（メラノーマ）の腫瘍マーカーとして G PCを使用する方法。
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