WO2005034994A1

WO2005034994A1 - 固形腫瘍治療剤

Info

Publication number: WO2005034994A1
Application number: PCT/JP2004/015205
Authority: WO
Inventors: Shigeto Kawai; Masahiko Mihara; Yasuo Koishihara
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-10-10
Filing date: 2004-10-07
Publication date: 2005-04-21
Also published as: TW200517125A; EP1693069B1; EP1693069A1; JP4794303B2; JPWO2005034994A1; US8603481B2; US20070110753A1; EP1693069A4

Abstract

配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片を有効成分として含有する固形腫瘍治療剤。

Description

明細書固形腫瘍治療剤技術分野

本発明は、固形癌に発現される蛋白質に特異的に結合する抗体を有効成分として含有する（悪性リンパ腫など造血器腫瘍を除く）固形癌に対する治療剤に関する。また、本発明は、固形癌に発現される蛋白質に特異的に結合し、細胞傷害活性を有する抗体に関する。背景技術

HM1.24抗原は、ヒト骨髄腫細胞に高発現している膜蛋白質として見出された。すなわち、ヒト骨髄腫細胞 KPC- 32をマウスに免疫して得られたモノクローナル抗体（抗 HM1.24抗体）がヒト骨髄腫細胞および形質細胞に結合し、認識される抗原（HM1.24抗原）が RPMI8226 などのヒト骨髄腫細胞株では高発現していることが示された（Goto ， Tら、 Blood (1994) 84， 1922) 。また、同時にヒト骨髄腫細胞 RP MI8226を移植したマウスに抗 HM1.24抗体を投与することで抗腫瘍効果が得られることも報告されている。その後、 HM1.24抗原の cDNAを取得し、その塩基配列を調べたところ、骨髄ストローマ細胞に発現する蛋白質として報告されていた Bst2 (Ishikawa, Jら、 Genomics (1995) 26, 527；国際出願公開 W095/10536号公報）と同一分子であることが判明した。

' 一方、骨髄腫以外にもリンパ球系腫瘍において、丽 1.24抗原が発現していること、および抗 HM1.24抗体がリンパ球系腫瘍に対し、抗体依存性細胞介在性細胞傷害活性（ antibody-dependent cell-media ted cytotoxicity, ADCC活性）や補体依存性細胞傷害活性（compleme nt - dependent cyt o t oxi c i ty , CDC活性）による細胞傷害活性を有し、抗腫瘍効果を発現することが示されている（国際出願公開 W098/3 5698号公報）。また、造血器腫瘍を int er fer on ひあるいは γ刺激することで、 HM1. 24抗原の発現量が増加することが明らかにされており、抗 HM1. 24抗体の抗腫瘍効果を増強できることが明らかになつている（国際出願公開 W002/64159号公報）。

このように、 HM1. 24抗原は造血器腫瘍での発現は認められていたものの、肺癌、乳癌、大腸癌を初めとする固形癌に発現していることは知られておらず、さらに、 ADCCによりこれら-の固形癌細胞を傷害できることも、知られていなかった。

造血器腫瘍を除く固形癌としては、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌、及び多形、肉腫様あるいは肉腫成分を含む癌、などを含む）、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌、悪性骨腫瘍などが挙げられる。

近年の医療技術の進歩により、これら固形癌に対し新たな治療法が提案され、試みられているが、進行期にある固形癌に対してはほとんど治癒が見込めず、未だ不十分であるといわざるを得ない。発明の開示

現在、おこなわれている固形癌の治療には、外科手術により病巣そのものを切除する以外に、種々の化学療法、放射線療法、骨髄移植などが挙げられ、さらにこれらを組み合わせて集学的治療により生存期間の延長と Q0L改善を目指している。しかし、前記のごとく、いずれの治療法も未だ完全ではなく、固形癌を寛解に導き、患者の生存期間を延長させる画期的な治療剤あるいは治療法が待たれている。したがって、本発明の目的は、造血器腫瘍を除く固形癌に対する新しい治療剤を提供することである。

本発明者らは、かかる治療剤を提供すべく、抗 HM1. 24抗体を用いて、固形腫瘍細胞での発現量を検討するフローサイトメトリー（FC M) 解析、 ADCC活性、 CDC活性のような細胞傷害活性の測定などの研究を重ねた結果、抗 HM1. 24抗体が認識する抗原蛋白質が造血器腫瘍以外にも様々な固形癌に発現していること、および抗匪 1. 24抗体が固形癌に対し、抗腫瘍効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 ·

すなわち、本発明は配列番号 2に示されるァミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合し、かつ細胞傷害活性を有する抗体を有効成分として含有する、固形癌治療剤を提供する。

前記の抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体、または、相補性決定領域、フレームワーク領域および定常領域がいずれもヒト抗体に由来する抗体である。

前記の抗体は、糖鎖が改変された抗体であってもよい。

前記の抗体断片は、例えば、 Fab、 Fab ' 、 F ( ab ' ) ₂ または Fv断片である。

前記の固形腫瘍は、例えば、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌、及び多形、肉腫様あるいは肉腫成分を含む癌、などを含む）、食道癌、乳癌、胃癌、'結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、脖臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌および悪性骨腫瘍、並びにこれらの固形癌の転移癌である。図面の簡単な説明

図 1は、ヒト固形癌細胞株（MCF7, WiDrおよび Caki- 1) に対するヒト化抗 HM1.24抗体の反応性を示すグラフである。実線は蛍光標識したヒト化抗 HM1.24抗体、点線は蛍光標識ヒト IgGlと反応させた試料である。

図 2は、ヒト固形癌細胞株（MDA- MB- 231， BxPc- 3および PA- 1) に対するヒト化抗匪 1.24抗体の反応性を示すグラフである。実線は蛍光標識したヒト化抗匪 1.24抗体、点線は蛍光標識ヒト IgGlと反応させた試料である。 - 図 3は、ヒト固形癌細胞株（COLO 205および UCC - 5) に対するヒト化抗 HM1.24抗体の反応性を示すグラフである。実線は蛍光標識したヒト化抗 HM1.24抗体、点線は蛍光標識ヒト IgGlと反応させた試料である。

図 4は、ヒト化抗 HM1.24抗体のヒト固形癌細胞株に対する ADCC活性を示すグラフである。

図 5は、 YB2/0で発現させた精製ヒト化抗 HM1.24抗体の SDS- PAGE (12%T) のパターンを示す。左図：還元条件下、右図：非還元条件下。精製ヒト化抗 HM1.24抗体各 4;u_gをアプライした。

図 6は、 HM1.24抗体- DG44と HM1.24抗体- YBの各抗体濃度におけるヒト PBMCの ADCC活性を、 4種類の HM1.24抗原発現 CH0細胞（匪 26, HM3 1， HM21, HM36)を標的細胞として、 E/T rat io = 25で測定した結果である。

図 7は、 HM1.24抗体 - DG44と HM1.24抗体- YB Ι/zg/mLにおけるヒト PBMCの ADCC活性を、 HM31を標的細胞として、 E/T ratio=l, 5， 25 で測定した結果である。

図 8は、 CH0由来の抗体（a)及び YB2/0由来抗体（b)から調製した PA 化糖鎖の逆相 HPLCク口マトグラムである。産生細胞の種類により糖鎖パターンが変化し、特に YB2/0由来抗体では、フコース無しと推定されるピーク群（A-D)が増加していることを示している。

図 9は、第 8図と第 1表で示した糖 A〜Hの構造を示す。

図 10は、第 8図と第 1表で示した糖 I〜0の構造を示す。

図 11は、ヒト GnTIII cDNAの PCRによる全合成に使用したプライマ一配列と組合わせを示した。予めプライマーに導入した B a m H I配列の前後の PCR断片を同部位で連結し、ヒト GnTIII cDNA全配列を取得した。

図 12は、 HM1.24抗体- DG44及び GnTIII発現ヒト化抗 HM1.24抗体産生株由来抗体 100ng/mLにおける ADCC活性の比較。 GnTIIIを発現させることにより ADCC活性が増強している抗体産生株が得られた。

図 13は、 HM1.24抗体 - DG44と GnTIII発現 CH0細胞由来ヒト化抗 HM1. 24抗体の各抗体濃度におけるヒト PBMCの ADCC活性を、 HM36を標的細胞として、 E/T ratio==25で測定した結果である。

図 14は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 3 0) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列 (配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は、两配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 15は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 3 0) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列 (配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が伺一であることを示す。

図 16は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 3 0) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列 (配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 17は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 3 0) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列 (配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は

、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 18は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 3

0) (GnTIII ori. nuc) と.変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列 (配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は

、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

図 19は、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 3

0) (GnTIII ori. nuc) と変異型ヒト GnTIII をコードする塩基配列 (配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は

、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明者らは、 HM1.24抗原が、造血器腫瘍以外の固形癌に発現し、抗丽 1.24抗体が ADCCなどを介して細胞傷害活性を示すことを初めて明らかにした。本発明において、抗 HM1.24抗体が抗腫瘍効果を示す細胞は、 HM1.24抗原を発現した造血器腫瘍以外の固形癌であり、具体的には、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌、腺扁平上皮癌、及び多形、肉腫様あるいは肉腫成分を含む癌、などを含む）、食道癌、乳癌、胃癌、結腸'癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、脖臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宫体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌、悪性骨腫瘍などが挙げられる。また、これら固形癌の転移ならびに転移巣、固形癌に伴うがん性胸膜炎、がん性腹膜炎、がん性髄膜炎なども挙げられる。

次に、本発明に用いる抗体について説明する。抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体の方が好ましい。次に、モノクローナル抗体の作製方法について説明する。

ハイブリドーマ

本発明で使用される抗体を産生するハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、 HM 1 , 24抗原蛋白質や HM1. 24抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスタリー二ング法により、モノクロ一ナルな抗体産生細胞をスタリーニングすることによつて作製できる。

具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得の感作抗原である匪 1. 24抗原発現細胞としては、ヒト多発性骨髄腫細胞株である KPMM2 (特開平 7- 236475) や KPC-32 ( Goto , T. et al. ， Jpn. J. Cl in. Hemato l . ( 1991 ) 32， 14 00) を用いることができる。また、感作抗原として配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質、あるいは抗丽 1. 24抗体が認識するェピトープを含むペプチドまたはポリペプチドを使用することができる。

なお、感作抗原として使用される、配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質の cDNAは pUC19 ベクタ一の Xbal切断部位の間に揷入されて、プラスミド pRS38-pUC19 として調製されている。このプラスミド pRS38-pUC19 を含む大腸菌（E. co l i ) は、平成 5年（1993 年） 10月 5 日付で独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、 Es cher i c hia col i DH5 a (_PRS38-pUC19) として、受託番号 FERM BP— 4434としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている（特開平 7-196694参照）。このプラスミド pRS38- pUC19 に含まれる cDNA断片を用いて遺伝子工学的手法により、抗 HM1.24抗体が認識するェピトープを含むぺプチドまたはポリぺプチドを作製することができる。

感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげつ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。

感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または、皮下に注射することにより行われる。 - 具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline) や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュパント、例えば、フロイント完全アジュパントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4〜 2 1 日毎に数回投与するのが好ましい。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。

このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。

前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、すでに、公知の種々の細胞株、例えば、 3 63 _§8.6 53 (J. Immunol. (1979) 123: 1548-1550 ) ， P3X63Ag8U.1 (Curre nt Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7) ， N S- 1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511 - 519) ， MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8: 405-415 ) , SP2/0 (Shulman, M. et al. , Nature (1978) 276: 269 - 270) ， F0 (de St. Groth, S. F. et al. , J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21 ) ， S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148: 313-3 23) ， R210 (Galfre, G. et al. , Nature (1979) 277: 131-133 ) 等が適宜使用される。

前記免疫細胞とミエ口一マ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミルスティンらの方法（Kohler.G. and Milstein, ， Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 等に準じて行うことがでさる。

より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール（PEG)、センダイウイ-ルス（HVJ) 等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。

免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM 培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用することもできる。

細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め、 37°C程度に加温した PEG 溶液、例えば、平均分子量 1000—6000程度の PEG 溶液を通常、 30〜60% ( w/ v ) の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去できる。

当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT 培養液 (ヒポキサンチン、アミノブテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択される。当該 HAT 培養液での培養は、目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが行われる。

また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球を in vi t roで HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発現細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266 と融合させ、 HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発現細胞への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 1-59878 参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジヱニック動物に抗原となる HM1. 24抗原または HM1. 24抗原発現細胞を投与し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号 W093/12227 , W092/03918 , W094/02602 , W094/2 5585 , 勸 6/34096， W096/33735参照）。

さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングにより所望のヒト抗体を単離することもできる。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（s cFv) としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、 HM1. 24抗原を固定化したプレートを用いて、 HM1. 24抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、 HM1. 24抗原に結合す'る抗体の可変領域をコ一ドする遺伝子を同定することができる。これらの遺伝子配列を用いれば、ヒト抗 HM1. 24抗体を作製することができる。これらの方法は既に周知の方法であり、 W092/01047 , W092/20791 , W0 93/06213 , 應 3/11236， W093/19172 , W095/01438 , W095/15388を参考にすることができる。

このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。

当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産に適している。

モノクローナル抗体

具体的には、抗 HM1.24抗体産生ハイブリドーマの作製は、 Goto, Τ·らの方法（Blood (1994) 84. 1922-1930) により行うことができる。独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、平成 7年 4月 27日に FE RM BP- 5233としてブダぺスト条約に基づき国際寄託された抗 HM1.24 抗体産生ハイブリドーマを BALB/cマウス（日本クレア製）の腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から抗 HM1.24抗体を精製する方法や、本ハイブリド一マを適当な培地、例えば、 10%ゥシ胎児血清、 5 % BM-CondimedHl (Boehringer Mannheim 製）含有 RPMI1640培地、ハイプリドーマ SFM 培地（GIBC0-BRL 製）、 PFHM- II培地（GIBC0- B RL製）等で培養し、その培養上清から抗 HM1.24抗体を精製する方法で行うことができる。

組換え型抗体

本発明では、モノクロ一ナル抗体として、抗体遺伝子をハイプリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、 Carl, A. K. Borrebaeck, James, W . Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in th e United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。具体的には、目的とする抗体を産生するハイプリドーマから、抗体の可変（V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グァニジン超遠心法（Chirgwin, J.M. ら、 Bi ochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法 ( Chmczynski , P. ら、 (1987) 162, 156-159) 等により全 RNA を調製し、 mRNA Purific ation Kit (Pharmacia製）等を使用して mRNAを調製する。また、 Qu ickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直接調製することができる。

得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの合成は、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDN A Synthesis Kit 等を用いて行うことができる。また、 cDNAの合成および増幅を行うには 5 ' -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製）および PCR を用いた 5 ' -RACE 法（prohman, M. A. ら、 Proc.Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85， 8998-9002; Belyavsky, A. ら、 Nuclei c Acids Res. (1989) 17, 2919-2932 ) を使用することができる。得られた PCR 産物から目的とする DNA 断片を精製し、ベクタ一 DNA と連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌等に導入してコ口ニーを選択して所望の組換えべクターを調製する。目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、例えば、ジデォキシ法により確認する。

目的とする抗体の V領域をコードする DNA が得られれば、これを所望の抗体定常領域（C領域）をコードする DNA と連結し、これを発現ベクターへ組み込む。または、抗体の V領域をコードする DNA を、抗体 C領域の DNA を含む発現ベクターへ組み込んでもよい。本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現べクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させることができる改変抗体

本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ch imer i c) 抗体、ヒト化（Humanized ) 抗体などを使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。

キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコ一ドする DN A をヒト抗体 C領域をコードする DNA と連結し、 -これを発現べクタ一に組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 125023 、国際特許出願公開番号 W096/02576参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。

例えば、キメラ抗 HM1. 24抗体の L鎖および H鎖を含むプラスミドを有する大腸菌は、各々 Escher i chia col i DH5ひ（pUC19- 1. 24L- g κ ) および Escher i chia co l i DH5ひ（pUC19_l. 24H— g γ 1 )として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、平成 8年 8月 2 9 日に、各々 FE RM ΒΡ-5646および FERM BP- 5644としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている（国際特許出願公開番号 W098/14580参照'）。

ヒト化抗体は、再構成（reshaped) ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR ； comp l e mentar i ty de t ermining region) ヒ卜キ几体の相袖性決疋域へ核植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている (欧州特許出願公開番号 EP 125023 、国際特許出願公開番号 W096/0 2576参照）。

具体的には、マウス抗体の CDR とヒト抗体のフレームワーク領域 (framework-region； FR) を連結するように設計した DNA 配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のォリゴヌクレオチドから PCR 法により合成する。得られた DNA をヒト抗体 C領域をコードする DNA と連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400 、国際特許出願公開番号 W096/02576参照）。

CDR を介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい (Sato, K. et al. , Cancer Res. (1993) 53， 851-856 ) 。

例えば、ヒト化抗 HM1.24抗体の L鎖および H鎖を含むプラスミドを有する大腸菌 ίま、各々 Escherichia coli DH5 a (pUC19-RVLa-AH M-g κ )および Escherichia coli DH5 a (pUC19_ r- AHM_g y 1 )として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、平成 8年 8月 29日に、各々 FERM BP-5645および FERM BP- 5643としてブダぺスト条約に基づき国際寄託されている（国際特許出願公開 W098/14580参照）。

キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体 C領域が使用され、細胞傷害活性を呈するヒト抗体 C領域として、ヒト C _Y例えば、 C T/ 1， Cy 2, Cy 3, Cy 4 を使用することができる。これらのうち、特に C₇1, Cy 3 を有する抗体が強力な細胞傷害活性、すなわち、 ADCC 活性、 CDC 活性を有し、本発明に好適に使用される。

キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の C領域からなり、ヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物'由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由来のフレームワーク領域（framewor k region； FR) および C領域からなり、ヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化抗 HM1.24抗体が挙げられる（W098/14580 参照）。

本発明では、糖鎖が改.変された抗体も使用できる。（特願 2003- 2 07165参照）

本発明の抗体として、 α— 1，6コアーフコース（ひ — l，6core fucos e) (還元末端の N—ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1 位とがひ結合している。）を含まない糖鎖を有する抗 HM1.24抗体、及びパイセクティング (bisecting) N—ァセチルダルコサミン (G lcNAc) 構造を有する糖鎖を有する抗体が高い ADCC活性を有するほ力、、 α - 1，6コアーフコース（ α - l，6core fucose) を含まない糖鎖とバイセクティング (bisecting) N—ァセチノレグノレコサミン (Glc NAc) 構造を有する糖鎖を共に有する抗 ΗΜ1· 24抗体が、一層高い ADC C活性を有する。

従って本発明で使用する抗体として、糖鎖の改変により ADCC活性が増強された、 HM1.24抗原に対する抗体（抗 HM1.24抗体）を使用することができる。この抗体は、典型的にはモノクローナル抗体またはそれに由来する抗体であり、例えばキメラ抗体、又は更に好ましくはヒト化抗体である。より具体的には、本発明では、ひ - 1， 6コアーフコース（ a _l，6core fucose) を含まない糖鎖を有する抗体、及びパイセクティング (bisecting) N—ァセチルダルコサミン (G lcNAc) 構造を有する糖鎖を有する抗体、更には、 α-1，6コアーフコース（ o; -l，6core fucose) を含まない糖鎖を有し、且つパイセクティング（bisecting) N—ァセチルダルコサミン (GlcNAc) 構造を有する糖鎖を有する抗体を使用することができる。

上記の糖鎖が修飾された抗体は、匪 1.24抗原に対する抗体（抗 HM 1. 24抗体）をコードする核酸が導入された YB2/0細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法； N ーァセチルダルコサミニルトランスフヱラーゼ I I I ( GnTI I I ) をコードする核酸を導入した宿主細胞を培養し、当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法；並びに、 N —ァセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ Ι Π ( GnTI I I ) をコードする核酸を導入した YB2/0細胞を培養し、そして当該培養物から当該抗体を採取することを特徴とする方法などにより製造することができる。本発明で使用する糖鎖の修飾により ADCC活性が増強された抗丽 1. 24抗体を得るには、ひ- 1 , 6コアーフコース（ α - l，6cor e fucose) を付加する能力を有しないか又はその能力が低い宿主細胞中で抗 HM 1. 24抗体を発現させる力、あるいは糖鎖にパイセクティング（bi s e ct ing) N —ァセチルダルコサミン（Gl cNAc) 構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗 HM1. 24抗体を発現させる必要がある。そして、そのためには、目的とする抗 HM1. 24抗体をコードする遺伝子がクローニングされなければならない。そして、クローニングされた遺伝子によりコードされた抗 HM1. 24抗体としては、モノクローナル抗体、可変領域がマウスなどのヒト以外の動物に由来し、不変領域がヒトの抗体に由来するキメラ抗体、可変領域中の相補性決定領域のみがマウスなどのヒト以外の動物の抗体に由来し、それ以外の抗体部分はヒト抗体に由来するヒト化抗体などが上げられる。

W0 98/14580の記載から明らかな通り、モノクロ一ナル抗 HM1. 24 抗体を産生するハイプリドーマは既に樹立されており、このハイブリドーマは、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、平成 7年 4月 27日に、 FERM BP-5233として寄託されている。また、このハイプリドーマから、軽鎖可変領域（L鎖 V領域）をコードする DNA及び重鎖可変領域（H鎖 V領域）をコードする DNAがクローニングされ、そしてこれちの DNAを含むプラスミドを収容した大腸菌が、それぞれ、 Escherichia coli DH5 a (pUC19-l.24L-g κ ) (FERM BP - 5646) 及び Escherichia coli DH5 a (pUC19- 1.24H- g γ 1 ) (FERM BP-5644) として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 ) に、平成 8年 8月 29日に寄託されている。

さらに、上にクローニングした L鎖 V領域をコードする DNA及び H鎖 V領域をコードする DNAから、キメラ抗 HM1.24抗体及びヒト化抗 HM1.24抗体が作成された。ヒト化抗体については、 W0 98/14580 の第 37頁〜第 40頁の表 1〜表 4に示されるように、ヒト化抗体の L 鎖についてはパージョン_ ^及び^ _が作製され、 H鎖については、パージョン_§_〜が作製され、これらを込み合わせたヒト化抗体の抗原結合活性の測定の結果、 L鎖パージョン_^_と H鎖パージョン丄又はとの組合わせから成るヒト化抗体が強力な抗原結合活性を有することが確認された。

従って、本発明においては、上に引用した W0 98/14580に記载されている種々のモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することができる。しかしながら、上記の抗体のみならず、 HM1.24に対する他のモノクローナル抗体に由来するキメラ抗体、ヒト化抗体などを使用することもできる。その場合、これらの調製方法としては、例えば W0 98/14580に記載されている方法を用いることができる。

•抗 HM1.24抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のァスパラギンの側鎖の N原子に結合する N—グリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリン又はスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合する O—ダリコシル結合糖鎖とがあり、本発明においてフコースの存否が問題となるのは N —ダリコシル結合糖鎖である。この N —グリコシル結合糖鎖は、図 9及び図 10に示すごとく、 1個のマンノース（Man) と 2個の N —ァセチルダルコサミン（Gl cNAc) が j3 1，4結合で結合した基本構造（コア）「- Man j3 1- 4Gl cNAc ]3 1- 4Gl cNc -」を有し、この構造の右の GlNAcを還元末端と称し、左側の Manを非還元末端と称する。フコース（Fuc) が結合している場合、これは主として、還元末端の N —ァセチルダルコサミンの 6位とフコースの 1位とがひ結合している.。

本発明の一つの態様によれば、抗 HM1. 24抗体は上記のフコースを含まない糖鎖を有する。抗体分子が複数の N _ダリコシル糖鎖を有する場合、少なくとも 1個の糖鎖は上記のフコースを有しない。このような、フコースを含まない糖鎖を有する抗体は、当該抗体を、糠鎖へのフコース付加能を欠失した細胞、すなわち、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い宿主中で発現させれば良い。

本発明で使用する抗体製造においては、フコース転移活性を有しないか又はこの活性が低い任意の宿主を用いることができるが、具体例として、ラットミエローマ YB2/3HL. P2. Gil . 16Ag. 20細胞 ( YB2/ 0細胞と略される）（ATCC CRL 1662として保存されている； Γが挙げられる。本発明で用いることができるその他の細胞としては、例えば、 FTVI I Iノックァゥト CH0細胞（W0 02/31140 )、 Lecl3 細胞（W003/03 5835 )、フコーストランスポーター欠損細胞（特願 2003-174006、特願 2003-282081、特願 2003-174010、特願 2003- 282102) を挙げることができる。

本発明のもう一つの態様によれば、本発明で使用する抗 HM1. 24抗体は、パイセクティング（b i s ec t ing) N —ァセチルダルコサミンを有する糖鎖を有する。 N —ダリコシル結合糖鎖は前記め如き基本構造（コア一）を有し、その非還元末端には、図 9に示すごとく、マンノースを含む 2個の鎖が a 1，6結合及びひ 1，3結合により結合している。他方、図 10に示す糖鎖においては、基本構造（コア一）の非還元末端に、前記 2個の糖鎖のほかに、 1個の N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) が j81，4結合により結合している。この N—ァセチルダルコサミン（GlcNAc) が、「パイセクテング N—ァセチルダルコサミン」である。

パイセクティング N—ァセチルダルコサミンを有する糖鎖は、 O 一ダリコシル結合糖鎖又は N—グリコシル結合糖鎖であり、 N—ァセチルダルコサミニルトランスフェラーゼ III (GnTIII ) により、 N—ァセチルダルコサミンを糖鎖に転移させることにより形成される。この酵素をコードする遺伝子は既にクローニングされており、そのアミノ酸配列及びそれをコードする DNAの塩基配列は記載されている（NCBIデーターベース（ACCESSION D13789) ) 。また、この DNAは、上記の配列情報に基づいて PCR法など、常法に従って、クローニングすることができる。

GnTIII をコードする DNAを用いて、パイセクティング N—ァセチルダルコサミンを有する糖鎖を形成するには、この DNAを含んでなる発現ベクターにより、抗匪 1.24抗体を産生する宿主細胞を形質転換すればよい。すなわち、 GnTIII をコードする DNAを含んで成る発現ベクターと抗 HM1.24抗体をコードする DNAを含んで成る発現べクターとにより、宿主細胞を形質転換し、これを培養すればよい。本発明の第三の態様によれば、本発明の抗 HM1.24抗体は、 a- 1,6 コアーフコース（ひ - l，6core fucose) を有しない糖鎖とパイセクティング N—ァセチルダルコサミンを有する糖鎖の両方を有する。このタイプの抗体を製造するには、 GnTIII をコードする DNAを含んで成る発現べクターと抗丽 1.24抗体をコードする DNAを含んで成る発現ベクターとにより、 a- 1，6コアーフコースを有する糖鎖を形成する活性を有しないか又はこの活性が弱い宿主細胞、例えば YB2/0 細胞、を形質転換し、これを培養すればよい。

宿主細胞の形質転換方法、培養方法、及び培養物からの抗体の単離 · 精製方法は、常法に従って行うことができる。

抗体断片

本発明において、全長抗体の一部すなわち抗体断片を人為的に作製して、抗体の効果を部分的ないしは全て代替させることができる抗体断片とは、一般に、抗原結合領域または可変領域のことである。例えば、抗体断片には Fab、 Fab ' 、 F ( ab' ) ₂、及び Fv断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、 Fab断片と呼ばれる、それぞれ 1つの抗原結合部位を有する 2つの同じ抗原結合断片、及び、残りの容易に結晶化するために Fcと呼ばれる断片が生じる。また、ぺプシン消化により 2つの抗原結合部位を有し、抗原を交差結合し得る F ( ab' ) ₂断片、及び、残りの別な断片（_PFc，と呼ばれる）が得られる。その他の断片としては、 diabody ( diabodi es )、線状抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片より形成された多特異性抗体が含まれる。

ここで、 Fv断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。この領域は 1つの重鎖及び軽鎖の可変ドメインが非共有結合により強く連結されたダイマーである（V_H -V_Lダイマー）。各可変ドメインの 3つの CDRが相互作用し、 V_H - V_Lダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。 6つの CDRは、抗体に抗原結合部位を付与するものである。しかしながら、 1つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な 3つの CDRのみを含む Fvの半分）であっても、全結合部位よりは低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。また、 Fab断片（F(ab)とも呼ばれる）はさらに、軽鎖の定常ドメイン、及び、重鎖の定常ドメイン（CH1)を含む。 Fab' 断片は Fab断片と、抗体のヒンジ領域からの 1またはそれ以上のシスティンを含む重鎖 CH1ドメインのカルボキシ末端由来の数個の残基を付加的に有する点で異なる。

本発明において、 diabody(diabodies)とは、 2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、該断片は、同じポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（VL)に連結された重鎖可変ドメイン（VH)(VH- VL )を含む。同じ鎖中で 2つのドメインの間を結合できない位に短いリンカーを用いると、 2つのドメインはもう一方の鎖の定常ドメインとペアを形成し、 2つの抗原結合部位が創り出される。 Diabodyはより詳細に、例えば、 EP404，097号、 W093/11161号、及び Holliner et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90， 6444) に記載される一本鎖抗体（以下、一本鎖 Fv若しくは sFvとも呼ぶ）、または sFv抗体断片には、抗体の VH及び VLドメインが含まれ、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、 Fvポリペプチドはさらに、 VH及び VLドメインの間にポリペプチドリンカ一を含み、それにより sFvは、抗原結合のために必要な構造が形成できる。 sFvにっレヽま、 Pluckthun 『The Pharmacology of Monoclonal Antibodi es』 Vol.113 (Rosenburg及び Moore編、 Springer Verla , New York ， pp.269-315 (1994) ) に記載されている。

抗体ファージライブラリー

本発明では、目的とするモノクローナル抗体をコードする DNAを得るために、抗体ファージライブラリーを使用することができる。抗体ファージライブラリーより抗体、または抗体断片を'単離するため fこま、ィ列免 ίま、、 McCafferty ¾ (Nature (1990) 348, 552) (こより記載された技術を用いて製造された抗体ファージライブラリーを用いることができる。ファージライブラリーを用いたマウスおよびヒト抗体の単離は、 Clacksonら（Nature (1991) 352, 624) 、および Marksら（J. Mol. Biol. (1991) 222, 581) が記載した方法を用いることができる。

また、チェーンシャッフリングによる方法（Marks et al.， Bio/ Technology (1992) 10， 779) を用いることで高親和性（nM程度）のヒト抗体を得ることができる。また、巨大なファージライブラリ一を構築するための方法としては、コンビナトリ-アル感染、および in vivo糸且換 (Waterhouse et al. , Nucleic Acids Res. 21:2265- 2266 (1993))などが知られている。これらの技術も、従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に代えて利用することができる。

ヒト抗体産生トランスジヱニック動物 '

本発明では、ヒト抗体産生トランスジエニック動物を用いることで、ヒト抗体を産生するハイプリドーマを直接得ることができる。

ヒト抗体は、免疫原（抗原）をヒト抗体産生トランスジヱニック哺乳動物に免疫し、既存の一般的な抗体産生方法によって取得することができる。その抗体遺伝子は、該細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて組換え抗体を作製することができる。

用いるヒト抗体産生非ヒト哺乳動物、特にヒト抗体産生トランスジヱニックマウスの作製方法は公知である（Nature Genetics (19 94) 7, 13 ； Nature Genetics (1997) 15, 146；特表平 4-504365 号公報；特表平 7- 509137号公報；日経サイエンス（1995) 6, 40 ; 国際出願公開 W094/25585号公報； Nature (1994) 368, 856；特表平 6-500233号公報等）。該ヒト抗体産生トランスジヱニック非ヒト哺乳動物は具体的には、次のような手順により製造することができる：

( 1 ) 非ヒト哺乳動物の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することにより該動物内在性免疫グロプリン重鎖遺伝子が機能的に不活性化されたノックアウト非ヒト哺乳動物を作製する工程、

( 2 ) 非ヒト哺乳動物内在性免疫グロプリン軽鎖遺伝子座の少なくとも一部を相同組換えにより薬剤耐性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等）で置換することによる該動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子（特に κ:鎖遺伝子）が機能的に不活性化されたノックァゥト非ヒト哺乳動物を作製する工程、

( 3 ) 酵母人工染色体（Yeast artificial chromosome, YAC)ベタター等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なベタターを用いて、ヒト免疫グロプリン重鎖遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組込まれたトランスジエニック非ヒト哺乳動物を作製する工程

( 4 ) YAC等に代表されるような巨大遺伝子を運搬可能なべクタ —を用いて、ヒト免疫グロブリン軽鎖（特に κ鎖）遺伝子座の所望の領域がマウス染色体中に組込まれたトランスジエニック非ヒト哺乳動物を作製する工程、

. ( 5 ) 前期（ 1 ) 〜（ 4 ) のノックアウト非ヒト哺乳動物及びトランスジエニック非ヒト哺乳動物を任意の順序で交配することにより、非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座及び非ヒト哺乳動物内在性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座がともに機能的に不活性化され、且つヒト免疫グロプリン重鎖遺伝子座の所望の領域及びヒト免疫グロプリン軽鎖遺伝子座の所望の領域が共に非ヒト哺乳動物染色体上に組込まれたトランスジエニック非ヒト哺乳動物を作製する工程。 .

上述のように、非ヒト哺乳動物の内在性免疫グ口プリン遺伝子座の適当な領域を外来性マーカー遺伝子（ネオマイシン耐性遺伝子等 ) で相同組換えにより置換することにより該遺伝子座が再構成できないように不活性化することができる。該相同組換えを用いた不活性化には、例えば、ポジティブ · ネガティブ · セレクション（PNS ) と呼ばれる方法を用いることができる（日経サイエンス（1994) 5, 52) 。また、免疫グロブリン重鎖遺伝子座の機能的な不活性化には、例えば、 J領域または C領域（例えば C i 領域）の一部に障害を導入することにより達成でき、免疫グロプリン軽鎖（例えば _κ鎖 ) の機能的不活性化には、例えば、 J領域若しくは C領域の一部、または J領域及び C領域にまたがる領域を含む領域に障害を導入することにより達成可能である。

トランスジエニック動物は、通常の方法により製造することができる（例えば、最新動物細胞実験マニュアル、エル · アイ · シ一発行、第 7章、第 361から 408頁（1990) ) 。具体的には、例えば、正常な非ヒト動物胚盤胞に由来するヒポキサンチングァニン · ホスホリポシルトランスフェラーゼ（HRPT) 陰性胚性幹（ES) 細胞を、該ヒト免疫グロプリン重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座をコードする遺伝子またはその一部並びに HRPT遺伝子が挿入された YACベクタ一を含む酵母とスフヱ口プラスト融合法により融合する。

該外来遺伝子がマウス内在性遺伝子上にィンテグレートされた ES 細胞を HATセレクションにより選別する。次いで、選別した ES細胞を別の正常非ヒト哺乳動物から取得した受精卵（胚盤胞）にマイク口インジェクションする（Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA ( 1980) 77, 7380 ；米国特許第 4，873，191号）。該胚盤胞を仮親となる別の非ヒト哺乳動物の子宮に移植することにより、キメラトランスジエニック非ヒト哺乳動物が誕生する。該キメラ動物を正常な非ヒト哺乳動物と交配させ、ヘテロトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得る。該へテロ動物同士を交配することにより、メンデルの法則に従い、ホモトランスジヱニック非ヒト哺乳動物を得ることができる。

発現および産生

前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプ口モーター、発現される抗体遺伝子、その 3 ' 側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させた DNA あるいはそれを含むベクターにより発現させることができる。例えばプロモーターノェンハンサ一としては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター/ェンハンサ一

( human cytomegalovirus immediate early promoter/ enhancer) を挙げることができる。

また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモ一ター zェンノ、ンサ一として、レトロゥイノレス、ポリオ一マウイノレス、アデノウィルス、シミアンウィルス 40 ( SV40) 等のウィルスプ口モーター/ェンハンサーゃヒトェロンゲーシヨンファクター 1 a (HEF1 a ) などの哺乳類細胞由来のプロモーター Zェンハンサーを用いればよい。

例えば、 SV40プロモーターノエンハンサーを使用する場合、 Mull iganらの方法（Nature (1979) 277, 108) 、また、 HEF1 αプロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mizushima らの方法（Nuclei c Acids Res. (1990) 18， 5322) に従えば容易に実施することができる。

大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合ざせて発現させることができる。例えばプロモーターとしては、 lacZプロモ一ター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプロモーターを使用する場合、 Wardらの方法（Nature (1098) 341,544-546; FAS EB J. (1992) 6, 2422-2427) 、 araBプロモーターを使用する場合、 Betterらの方法（Science (1988) 240, 1041-1043 ) に従えばよレゝ

抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のぺリブラズムに産生させる場合、 pelBシグナル配列（Lei， S. P. et al J.Bacter iol. (1987) 169, 4379 ) を使用すればよい。ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に ITフォールド（refo Id) して使用する（例えば、 W096/30394を参照）。

複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV) 等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現べクタ —は選択マーカ一として、アミノグリコシドトランスフェラ一ゼ（A PH) 遺伝子、チミジンキナーゼ（TK) 遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシノレトランスフェラーゼ（Ecogpt) 遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr) 遺伝子等を含むことができる。

本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in v ivo の産生系がある。 in vitroの産生系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる。

真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を用いる産生系がある。動物細胞としては、（ 1 ) 哺乳類細胞、例えば、 CH0, C0S、ミエローマ、 B HK (baby hamster kidney ) 、 HeLa, Vero、（ 2 ) 両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵母細胞、あるいは（ 3 ) 昆虫細胞、例えば、 sf9， sf21, Tn5などが'知られている。植物細胞としては、ニコティアナ（Nicotiana ) 属、例えばニコティアナ · タパカム（Nicotiana tabacum ) 由来の細胞が知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、、サッカロミセス（Saccharomyces ) 属、ィ列えばサッカロミセス ' セレビシェ (Saccharomyces serevisiae) 、糸状菌、例えば、ァスペルギルス（Aspergillus ) 属、例えばァスペルギルス · 二 1 — (Aspergillus niger ) など力 S失口られてレヽる。

原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大腸菌（E. coli) 、枯草菌が知られている。

これらの細胞に、目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、 DM EM, MEM, RPMI1640, IMDM を使用することができ、牛胎児血清（FCS ) 等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivo にて抗体を産生してもよい。

一方、 in vivo の産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。

哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシなどを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology App lication, 1993) 。また、昆虫としては、カイコなどを用いることができる。

植物を使用する場合、タバコなどを用いることができる。

' これらの動物または植物に抗体遺伝子を導入し、動物または植物の体内で抗体を産生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をャギ j8 カゼインのような乳汁中に固有に産生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が揷入された融合遺伝子を含む DNA 断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジェニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい（Ebert， K. M. et al. , Bio/Technology (1994) 12, 69 9-702 ) 。

また、カイコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を揷入したパキュ口ウィルスをカイコに感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る (Susumu, M. et al. , Nature (1985) 315， 592-594 ) 。さらに、タバコを用いる場合、目的の抗体遺伝子を植物発現用べクタ一、例えば pM0N530 に挿入し、このベクターをァグロパクテリゥム - ッメファシエンス ( Agrobacterium tumefaciens ) のようなノクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えばニコチェア ' タパカム（Nicotiana tabacum ) に感染させ、本タバコの葉より所望の抗体を得る (Julian, K. -C. Ma et al. , Eur. J. Immunol. (1994 ) 24, 131-138 ) 。

上述のように in vitroまたは in vivo の産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H鎖）または軽鎖（L鎖）をコードする DNA を別々に発現べクターに組み込んで宿主を同時形質転換させてもよいし、あるいは H鎖および L鎖をコードする DNA を単一の発現べクタ一に組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号 W094-11523参照）。

上述のように得られた抗体は、ポリエチレングリコール（PEG) 等の各種分子と結合させ抗体修飾物として使用することもできる。本願特許請求の範囲でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。

抗体の分離、精製

前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフイエティークロマトグラフィーにより行うことができる。ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては

、例えば、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。プロテイン Aカラムに用いる担体として、例えば、 Hyper D， P0R OS , Sepharo s e F. F.等が挙げられる。

その他、通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アブイニティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フイノレター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体を分離、精製することができる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。

薬物 · 毒物などとの結合体

本発明では、治療目的として抗体に各種試薬を結合して使用することもできる。このような試薬としては、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソールなどの化学療法剤、重金属、 I odine- 131， Yt t r ium- 90などの放射核種、 Ps eud。m。nas毒素などのトキシン類、を挙げることができる。治療用試薬との結合体を生産する方法および治療用に使用する方法については、米国特許 5057313号、米国特許 5156840号に記載されている。

抗体の濃度測定 .

上記方法で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定または ELI SA 等により行うことができる。すなわち、吸光度の測定による場合には、本発明で使用される抗体又は抗体を含むサンプルを PBS (-)で適当に希釈した後、 280nmの吸光度を測定し、 1 mg/mlを 1.350Dとして算出する。また、 ELISAによる場合は以下のように測定することができる。すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液（ρΗ9·6) で 1 z g /mlに希釈したャギ抗ヒト IgG (BIO SOURCE 製） 100 μ 1 を 96穴プレート

(Nunc製）に加え、 4 °Cでー晚インキュベーションし、抗体を固相化する。

ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使用される抗体または抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒト IgG (CAPPEL 製） 10 0 μ 1 を添加し、室温にて 1時間ィンキュベーションする。洗浄後、 5000倍希釈したアル力リフォスファターゼ標識抗ヒト IgG (BIO S 0URCE 製） 100 μ 1 を加え、室温にて 1時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュベーションの後、 MICR0PLATE REA DER Model 3550 (Bio-Rad 製）を用いて 405nmでの吸光度を測定し、目的の抗体の濃度を算出する。

F CM解析

骨髄腫細胞と本発明で使用される抗体との反応性は、 FCM (フ口一サイトメトリー）解析で行うことができる。細胞としては、樹立細胞株あるいは新鮮分離細胞を用いることができる。樹立細胞株としては、ヒト乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HTB-22) および MDA - MB-231 (A TCC HTB-26) 、ヒト大腸癌細胞株 C0L0 205 (ATCC CCL-222) および WiDr (ATCC CCL-218) 、ヒト膝臓癌細胞株 BxPC-3 (ATCC CRL - 1 687) 、ヒト子宮頸癌細胞株 UCC - 5 (実験動物中央研究所）、ヒト腎臓癌細胞株 Caki-1 (ATCC HTB-46) 、ヒト卵巣癌細胞株 PA- 1 (ATC C CRL-1572) などを用いることができる。

上記細胞を PBS (-)で洗浄した後、 FACS緩衝液（ 2 %ゥシ胎児血清、 0.05%アジ化ナトリウム含有 PBS( -)) で 25 g Zmlに希釈した抗体あるいはコント口ール抗体 100 μ 1 を加え、氷温化 30分ィンキュペートする。 FACS緩衝液で洗浄した後、 25μ g /mlの FITC標識ャギ抗マウス抗体（GAM, Becton Dickinson 製） 100 μ 1 を加え、氷温化 30分間インキュベートする。 FACS緩衝液で洗浄した後、 600 _μ 1 あるヽ ίま 1 mlの FACS緩衝液【こ懸獨し、 FACScan (Becton Dickinson 製）で各細胞の蛍光強度を測定すればよい。

また、前記の間接法による染色ではなく、細胞を高濃度の免疫グロブリンで処理し、 Fcレセプターをプロックした後に FITC標識した抗 HM1.24抗体を用いた直接法による染色により FCM 解析することもできる。

細胞傷害活性

A D C C活性の測定

本発明に使用される抗体は、細胞傷害活性として、例えば、 ADCC 活性を有する抗体である。

本発明において腫瘍細胞に対する ADCC活性は、次のようにして測定することができる。まず、ヒトの末梢血や骨髄より比重遠心法で単核球を分離し、エフヱクタ一細胞（Effector cell ： E) として調製する。

また、標的細胞（Target cell ： T) としては、ヒト'乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HTB-22) 、 MDA-MB - 231 (ATCC HTB-26) 、ヒト大腸癌細胞株 C0L0 205 (ATCC CCL-222) および WiDr (ATCC CCL-218) 、ヒト子宮頸癌細胞株 UCC-5 (実験動物中央研究所）、ヒト卵巣癌細胞株 PA- 1 (ATCC CRL-1572) 、患者由来の細胞などを⁵¹ Crにより標織して、標的細胞として調製する。次いで、標識した標的細胞に AD CC活性を測定する抗体を加えィンキュベ一トし、その後、 '標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えィンキュベートする。インキュベートした後上清を取り、ガンマカウンターで放射活性を測定する。その際、最大遊離放射能測定用に、 1 %の NP- 40 を用いることができる。細胞傷害活性（％) は、（A- C)/(B- C) X100 で計算することができる。なお、 Aは抗体存在下において遊離された放射活性（cpm ) 、 Bは NP- 40 により遊離された放射活性（cpm ) 、 Cは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（cpm ) である。

細胞傷害活性の増強

ADCC活性のような細胞傷害活性を発揮するにば、ヒトにおいては抗体定常領域（C領域）として C 、特に C_y l, Cy 3 を使用することが好ましい。さらに、抗体 C領域のアミノ酸を一部付加、改変、修飾することにより、より強力な ADCC活性、あるいは CDC 活性を誘導することができる。

例えば、アミノ酸置換による IgG の IgM 様ポリマー化（Smith,. R . I.F. & Morrison, S. L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683 - 688 ) 、アミノ酸付加による IgGの IgM様ポリマー化（Smith, R. I.F. et al. ， J. Immunol. (1995) 154， 2226-2236) 、 L鎖をコードする遺伝子の直列連結での発現（Shuford, W, et al. , Science (1991) 252, 724-727 ) 、アミノ酸置換による IgG の二量体化（Caron, P. C. et al. , J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B.， J. Immuno 1. (1992) 148, 2918-2922) 、化学修飾による I g Gの二量体化（ Wolff, E.A. et al.， Cancer Res. (1993) 53， 2560-2565) 、および抗体ヒンジ領域のアミノ酸改変によるエフェクター機能の導入（ Norderhaug, L. et al.， Eur. J. Immunol. (1991)21, 2379-2384) が挙げられる。

これらは、プライマーを利用したオリゴマー部位特異的'変異導入法、制限酵素切断部位を利用した塩基配列の付加、共有結合をもたらす化学修飾剤を使用することによって達成される。

投与経路および製剤

本発明の固形癌治療剤は、非経口的にあるいは経口的に、全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、胸腔内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。有効投与量は、一回につき体重 lkgあたり 0. 01〜： 100 mg の範囲で選ばれる。あるいは、患者あたり 10- 2000 mg、好ましくは 100- 1000 mgの投与量を選ぶことができる。 - 本発明の固形癌治療剤は、投与経路次第で医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであつても良い。

このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビエルアルコール、ポリビュルピロリドン、カノレポキシビニノレポリマー、カノレポキシメチノレセノレロースナトリウム、 'ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチノレセノレロース、ェチノレセノレロース、キサンタンガム、ァラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（HSA ) 、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜あるいは組合せて選択されるが、これらに限定されるものではない。

本発明の治療対象疾患としては、標的とする腫瘍細胞上に本発明で使用される抗体が結合する抗原が存在する造血器腫瘍を'除く固形癌である。具体的には、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、腌臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宫体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌、悪性骨腫瘍などが挙げられる。また、これら固形癌の転移ならびに転移巣、固形癌に伴うがん性胸膜炎、がん性腹膜炎、がん性髄膜炎なども挙げられる。本発明の治療剤は、これら造血器腫瘍を除く固形癌の治療剤として有用である。実施例

次に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1. 抗 HM1.24抗体の固形癌細胞株に対する反応性

1. フローサイトメトリ一解析

ヒト孚 L癌細胞株 MCF7 (ATCC HTB-22) および MDA— MB— 231 (ATCC HTB-26) 、ヒ卜大腸癌細胞株 COLO 205 (ATCC CCL-222) および WiD r (ATCC CCL-218) 、ヒ卜腌臓癌細胞株 BxPC-3 (ATCC CRL-1687) 、ヒト子宮頸癌細胞株 UCC-5 (実験動物中央研究所）、ヒト腎臓癌細胞株 Caki - 1 (ATCC HTB-46) 、ヒト卵巣癌細胞株 PA- 1 (ATCC CR L-1572) を用いた。

これらの細胞について、それぞれ約 1X10⁶個の細胞を、 80 Lの F ACS/PBS (1 gのゥシ血清アルブミン（SIGMA社製）を 1 Lの CellWAS H (Becton Dickinson社製）に溶解して調製）に懸濁後、 200 μ g/m Lの蛍光標識ヒトイ匕抗 HM1.24抗体 (NHS-fluorescein (PIERCE社製 ) にて、ヒト化抗腿 1.24抗体を標識して調製）または蛍光標識ヒト IgGl (NHS - fluoresceinにてヒト IgGl (SIGMA社製）を標識して調製）または FACS/PBSを 20/zL加え、氷上にて 30分間反応させた。 1 m Lの FACS/PBSにて 2回洗浄後、 1 mLの FACS/PBSに懸濁し、フローサイトメーター（EPICS XL、 BECKMAN COULTER社製）にて細胞の蛍光強度を測定した。

2. 結果

抗 HM1.24抗体は全ての細胞株に対し、反応性を示した（図 1、図 2及び図 3 ) 。

実施例 2. 固形癌細胞株に対する抗 HM1.24抗体による ADCC活性

ADCC活性の測定は Current protocols in Immunology, Chapter 7 . Immunologic studies in humans , Editor , John E, Col igan et . al. , John Wiley & Sons, Inc. , 1993の方法に従った。

1. 標的細胞の調製 "

ヒ卜乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HTB-22) および MM - MB - 231 (ATCC HTB-26) 、ヒ卜大腸癌細胞 ftCOLO 205 (ATCC CCL-222) および WiD r (ATCC CCL-218) 、ヒト子宮頸癌細胞株 UCC- 5 (実験動物中央研究所）、ヒト卵巣癌細胞株 PA-1 (ATCC CRL-1572) を標的細胞として用いた。

各細胞を 96ゥヱル平底プレート（Becton Dickinson社製）に 3X1 0³/ウエノレ（C0L0 205および WiDrま 2X10³/ウエノレ、 UCC5iま 5X10³/ ゥヱル、 PA- 1は 1X10³/ゥエル）播種し、 3日間培養した。培養後、 " ¹ Cr-sodium cnromat e ( Amersham Pharmacia Biotecn|i¾¾) を添加し終濃度を 50μ Ci/mLとし、 37°Cにて 1時間培養することにより放射性標識した。標識後、細胞を 10%ゥシ胎児血清（FBS、 HyClone社製）を含む RPMI1640培地（GIBC0社製）にて 1回洗浄し、同培地 50 Lを添加し、標的細胞とした。

2. エフヱクタ一細胞の調製

健康成人ポランティアの末梢血から Ficoll- Paque^TM PLUS (Amer sham Pharmacia Biotech社製）を用いて単核球を分離した。 10%FBS 含有 RPMI1640培地にて細胞濃度を lXl0⁷/mLに調製し、ェフクタ一細胞とした。 3. ADCC活性の測定

ヒト化抗 HMl.24抗体またはヒト IgGlを 10%FBS含有 RPMI1640培地にて希釈し、標的細胞に 50μ Lずつ加え、氷上にて 15分間反応させた。次にエフェクター細胞を 100 μ L加え、炭酸ガスインキュベーター内で 37°Cにて 4時間培養した。抗体の終濃度は 0または 10 μ g/mLとした。培養後、上清を 100 μ L回収し、ガンマカウンター（COBRAIIAUT 0_GAMMA、 MODEL D5005、 Packard Instrument Company社製）にて放射活性を測定した。 ADCCによる細胞傷害活性を以下の計算式により求めた。なお、最大遊離放射活性は、標的細胞に ·1 %NP- 40 (半井社製）を加えることで細胞を破壊して測定した。細胞傷害活性（％ ) は、（A-C)/(B- C) X100で計算した。なお、 Aは抗体存在下において遊離された放射活性（cpin) 、 Bは NP-40により遊離された放射活性（cpin) 、 Cは抗体を含まず培養液のみで遊離された放射活性（c pm) である。

4. 結果

ヒ卜ィ匕抗 HM1.24抗体は MCF7、 MDA— MB 231、 C0L0 205、 WiDr、 UCC— 5、 PA- 1に対して、 ADCC活性を示した（図 4 ) 。

参考例 1. ラットミエロ一マ YB2/0でのヒト化抗 HM1.24抗体の発 lO tgのヒト化抗 HM1.24抗体発現ベクター（AHi/N5KGlV - lark, Ba rnett , R. S. et al. Antibody Production in Chinese Hamster Ov ary Cells Using an Impaired Selectable Marker. In: Wan , H. Y . & Imanaka, T. ( eds ) ACS Symposium Series Vol 604： Ant ibody Expression and Engineering, 27, 1995， W0 98/4580) を 2X10⁶Z 0.6 mL PBS (-)の YB2/0 (ATCC CRT- 1662) へ、エレクトロボレ一シヨン法で 1.5kV， 25 μ Fの条件で導入した。培養は 5% C02インキュべ一ター内で 37°Cで行った。 10% FCSを含む RPMI1640培地（Gibco社）に 400 μ g/mL Geneticin をカロえて選択した後、 50 nM MTX, 100 nM MTX， 200nM MTXと順次 MT X濃度をあげ、遺伝子増幅を行った。また、 96ゥエルプレート（Fal con社）に 200nM MTX、 400 μ g/mL Gene t ic inを含む 10% FCS/RPMI164

0中、 0.5 cells I 100 iL / wellで蒔きこみ、限界希釈法にて細胞のクローニングを行った。

ヒト化抗ヒト HM1.24抗体遺伝子を導入した YB2/0細胞の培養上清は参考例 2で示す ELISAにより定量した。

参考例 2. ヒト化抗 HM1.24抗体の定量（ELISA法）

96—ウエノレ ELISA用プレート（Nunc社製）にコート緩衝液（100mmol/L 炭酸水素ナトリウム， pH9.6)で 100ng/ml程度に希釈した可溶型 HM1 .24抗原を IOO Lずつ添加し、 4°Cで 1晚以上反応させた。反応後、 1 % BSA-PBSを 200 L/ゥエルで加え室温で約 2時間放置し、作製したプレートは 4°Cで保存した。 1%BSA- PBSを転倒除去した後、各 wellを Tween- PBSで洗浄した。

適宜希釈したヒト化抗 HM1.24抗体標準液又はサンプル溶液と 100η _g/mLに希釈したピオチン標識ヒト化抗 HM1.24抗体を 1:1で混ぜた後、 lOO/zL/wellで分注した。室温で、約 1時間反応させた後、各ゥエルを Tween- PBSで洗浄した。了ビジン標識 HRPを各ゥエルに添加し、室温で 15分以上反応させ、 TMB liqid(Sigma社製）を 100μ L/ゥェルで加え、 2 mol/L硫酸を 50/z'L/ゥエル加えることにより反応を止めた後、 450nmの吸光度を測定した。ヒト化抗 HM1.24抗体標準液の濃度一吸光度の検量線から、サンプル溶液のヒト化 HM1.24抗体濃度を算出した。

参考例 3. YB2/0で発現させたヒト化抗ヒト HM1.24抗体の精製ヒト化抗 HM1.24抗体の発現が確認された細胞は、 1700cm²のローラーボトル（CORNING社）で拡大培養を行った。すなわち IX 10⁹個のヒト化抗 HMl.24抗体発現 YB2/0細胞を 400mLの 200nM MTX、 400 μ g/ mL ゲンタマイシンを含む 10% FCS/RPMI1640培地で（2.5rpm)でコンフルェントになるまで培養した。その後、培養上清の回収用に FCS を PBS (-）で平衡化した rProteinA FF( AmershamPharmacia社）を予め素通りさせることでゥシ由来 IgGを除き（FCS (-））、この FCS (-)を用レヽた 200nM MTX、 400 μ g/mLゲンタマイシンを含む 10%FCS (—）/ RPMI 1640培地で 3〜 4日間培養した。

培養上清は 0.22 μ mフィルター処理した後、 rProteinA FF(PBS/PB S -クェン酸：リニアグラジェント溶出）および Sourcel5S (20mM酢酸、 0-0.5mM NaCl:リニアグラジェント溶出）で精製した。精製したヒト化抗 HM1.24抗体は HM1.24抗体 - YBと名付けた（図 5 )。

参考例 4. Ml .24抗原（ BST- 2 )を発現する CH0細胞の作製

HM1.24抗原蛋白質を発現する CH0細胞を次のようにして作製した（ Ohtomo T. et al. ， Biochemical and Biophysical Research し ommu nications 258(1999) , 583 - 591)。即ち、 DHFRを欠損した CHO細胞株に、 HMl.24抗原をコードする発現ベクター p3.19 (上記文献）を導入し、 500 μ g/mlの G418で選択し、さらに限界希釈法により HM26、 H M31、 HM21及び HM36の 4つの細胞株を得た。細胞表面上の HM1.24抗原の発現数は特願 2001 - 115889に記された方法にてフローサイトメトリーで測定したところ、それぞれ細胞あたり 3.8X10³、 2.2X10 , 2.2 X 10⁴及び 1.8 X 10⁵個であった。

参考例 5. ヒト末梢血由来 PBMCを用いた ADCC活性の測定

( 1 ) ヒト PBMC溶液の調製

'健常人よりへパリン加採血した末梢血を、 PBS (-)で 2倍に希釈し、 Fi col 1-Paque™ PLUS (Amer sham Pharmacia Biotech AB)に重層した。これを遠心（500Xg、 30分間、 20°C) した後、単核球画分である中間層を分取した。 3回洗浄後、 10% FBS/RPMIに懸濁し、ヒト PBM c溶液とした。

( 2 ) 標的細胞溶液の調製

参考例 4に示した HM1.24抗原（BST- 2)を発現する CH0細胞は、細胞剥離緩衝液（Invitrogen Corp )を用いてディッシュから剥離し、 10% FBS/RPMI 200 /zUこ、浮遊し、 5.55MBqの Chromium— 51をカロえ、 5%炭酸ガスィンキュベータ中 37°C1時間培養した。この細胞を 3回洗浄した後、 10%FBS- RPMI1640培地中個々の細胞濃度に調製し、標的細胞溶液とした。

( 3 ) クロム遊離試験（ADCC活性） - 標的細胞溶液を 96ゥエル U底プレートに 50 Lずつ分注し、各濃度に調製した抗体溶液 50 Lを添加し、氷上で 1時間反応させた後に、ヒト PBMC溶液: 100/iLを力 [1え、 5%炭酸ガスインキュベータ中 37°C4時間培養し、培養後培養上清 100 zL中の放射活性をガンマ力ゥンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。

特異的クロム遊離率（％) = (A - C)X100パ B-C)

Aは各クエルにおける放射活性（cpm)の平均値、 Bは標的細胞浮遊液を 50 L、 10%NP - 40水溶液（Nonidet (商標） P-40, ナカラィテスク社製）を 20 zL、 10%FBS/RPMI培地を 130 _μ L添カ卩したウエノレにおける放射活性（cpm)の平均値、 Cは標的細胞浮遊液を 50μし、 10%FBS/ RPMI培地を 150 μ L添加したゥルにおける放射活性（ cpm)の平均値を示す。

参考例 6. β ガラクトシダーゼ安定発現 CH0細胞株を用いた ADCC 活性測定法

エフヱクタ一細胞として健常人の末梢血より比重遠心法で分離した単核球を用いた。すなわち、健常人の末梢血に等量の PBSを加え、 Ficoll-PaquePLUS(Pharmacia)に積層し、 500gで 30分間遠心した。単核球相を分取し、 10%FCSを含む RPMI1640で 3回洗浄後、 10%F CSを含む α - MEMで細胞数が 5xl0⁶/mLになるように調製した。

トリプシン一 EDTAで剥がし、 10%FCSを含む a -MEMで懸濁した 2x1 0⁵ 細胞 ZmLの；3ガラクトシダーゼ安定発現 CH0#30細胞株 50μ Lと、様々な濃度の抗 HM1.24抗体 50 しを 96ゥエル U底プレートに加え、 4 °Cで 15分間反応させた。ついでエフェクター細胞 100 β Lを加え、 37°Cで 4時間培養した。培養後、 20 /iLの培養上清を採取し、 β ガラタトシダーゼ活性を測定した。最大遊離酵素量は Galactone- star アツセィキットの細胞溶解緩衝液により遊離される酵素量とした。細胞傷害活性は、 ·

細胞傷害活性（％) = (A-C) X100/(B-C)

(% β —ガラクトシダーゼ）

として計算した。ここで Αは抗体存在下において遊離された βガラクトシダーゼ活性（RLU/sec)、 Bは細胞溶解緩衝液により遊離された ι8ガラクトシダーゼ活性（RLU/sec)、 Cは抗体を含まず培養液のみで遊離された β ガラクトシダーゼ活性（RLU/sec)を示す。

参考例 7. YB2/0由来ヒト化抗ヒト HM1.24抗体の ADCC活性の測定 YB2/0で発現させた HM1.24抗体（HM1.24抗体- YB) の ADCC活性を参考例 5の方法にて測定した結果を図 6〜図 7に示した。図 6に示したように、いずれの標的細胞においても、 HM1.24抗体- YBは、 DG44 (DHFR欠損 CH0細胞： Urlaub, G. et al. (1986) Effect of Gamma Rays at the Dihydrof olate Reductase Locus： Deletions) and In versions. Somatic Cell and Molecular Genetics, 12: 555 , 1986 ) で産生した HM1.24抗体（随 1· 24抗体- DG44) よりも高い ADCC活性を示しに。

具体的には、より低濃度で ADCC活性の誘導が認められ、最大の AD CC活性にも向上が見られた。特に HM1.24抗原の発現数が少ない標的細胞 HM26， HM31を用いた場合、 HM1.24抗体- DG44では非常に低い ADC C活性しか示さなかったのに対して HM1.24抗体- YBでは高い ADCC活性が出現した。また、図 7に示したように、標的細胞数に対する PBMC 数の割合（E/T比）が 25の時のみならず、 E/T比が 5の場合も HM1.24抗体 - YBは HM1.24抗体- DG44よりも高い ADCC活性を示した。

参考例 8. 糖鎖の解析

1. 2-アミノビリジン標識糖鎖（PA化糖鎖）の調製

本発明の YB2/0由来抗体、及び対照試料として CH0由来の.抗体に、 N-グリコシダーゼ F(Roche)を作用させ、糖鎖を蛋白質から遊離させ 7こ (Weitzhandler M. et al. , Journal of Pharmaceutical icien ces 83:12(1994), 1670-1675)。セルロースカートリッジ（TAKARA製 )を用いた固ネ目抽出（Shimizu Y. et al. , Carbohydrate Research 3 32(2001) , 381- 388)により脱塩した後濃縮乾固し、 2-アミノビリジンによる蛍光標識を行った（Kondo A. et al.， Agricultural and B iological Chemistry 54:8(1990), 2169-2170)。得られた PA化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製 PA化糖鎖とした。

2. 精製 PA化糖鎖の逆相 HPLCによる分析

上記参考例 8の 1項の方法で、本発明の YB2/0由来抗体、及び対照試料として CH0由来の抗体について PA化糖鎖の調製を行った後、 0DS カラム（TAKARA製 Palpak Type R)による逆相 HPLC分析を行い、クロマトグラムを比較した。 CH0由来抗体の糖鎖に比較して、 YB2/0由来抗体の糖鎖は、 20分から 35'分までに溶出するフコース無しと推定される糖鎖（A-D)のピーク増加が確認された（図 8 )。

' 3. 精製 PA化糖鎖の二次元マッビングによる分析

上記参考例.8の 1項の方法で、本発明の YB2/0由来抗体について PA 化糖鎖の調製を行った後、 0DS力ラムによる逆相 HPLC分析及びァミンカラム（TAKARA製 Palpak Type N)による順相 HPLC分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施した。具体的には、ァミンカラムによる順相 HPLCで、精製 PA化糖鎖のメインピークを粗分画し、各分画を逆相 HPLCにて分析した。

各糖鎖の同定は、 PA化糖鎖標準品（TAKARA製、ホーネン製、生化学工業製；図 9の K， 0， Pを除く）との HPLCにおける溶出位置の比較及び T0F- MSによる分子量確認にて行った。同定された各糖鎖の相対比を第 1表に示す（J， Kの区別及び N， 0の区別は本参考例においては行っていない）。また、表 1に示す糖鎖の構造を図 9及び図 10に示す。この結果本発明の YB2/0由来抗体は、フコ^"スの無い糖鎖が 3 0%以上存在し、且つパイセクティング GO L

COlcNAcを持つ糖鎖が存在することが確認された。 O 糖鎖グループ各糖鎖相対比各グループ相対比

A - Fuc， -Bisecting GlcNAc 17.7% 33.5%

B 9.9%

C

D 1.9%

E +Fuc， -Bisecting GlcNAc

55.2%

F 21.4%

G

H 5· 4%

I - Fuc , +Bisect ing GlcNAc 2· 0% 3.3%

J (K)

Μ +Fuc , +Bisect ing GlcNAc 3.7% 8..0%

Ν(Ο) 4.2%

参考例 9. ヒト GnTIII発現ベクターの作製

ヒト GnTIII遺伝子配列は NCBIデーターベース（ACCESSION D13789 ) より入手した。配列は GENETYX- SV/RCで解析し、繰返し配列が多いことから、 PCRによる増幅を容易にする目的で、サイレント変異を複数箇所導入したプライマーをデザィンし、 PCRによる合成にて取得した。 PCRには KODポリメラーゼ（T0Y0B0社）を用い、塩基番号 801から 870までの二本鎖を最初の铸型とし、下に示すプライマーを用いて順次、 PCRを行った。下記のプライマー配列において、大文字はサイレント変異を導入した塩基を示す。また、数字は翻訳開始部位からの何塩基目かを示す。図 11は、 GnTI I I 遺伝子に対する各プライマーの位置を示す。

化 1

フォワードプライマー

Initial (BamHI ) ： TTTCTCGAGatgagacgc tacaagc tc 11 tc tcatgt tc

1~97： atgagacgctacaagctctttctcatgttctgtatggccggcctgtgcctcatctccttcctgcacttcttcaagaccctgtcctatgtcaccttcc

78-177 :cctgtcctatgtcaccttcccAcgagaactggcctccctcagccctaacctggtgtccagctttttctggaacaatgccccggtcacgccccaggccagc 158-259 icggtcacgccccaggccagcccrgagccaggaggccctgacctgctgcgtaccccactctactcccactcgcccctgctgcagccgctgccgcccagcaagg - 239-331： agccgctgccgcccagcaaggcggccgaggagctccaccgggtggacttggtgctgcccgaggacaccaccgagtatttcgtgcgcaccaagg

312-409： gtatt tcgtgcgcaccaaggcTggAggcgtc tgct tcaaacccggcaccaagatgctggagagAccgccrccgggacgAccggaggagaagcctgagg 390-472： AccggaggagaagcctgagggggccaacggAtcctcggcCcggcgAccaccccggtacctcctgagcgcccgggagcgcacgg

453-556 : gagcgcccgggagcgcacggggggccgaggTgcAcgAcgcaag tgggtggagtgcgtgtgTc tgcccggAtggcacggacccagc tgcggcgtgcccactgtgg

535-618： agctgcggcgtgcccactgtggtgcagtaTtccaacctgccTaccaaggagcggctggtgcccagggaggtgccgcgccgcgtc

598-696： agggaggtgccgcgccgcgtcatTaargcTatcaacgtcaaccacgagttcgacctgctggacgtgcgcttccacgagctgggcgacgtggtggacgcc

677-777： tgggcgacgtggtggacgcctt t tggtgtgcgagtccaac ttcacggc ttatggggagccgcggccgctcaagttccgggagatgctgaccaatggcacc 58-820： agatgctgaccaatggcaccttcgagtacatccgccacaaggtgctctatgtcttcctggacc '

801-870： gctctatgtcttcctggaccacttTccTccTggAggAcgAcaAgaTggAtggatcgccgacgactacctg

化 2

リパ一スプライマー

End(Hindlll) ： TTTAAGCTTActagacttccgcctcgtccagtttTcc

159ο- 1488= c tagact tccgcctcgtccagt tt iccccgAgcAggcggTct tec i tcAggacccct tggcgccaTccTcccgcAgccgt c tec tgggc tec tggtaggg ttgtcc 1508-1407： ggctcctggtaggggttgtccagAaggtagtggaaccggtcgtagttcttcagcaggtacttgggcgcatacatgtgctcgctggggtctgcaggcgggtac

142 -1324： ctggggtctgcaggcgggtactcTtgctgcgtgccgtcgaaccagcccccggtgcggatcaggccgcggatgtagttcaggtcccgcttgtcctcgtagtcacc

1264-1162： tgaagcaccaggagcagtgccagccggcgaagtgAagggggctgcccagcgaccac tgcaccaggatgtgTccggtgcggt tct catac tgtctgaagt tgg 1182-1084： ctcatactgtctgaagt tgggcatggtgtagtaTtggcggcggcgcaggcggatgccgtccagcccatacactgcct cagcatgtccacc tgcagcc

1103-1004： agcatgtccaccgtgcagcctgacaccacctccagggtgcccggTtgct ccaAaagaaTccgtagagcgacgtgcgcatgtggaaggcgaagggctcgg

1023-922： gtggaaggcgaagggctcggtccagccatcgtagagcttgaggaaCaggacgccgtcacgggccgggatctcgtccgcatcgtcaatgatgaagacgtcgtc

941-851： tcaatgatgaagacgtcgtcgggccgcaggttgcgcagccgcgagacgccgtcctgggtgaggaaggtgcgcaggtagtcgtcggcgatcc

870-801： caggtagtcgtcggcgatccaTccAtcTtgTcgTccTccAggAggAaagt gtccaggaagacatagagc

320-241 acgaaatactcggtggtgtcctcgggcagcaccaagtccacccggtggagctcctcggccgccttgctgggcggcagcgg

Bam— 359 TTTggaTccgttggccccctcaggcttctcctccggTcgtcccggAggcggTctctccagcatcttgg

必要に応じて増幅断片をァガロースゲル電気泳動して、目的靳片をゲルから切り出して精製したものを次の PCRの铸型とした。最終的に PCRのみで全長を増幅することが困難であったため、予めブライマ一内にサイレント変異として挿入しておいた BamHI部位を用いて、その前後の断片を増幅後に連結することにより、全長ヒト GnTI II遺伝子を取得した。図 15〜図 19に、生来型ヒト GnTIII をコードする塩基配列（配列番号： 30) (GnTIII ori.nuc) と変異型ヒト GnT III をコードする塩基配列（配列番号： 31) (GnTIII mut.nuc) と対比を示す。図中、星印は、両配列の対応する塩基が同一であることを示す。

ヒ卜 GnTIIIは、 pcDNA3. l(Hygro-) ( Invitrogen†± ) の Xhol/Hindl II部位に耝込み、配列を確認した。

参考例 10. HM1.24抗体- DG44発現 CH0細胞での GnTIIIの発現

上記参考例 9で得られた 10 μ gの GnTIII/pcDNA3. l(Hygro- )を HM1.2 4抗体- DG44発現 CH0株にェレクトロポレーション法で 1.5kV, 25 F の条件で導入した。培養は 5% C02インキュベーター内で 37°C で行つた。 96ゥヱルプレート（Falcon社）に、 10% FCSを含む IMDM培地 (Gibco社）を用いて、 10細胞/ 100 μ L/wellで蒔きこみ、 2日間培養した。 400 μ g/mLハイグロマイシンを含む 10% FCS- IMDM培地に代え、 1〜2週間、細胞の選択を行った。ハイグロマイシン耐性コロニーが出現し、増殖の認められた細胞の培養上清を回収し、ヒト化抗 HM1.24抗体抗体量を参考'例 2の ELISA法により測定した。

参考例 11. GnTI II発現ヒト化抗匪 1.24抗体産.生 CH0細胞の ADCC活性によるスクリーニング

GnTIIIを強制的に発現させたヒト化抗丽 1.24抗体産生細胞（クローン Νο·1〜31) に由来するヒト化抗 HM1.24抗体及び HM1.24'抗体- DG4 4の培養液を抗体濃度 400ng/mlに培地を用いて希釈し、参考例 6に示した方法を用いて ADCC活性を測定し比較した（図 12) 。

最終的に ADCC活性とヒト化抗 HM1.24抗体発現量および増殖速度を考慮してスクリーニングを行い、クローン No.6 (57B2) を得た。

参考例 12. GnTIII発現 CH0細胞由来ヒト化抗 HM1.24抗体の ADCC活性の測定

GnTIIIを強制的に発現させたヒト化抗 HM1.24抗体産生細胞に由来するヒト化抗 HM1.24抗体の ADCC活性を参考例 5の方法にて測定した結果を図 13に示した。クローン No.3， No.6 (57B2) と HM1.24抗体 - D G44を比較した結果、いずれのクローンも HM1.24抗体 -DG44よりも高い ADCC活性を示した。

Claims

請求の範囲

1 . 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片を有効成分として含有する固形腫瘍治療剤。

2 . 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項 1に記載の治療剤。

3 . 前記抗体が、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体である、請求項 1 に記載の治-療剤。

4 . 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体である、請求項 1 に記載の治療剤。

5 . 前記抗体がヒト抗体である、請求項 1 に記載の治療剤。

6 . 前記抗体断片が、 Fab、 Fab' 、 F ( ab' )₂ または Fv断片である、請求項 1〜 5のいずれか 1項に記載の治療剤。

7 . 前記固形腫瘍が、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、腌臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌もしくは悪性骨腫瘍、またはこれらの固形癌の転移癌である、請求項 1〜 6のいずれか 1項に記載の治療剤。

8 . 固形腫瘍治療剤の製造のための、配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片の使用。

' 9 . 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項 8に記載の使用。

10. 前記抗体が、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体である、請求項 8に記載の使用。

11. 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体である、請求項 8に記載の使用。

12. 前記抗体がヒト抗体である、請求項 8に記載の使用。

13. 前記抗体断片が、 Fab、 Fab' 、 F ( ab' )₂ または Fv断片である、請求項 8〜12のいずれか 1項に記載の使用。

14. 前記固形腫瘍が、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、膝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、 ·膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌もしくは悪性骨腫瘍、またはこれらの固形癌の転移癌である、請求項 8〜 13のいずれか 1項に記載の使用。

15. 配列番号 2に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質に特異的に結合する抗体または抗体活性を維持している抗体断片を治療を必要とする対象に投与することを含んで成る固形腫瘍の治療方法。

16. 前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項 15に記載の方法。

17. 前記抗体が、ヒト抗体の定常領域とマウス抗体の可変領域とから成るキメラ抗体である、請求項 15に記載の方法。

18. 前記抗体が、マウス抗体の相補性決定領域とヒト抗体のフレームワーク領域および定常領域とから成るヒト化抗体である、請求項 15に記載の方法。

19. 前記抗体がヒト抗体である、請求項 15に記載の方法。

20. 前記抗体断片が、 Fab、 Fab' 、 F ( ab' ) ₂ または Fv断片である、請求項 15〜19のいずれか 1項に記載の方法。

21. 前記固形腫瘍が、頭頸部癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、食道癌、乳癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、胆道癌、腌臓癌、卵巣癌、子宫頸癌、子宮体癌、前立腺癌、腎臓癌、膀胱癌、皮膚癌、脳腫瘍、小児固形癌もしくは悪性骨腫瘍、またはこれらの固形癌の転移癌である、請求項 15〜 20のいずれか 1項に記載の方法。