WO2005033674A1 - Detektion von nanopartikeln - Google Patents

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WO2005033674A1
WO2005033674A1 PCT/EP2004/010191 EP2004010191W WO2005033674A1 WO 2005033674 A1 WO2005033674 A1 WO 2005033674A1 EP 2004010191 W EP2004010191 W EP 2004010191W WO 2005033674 A1 WO2005033674 A1 WO 2005033674A1
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nanoparticles
sensor
peptides
biomolecules
signal
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Daniel Hoffmann
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Stiftung Caesar Center Of Advanced European Studies And Research
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    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/06—Investigating concentration of particle suspensions
    • G01N15/0606—Investigating concentration of particle suspensions by collecting particles on a support
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/55—Specular reflectivity
    • G01N21/552—Attenuated total reflection
    • G01N21/553—Attenuated total reflection and using surface plasmons
    • G01N21/554—Attenuated total reflection and using surface plasmons detecting the surface plasmon resonance of nanostructured metals, e.g. localised surface plasmon resonance

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of particles in aqueous solution, in particular inorganic particles or particles which, like soot, cannot be termed “biological” and whose size is in the range of nanometers (nanoparticles), the detection not by means of a specific binding to proteins and
  • the invention also relates to a device for carrying out the method.
  • nanotechnology is a young field, it represents a dynamically developing scientific and economic branch.
  • the main focus is the controlled production of structures on the length scale of a few nanometers, with inorganic nanoparticles often being used as building blocks.
  • These nanoparticles are inorganic and other “non-biological” particles, ie nanoparticles that do not have any biological macromolecules.
  • nanotechnology it is still a major problem to quantitatively detect the nanoparticles that are produced Methods such as transmission electron microscopy to detect nanoparticles on a laboratory scale, however, there is no known inexpensive method with which the occurrence of nanoparticles can be monitored on a larger scale.
  • BESTATIGUNGSKOPIE It is therefore an object of the present invention to provide a method for the detection of such nanoparticles, which are not to be referred to as biological, which can be implemented with simple means and which allows fast and reliable measurements of the concentration of the nanoparticles. It is also an object of the invention to provide a device for implementing the method.
  • biomolecules in particular peptides
  • detection of these nanoparticles takes place through the binding of the nanoparticles to the peptides on a sensor and the computational evaluation of the sensor signal with a view to determining the quantity and size distribution of the nanoparticles Detection does not take place by means of a specific binding to proteins and / or nucleic acid in the nanoparticles.
  • the areas of application for the invention are diverse: for example, it can be assumed that nanoparticles are taken up by humans and then, similar to what is suspected for soot, trigger harmful biochemical and biological processes.
  • the extent of the biological effect depends on the amount and type of particles.
  • suitable protective measures such as the elimination of leaks
  • these two variables should be monitored in the vicinity of potential sources of nanoparticles, which enables the invention.
  • the monitoring of nanoparticles in aqueous solution is particularly interesting, which corresponds to a simple model of the situation on mucous membranes.
  • the mucous membranes form a biological structure through which nanoparticles can be absorbed into the body.
  • detection for quality control purposes in production is also of economic interest. For example, it may be desirable to produce certain size monodisperse nanoparticles. A measurement of the size distribution can then be used to control particle production.
  • peptides for predetermined nanoparticles are selected using methods of directed evolution, for example the “phage display”, which bind these nanoparticles firmly and specifically.
  • the peptides are then immobilized on the surface of a sensor before the actual detection takes place.
  • the solution is then applied to the sensor surface by means of a fluid, where the nanoparticles are specifically bound by the immobilized peptides and detected by the sensor.
  • the level of the sensor signal is recorded in equilibrium, but the increase in the signal upon binding of the nanoparticle and the fall of the signal when rinsing with a particle-free solution are also recorded determined by calculation.
  • the measurement on the solution carrying the particles is compared with a standard, for example with a reference measurement on a sensor of the same design on a particle-free solution or on solutions with a known particle content.
  • a reference measurement on a sensor of the same design on a particle-free solution or on solutions with a known particle content By rinsing with a particle-free solution, bound nanoparticles are removed again before the sensor is available for further measurements.
  • Figure 1 shows schematically a detector
  • Figure 2 schematically shows the surface of a detector
  • the peptide molecules P are coupled via their amino end to polyethylene glycol (PEG) or alkyl chains, which in turn are bound to the gold surface of the sensor chip via SH functions.
  • the following embodiment shows how the method according to the invention for the detection of GaAs particles by means of microbalance sensors can be used.
  • peptides that specifically bind GaAs are selected using the phage display method. This step, which is known per se, leads to peptides such as, for example, the peptide with the sequence RLELAIPLQGSG, which binds specifically to GaAs (100) surfaces (Whaley et al. 2000 Nature 405: 665).
  • This peptide is synthesized in and coupled on a microbalance to at least two sensor elements, one for the actual measurement and one for reference.
  • the microbalance has a gold surface which is prepared by covering with “soap-assembled monolayers” made of bifunctional alkyl chains or with a layer of bifunctional polyethylene glycol ( PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • One of the two functions is an SH function, the other an OH or carboxyl function.
  • the alkyl chains react with the gold surface via the SH group.
  • the above-mentioned peptide is via its amino end coupled with the carboxyl groups of the PEG or alkyl chains
  • Figure 2 shows a schematic representation of the surface of the sensor after immobilization of the peptides.
  • GaAs nanoparticles are now passed in aqueous solution through a flow cell (Liss et al. 2002 Anal. Chem. 74: 4488) over the sensor. They are bound by the peptides on the sensor surface.
  • the microbalance signal is accumulated over a period of time, the length of which depends on the concentration of the nanoparticles.
  • the flow cell is decoupled from the flow of the particle-containing solution and rinsed with particle-free solution. The drop in the signal is registered and is used to calculate the distribution of the nanoparticle sizes, as described below:
  • s 0 for the microbalance is proportional to the total mass of the bound nanoparticles, which results from the mass m of the individual particle and the amount N. So ⁇ N m (2)
  • m const pa 3/2 , where a is the interaction surface between the nanoparticle egg and the substrate.
  • the distribution of interest N (a) of the particle sizes can be calculated numerically from Eq. 5 on the basis of the measured curve of s (t) and after determining the constant on the right-hand side by means of calibration measurements or model calculations.
  • the numerical evaluation can be carried out by discretization at intervals of a followed by a "singular value decomposition".
  • the measurement signal s (t) or the distribution N (a) calculated therefrom can then be used for monitoring purposes.
  • optical methods can also be used for the detection.
  • the optical detection described below is less suitable for the detection of nanoparticles that interfere with the fluorescence of a group in a peptide that is used for the detection.
  • peptide A a peptide which specifically binds the nanoparticles to be detected.
  • Peptide A is immobilized as described.
  • peptide B a further peptide is created, which must meet the following conditions: it must also bind the nanoparticle specifically, it must not bind the surface on which peptide A is immobilized and it must contain a fluorophore.
  • the same protocol can be used as for the creation of peptide A, in particular a phage display with a selection for the binding of the desired nanoparticle egg.
  • an additional step is built into the selection: only those phages are amplified that do not bind to a surface, as shown in Fig. 2.
  • the fluorophore in peptide B can be realized, for example, by subsequent modification with suitable fluorophores (Dansyl, Alexa TM, Cascade Blue, etc.) or by a tryptophan, which must be contained in all elements of the phage library. In the latter case, the fulfillment of the first two Conditions tested after modification. If necessary, further modifications are carried out until all three conditions are met.
  • the nanoparticle-containing solution is then passed over the immobilized peptides A by means of a flow cell, as shown above.
  • the detection is again carried out by a microbalance or by surface plasmon resonance.
  • Peptides B are used to further increase the sensitivity of the method.
  • a solution containing peptides B is also passed into the flow cell for this purpose.
  • Peptides B bind to the nanoparticles that have already been bound by the immobilized peptides A. Then it is rinsed with a solution that contains neither nanoparticles nor peptides B. With the start of this rinsing process, the fluorescence of the peptides is optically excited via direct irradiation or surface plasmons and also optically detected. In this way, nanoparticles can be detected even at lower concentrations.

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Abstract

Verfahren zur Detektion von in wässriger Lösung befindlichen Partikeln, deren Grösse im Bereich von Nanometern liegt (Nanopartikel), wobei die Detektion nicht vermittels einer spezifischen Bindung an Proteine und/oder Nucleinsäure in den Nanopartikeln geschieht, wobei Biomoleküle, insbesondere Peptide, gewonnen werden, die an die Substanz und damit an die Nanopartikei spezifisch binden, wobei die Biomoleküle auf die Oberfläche eines Sensors immobilisiert werden, der geeignet ist, eine massenabhängige Grösse zu detektieren, wobei die wässrige Lösung von Nanopartikeln über die Oberfläche des Sensors geleitet wird, wobei ein Signal des Sensors registriert wird, wobei die Oberfläche des Sensors mit einer Standardlösung gespült wird, wobei eine Änderung des Signals registriert wird, und wobei aus dem Verlauf des Sensorsignals die Menge N(a) der Nanopartikei bestimmt wird.

Description

Detektion von Nanopartikeln
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion in wässriger Lösung befindlicher Partikel, insbesondere anorganischer Partikel oder wie Ruß nicht als „biologisch" zu bezeichnender Partikel, deren Größe im Bereich von Nanometem liegt (Nanopartikei), wobei die Detektion nicht vermittels einer spezifischen Bindung an Proteine und/oder Nucleinsäure in den Nanopartikeln geschieht. Die Erfindung betrifft gleichfalls eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.
Die Nanotechnologie ist zwar ein junges Gebiet, stellt aber einen sich dynamisch entwickelnden Wissenschafts- und Wirtschaftszweig dar. Im Vordergrund steht dabei die kontrollierte Herstellung von Strukturen auf der Längenskala einiger Nanometer, wobei als Bausteine häufig anorganische Nanopartikei eingesetzt werden. Bei diesen Nanopartikeln handelt es sich und anorganische und sonstige „nicht-biologische" Partikel, also um Nanopartikei, die keine biologischen Makromoleküle aufweisen. In der Nanotechnologie ist es jedoch nach wie vor ein großes Problem, die erzeugten Nanopartikei quantitativ zu detektieren. Es gibt zwar Methoden, wie z.B. die Transmissions-Elektronenmikroskopie, um Nanopartikei im Labormaßstab zu detektieren, es ist jedoch kein preiswertes Verfahren bekannt, mit dem das Vorkommen von Nanopartikeln in größerem Umfang überwacht werden kann.
BESTATIGUNGSKOPIE Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, ein Verfahren zu Detektion von solchen als nicht biologisch zu bezeichnenden Nanopartikeln zu schaffen, das sich mit einfachen Mitteln umsetzen lässt und das schnelle und zuverlässige Messungen der Konzentration der Nanopartikei erlaubt. Es ist auch Aufgabe der Erfindung eine Vorrichtung zur Umsetzung des Verfahrens zu schaffen.
Diese Aufgaben werden mit dem Verfahren nach Anspruch 1 und der Vorrichtung nach Anspruch 18 gelöst. Die Unteransprüche beinhalten bevorzugte Ausführungsformen.
Der erfindungsgemäße Grundgedanke ist darin zu sehen, aus der Biotechnologie an sich bekannte Verfahren für die quantitative Detektion anorganischer und sonstiger „nicht-biologischer" Nanopartikei in wässriger Lösung einzusetzen. Gemäß der Erfindung werden dazu Biomoleküle, insbesondere Peptide, selektiv hergestellt, die fest und spezifisch an vorgegebene Nanopartikei binden. Die Detektion dieser Nanopartikei geschieht durch die Bindung der Nanopartikei an die auf einem Sensor befindlichen Peptide und die rechnerische Auswertung des Sensor-Signals im Hinblick auf die Bestimmung von Menge und Größenverteilung der Nanopartikei. Ein wichtiger Gesichtspunkt ist dabei, dass die Detektion nicht vermittels einer spezifischen Bindung an Proteine und/oder Nucleinsäure in den Nanopartikeln geschieht.
Dabei ist die Detektion biologischer Objekte wie Bakterien, Viren, und Biomoleküle ein an sich verwandtes Problem, für das es bereits eine Reihe von Lösungen gibt, wie beispielsweise Mikroarrays oder Oberflächen-Plasmonen-Resonanz. Diese Verfahren beruhen auf der naturgegebenen spezifischen Erkennung biologischer Objekte durch andere Biomoleküle. Allerdings ist in Organismen die Bindung von Biomolekülen beispielsweise an Oberflächen aus Metall, Halbleitermaterial oder Keramik im allgemeinen nicht vorgesehen. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass es spezielle Biomoleküle gibt, die dennoch an solche Oberflächen spezifisch binden. Diesen Effekt macht sich die Erfindung zunutze. Somit bietet das erfindungsgemäße Verfahren eine vergleichsweise preiswerte Lösung des Problems der quantitativen spezifischen Detektion von Nanopartikeln aus solchen nicht-biologischen Materialien.
Die Einsatzgebiete für die Erfindung sind vielfältig: So ist beispielsweise davon auszugehen, dass Nanopartikei von Menschen aufgenommen werden und dann, ähnlich wie es für Ruß vermutet wird, gesundheitsschädliche biochemische und biologische Prozesse auslösen. Das Ausmaß der biologischen Wirkung hängt dabei von der Menge und Art der Partikel ab. Um geeignete Schutzmaßnahmen, wie das Beseitigen von Leckagen, treffen zu können, sollten diese beiden Größen in der Umgebung potenzieller Quellen von Nanopartikeln überwacht werden, was die Erfindung ermöglicht. Besonders interessant ist dabei die Überwachung von Nanopartikeln in wässriger Lösung, was einem einfachen Modell der Situation auf Schleimhäuten entspricht. Die Schleimhäute bilden dabei eine biologische Struktur, über die Nanopartikei in den Körper aufgenommen werden können. Neben der Detektion von Nanopartikeln im Rahmen von Schutzmaßnahmen ist auch die Detektion für Zwecke der Qualitätskontrolle bei der Produktion von wirtschaftlichem Interesse. Beispielsweise kann es erwünscht sein, monodisperse Nanopartikei bestimmter Größe herzustellen. Eine Messung der Größenverteilung kann dann für die Regelung der Partikelproduktion eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren läuft in mehreren Schritten ab. So werden zuerst mit Verfahren der gerichteten Evolution, z.B. dem „Phage Display", Peptide für vorgegebene Nanopartikei selektiert, die diese Nanopartikei fest und spezifisch binden. Die Peptide werden dann auf der Oberfläche eines Sensors immobilisiert, bevor die eigentliche Detektion stattfindet. Bei der Detektion werden Nanopartikei in wässrige Lösung gebracht, falls sie nicht schon so vorliegen. Die Lösung wird dann über eine Fluidik auf die Sensor-Oberfläche gegeben, wo die Nanopartikei durch die immobilisierten Peptide spezifisch gebunden und durch den Sensor detektiert werden. Dabei wird nicht nur die absolute Höhe des Sensorsignals im Gleichgewicht aufgezeichnet, sondern es wird auch das Ansteigen des Signals bei der Bindung der Nanopartikei und der Abfall des Signals beim Spülen mit partikelfreier Lösung registriert. Aus der Signalamplitude und dem Signalverlauf wird anschließend die Größenverteilung und die Konzentration der Nanopartikei rechnerisch bestimmt. Erfindungsgemäß wird die Messung an der die Partikel führenden Lösung mit einem Standard verglichen, beispielsweise mit einer Referenzmessung auf einem Sensor gleicher Bauart an einer partikelfreien Lösung oder an Lösungen mit bekanntem Partikelgehalt. Durch Spülen mit partikelfreier Lösung werden gebundene Nanopartikei wieder entfernt, bevor der Sensor für weitere Messungen zur Verfügung steht.
Nachfolgend werden spezielle Ausführungsbeispiele der Erfindung auch anhand der Abbildungen beschrieben. Dabei zeigen:
Figur 1 schematisch einen Detektor und
Figur 2 schematisch die Oberfläche eines Detektors
In der Figur 1 sind die Nanopartikei 1 , Peptide auf der Oberfläche eines Phagen mit 2, die mit Peptiden bestückte Sensoroberfläche mit 3, der Signalgeber für den Sensor mit 4, der Fluss der Nanopartikei mit 5 und das Messsignal mit 6 bezeichnet. Nach Figur 2 sind die Peptidmoleküle P über ihr Amino-Ende an Polyethylenglykol (PEG) oder Alkyl-Ketten gekoppelt, die ihrerseits wieder über SH-Funktionen an der Goldoberfläche des Sensorchips gebunden sind.
In den Zeichnungen ist dargestellt, wie zuerst mit Verfahren der gerichteten Evolution für vorgegebene Nanopartikei Peptide selektiert werden, die diese Nanopartikei fest und spezifisch binden (oberer Teil von Abb. 1 ). Die Peptide werden auf der Oberfläche eines Sensors immobilisiert (mittlerer Teil von Abb. 1.) Dann findet die eigentliche Detektion statt (unterer Teil von Abb. 1 ).
Das folgende Ausführungsbeispiel zeigt, wie das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion von GaAs-Partikeln mittels Mikrowaage-Sensoren eingesetzt werden kann. Zuerst werden mit Hilfe des Phage Display-Verfahrens Peptide selektiert, die spezifisch GaAs binden. Dieser an sich bekannte Schritt führt auf Peptide wie z.B. das Peptid mit der Sequenz RLELAIPLQGSG, das spezifisch an GaAs(100) Oberflächen bindet (Whaley et al. 2000 Nature 405:665). Dieses Peptid wird in synthetisiert und auf einer Mikrowaage mit mindestens zwei Sensorelementen gekoppelt, wobei eines für die eigentliche Messung und eines als Referenz dient. Geeignete Methoden zur Kopplung der Peptid-Moleküle sind an sich bekannt und können insbesondere wie folgt eingesetzt werden: Die Mikrowaage hat eine Goldoberfläche, die vorbereitet wird durch Bedeckung mit „Seif Assembled Monolayers" aus bifunktionalen Alkyl-Ketten oder mit einer Schicht aus bifunktionalem Polyethylenglykol (PEG). Die eine der beiden Funktionen ist eine SH-Funktion, die andere eine OH- oder Carboxyl-Funktion. Die Alkyl-Ketten reagieren über die SH-Gruppe mit der Gold-Oberfläche. Das oben genannte Peptid wird über sein Amino-Ende mit den Carboxyl-Gruppen der PEG oder Alkyl-Ketten gekoppelt. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung der Oberfläche des Sensors nach der Immobilisierung der Peptide.
GaAs-Nanopartikel werden nun in wässriger Lösung durch eine Durchflusszelle (Liss et al. 2002 Anal. Chem. 74:4488) über den Sensor geleitet. Dabei werden sie auf der Sensor-Oberfläche von den Peptiden gebunden. Das Signal der Mikrowaage wird akkumuliert über einen Zeitraum, dessen Länge abhängt von der Konzentration der Nanopartikei. Sobald eine gewünschte Signalamplitude erreicht ist, wird die Durchflusszelle vom Fluss der partikelhaltigen Lösung abgekoppelt und mit partikelfreier Lösung gespült. Der Abfall des Signals wird registriert und dient zur Berechnung der Verteilung der Nanopartikelgrößen, wie im Folgenden beschrieben:
Für Konzentrationen von Nanopartikeln, bei denen noch keine nennenswerte Wechselwirkung zwischen den Nanopartikeln stattfindet, ist der Abfall s(t) des Signals über die Zeit t zurückzuführen auf eine Reaktion erster Ordnung und für monodisperse Nanopartikeln deshalb im wesentlichen exponentiell: s(t)= s0exp (- t / x), (1 )
mit der Startamplitude s0 beim Beginn des Spülens und der Rate x"1 des Abfalls. Dabei ist s0 bei der Mikrowaage proportional zur Gesamtmasse der gebundenen Nanopartikei, die sich aus der Masse m des einzelnen Partikels und der Menge N ergibt. So ~ N m (2)
Für würfelförmige Nanopartikei ist die Masse m = p a m, wobei a die Größe der Würfelfläche ist, über die das Nanopartikei an die Unterlage gebunden ist. Für allgemeiner geformte Nanopartikei gilt etwa m = const p a 3/2, wobei a die Wechselwirkungsfläche zwischen dem Nanopartikei und der Unterlage ist. Damit wird Gleichung 2 zu
Figure imgf000008_0001
mit einer Konstanten ß, die von der Form der Nanopartikei und von der Messapparatur abhängt.
Die Rate t"1 in Gl. 1 ist abhängig von der Stärke der Bindung ΔG, der Differenz der freien Enthalpien zwischen freiem und gebundenem Zustand, der Partikel an die peptid bestückte Unterlage und von der Temperatur τ"1 = y exp (-ΔG / R T) = y exp {-e a / R T) (4)
wobei ΔG angenähert werden kann durch e, die Bindungsstärke des Nanopartikels pro wechselwirkender Fläche a multipliziert mit a. Dabei ist R die allgemeine Gaskonstante und y ebenfalls eine Konstante.
Durch Einsetzen von Gin 3 und 4 in Gl. 1 entsteht ein Ausdruck für den Signalabfall bei monodispersen Nanopartikeln mit der Wechselwirkungsfläche a: s(t,a) = N ß p a32 exp (-t y exp (-e a / R T))
Da im allgemeinen keine monodispersen Teilchen vorliegen, muss die Gleichung über die Beiträge aller Nanopartikel-Klassen mit Wechselwirkungsflächen zwischen amin und amax integriert werden, um den Verlauf des Messsignals zu erhalten: s(t) N(a) ß p a 32 exp (-t y exp (-e a / R TJ) d a (5) Die interessierende Verteilung N(a) der Teilchengrößen kann numerisch berechnet werden aus Gl. 5 anhand des gemessenen Verlaufes von s(t) und nach Bestimmung der Konstanten auf der rechten Seite durch Kalibrierungsmessungen oder Modellrechnungen. Die numerische Auswertung kann durchgeführt werden durch Diskretisierung in Intervalle von a gefolgt von einer „Singular Value Decomposition". Das Messsignal s(t) oder die daraus berechnete Verteilung N(a) kann dann für Überwachungszwecke eingesetzt werden.
Das nachfolgende Ausführungsbeispiel betrifft eine Methode zur optischen Detektion von Nanopartikeln:
Abhängig von der Natur der Nanopartikei kommen auch optische Verfahren bei die Detektion in Betracht. Wobei die nachfolgend beschriebene optische Detektion weniger geeignet ist für die Detektion von Nanopartikeln, die mit der Fluoreszenz einer Gruppe in einem Peptid interferieren, das für die Detektion verwendet wird.
Im Unterschied zum obigen Ausführungsbeispiel werden zwei Peptide hergestellt, wobei zuerst - wie oben beschrieben - ein Peptid (Peptid A) erstellt wird, das die zu detektierenden Nanopartikei spezifisch bindet. Peptid A wird wie beschrieben immobilisiert. Zusätzlich wird ein weiteres Peptid (Peptid B) erstellt, das folgenden Bedingungen genügen muss: Es muss ebenfalls die Nanopartikei spezifisch binden, es darf nicht die Oberfläche auf der Peptid A immobilisiert ist binden und es muss ein Fluorophor enthalten.
Zum Erhalt einer Bindung von Peptid B an die Nanopartikei kann das gleiche Protokoll verwendet werden wie für die Erstellung des Peptids A, insbesondere ein Phage Display mit einer Selektion auf die Bindung der gewünschten Nanopartikei. Zum Vermeiden der Bindung von Peptid B an die Oberflächen wird in die Selektion ein zusätzlicher Schritt eingebaut: So werden nur solche Phagen amplifiziert, die nicht an einer Oberfläche binden, wie in Abb. 2 gezeigt. Das Fluorophor in Peptid B kann beispielsweise durch nachträgliche Modifikation mit geeigneten Fluorophoren (Dansyl, Alexa™, Cascade Blue, etc.) oder durch ein Tryptophan, das in allen Elementen der Phagen-Bibliothek enthalten sein muss, realisiert werden. Im letzt genannten Fall wird die Erfüllung der beiden ersten Bedingungen nach der Modifikation getestet. Falls nötig, werden solange weitere Modifikationen durchgeführt, bis alle drei Bedingungen erfüllt sind.
Die nanopartikelhaltige Lösung wird dann, wie oben dargestellt, mittels einer Durchflusszelle über die immobilisierten Peptide A geleitet. Die Detektion erfolgt wiederum durch eine Mikrowaage oder durch Oberflächenplasmonen-Resonanz.
Zur weiteren Steigerung der Empfindlichkeit des Verfahrens werden die Peptide B eingesetzt. Eine Lösung, die Peptide B, enthält wird zu diesem Zweck ebenfalls in die Durchflusszelle geleitet. Peptide B binden an die Nanopartikei, die bereits durch die immobilisierten Peptide A gebunden wurden. Danach wird mit einer Lösung gespült, die weder Nanopartikei noch Peptide B enthält. Mit dem Beginn dieses Spülvorgangs wird die Fluoreszenz der Peptide über direkte Einstrahlung oder Oberflächenplasmonen optisch angeregt und auch optisch detektiert. Auf diese Weise lassen sich Nanopartikei schon bei geringeren Konzentrationen nachweisen.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Detektion von in wässriger Lösung befindlichen Partikeln, deren Größe im Bereich von Nanometern liegt (Nanopartikei), wobei die Detektion nicht vermittels einer spezifischen Bindung an Proteine und/oder Nucleinsäure in den Nanopartikeln geschieht, dadurch gekennzeichnet, dass Biomoleküle, insbesondere Peptide, gewonnen werden, die an die Substanz und damit an die Nanopartikei spezifisch binden, dass die Biomoleküle auf die Oberfläche eines Sensors immobilisiert werden, der geeignet ist, eine massenabhängige Größe zu detektieren, dass die wässrige Lösung von Nanopartikeln über die Oberfläche des Sensors geleitet wird, wobei ein Signal des Sensors registriert wird, dass die Oberfläche des Sensors mit einer Standardlösung gespült wird, wobei eine Änderung des Signals registriert wird, dass aus dem Verlauf des Sensorsignals die Menge N(a) der Nanopartikei bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle durch eine auf die Oberfläche des Sensors befindliche Molekülschicht immobilisiert werden, wobei die Molekülschicht die Nanopartikei nicht in nennenswerter Menge bindet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Menge N(a) verschiedener vorkommender Größen von Nanopartikeln bestimmt wird, wobei ein Parameter a die Größe der Wechselwirkungsfläche von Nanopartikei und Sensor beschreibt.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Biomoleküle Peptide durch gerichtete Evolution, insbesondere durch „Phage Display", gewonnen werden.
5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle, insbesondere die Peptide, durch Kopplung an eine Schicht von Molekülen auf der Oberfläche des Sensors immobilisiert werden.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikei über eine Durchflusszelle über den Sensor geleitet werden.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Beaufschlagung der Sensoroberfläche ein Anstieg des Sensorsignales registriert wird und dass aus dem Verlauf von Anstieg und Abfall des Signals die Menge N(a) der Nanopartikei bestimmt wird.
8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Standardlösung eine partikelfreie Lösung verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Standardlösung eine Lösung mit bekanntem Partikelgehalt verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Sensor eine Mikrowaage oder ein Oberfldchenplasmonen- Resonanz-Sensor verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine von Nanopartikeln freie wässrige Lösung mit fluoreszierenden Peptiden über den Nanopartikei tragenden Sensor geleitet wird und dass die gebundenen Peptide über ihre Fluoreszenz optisch detektiert werden, wobei die fluoreszierenden Peptide so beschaffen sind, dass sie nicht unmittelbar an der Sensoroberfläche sondern spezifisch an darauf befindlichen Nanopartikei binden.
12. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch geken zeichnet, dass die Anregung der Fluoreszenz über Oberflächenplasmonen erfolgt.
13. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeic net, dass die Referenzmessung auf einem separaten Sensorelement mit nanopartikelfreier wässriger Lösung oder mit einer Lösung mit definiertem Gehalt an Nanopartikeln durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass unterschiedliche Peptide auf verschiedenen Elementen eines Sensor-Arrays immobilisiert werden, die jeweils Nanopartikei aus unterschiedlichen Materialien binden.
15. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Nanopartikei aus einer bekannten Substanz bestehen und keine Proteine und/oder Nucleinsäuren enthalten.
16. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass metallische, keramische oder aus Kohlenstoff bestehende Nanopartikei detektiert werden.
17. Verwendung biologischer Detektionsverfahren, die auf spezifischen Bindungen von Biomolekülen an entsprechenden Substanzen bauen, zum quantitativen Nachweis von Nanaopartikeln, die aus einer bekannten Substanz bestehen und keine Proteine und/oder Nucleinsäuren enthalten.
18. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche .
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