WO2005031335A1 - 電気泳動装置および電気泳動法並びにそれを用いた生体関連物質の検出方法 - Google Patents

電気泳動装置および電気泳動法並びにそれを用いた生体関連物質の検出方法 Download PDF

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WO2005031335A1
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liquid
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liquid storage
sample liquid
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Chiho Itou
Tetsuya Jigami
Teruta Ishimaru
Noriyuki Ogawa
Masakazu Minagawa
Yasuo Hiromoto
Toshinori Sumi
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Mitsubishi Chemical Corp
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Mitsubishi Rayon Co Ltd
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44756—Apparatus specially adapted therefor

Definitions

  • Electrophoresis apparatus electrophoresis method, and method for detecting biological substances using the same
  • the present invention relates to an electrophoresis apparatus and an electrophoresis method suitable for detecting a biological substance such as a nucleic acid.
  • biochips such as DNA microarrays and DNA chips have been developed for diagnosing diseases and elucidating the causes.
  • Such biochips can be produced by direct solid-phase synthesis of short-chain nucleic acids on a silicon or other substrate by photolithography (Patent Documents 1 and 2), or by chemically or physically modifying them.
  • a method is known in which a bio-related substance probe such as a nucleic acid (hereinafter simply referred to as a probe! /) Is spotted and immobilized on a substrate (Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 3 a method for converting the same.
  • the type disclosed in Patent Document 3 can hold a probe not only in the surface area of the chip but also in the thickness direction, so that a large amount of probes can be introduced and high detection sensitivity can be obtained. .
  • a Noo chip obtained by immobilizing such a probe on a gel can increase hybridization efficiency by electrophoresis.
  • a hybridization method by electrophoresis there is known a method in which a hybridization reaction and a washing treatment of an unnecessary sample that has not been hybridized are performed at high speed (Patent Document 4).
  • Non-Patent Document 1 "Science", 1995, No. 270, p. 467-470 Patent Document 1: U.S. Pat. No. 5,445,934
  • Patent Document 2 U.S. Pat.No. 5,774,305
  • Patent Document 3 JP 2000-270878 A
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 2000-60554 Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to suppress the deterioration of sample molecules due to electrode reactions caused by adsorption of sample molecules to the electrodes and electrolysis, and to eliminate the influence of gas generated from the electrodes by electrolysis.
  • An object of the present invention is to provide an electrophoresis apparatus and an electrophoresis method having high efficiency of iris.
  • Another object of the present invention is to provide an electrophoresis apparatus and an electrophoresis method capable of performing a washing process in a short time.
  • the present invention provides a gel holding layer, two or one sample liquid accommodating portions disposed outside both or one of the gel retaining layers, and a two or one sample liquid accommodating portion disposed on both outer sides of the sample liquid accommodating portion.
  • the electrophoresis device is provided with at least one liquid inlet / outlet in each of the liquid storage units.
  • an electrophoresis apparatus for applying a voltage between a pair of electrodes while introducing a sample liquid into a sample liquid storage section and introducing a buffer liquid into a buffer liquid storage section using the above-described electrophoresis apparatus. Electrophoresis method.
  • the electrophoresis apparatus and the electrophoresis method of the present invention alteration of sample molecules due to electrode reaction caused by adsorption of sample molecules to the electrodes and electrolysis can be suppressed. Eliminate the effects of gas by quickly discharging the gas generated Therefore, it is possible to increase the high-priority efficiency. Further, according to the present invention, the cleaning process can be performed in a short time.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing an example of an electrophoresis device of the present invention.
  • the electrophoresis section 100 surrounded by a square dashed line is shown in a disassembled state.
  • FIG. 2 is an exploded view showing the electrophoresis section of FIG. 1.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view taken along line AA ′ of FIG. 2.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing another example of the electrophoresis device of the present invention.
  • FIG. 5 is a schematic diagram showing the electrophoresis unit in FIG. 4.
  • FIG. 6 is a sectional view taken along line BB ′ of FIG. 5.
  • FIG. 7 is a cross-sectional view showing an electrophoresis section of Comparative Example 2.
  • FIG. 8 is a cross-sectional view taken along CC ′ in FIG. 3.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram showing a first embodiment of the electrophoresis apparatus of the present invention, which has a structure in which sample liquid storage sections are arranged on both outer sides of a gel holding layer.
  • the electrophoresis section 100 of the electrophoresis apparatus is shown in a disassembled state.
  • the electrophoresis section 100 includes a gel holding layer 5, two sample liquid storage sections 4 and 6 disposed on both outer sides thereof, two semipermeable membranes 3 and 7 disposed on both outer sides thereof, It has buffer liquid storage sections 2 and 8 arranged on both outer sides, and a pair of electrodes 1 and 9 arranged on both outer sides.
  • FIG. 2 is a perspective view of the electrophoresis section 100 and a perspective view of each component.
  • FIG. 3 is a cross-sectional view showing a cross section along AA ′ of FIG.
  • FIGS. 1 and 2 show the components of the electrophoresis section as being stacked so that the lamination surface is in the horizontal direction, actually, as shown in FIG. The layers are arranged in a stack such that the stacking surface is vertical.
  • sample solution spacers 11 and 12 are provided on both outer sides of the gel holding layer 5, and semipermeable membranes 3 and 7 are further provided on the outer sides thereof.
  • Each of the sample solution spacers 11 and 12 has a hollow portion penetrating from the surface in contact with the gel holding layer 5 to the surface on the opposite side, and these hollow portions form the sample solution accommodating portions 4 and 6, respectively. are doing.
  • Each of the sample liquid storage sections 4 and 6 has one surface in contact with the gel holding layer 5 and the other surface in contact with the semipermeable membranes 3 and 7, respectively.
  • the buffer solution spacers 10 and 13 have hollow portions penetrating from the surface in contact with the semipermeable membranes 3 and 7 to the surface on the opposite side, and these hollow portions form the buffer solution storage portions 2 and 8, respectively. are doing .
  • One of the surfaces of the buffer solutions 2 and 8 is in contact with the semipermeable membranes 3 and 7, and the other surface is sealed by the electrodes 1 and 9.
  • a voltage is applied to the gel holding layer 5 from the outside using the electrodes 1 and 9.
  • the gel holding layer 5 has a configuration such that the sample liquid stored in the adjacent sample liquid storage units 4 and 6 can come into contact with the gel.
  • the gel is held in a through-hole portion of a perforated flat plate having at least one through-hole.
  • Fig. 3 shows a flat plate with a certain interval
  • a gel-retaining layer in which the gel-like material is retained is shown in the numerous through-holes!
  • Known gels such as acrylamide gel-agarose gel can be used as the gel.
  • Biological substances such as DNA probes are bound to the gel.
  • biological substances such as sample DNA in the sample solution to be tested hybridize with biological substances such as DNA probes.
  • the gel holding layer 5 has a structure that can be easily attached to and detached from the electrophoresis unit when the electrophoresis unit 100 is assembled. That is, for example, a spacer having a gel holding layer housing portion can be arranged at the position of the gel holding layer 5 in FIG. 3 so that the gel holding layer can be arranged in the gel holding layer housing portion by an insertion method. .
  • the area of the sample liquid storage sections 4 and 6 on the side to be joined to the gel holding layer 5 should be larger than the cross-sectional area of the gel holding section of the gel holding layer 5.
  • the shape of the sample liquid storage units 4 and 6 can take various forms such as a square, a circle, a polygon, etc. for the first time.
  • the material of the sample solution spacers 11 and 12 is chemically stable without leaking the sample solution and the washing solution, and a small amount of ions and other components is eluted into the sample solution and the washing solution.
  • butyl rubber, nitrile rubber, silicone rubber, Teflon (registered trademark) resin, acrylic resin, polycarbonate resin and the like can be mentioned.
  • the sample liquid inlet / outlet 16 for introducing / discharging the sample liquid from the lowermost part of the sample liquid storage section 4 to the sample liquid spacer 11 is provided.
  • the uppermost force of the sample liquid container 4 is formed with a sample liquid container supply / exhaust port 17 for supplying or exhausting air to the space inside the sample liquid container 4.
  • the sample solution spacer 12 is formed with a sample solution introduction / discharge port 18 for introducing or discharging a sample solution from the bottom of the sample solution storage unit 6, and is formed from the top of the sample solution storage unit 6.
  • a supply / exhaust port 19 for a sample liquid storage section for supplying / exhausting air to / from the space inside the sample liquid storage section 6 is formed. Note that the position of the supply / exhaust port is not limited to the uppermost portion, and the position of the sample liquid inlet / outlet port is not limited to the lowermost portion.
  • the sample liquid When introducing the sample liquid into the sample liquid storage, absorb the gas in the sample liquid storage. Or a method in which the sample liquid is pressed into the sample liquid storage section. In these cases, the supply and exhaust ports are used as exhaust ports.
  • the sample liquid in order to introduce the sample liquid without leaving air bubbles in the sample liquid storage section, it is preferable that the sample liquid be introduced from the bottom of the sample liquid storage section and air be removed from the uppermost section.
  • a method of injecting gas into the sample liquid storage section or a method of suctioning the sample liquid from the sample liquid storage section is adopted. In these cases, the air supply / exhaust port is used as the air supply port.
  • the number of the sample liquid introduction / discharge ports 16 and 18 and the number of the supply / exhaust ports 17 and 19 for the sample liquid storage section may be at least one.
  • the material for the sample liquid inlet / outlet ports 16 and 18 and the supply / exhaust ports 17 and 19 for the sample liquid storage section are chemically stable without leaking the sample liquid and washing liquid, and are stable in the sample liquid containing ions and other components.
  • the sample liquid storage sections 4 and 6 have as small a volume as possible! The smaller this volume, the higher the analyte concentration in the sample liquid and the higher the detection sensitivity.
  • a solution containing a specimen of a biological substance can be used, for example, a solution containing DNA, RNA, protein, peptide, surfactant, carbohydrate, etc. Can be used.
  • a specimen of a biological substance can be labeled and used by a known method such as a fluorescent substance, a radioisotope, and a chemiluminescent substance.
  • the semipermeable membranes 3 and 7 do not allow a sample to permeate, but allow low molecules such as water and salts in a solution to permeate.
  • a gelatin membrane, an acetate membrane, an acrylamide polymer, Hide mouth gels such as polyvinyl alcohol, regenerated cellulose membranes, and the like can be used.
  • an acetate membrane is preferable because of its mechanical strength, handling, and availability.
  • the electrophoresis conditions such as the temperature of the sample solution can be adjusted via the buffer solution, and the biologically-relevant substance to be detected is efficiently brought into contact with the carrier gel of the gel holding layer to efficiently perform the hybridization reaction. It can be carried out. It is more preferable to select a semipermeable membrane having an appropriate cutoff molecular weight according to the biological substance to be detected among the semipermeable membranes.
  • the cut-off molecular weight is the minimum molecular weight that remains 90% after dialysis for 17 hours, and semipermeable membranes with cut-off molecular weights of thousands and hundreds of thousands are commercially available. That is, it is preferable to use a semipermeable membrane having a cut-off molecular weight smaller than the molecular weight of the biological substance to be detected.
  • buffer solution inlets 14 and 20 are formed in the buffer solution spacers 10 and 13 to introduce buffer solution from the lowermost portions of the buffer solution storage units 2 and 8, respectively.
  • the buffer liquid discharge ports 15 and 21 for discharging the buffer liquid from the uppermost part of the section are respectively formed.
  • the position of the buffer solution inlet is not limited to the lowermost portion, and the position of the buffer solution outlet is not limited to the uppermost portion.
  • any material that does not leak the noffeer solution, is chemically stable, and has little elution of ions and other components into the buffer solution can be used.
  • butyl rubber, nitrile rubber, silicon rubber, Teflon (registered trademark) resin, acrylic resin, polycarbonate resin and the like can be mentioned.
  • the shape of the buffer liquid storage sections 2 and 8 is not particularly limited, and may be a square, a circle, a polygon, or the like.
  • the number of the buffer solution inlets 14 and 20 and the number of the buffer solution outlets 15 and 21 are not limited.
  • the materials at the buffer solution inlets 14, 20 and the buffer solution outlets 15, 21 do not leak buffer solution, are chemically stable, and have low elution of ions and other components into the buffer solution! Prefer to be things! /.
  • Examples of the buffer solution stored in the buffer solution storage sections 2 and 8 include tris-borate buffer (TB), tris-acetate buffer (TA), sodium salt sodium citrate (SSC), and the like.
  • An electrolyte solution can be used.
  • the materials of the electrodes 1 and 9 are not particularly limited as long as they are conductive materials. Except when a reversible electrode is used, those which are chemically stable and have little elution of ions and other components into the buffer solution are preferable, and those made of platinum, for example, are preferable. Electrodes 1 and 9 are flat Various shapes including a shape can be taken. Further, each of the electrodes 1 and 9 can be composed of a plurality of electrodes.
  • the positional relationship between the electrodes 1 and 9 and the buffer liquid storage sections 2 and 8 is such that the electrodes 1 and 9 contact at least the buffer liquid storage sections 2 and 8, respectively, and the surface of the electrodes 1 and 9 is generated by electrolysis. It is preferable that the gas to be discharged be discharged from the buffer liquid storage sections 2 and 8 together with the buffer liquid. A structure in which the electrode 9 is immersed in the buffer solution storage sections 2 and 8 may be employed.
  • a part or all of the buffer inlets 14 and 20 and the buffer outlets 15 and 21 may also serve as electrodes. In that case, electrodes 1 and 9 are not required.
  • Electrodes 1 and 9, buffer solution spacers 10 and 13, semipermeable membranes 3 and 7, and sample solution spacers 11 and 12 do not need to be configured as independent parts.
  • electrode 1 buffer solution At least two of the sampler 10, the semipermeable membrane 3, and the sample solution spacer 11 can be used as a part integrally manufactured. Further, all of them can be used as one. Further, it is also possible to adopt a structure in which an electrophoresis section is formed by press-fitting, bonding or joining each of these members and each part.
  • the electrophoresis section 100 includes the electrode 1, the buffer liquid storage section 2, the semipermeable membrane 3, the sample liquid storage section 4, the gel holding layer 5, the sample liquid storage section 6, the semipermeable membrane 7, and the buffer liquid.
  • the components can be installed so that the stacking surface of these components is horizontal, vertical, or any other direction. However, in order to efficiently discharge the gas from the sample liquid storage units 4 and 6 and the buffer liquid storage units 2 and 8, it is preferable to install the sample in the vertical direction.
  • the sample liquid supply mechanism includes a sample liquid container 32 for storing the sample liquid, and a sample liquid introduction / discharge for introducing or discharging the sample liquid from the sample liquid container 32 to the sample liquid storage units 4 and 6. It comprises a pump 37, a pipe connecting these, a supply / exhaust port 55, and a first flow path switching means 35.
  • the “channel switching means” means that a valve mechanism or a flexible pipe is directly pressed and connected to one or more connection ports, or a pipe and a connection port are connected. This is a fluid operation mechanism in which a connection means such as a force braid is provided, and the flow path is switched by connecting and disconnecting the connection port and piping.
  • the sample liquid container 32 shown in FIG. 1 is connected to the sample liquid introduction / discharge outlets 16 and 18 shown in FIGS. 2 and 3 by piping, and the sample liquid introduction / discharge pump 37 is connected by piping to the sample liquid shown in FIGS. 2 and 3. Connected to supply / exhaust ports 17 and 19 for liquid container.
  • the sample liquid supply mechanism includes a cleaning liquid server 38 for storing a previously prepared cleaning liquid, and a cleaning liquid introduction / discharge for introducing or discharging the cleaning liquid from the cleaning liquid server 38 to the sample liquid storage units 4 and 6. It has a pump 40 and a second flow path switching means 33 for switching the type of solution to be introduced into and discharged from the sample liquid storage sections 4 and 6 to the sample liquid or the cleaning liquid, and the cleaning liquid discharged from the sample liquid storage sections 4 and 6 And the third is to switch the flow path of the cleaning liquid from the cleaning liquid server 38 to the introduction to the sample liquid storage units 4 and 6 or the discharge from the sample liquid storage units 4 and 6 to the discharge cleaning liquid container 41.
  • TB Tris-borate buffer
  • TA Tris acetate buffer
  • SSC sodium salt sodium citrate
  • sample liquid supply mechanism of this example when the flow path is opened to the sample liquid container 32 side using the second flow path switching means 33, when the sample liquid introduction / discharge pump 37 is used for suction, the sample liquid container
  • the sample liquid stored in 32 is introduced into the sample liquid storage units 4 and 6 through the sample liquid inlets and outlets 16 and 18.
  • the introduced amount of the sample liquid can be monitored by the liquid detection sensor 34.
  • the supply / exhaust port 55 and the sample liquid introduction / discharge pump 37 are communicated with each other using the first flow path switching means 35, and air is sucked into the sample liquid introduction / discharge pump 37.
  • the first flow path switching means 35 is used to set the flow path so that the sample liquid introduction / discharge pump 37 communicates with the sample liquid storage units 4 and 6, and the sample liquid introduction / discharge pump 37 is turned on. Set to the extrusion side, air is introduced into the sample liquid storage units 4 and 6, and the sample liquid stored in the sample liquid storage units 4 and 6 is discharged. Next, the washing liquid is introduced into the sample liquid storage sections 4 and 6.
  • the cleaning liquid server 38 and the sample liquid storage sections 4, 6 are in communication with each other, and the cleaning liquid introduction / discharge pump 40 is sucked. And the cleaning liquid stored in the cleaning liquid server 38 is introduced into the sample liquid storage sections 4 and 6 from the sample liquid introduction and discharge ports 16 and 18.
  • the introduction amount of the cleaning liquid can be monitored by the liquid detection sensor 34.
  • the discharging of the cleaning liquid is performed in the following procedure. First, by using the fourth flow path switching means 36 and the first flow path switching means 35, the supply / exhaust port 55 and the introduction / discharge pump 40 for cleaning liquid are communicated, and air is supplied to the introduction / discharge pump 40 for cleaning liquid. Suction.
  • the third flow path switching means 39 is set on the discharge side to the discharge cleaning liquid container 41, and further, using the first flow path switching means 35, the cleaning liquid introduction / discharge pump 40 and the sample liquid storage section 4, 6 and the cleaning liquid introduction / discharge pump 40 was set to the pushing side, air was introduced into the sample liquid storage sections 4 and 6, and the sample liquid storage sections 4 and 6 were stored in the sample liquid storage sections 4 and 6. Drain the cleaning solution.
  • the operation of introducing and discharging the cleaning liquid can be repeated a plurality of times. Further, in a state where the washing liquid is accommodated in the sample liquid accommodation sections 4 and 6, a voltage can be applied between the electrodes to remove the unbound analyte by electrophoresis.
  • the sample solution feeding mechanism In the case of the sample solution feeding mechanism, if contamination by the sample solution containing radioisotopes, mutagens, etc. becomes a problem, connect one or more flexible pipes that can easily discard the contaminated part. It is preferable to use a fluid operating mechanism which is connected directly to the port by pressing and pressing, or a connecting means such as a force bra is provided in the pipe and the connection port, and the flow path is switched by detaching the connection port and the pipe.
  • a sample liquid introduction / discharge pump 37 and a cleaning liquid introduction / discharge pump 40 are provided, but a structure is adopted in which a single pump introduces or discharges the sample liquid or the cleaning liquid into and from the sample liquid storage units 4 and 6. You can also. Furthermore, a configuration is provided in which a flow path switching means is further added so that a plurality of types of sample liquids and washing liquids can be switched and used.
  • sample liquid storage units 4 and 6 introduce and discharge the sample liquid or the cleaning liquid to and from the force sample liquid storage units 4 and 6 which share the sample liquid supply mechanism.
  • the liquid supply mechanism can be installed independently.
  • the sample liquid storage units 4 and 6 include a sample liquid supply mechanism that switches and introduces a sample liquid or a cleaning liquid having different one or more of concentration, temperature, and fiber composition.
  • a second cleaning liquid server storing a cleaning liquid different in at least one of concentration, temperature, and composition from the cleaning liquid stored in the cleaning liquid server 38 is installed, and the flow is switched to one of the second cleaning liquid server and the cleaning liquid server 38.
  • the path switching means and the cleaning liquid introduction / discharge pump 40 the cleaning liquid can be maintained under optimum conditions.
  • the buffer solution supply mechanism includes buffer solutions Sano 23, 27 for storing a buffer solution prepared in advance, and buffer solutions from the buffer solution servers 23, 27 to the buffer solution storage units 2, 8.
  • Liquid transfer pumps 24 and 28 for transferring the buffer, pipes for connecting these pumps, and discharging the buffer liquid discharged from the buffer liquid storage units 2 and 8 to the discharge buffer liquid container 31 or the buffer liquid server 23,
  • a buffer liquid flow path switching means 26 and 30 for switching the circulation to and from the buffer liquid flow path 27.
  • the buffer solution servers 23 and 27 are connected to the buffer solution introduction ports 14 and 20 shown in FIG. Pipes are connected to the buffer liquid outlets 15 and 21 shown in FIG. 3, respectively, and these pipes lead to a discharged buffer liquid container 31 and buffer servers 23 and 27 shown in FIG.
  • the buffer liquid flow switching means 26, 30 when the buffer liquid flow switching means 26, 30 is set to be opened to the discharge buffer liquid container 31 side, the buffer liquid is supplied by the buffer liquid supply pumps 24, 32. Then, the liquid is transferred from the buffer liquid servers 23 and 27 to the buffer liquid storage units 2 and 8 through the buffer liquid inlets 14 and 20 and then discharged to the discharge buffer liquid container 31.
  • the buffer liquid flow path switching means 26, 30 When the buffer liquid flow path switching means 26, 30 is set in a circulation system between the buffer liquid storage units 2, 8, and the buffer liquid servers 23, 27, the buffer liquid is transferred to the buffer liquid server 23, the buffer liquid storage unit 2, Circulation can be performed between the buffer liquid server 27 and the buffer liquid storage unit 8, respectively.
  • the buffer liquid supply pumps 24 and 32 are operated continuously or intermittently to suction or push out, so that the buffer liquid is continuously supplied to the buffer liquid storage units 2 and 8. It can be introduced or discharged intermittently or intermittently.
  • a suction pump can be provided on the opposite side of the buffer liquid supply pumps 24 and 28 with respect to the buffer liquid storage units 2 and 8.
  • the buffer liquid supply mechanisms for supplying the buffer liquid to the buffer liquid storage units 2 and 8 are independently installed, a part or all of these mechanisms are shared. It can also be installed as Further, a plurality of buffer liquid servers storing buffer liquids different in at least one of concentration, temperature, and composition, a buffer liquid supply pump, and buffer liquids to be introduced into the buffer liquid storage units 2 and 8 respectively.
  • a buffer solution supply mechanism consisting of a channel switching means that switches to each buffer solution server side, buffer solutions with at least one of concentration, temperature, and composition different in buffer solution storage units 2 and 8 are switched. Can be supplied. This makes it possible to maintain the concentration, temperature, composition, and the like of the buffer solution under the optimum conditions for turbidity, hybridization, and washing.
  • a solution of a bio-related substance such as DNA is prepared and labeled by a known method to prepare a sample solution.
  • the sample liquid, the buffer liquid and the cleaning liquid prepared in advance are stored in the sample liquid container 32, the buffer liquid servers 23 and 27, and the cleaning liquid server 38, respectively.
  • the second flow path switching means 33 is set to the sample liquid side, and the sample liquid introduction / discharge pump 37 is set to the suction side, whereby the sample liquid is transferred from the sample liquid container 32 to the sample liquid storage section 4, Introduce to 6.
  • the buffer liquid flow path switching means 26, 30 is set in the circulation system between the buffer liquid storage sections 2, 8 and the buffer liquid servers 23, 27, and the buffer liquid feed pumps 24, 28 are operated. To circulate the buffer solution.
  • a voltage is applied with the electrode 1 serving as a positive electrode and the electrode 9 serving as a negative electrode, thereby causing the DNA sample contained in the sample solution to migrate.
  • a negatively charged DNA specimen migrates into the carrier gel 22 of the gel holding layer 5 in the sample liquid storage unit 6.
  • the DNA sample specific to the DNA probe immobilized on the carrier gel 22 is hybridized with the DNA probe and held in the carrier gel 22.
  • the DNA sample that is not complementary to the DNA probe does not hybridize with the DNA probe, but passes through the sample solution container 4 and migrates in the direction of the semipermeable membrane 7. Less than, The DNA sample that has hybridized with the DNA probe is called the “unbound sample”.
  • the unbound sample migrates again from the sample liquid storage unit 4 into the inside of the carrier gel 22. Therefore, if the voltage applied to the electrode is inverted and the unbound sample is reciprocated between the sample liquid storage section 4 and the sample liquid storage section 6, the probability of hybridization with the DNA probe can be increased. it can.
  • the buffer liquid feed pumps 24 and 28 are continuously operated, so that the buffer liquid is introduced from the buffer liquid inlets 14 and 20 into the buffer liquid storage sections 2 and 8 and the electrodes are simultaneously discharged.
  • 1, 9 Discharge the gas generated on the surface together with the buffer solution from the buffer solution outlets 15, 21.
  • the fourth flow path switching means 36 is set to the cleaning liquid introduction / discharge pump 40 side, and the third flow path switching means 39 is set to the introduction side, and the cleaning liquid introduction / discharge pump is set.
  • the sample liquid in the sample liquid storage units 4 and 6 is replaced with the cleaning liquid.
  • a voltage is applied between the electrode 1 and the electrode 9
  • only the negatively charged unbound analyte migrates to the sample liquid storage section on the positive electrode side and is removed from the gel holding layer 5.
  • the third flow path switching means 39 is set to the discharge side, and the cleaning solution introduction / discharge pump 40 is set to the push side, so that the sample liquid storage sections 4 and 6 The washing solution containing the unbound sample is discharged into the washing solution container 41.
  • the gel holding layer 5 is taken out, and the biologically relevant substance held in the carrier gel 22 is detected by a detection method corresponding to the labeling method used for the sample solution.
  • buffer solution inlets 14 and 20 are formed at the bottom of buffer solution spacers 10 and 13, and buffer solution outlets 15 and 21 are formed at the top of buffer solution spacers 10 and 13.
  • the gas generated from the vicinity of the electrodes 1 and 9 when a voltage is applied can be efficiently exhausted from the buffer liquid feeds 2 and 8.
  • the moving speed of the bio-related substance in the sample liquid storage sections 4 and 6 and the carrier gel 22 The electrophoresis can be performed without causing a problem such as formation of an insulating layer due to gas generated from the electrodes 1 and 9, thereby improving detection accuracy.
  • the buffer liquid can be continuously supplied to the buffer liquid storage sections 2 and 8 using the buffer liquid supply mechanism, the sample liquid storage section that is in contact with these via the buffer liquid storage sections 2 and 8 and the semipermeable membrane.
  • the ion concentration can be made uniform and the detection accuracy can be improved.
  • a temperature control mechanism for heating or cooling the buffer liquid supplied to the buffer liquid storage units 2 and 8 to a predetermined temperature is provided.
  • the temperature control mechanism is composed of heat exchangers 25 and 29 for heating or cooling the buffer liquid flowing into the buffer liquid storage sections 2 and 8, and a temperature control device.
  • the heat exchangers 25 and 29 are operated to heat or cool the buffer solution in accordance with a signal preset in the temperature control device 42, so that the buffer solution storage units 2 and 8 are in a desired state.
  • the temperature can be maintained, and the temperature of the sample liquid in the sample liquid storage sections 4 and 6 and the temperature of the carrier gel 22 of the gel holding layer 5 can be kept constant through the semipermeable membranes 3 and 7.
  • the method for heating and cooling the buffer solution is not particularly limited.
  • a heat medium circulation method for circulating a heat medium between the heat exchange 25, 29 and the temperature control device 42, a heat exchanger 25, As 29, a method of performing heating and cooling using a Peltier element can be used.
  • a temperature detecting element such as a thermocouple is provided inside or outside the sample liquid storage sections 4 and 6, and a mechanism for optimally adjusting the temperature of the buffer solution according to the signal of the temperature detecting element can be attached. .
  • the electrode 1 and the electrode 9 are connected via electric wiring and a signal generation mechanism.
  • the signal generating mechanism includes an arbitrary waveform generator 43 capable of setting or selecting an arbitrary waveform by an external signal, setting an output voltage, and controlling ON / OFF of an output, and a predetermined sequence and time. And a cooperative control device 44 for sending a control signal to the arbitrary waveform generator 43.
  • this signal generation mechanism it is possible to apply an arbitrary voltage having an arbitrary waveform including a direct current to the electrophoresis unit according to a predetermined order and time.
  • the liquid flow path switching means 26, the second flow path switching means 33, the first flow path switching means 35, and the third flow path switching means 39 are each transmitted to the cooperative control device 44 by a signal line.
  • a cooperative control mechanism consisting of connections is installed.
  • a signal such as the amount of introduction of the sample liquid or the cleaning liquid and the temperature detected by the liquid sensor 34 is transmitted to the cooperative control device 44, and the cooperative control device 44 transmits the signal to the buffer.
  • Signals for controlling these operations are transmitted to the liquid feeding pumps 24 and 28, the temperature controller 42, and the arbitrary waveform generator 43.
  • the buffer liquid supply mechanism and the sample liquid supply mechanism can be coordinated, or the buffer liquid supply mechanism, the sample liquid supply mechanism, and the signal generation mechanism can be coordinated. . Therefore, the electric swimming can be continued while maintaining the temperature, the composition, the concentration, and the current applied to the gel holding layer 5 of the buffer solution and the sample solution under the optimum conditions.
  • FIGS. 4 to 6 show an electrophoresis apparatus according to a second embodiment of the present invention, which has a structure in which the sample liquid container 4 is arranged on only one side of the gel holding layer.
  • the sample liquid is introduced from the sample liquid container 32 into the sample liquid container 4.
  • the negatively charged sample contained in the sample liquid container 4 is moved from the sample liquid container 4 to the carrier gel 22 of the gel holding layer 5 by the applied voltage.
  • Run inside. a DNA sample complementary to the DNA probe held on the carrier gel 22 is hybridized with the DNA probe and held on the carrier gel 22.
  • the sample that is not complementary to the DNA probe passes through the gel retention layer 5 and is blocked by the semi-permeable membrane 7 and is concentrated between the semi-permeable membrane 7 and the gel retention layer 5.
  • the negatively-charged unbound analyte migrates to the sample liquid container 4.
  • This sample liquid storage section 4 The unbound specimen is discharged to the discharge washing liquid container 41.
  • a polyurethane resin manufactured by Nippon Polyurethane Industry Co., Ltd., -supporan 4276, coronate 4403 colored with carbon black (MA1000, manufactured by Mitsubishi Iridaku Co., Ltd.) was poured into the enclosure. Subsequently, the resin was allowed to stand at room temperature for one week to cure the resin. Thereafter, the surroundings of the perforated plate and the polytetrafluoroethylene plate were removed to obtain a hollow fiber array having a prismatic force of 20 mm, 20 mm and a length of 50 mm. In this hollow fiber array, 25 hollow fibers were arrayed in a range of 2. lmm X 2. lmm in the central portion of the cross section.
  • N, N-dimethylacrylamide 4.5 parts by mass
  • N, N-methylenebisacrylamide 0.5 parts by mass
  • 2,2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride 0.1 parts by mass
  • water A mixed solution having a composition of 95 parts by weight was prepared. This mixed solution was introduced into the hollow portion of 22 hollow fibers of the hollow fiber array. Into the hollow portions of the remaining three hollow fibers, a solution was added in which DNA of 40 bases was added to the mixed solution so that the concentration became 5 nmolZml. Next, polymerization was carried out at 70 ° C. for 3 hours to produce a gel in the hollow portion of the hollow fiber.
  • the electrophoresis apparatus shown in FIGS. 13 to 13 was assembled using the following components. That is, this DNA chip was used as the gel holding layer 5, and semipermeable membranes having “Sbeta tropore” (cut-off molecular weight: 3500) produced by Spectrum were used as the semipermeable membranes 3 and 7.
  • semipermeable membranes having “Sbeta tropore” cut-off molecular weight: 3500
  • butyl rubber Using buffer solution spacers 10 and 13, sample solution spacers 11 and 12 made of butyl rubber, and electrodes 1 and 9 made of platinum, they were arranged in the configuration shown in FIG. 1 and pressed to assemble electrophoresis section 102.
  • the arbitrary waveform generator 43 was connected to the electrodes 1 and 9, and the heat exchangers 25 and 29 and the temperature controller 42 were installed.
  • the size of the buffer solution storage section was 8 mm long, 8 mm wide, 2 mm thick, and the volume was 128 ⁇ 1, and the size of the sample liquid storage section was 8 mm long, 8 mm wide, lmm thick, and the volume was 64 ⁇ 1.
  • 40-base pair DNA that is labeled with Cy5 dye (excitation wavelength: 635 nm, detection wavelength: 660 nm) and that can complementarily bind to DNA (hereinafter referred to as “probe A”) fixed together with the substrate gel in the DNA chip
  • probe A DNA
  • the lOOfmol of the sample a and the lOOfmol of the 40-base pair DNA sample b, which is labeled with Cy3 dye (excitation wavelength 530 nm, detection wavelength 570 nm) and does not bind complementarily to probe A, are 0.5 XTB -Dissolved in 15 mM NaCl solution 100 / zl to make a sample solution.
  • the fourth flow path switching means 36 is set to the sample solution side, and the sample solution introduction / discharge pump 37 is set to the suction side, and the sample solution is sucked. It was introduced into the liquid storage units 4 and 6.
  • a 0.5 XTB-15 mM NaCl solution was prepared as a washing solution and stored in the washing solution server 38.
  • a DC voltage was applied by the arbitrary waveform generator 43 so that the electrode 1 was a positive electrode and the electrode 9 was a negative electrode, so that the DNA sample a and the DNA sample ab contained in the sample solution were electrophoresed. At this time, the applied voltage was 3 V, and the application time was 10 minutes.
  • the DNA not bound to the probe A from the gel holding layer 5 is applied.
  • the specimen was removed.
  • the applied voltage at this time was 3 V and the time was 10 minutes.
  • the gel holding layer 5 was taken out and observed with a fluorescence microscope at excitation wavelengths of 532 nm and 633 nm.
  • hybridization and washing were performed in the same manner as in Example 1 except that the DNA sample was allowed to stand for 10 minutes without applying a voltage.
  • the gel holding layer 5 composed of a chip color was observed with a fluorescence microscope.
  • Example 7 As shown in Fig. 7, the washing by hybridization and electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 except that an electrophoresis apparatus without the buffer solutions 2 and 8 and the semipermeable membranes 3 and 7 was used.
  • the gel holding layer 5 was observed with a fluorescence microscope in the same manner as in Example 1.

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Abstract

　電気泳動装置は、ゲル保持層と、前記ゲル保持層の両方または一方の外側に配置された２つまたは１つのサンプル液収容部と、前記サンプル液収容部の両外側に配置された２つの半透膜と、前記半透膜の両外側に配置されたバッファ液収容部と、前記バッファ液収容部の両外側に配置された一対の電極とを有し、サンプル液収容部とバッファ液収容部とにはそれぞれ少なくとも１つの液出入り口が設けられている。

Description

明 細 書
電気泳動装置および電気泳動法並びにそれを用いた生体関連物質の検 出方法
技術分野
[0001] 本発明は、核酸等の生体関連物質の検出に適した電気泳動装置および電気泳動 法に関する。
背景技術
[0002] 近年、病気の診断、原因の解明のために、 DNAマイクロアレイや DNAチップ等と呼 ばれるバイオチップが開発されている。このようなバイオチップの製法としては、シリコ ン等の基盤上にフォトグラフィー技術により短鎖の核酸を直接固相合成していく方法 (特許文献 1及び 2)や、化学的又は物理的に修飾した基盤上に核酸等の生体関連 物質プローブ (以下単にプローブと!/、う）をスポッティングして固定ィヒする方法 (非特 許文献 1)が知られている。また、多数の中空繊維を束ねて榭脂で固定化し、その中 空繊維の中空部にゲル状物と共にプローブを導入した後、この固定ィ匕物を中空繊維 に直交する方向に切断して薄片化する方法も知られて 、る (特許文献 3)。特許文献 3のタイプのものは、チップの表面部だけでなく厚み方向にお!、てもプローブを保持 可能であるので、多量のプローブを導入可能であり、高い検出感度を得ることが出来 る。
また、このようなプローブをゲルに固定ィ匕したノィォチップは、電気泳動法によって ハイブリダィゼーシヨン効率を高めることができる。電気泳動によるハイブリダィゼーシ ヨン法としては、ハイブリダィゼーシヨン反応とハイブリダィズしなかった不要な検体の 洗浄処理を高速に行う方法が知られて ヽる（特許文献 4)。
非特許文献 1：「サイエンス」（Science；)、 1995年、第 270号、 p. 467—470 特許文献 1 :米国特許第 5, 445, 934号明細書
特許文献 2 :米国特許第 5, 774, 305号明細書
特許文献 3 :日本国特開 2000— 270878号公報
特許文献 4:日本国特開 2000— 60554号公報 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] しカゝしながら、特許文献 4で開示されて ヽる方法では、検体溶液と電極が接触して おり、電極への検体分子の吸着、電気分解に起因する電極反応による検体分子の 変質により、ハイプリ効率が低下する。
また、検体溶液と電極が接触しているために、電気分解により電極から発生するガ スの発泡で、検体分子が意図した方向へ泳動することを阻害し、ハイブリダィゼーシ ヨン反応，洗浄処理に時間がかかる。
[0004] 本発明の目的は、電極への検体分子の吸着や電気分解に起因する電極反応によ る検体分子の変質を抑制し、また電気分解により電極から発生するガスの影響を排 除したノ、イブリ効率が高い電気泳動装置および電気泳動法を提供することにある。 また本発明の目的は、短時間で洗浄処理が可能な電気泳動装置および電気泳動 法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明は、ゲル保持層と、前記ゲル保持層の両方または一方の外側に配置された 2つまたは 1つのサンプル液収容部と、前記サンプル液収容部の両外側に配置され た 2つの半透膜と、前記半透膜の両外側に配置されたバッファ液収容部と、前記バッ ファ液収容部の両外側に配置された一対の電極とを有し、サンプル液収容部とバッ ファ液収容部とにはそれぞれ少なくとも 1つの液出入り口が設けられてなる、電気泳 動装置である。
また本発明は、前記の電気泳動装置を用いて、サンプル液収容部にサンプル液を 導入し、ノ ッファ液収容部にバッファ液を導入した状態で、一対の電極間に電圧を印 加する電気泳動法である。
発明の効果
[0006] 本発明の電気泳動装置および電気泳動法によれば、電極への検体分子の吸着や 電気分解に起因する電極反応による検体分子の変質を抑制することができ、また電 気分解により電極カゝら発生するガスを速やかに排出することでガスの影響を排除する ことができるので、ハイプリ効率を高めることができる。また本発明によれば短時間で 洗浄処理を行うことができる。
図面の簡単な説明
[0007] [図 1]本発明の電気泳動装置の一例を示す概念図である。四角い破線で囲まれた電 気泳動部 100は分解状態で示されて ヽる。
[図 2]図 1の電気泳動部を示す分解図である。
[図 3]図 2の A— A'における断面図である。
[図 4]本発明の電気泳動装置の他の一例を示す概念図である。この例ではサンプル 液収容部は一つである。
[図 5]図 4の電気泳動部を示す模式図である。
[図 6]図 5の B— B'における断面図である。
[図 7]比較例 2の電気泳動部を示す断面図である。
[図 8]図 3の C C'における断面図である。
符号の説明
[0008] 1 電極
2 バッファ液収容部
3 半透膜
4 サンプル液収容部
5 ゲル保持層
6 サンプル液収容部
7 半透膜
8 バッファ液収容部
9 電極
22 担体ゲル
32 サンプル液容器
42 温度制御装置
43 任意波形発生器
44 協調制御装置 発明を実施するための最良の形態
[0009] 以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して説明する。
図 1は本発明の電気泳動装置の第一態様を示す概念図であり、ゲル保持層の両 外側にサンプル液収納部が配置されて ヽる構造のものである。この電気泳動装置の 電気泳動部 100は分解状態で示されている。電気泳動部 100は、ゲル保持層 5と、 その両方の外側に配置された 2つサンプル液収容部 4及び 6と、その両外側に配置さ れた 2つの半透膜 3及び 7と、その両外側に配置されたバッファ液収容部 2及び 8と、 その両外側に配置された一対の電極 1及び 9とを備えている。
[0010] 図 2は、電気泳動部 100の斜視図、及び各構成要素の斜視図である。図 3は、図 2 の A— A'に沿った断面を示す断面図である。なお、図 1及び図 2では、電気泳動部の 各構成部材の積層面が水平方向となるように積層したものとして図示しているが、実 際には図 3に示すように各構成部材の積層面が鉛直方向となるように積層に配列さ れている。
この例では、ゲル保持層 5の両外側にサンプル液スぺーサ 11、 12が設置され、さら にその外側に半透膜 3、 7が設置されている。サンプル液スぺーサ 11、 12はそれぞ れ、ゲル保持層 5に接する面からそれと反対側の面へ貫通する中空部を有し、それら の中空部がそれぞれサンプル液収容部 4、 6を形成している。そしてサンプル液収容 部 4、 6は、それぞれ一方の面がゲル保持層 5と接し、それぞれ他方の面が半透膜 3 、 7と接している。
半透膜 3、 7の外側にはそれぞれ、ノ ッファ液スぺーサ 10、 13が設置されている。 ノ ッファ液スぺーサ 10、 13は、半透膜 3、 7に接する面からそれと反対側の面へ貫通 する中空部を有し、これらの中空部がそれぞれバッファ液収容部 2、 8を形成している 。 ノ ッファ液収容部 2、 8は、それぞれ一方の面が半透膜 3、 7と接し、他方の面は電 極 1、 9により密封される。電極 1、 9を用いて、外側からゲル保持層 5に電圧が印加さ れる。
[0011] ゲル保持層 5は、隣接するサンプル液収容部 4、 6に収容されたサンプル液がゲル に接触できるような構成を有する。例えば、貫通孔がーつ以上設けられた多孔平板 の貫通孔部にゲルを保持させた構成である。図 3には平板に所定間隔をもって形成 された多数の貫通孔の中にゲル状物が保持されたゲル保持層が示されて!/ヽる。ゲル 状物としてはアクリルアミド系ゲルゃァガロースゲル等公知のゲルが使用できる。この ゲル状物には DNAプローブ等の生体関連物質が結合される。電気泳動の際には、 検査対象となる試料溶液中の検体 DNA等の生体関連物質が DNAプローブ等の生 体関連物質とハイブリダィズする。
このゲル保持層 5は、電気泳動部 100を組み立てた状態で、電気泳動部から容易 に着脱可能な構造であることが好ましい。即ち、例えば、図 3のゲル保持層 5の位置 にゲル保持層収容部を有するスぺーサを配置して、ゲル保持層を挿入方式によって ゲル保持層収容部に配置できる構造とすることができる。
[0012] ゲル保持層 5に接合される側のサンプル液収容部 4、 6の面積は、ゲル保持層 5の ゲル保持部の断面積以上の面積であればょ 、。
サンプル液収容部 4、 6の形状は、四角形を初めてとして、円形、多角形等の種々 の形態をとることができる。サンプル液スぺーサ 11、 12の材料としては、サンプル液 および洗浄液を漏出させず、化学的に安定であって、イオンやその他の成分をサン プル液中および洗浄液中へ溶出する量が少なく、かつサンプル液中の検体分子の 吸着が少ないものを用いることが好ましい。例えばブチルゴム、二トリルゴム、シリコン ゴム、テフロン (登録商標)榭脂、アクリル榭脂、ポリカーボネート榭脂等が挙げられる
[0013] この例では、図 3及び図 8に示すように、サンプル液スぺーサ 11に、サンプル液収 容部 4の最下部カゝらサンプル液を導入または排出するサンプル液導入排出口 16が 形成され、サンプル液収容部 4の最上部力 サンプル液収容部 4の内部の空間に給 気または排気するサンプル液収容部用給排気口 17が形成されている。同様に、サン プル液スぺーサ 12には、サンプル液収容部 6の最下部からサンプル液を導入または 排出するためのサンプル液導入排出口 18が形成され、サンプル液収容部 6の最上 部からサンプル液収容部 6の内部の空間に給気または排気するためのサンプル液収 容部用給排気口 19が形成されている。尚、この給排気口の位置は最上部に限定さ れず、サンプル液導入排出口の位置は最下部に限定されない。
サンプル液収容部にサンプル液を導入する際には、サンプル液収容部の気体を吸 気する方法、またはサンプル液収容部に対してサンプル液を圧入する方法が採用さ れる。これらの場合において給排気口は排気口として使用される。ここで、サンプル 液収容部に気泡を残さずサンプル液を導入するためには、サンプル液収容部の最 下部からサンプル液を導入し、最上部から空気を抜く配置が好ましい。またサンプル 液収容部からサンプル液を排出する際には、サンプル液収容部に気体を圧入する 方法、またはサンプル液収容部力 サンプル液を吸引する方法が採用される。これら の場合において給排気口は給気口として使用される。
サンプル液導入排出口 16、 18の数およびサンプル液収容部用給排気口 17、 19 の数は、いずれも 1つ以上であればよい。またサンプル液導入排出口 16、 18とサン プル液収容部用給排気口 17、 19の材料としては、サンプル液および洗浄液が漏出 せず、化学的に安定でイオンやその他の成分のサンプル液中および洗浄液中への 溶出が少なぐ且つサンプル液中の検体分子の吸着が少ないものを用いることが好 ましい。
[0014] サンプル液収容部 4、 6は、可能な限り容積が少な!/、ことが好ま U、。この容積が小 さいほど、サンプル液中の検体濃度を高くし、検出感度を上げることができる。
サンプル液収容部 4、 6に導入されるサンプル液としては、生体関連物質の検体を 含有する溶液を用いることができ、例えば DNA、 RNA、蛋白質、ペプチド、界面活 性剤、炭水化物等を含む溶液を用いることができる。生体関連物質の検体は、例え ば蛍光物質、放射性同位体、化学発光性物質等公知の方法により標識して用いるこ とがでさる。
[0015] 半透膜 3、 7としては、検体を透過させず、溶液中の水や塩類のような低分子は透 過させるようなものであり、例えばゼラチン膜、アセテート膜、アクリルアミド系ポリマー やポリビュルアルコール等のハイド口ゲル、再生セルロース膜等を用いることができる 。これらの中で、機械的強度、取り扱い、入手の容易性から、アセテート膜が好ましい 半透膜 3、 7を用いることにより、例えばバッファ液収容部 2、 8のバッファ液とサンプ ル液収容部 4、 6のサンプル液とが半透膜 3、 7を透過して交換され、かつ、サンプル 液収容部 4、 6に含まれる検出対象の生体関連物質は、半透膜 3、 7を透過できずサ ンプル液収容部 4、 6〖こ留まる。したがって、ノ ッファ液を介してサンプル液の温度等 の泳動条件を調整できるとともに、検出対象の生体関連物質を効率よくゲル保持層 の担体ゲルに接触させて、ハイブリダィゼーシヨン反応を効率よく行うことができる。 半透膜の中で、検出対象の生体関連物質に応じて適当なカットオフ分子量を有す る半透膜を選択することがさらに好ましい。カットオフ分子量とは、 17hr透析を行った 際に 90%残留する最小の分子量であり、カットオフ分子量が数千力も数十万の半透 膜が市販されている。すなわち、検出しょうとしている生体関連物質の分子量よりも小 さ 、カットオフ分子量を持つ半透膜を用いることが好ま U、。
[0016] この例では、バッファ液スぺーサ 10、 13にはバッファ液収容部 2、 8の最下部からバ ッファ液を導入するバッファ液導入口 14、 20がそれぞれ形成され、ノ ッファ液収容部 の最上部からバッファ液を排出するノ ッファ液排出口 15、 21がそれぞれ形成されて いる。尚、このバッファ液導入口の位置は最下部に限定されず、ノ ッファ液排出口の 位置は最上部に限定されない。
ノッファ液スぺーサ 10、 13の材料としては、ノ ッファ液を漏出させず、化学的に安 定であって、イオンやその他の成分のバッファ液中への溶出が少ない材料を用いる ことができ、例えばブチルゴム、二トリルゴム、シリコンゴム、テフロン (登録商標)榭脂 、アクリル榭脂、ポリカーボネート榭脂等が挙げられる。ノ ッファ液収容部 2、 8の形状 は特に限定されず、四角形、円形、多角形等の形状とすることができる。
なお、バッファ液導入口 14、 20の数およびバッファ液排出口 15、 21の数はいずれ も制限されない。さらに、バッファ液導入口 14、 20とバッファ液排出口 15、 21の材料 は、バッファ液が漏出せず、化学的に安定でイオンやその他の成分のバッファ液中 への溶出の少な!/、ものであることが好まし！/、。
[0017] ノ ッファ液収容部 2、 8に収容されるバッファ液としては、例えばトリス-ホウ酸バッフ ァ (TB)、トリスー酢酸バッファ (TA)、塩ィ匕ナトリウム クェン酸ナトリウム（SSC)等の 電解質溶液を用いることができる。
[0018] 電極 1、 9の材質は特に限定されず導電性の材料であればよい。可逆電極を使用 する場合を除けば、化学的に安定でイオンやその他の成分のバッファ液中へ溶出の 少ないものが好適であり、例えば白金製のものが好ましい。電極 1、 9の形状は、平板 状を初めとして種々の形状をとることができる。また、電極 1、 9を各々複数の電極で 構成することちできる。
[0019] 電極 1、 9とバッファ液収容部 2、 8の位置関係は、電極 1、 9が少なくともバッファ液 収容部 2、 8にそれぞれ接し、電気分解によって電極 1、 9の表面カゝら発生するガスが ノ ッファ液と共にバッファ液収容部 2、 8から排出されうる構造であることが好ま 、。 電極 9がバッファ液収容部 2、 8に浸漬された構造にすることもできる。
また、図 3において、バッファ導入口 14、 20及びバッファ排出口 15, 21の一部又 は全部が電極としての役割を兼ねていても良い。その場合、電極 1及び 9は不要とな る。
電極 1、 9、バッファ液スぺーサ 10、 13、半透膜 3、 7、サンプル液スぺーサ 11、 12 は各々独立した部品として構成されている必要はなぐ例えば電極 1、ノ ッファ液スぺ ーサ 10、半透膜 3、サンプル液スぺーサ 11のうち少なくとも 2つを一体として製作した 部品として用いることができる。更に、これら全てを一体として用いることもできる。また これらの各部材ゃ各部品どうしを圧接、接着あるいは接合等によって電気泳動部を 形成する構造とすることもできる。
[0020] この例では電気泳動部 100は電極 1、ノ ッファ液収容部 2、半透膜 3、サンプル液 収容部 4、ゲル保持層 5、サンプル液収容部 6、半透膜 7、バッファ液収容部 8、電極 9の積層面が鉛直方向となるように設置されている力 これら構成部材の積層面が水 平、鉛直、あるいは他のいずれの方向になるように設置することができる。ただし、サ ンプル液収容部 4、 6およびバッファ液収容部 2、 8から効率よくガスを排出させるため には、鉛直方向に設置することが好ましい。
[0021] この例では、サンプル液収容部 4、 6にサンプル液または洗浄液を導入、排出する 送給機構 (以下、「サンプル液送給機構」という）が接続されている。図 1に示すよう〖こ 、サンプル液送給機構は、サンプル液を貯留するサンプル液容器 32と、サンプル液 容器 32からサンプル液収容部 4、 6ヘサンプル液を導入または排出するサンプル液 用導入排出ポンプ 37と、これらを接続する配管と、給排気口 55と、第一の流路切り 替え手段 35とから構成される。なお、「流路切り替え手段」とは、バルブ機構や、可と う性配管を一つ以上の接続口に直接押し当て圧接接続し、或いは配管及び接続口 に力ブラ等の接続手段を設け、接続口と配管の脱着により流路を切り替える流体操 作機構をいう。
図 1に示すサンプル液容器 32は、配管によって図 2、図 3に示すサンプル液導入排 出口 16、 18に接続され、サンプル液用導入排出ポンプ 37は、配管によって図 2、図 3に示すサンプル液収容部用給排気口 17、 19に接続される。
この例のサンプル液送給機構は、さら〖こ、予め調製された洗浄液を貯留する洗浄 液サーバ 38と、洗浄液サーバ 38からサンプル液収容部 4、 6へ洗浄液を導入または 排出する洗浄液用導入排出ポンプ 40と、サンプル液収容部 4、 6に導入、排出する 溶液の種類をサンプル液または洗浄液に切り替える第二の流路切り替え手段 33を 有し、サンプル液収容部 4、 6から排出された洗浄液を貯留する排出洗浄液容器 41 と、洗浄液の流路を洗浄液サーバ 38からサンプル液収容部 4、 6への導入またはサ ンプル液収容部 4、 6から排出洗浄液容器 41への排出に切り替える第三の流路切り 替え手段 39を有し、更に、作動するポンプをサンプル液用導入排出ポンプ 37または 洗浄液用導入排出ポンプ 40に切り替える第四の流路切り替え手段 36を有する。 洗浄液としては、例えば、トリス-ホウ酸バッファ (TB)、トリス 酢酸バッファ (TA)、 塩ィ匕ナトリウム クェン酸ナトリウム（SSC)等を用いることができる。
この例のサンプル液送給機構において、第二の流路切り替え手段 33を用いて流 路をサンプル液容器 32側に開通した場合、サンプル液用導入排出ポンプ 37を用い て吸引すると、サンプル液容器 32に貯留されたサンプル液は、サンプル液導入排出 口 16、 18を通ってサンプル液収容部 4、 6に導入される。サンプル液の導入量は、液 体検知センサ 34によって監視できる。
電気泳動の終了後、サンプル液を排出する。先ず、第一の流路切り替え手段 35を 用いて給排気口 55とサンプル液用導入排出ポンプ 37とを連通させて、サンプル液 用導入排出ポンプ 37へ空気を吸引する。次いで、第一の流路切り替え手段 35を用 V、て流路をサンプル液用導入排出ポンプ 37とサンプル液収容部 4、 6とを連通させ た状態にして、サンプル液用導入排出ポンプ 37を押出し側に設定して、サンプル液 収容部 4、 6に空気を導入し、サンプル液収容部 4、 6に収容されていたサンプル液を 排出する。 次に、サンプル液収容部 4、 6に洗浄液を導入する。第二の流路切り替え手段 33と 第三の流路切り替え手段 39とを用いて、洗浄液サーバ 38とサンプル液収容部 4、 6 とを連通させた状態にして、洗浄液用導入排出ポンプ 40を吸引側に設定して、洗浄 液サーバ 38に貯留された洗浄液を、サンプル液導入排出口 16、 18からサンプル液 収容部 4、 6へ導入する。洗浄液の導入量は、液体検知センサ 34によって監視できる 洗浄液の排出は次の手順で行う。先ず、第四の流路切り替え手段 36と第一の流路 切り替え手段 35とを用いて、給排気口 55と浄液用導入排出ポンプ 40とを連通させ、 洗浄液用導入排出ポンプ 40へ空気を吸引する。次いで、第三の流路切り替え手段 3 9を排出洗浄液容器 41への排出側に設定し、更に、第一の流路切り替え手段 35を 用いて洗浄液用導入排出ポンプ 40とサンプル液収容部 4、 6とを連通させた状態に して、洗浄液用導入排出ポンプ 40を押出し側に設定して、サンプル液収容部 4、 6に 空気を導入し、サンプル液収容部 4、 6に収容されていた洗浄液を排出する。
尚、これらの洗浄液の導入操作と排出操作は、複数回繰り返すことができる。また、 サンプル液収容部 4、 6に洗浄液を収容した状態で、電極間に電圧をかけて未結合 検体を電気泳動させて除去することもできる。
なお、サンプル液送給機構にぉ ヽては、放射性同位体、変異原等を含むサンプル 液による汚染が問題となる場合は、汚染部分を容易に廃棄できる可とう性配管を一 つ以上の接続口に直接押し当て圧接接続し、或いは配管及び接続口に力ブラ等の 接続手段を設け、接続口と配管の脱着により流路を切り替える流体操作機構を用い ることが好ましい。
この例ではサンプル液用導入排出ポンプ 37と洗浄液用導入排出ポンプ 40が設け られて ヽるが、 1台のポンプによってサンプル液または洗浄液をサンプル液収容部 4 、 6へ導入または排出する構造とすることもできる。さらに、複数種のサンプル液およ び洗浄液を切り替えて使用できるように、流路切り替え手段をさらに加えた構成とす ることちでさる。
この例では、サンプル液収容部 4、 6は、サンプル液送給機構を共有している力 サ ンプル液収容部 4、 6に対してそれぞれ、サンプル液または洗浄液を導入、排出する 液送給機構を独立して設置することもできる。
また、サンプル液収容部 4、 6には、濃度、温度、糸且成のうちの 1つ以上が異なるサ ンプル液または洗浄液を切り替えて導入するサンプル液供給機構を備えることが好 ましい。
例えば洗浄液サーバ 38に貯留された洗浄液と濃度、温度、組成のうち 1つ以上が 異なる洗浄液を貯留した第二の洗浄液サーバを設置し、この第二の洗浄液サーバと 洗浄液サーバ 38の一方に切り替える流路切り替え手段と、洗浄液用導入排出ボン プ 40とによって、洗浄液を最適な条件に維持することができる。
この例では、ノ ッファ液収容部 2、 8にバッファ液を導入、排出する送給機構 (以下、 「バッファ液送給機構」という）が設けられている。図 1に示すように、バッファ液供給機 構は、予め調製されたバッファ液を貯留するバッファ液サーノ 23、 27と、これらバッ ファ液サーバ 23、 27からバッファ液収容部 2、 8へバッファ液を移送するバッファ液送 液ポンプ 24、 28と、これらを接続する配管と、ノ ッファ液収容部 2、 8から排出された ノ ッファ液を排出バッファ液容器 31への排出またはバッファ液サーバ 23、 27との間 の循環に切り替えるバッファ液流路切り替え手段 26、 30とから構成される。バッファ 液サーバ 23、 27は、配管を介して図 3に示すバッファ液導入口 14、 20に接続される 。図 3に示すバッファ液排出口 15、 21にはそれぞれ配管が接続され、これらの配管 は図 1に示す排出バッファ液容器 31およびバッファサーバ 23、 27に至る。
この例のバッファ液送給機構において、バッファ液流路切り替え手段 26、 30を排出 ノ ッファ液容器 31側に開通して設定した場合、ノ ッファ液は、ノ ッファ液送液ポンプ 24、 32によって、バッファ液サーバ 23、 27からバッファ液導入口 14、 20を通ってバ ッファ液収容部 2、 8へ移送され、ついで排出ノ ッファ液容器 31へ排出される。
バッファ液流路切り替え手段 26、 30をバッファ液収容部 2、 8とバッファ液サーバ 23 、 27との間の循環系に設定した場合、ノ ッファ液をバッファ液サーバ 23とバッファ液 収容部 2、ノ ッファ液サーバ 27とバッファ液収容部 8の間でそれぞれ循環できる。 このようなバッファ液送給機構において、バッファ液送液ポンプ 24、 32を連続的あ るいは間欠的に運転して吸引しまたは押し出すことにより、バッファ液収容部 2、 8に ノ ッファ液を連続的あるいは間欠的に導入または排出することができる。なお、ノッフ ァ液層送給機構においては、ノ ッファ液収容部 2、 8に対しバッファ液送液ポンプ 24 、 28と反対側に吸引ポンプを設置することができる。
[0025] また、図 1においては、バッファ液収容部 2、 8にバッファ液を送給するバッファ液送 給機構がそれぞれ独立して設置されているが、これらのうちの一部または全部を共通 のものとして設置することもできる。更に、濃度、温度、組成のうち 1つ以上が異なるバ ッファ液をそれぞれ貯留した複数のバッファ液サーバと、ノ ッファ液送液ポンプと、バ ッファ液収容部 2、 8に導入するバッファ液を各バッファ液サーバ側に切り替える流路 切り替え手段とからなるノ ッファ液供給機構を設けることにより、ノ ッファ液収容部 2、 8に、濃度、温度、組成のうち 1つ以上が異なるバッファ液を切り替えて供給すること ができる。このことにより、バッファ液の濃度、温度、組成等を、ノ、イブリダィゼーシヨン および洗浄に最適な条件に維持することができる。
[0026] 以下に、本発明の実施の第一の形態における好適な使用方法を図 1及び図 2を参 照しつつ説明する。
DNA等の生体関連物質の溶液を調製し、公知の方法で標識してサンプル液とす る。予め調製したサンプル液、ノ ッファ液、洗浄液を、それぞれサンプル液容器 32、 ノ ッファ液サーバ 23、 27、洗浄液サーバ 38に貯留する。まず、第二の流路切り替え 手段 33をサンプル液側に設定し、サンプル液用導入排出ポンプ 37を吸引側に設定 すること〖こよって、サンプル液をサンプル液容器 32からサンプル液収容部 4、 6へ導 入する。
また、バッファ液流路切り替え手段 26、 30をバッファ液収容部 2、 8とバッファ液サ ーバ 23、 27との間の循環系に設定し、ノ ッファ液送液ポンプ 24、 28を運転して、ノ ッファ液をそれぞれ循環させる。
ついで、電極 1を正極、電極 9を負極として電圧を印加して、サンプル液に含まれる DNA検体を泳動させる。例えば、負に荷電した DNA検体は、サンプル液収容部 6 力 ゲル保持層 5の担体ゲル 22の内部へ泳動する。担体ゲル 22に固定された DNA プローブに特異的な DNA検体は、 DNAプローブとハイブリダィズして担体ゲル 22 内に保持される。 DNAプローブに相補的でない DNA検体は、 DNAプローブとハイ ブリダィズせず、サンプル液収容部 4を通過して半透膜 7の方向に泳動する。以下、 DN Aプローブとハイブリダィズして!/ヽな ヽ DNA検体を「未結合検体」と称する。 ここで、電極の正負を反転させて電極 1を負極、電極 9を正極とすれば、未結合検 体は、サンプル液収容部 4から担体ゲル 22の内部へ再び泳動する。従って、電極に 印加して!/ヽる電圧を反転し、未結合検体をサンプル液収容部 4とサンプル液収容部 6との間で往復させれば、 DNAプローブとハイブリダィズする確率を高めることができ る。
電圧を印加している間、ノ ッファ液送液ポンプ 24、 28を運転し続けることにより、バ ッファ液導入口 14、 20からバッファ液収容部 2、 8にバッファ液を導入させると同時に 、電極 1、 9表面に発生したガスをバッファ液とともにバッファ液排出口 15、 21から排 出させる。
電圧の印加を終了した後、第四の流路切り替え手段 36を洗浄液用導入排出ボン プ 40側に設定し、第三の流路切り替え手段 39を導入側に設定して、洗浄液用導入 排出ポンプ 40を吸引側に設定して洗浄液サーバ 38から洗浄液を吸引することにより 、サンプル液収容部 4、 6のサンプル液を洗浄液で置換する。その後、電極 1と電極 9 との間に電圧を印加すれば、負に荷電した未結合検体のみが正極側のサンプル液 収容部へ泳動し、ゲル保持層 5から除去される。ここで、洗浄液用導入排出ポンプ 40 を吸引または押し出して、サンプル液収容部 4、 6の洗浄液を攪拌しながら前記未結 合検体の除去を行なうこともできる。
電圧の印加を終了し、その後、第三の流路切り替え手段 39を排出側に設定して洗 浄液用導入排出ポンプ 40を押し出し側に設定することにより、サンプル液収容部 4、 6から、未結合検体を含む洗浄液を排出洗浄液容器 41へ排出する。
次 ヽでゲル保持層 5を取り出して、サンプル液に用いた標識方法に対応する検出 方法により、担体ゲル 22に保持された生体関連物質を検出する。
本実施形態においてはバッファ液スぺーサ 10、 13の最下部にバッファ液導入口 1 4、 20が形成され、バッファ液スぺーサ 10、 13の最上部にバッファ液排出口 15、 21 が形成されていることが好ましぐこれによつて電圧を印加した際に電極 1、 9付近か ら発生するガスをバッファ液送 2、 8から効率よく排出することができる。この構造であ れば、生体関連物質のサンプル液収容部 4、 6における移動速度、担体ゲル 22中で の拡散速度が改善され、電極 1、 9から発生したガスに起因する絶縁層の形成などの 問題を起こすことなく電気泳動を行うことができ、検出精度が向上する。
また、バッファ液送給機構を用いてバッファ液をバッファ液収容部 2、 8に連続的に 供給できることから、ノ ッファ液収容部 2、 8および半透膜を介してこれらと接するサン プル液収容部 3、 7において、イオン濃度を均一にすることができ、検出の精度を上 げることができる。
[0028] この例では、バッファ液収容部 2、 8に供給されるバッファ液を所定の温度に加熱も しくは冷却するための温度調節機構が設けられて 、る。
図 1に示すように、温度調節機構は、バッファ液収容部 2、 8に流入するバッファ液 を加熱もしくは冷却する熱交換器 25、 29と温度制御装置 42とで構成される。
このような温度調節機構では、温度制御装置 42に予め設定した信号にしたがって 熱交^^ 25、 29を運転してバッファ液を加熱または冷却することにより、バッファ液 収容部 2、 8を所望の温度に保つことができ、さらには半透膜 3、 7を介してサンプル 液収容部 4、 6のサンプル液とゲル保持層 5の担体ゲル 22の温度を一定に保持する ことができる。
バッファ液を加熱、冷却する方式としては、特に限定されるものでなぐ例えば熱交 翻 25、 29と温度制御装置 42との間で熱媒を循環させる熱媒循環方式や、熱交換 器 25、 29としてペルチェ素子を用いて加熱'冷却を行う方式を用いることができる。 更に、サンプル液収容部 4、 6の内部もしくは外部近傍に熱電対等の温度検出素子 を設け、該温度検出素子の信号に応じてバッファ液の温度を最適に調節する機構を 付カロすることちできる。
[0029] この例では、電極 1と電極 9は、電気配線および信号発生機構を介して接続されて いる。信号発生機構は、外部信号によって任意の波形を設定し、或いは選択し、出 力電圧を設定し、出力のオン Zオフを制御できる任意波形発生器 43と、予め定めら れた順序および時間に従って任意波形発生器 43に制御信号を送出する協調制御 装置 44とから構成されている。この信号発生機構を用いて、電気泳動部に直流を含 む任意の波形を有する任意の電圧を予め定められた順序、および時間に従って印 カロすることがでさる。 [0030] この例では、任意波形発生器 43と、温度制御装置 42と、バッファ液送液ポンプ 24 、 32と、サンプル液または洗浄液の導入量や温度等を監視する液体センサ 34と、バ ッファ液流路切り替え手段 26と、第二の流路切り替え手段 33と、第一の流路切り替 え手段 35と、第三の流路切り替え手段 39とを、それぞれ協調制御装置 44に信号回 線で接続してなる協調制御機構が設置されて 、る。
このような協調制御機構にぉ 、ては、液体センサ 34により検知されたサンプル液ま たは洗浄液の導入量や温度等の信号が、協調制御装置 44に送信され、協調制御 装置 44から、バッファ液送液ポンプ 24、 28、温度制御装置 42、任意波形発生器 43 へ、これらの作動を制御する信号が送信される。
このような協調制御機構を用いることにより、ノ ッファ液送給機構およびサンプル液 送給機構を協調させ、あるいはバッファ液送給機構、サンプル液送給機構および信 号発生機構を協調させることができる。したがって、ノ ッファ液やサンプル液の温度、 組成、濃度、並びにゲル保持層 5に印加される電流等を最適条件に維持して電気泳 動を継続することができる。
さらに、流路切り替え手段の作動および温度調節機構の作動を協調させて実行す ることちでさる。
[0031] 図 4一図 6は、本発明の実施における第二の形態の電気泳動装置であり、ゲル保 持層の片側のみにサンプル液収容部 4が配置された構造を有する。
この例では、本発明の実施における第一の形態と同様に、サンプル液がサンプル 液容器 32からサンプル液収容部 4へ導入される。電極 1を負極、電極 9を正極として 電圧を印加した場合、サンプル液収容部 4に含まれる負電荷の検体は、印加された 電圧によってサンプル液収容部 4からゲル保持層 5の担体ゲル 22の内部へ泳動する 。負荷電の検体のうち、担体ゲル 22に保持された DNAプローブに相補的な DNA検 体は、 DNAプローブとハイブリダィズして担体ゲル 22内に保持される。また DNAプ ローブに非相補的な検体はゲル保持層 5を通過して半透膜 7にせき止められ半透膜 7とゲル保持層 5との間に濃縮される。
ここで、電極に印加している電圧を反転させ、電極 1を正極、電極 9を負極とすれば 、負電荷の未結合検体はサンプル液収容部 4へ泳動する。このサンプル液収容部 4 の未結合検体は排出洗浄液容器 41へ排出される。
実施例
[0032] (実施例 1) (ゲル保持層用 DNAチップの製造）
縦 35mm、横 35mm、厚さ 0. 1mmの SUS304製板の中央部 2. lmm X 2. lmm の範囲に、直径 0. 32mmの孔が縦横各方向に 0. 42mm間隔で 5行、 5列に 25個 設けられた多孔板を 2枚準備した。これらの多孔板を積層し、その各孔に、ポリカーボ ネート製中空繊維（外径 0. 28mm,内径 0. 16mm、長さ 100cm)を通した。次いで 、 2枚の多孔板の位置が中空繊維の一方の端部から 10cmと 60cmの位置となるよう に多孔板の間隔を 50cmに広げ、さらにこれらの多孔板とその間の中空繊維束の周 囲を厚さ 10mmのポリテトラフルォロエチレン製板で囲った。
次に、この囲いの中にカーボンブラック（三菱ィ匕学 (株)製、 MA1000)で着色した ポリウレタン榭脂（日本ポリウレタン工業 (株)製、 -ッポラン 4276,コロネート 4403) を流し込んだ。引き続き、室温で 1週間静置し、榭脂を硬化させた。その後、多孔板と ポリテトラフルォロエチレン製板の囲いを取り除き、 20mm、 20mm,長さ 50mmの角 柱力もなる中空繊維配列体を得た。この中空繊維配列体には、その断面の中央部 2 . lmm X 2. lmmの範囲に 25本の中空繊維が配列されていた。
N, N—ジメチルアクリルアミド： 4. 5質量部、 N, N—メチレンビスアクリルアミド： 0. 5 質量部、 2, 2'—ァゾビス（2—アミジノプロパン）二塩酸塩： 0. 1質量部、水： 95重量部 からなる組成の混合溶液を調製した。この混合溶液を中空繊維配列体の 22本の中 空繊維の中空部に導入した。残り 3本の中空繊維の中空部には、前記混合溶液に対 して更に 40塩基の DNAを濃度が 5nmolZmlになるように添加した溶液を導入した 。次いで、 70°Cで 3時間かけて重合させ、中空繊維の中空部にゲル状物を生成させ た。その後、ミクロトームを用いて中空繊維軸と直角方向に、厚みが 0. 5mmとなるよ うに薄片を切り出した。更にその周囲をトリミングして 12mm X 12mm X 0. 5mmの D NAチップを得た。
[0033] 次いで以下の部品を用いて図 1一 3に示す電気泳動装置を組み立てた。即ち、ゲ ル保持層 5としてこの DNAチップを用い、半透膜 3、 7としてスペクトラム社製「スベタ トロポア」（カットオフ分子量： 3500)力もなる半透膜を用いた。また、ブチルゴム製の バッファ液スぺーサ 10、 13、ブチルゴム製のサンプル液スぺーサ 11、 12、及び白金 製の電極 1、 9を用いて図 1の構成に配列させ、圧接して電気泳動部 102を組み立て た。また、任意波形発生装置 43を電極 1、 9に接続して、熱交換器 25、 29、及び温 度制御装置 42設置した。
バッファ液収容部のサイズは縦 8mm、横 8mm、厚み 2mm、容積は 128 μ 1であり、 サンプル液収容部のサイズは縦 8mm、横 8mm、厚み lmm、容積は 64 μ 1であった
[0034] まず、バッファ液サーバ 23、 27に 0. 5 ΧΤΒ- 15mM NaCl溶液を各々 50ml入れ 、バッファ液流路切り替え手段 26、 30を共に循環側に設定して、バッファ液送液ボン プ 24、 28を運転し、バッファ液サーバ 23とバッファ液収容部 2の間、バッファ液サー ノ 27とバッファ液収容部 8の間で、それぞれバッファ液を循環させた。このとき、バッ ファ液導入口 14、 20を通してバッファ液収容部 2、 8の最下部からバッファ液を導入 させ、バッファ液排出口 15、 21を通してバッファ液収容部 2、 8の最上部からバッファ 液を排出させた。バッファ液の温度は、温度制御装置 42を用いて 45°Cに設定した。
Cy5染料 (励起波長 635nm、検出波長 660nm)で標識されており、 DNAチップ内 に前記基材ゲルと共に固定された DNA (以下「プローブ A」という）と相補的に結合し うる 40塩基対の DNA検体 aの lOOfmolと、 Cy3染料 (励起波長 530nm、検出波長 570nm)で標識されており、プローブ Aと相補的に結合しな ヽ 40塩基対の DNA検 体 bの lOOfmolとを、 0. 5 XTB- 15mMNaCl溶液 100 /z lに溶解してサンプル液と した。このサンプル液をサンプル液容器 32に貯留した後、第四の流路切り替え手段 36をサンプル液側に設定し、サンプル液用導入排出ポンプ 37を吸引側に設定して サンプル液を吸引し、サンプル液収容部 4、 6に導入した。
洗浄液として 0. 5 XTB- 15mMNaCl溶液を調製し、洗浄液サーバ 38に貯留した
[0035] 電極 1が正極、電極 9が負極になるように、任意波形発生器 43により直流電圧を印 カロして、サンプル液に含まれる DNA検体 aおよび DNA検体 abを泳動させた。このと きの印加電圧は 3V、印加時間は 10分であった。
その後、サンプル液用導入排出ポンプ 37を押し出し側に設定して、サンプル液を サンプル液収容部 4および 6から排出洗浄液容器 41へ排出した。引き続いて、第四 の流路切り替え手段 36を洗浄液側に設定し、第三の流路切り替え手段 39を導入側 に設定して、洗浄液用導入排出ポンプ 40を用いて洗浄液サーバ 38から洗浄液を吸 引し、サンプル液収容部 4および 6のサンプル液を洗浄液で連続的に置換することに より、未結合検体をサンプル液収容部 4および 6から除去した。
次に、電極 1が負極、電極 9が正極となるように、任意波形発生装置 43を用いて直 流電圧を逆向きに印加することにより、ゲル保持層 5からプローブ Aと結合していない DNA検体を除去した。このときの印加電圧は 3V、時間は 10分であった。
電圧の印加を終了後、ゲル保持層 5を取り出し、励起波長 532nmおよび 633nm の蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、ゲル保持層 5の 25箇所の担体ゲル部のうちプローブ Aが固定されてい る 3個所でのみ Cy5染料が発する蛍光を検出できた。一方 Cy3染料が発する蛍光は 、何れの個所からも検出されな力つた。
[0036] (比較例 1)
電気泳動によって DNA検体の濃縮とプローブとのハイブリダィズを行う代わりに、 電圧を印加しないで 10分間静置する以外はすべて実施例 1と同様にハイブリダィズ および洗浄を行 ヽ、実施例 1と同様に DNAチップカゝらなるゲル保持層 5を蛍光顕微 鏡で観察した。
その結果、ゲル保持層 5においてプローブ Aが固定化されている 3か所でのみ、 Cy 5染料が発する蛍光を検出することができたが、その蛍光強度は実施例 1に比較して 1Z 10以下であった。
[0037] (比較例 2)
図 7に示すように、ノ ッファ液収容部 2、 8と半透膜 3、 7を有しない電気泳動装置を 用いたこと以外は、実施例 1とすべて同様にハイブリダィズおよび電気泳動による洗 浄を行い、実施例 1と同様にゲル保持層 5を蛍光顕微鏡で観察した。
その結果、ゲル保持層 5にお 、て 25箇所のどの個所にぉ ヽても Cy5染料が発する 蛍光および Cy3染料が発する蛍光の両方が検出されな力つた。電気分解に起因す る電極反応による核酸検体の変質によりハイプリ効率が低下したものと思われる。

Claims

請求の範囲
[1] ゲル保持層と、前記ゲル保持層の両方または一方の外側に配置された 2つまた は 1つのサンプル液収容部と、前記サンプル液収容部の両外側に配置された 2つの 半透膜と、前記半透膜の両外側に配置されたバッファ液収容部と、前記バッファ液収 容部の両外側に配置された一対の電極とを有し、サンプル液収容部とバッファ液収 容部とにはそれぞれ少なくとも 1つの液出入り口が設けられた電気泳動装置。
[2] ゲル保持層と、前記ゲル保持層の両方または一方の外側に配置された 2つまたは 1つのサンプル液収容部と、前記サンプル液収容部の両外側に配置された 2つの半 透膜と、前記半透膜の両外側に配置されたバッファ液収容部とを有し、サンプル液収 容部とバッファ液収容部とにはそれぞれ少なくとも 1つの液出入り口が設けられ、バッ ファ液収容部の液出入り口は電極を兼ねている電気泳動装置。
[3] バッファ液収容部にバッファ液を導入及び Z又は排出する第一の送給機構が接続 された請求項 1又は 2に記載の電気泳動装置。
[4] サンプル液収容部にサンプル液又は洗浄液を導入及び Z又は排出する第二の送 給機構が接続された請求項 1又は 2に記載の電気泳動装置。
[5] サンプル液収容部の最下部にサンプル液又は洗浄液を導入または排出する導入 排出口が形成され、サンプル液収容部の最上部にサンプル液又は洗浄液を導入ま たは排出するための給排気口が形成された請求項 4に記載の電気泳動装置。
[6] ノ ッファ液収容部の最下部にバッファ液を導入する導入口が形成され、バッファ液 収容部の最上部にバッファ液を排出する排出口が形成された請求項 1又は 2に記載 の電気泳動装置。
[7] バッファ液収容部に導入するバッファ液を所定の温度に加熱もしくは冷却するため の温度調節機構が備えられた請求項 1又は 2に記載の電気泳動装置。
[8] ノ ッファ液収容部に、濃度、温度、組成のうちの 1つ以上が異なるノ ッファ液を切り 替えて導入するためのノ ッファ液供給機構が備えられた請求項 1又は 2に記載の電 気泳動装置。
[9] 電極に、予め定めた順序および時間に従って、任意の波形及び Z又は電圧を印 加するための信号発生機構が備えられた請求項 1又は 2に記載の電気泳動装置。
[10] ノ ッファ液収容部に、濃度、温度、組成の内の 1つ以上が異なるノ ッファ液を切り替 えて導入するためのノ ッファ液供給機構と、電極に、予め定めた順序および時間に 従って任意の波形及び又は電圧を印加するための信号発生機構と、バッファ液供給 機構と信号発生機構の作動を協調させるための協調制御機構とが備えられた請求 項 1又は 2に記載の電気泳動装置。
[11] サンプル液収容部に、濃度、温度、組成のうちの 1つ以上が異なるサンプル液又は 洗浄液を切り替えて導入するためのサンプル液供給機構と、このサンプル液供給機 構とバッファ液供給機構と信号発生機構とサンプル液供給機構の作動を協調させる ための協調制御機構とが備えられた請求項 10に記載の電気泳動装置。
[12] ゲル保持層が、貫通孔がーつ以上設けられた多孔平板の貫通孔の中に保持され たゲル状物の層であって、このゲル状物に生体関連物質が結合されたものである請 求項 1又は 2に記載の電気泳動装置。
[13] 生体関連物質力 ¾NAプローブである請求項 12に記載の電気泳動装置。
[14] 請求項 1又は 2に記載の電気泳動装置を用いて、サンプル液収容部にサンプル液 または洗浄液を導入する工程と、ノ ッファ液収容部にバッファ液を導入した状態で、 一対の電極間に電圧を印加する工程とを有する電気泳動法。
[15] サンプル液収容部にサンプル液又は洗浄液を連続的または間欠的に導入または 排出する請求項 14に記載の電気泳動法。
[16] バッファ液収容部にバッファ液を連続的または間欠的に導入または排出する工程 を有する請求項 14に記載の電気泳動法。
[17] ノ ッファ液収容部の最下部の液出入り口からバッファ液を導入する工程と、ノ ッファ 液収容部の最上部の液出入り口からバッファ液を排出する工程とを有する請求項 14 に記載の電気泳動法。
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