WO2005028652A1 - 新規hcv株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 - Google Patents

新規hcv株由来の核酸、遺伝子、及び該遺伝子を利用したレプリコン複製細胞 Download PDF

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rna
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Takaji Wakita
Takanobu Kato
Tomoko Date
Michiko Miyamoto
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Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research
Toray Industries, Inc.
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the present invention relates to nucleic acids and genes derived from a novel strain of fulminant hepatitis C virus, and HCV replicons and replicon-replicating cells using the genes. Background technology
  • Hepatitis C virus is a virus belonging to the Flaviviridae family and having a single-stranded (+)-sense RNA as its genome, and is known to cause hepatitis C. Has been. Recent studies have shown that hepatitis C virus can be classified into multiple types by genotype or serotype. According to phylogenetic analysis using the nucleotide sequence of HCV strains by Sin mds et al., Which is the mainstream HCV genotype classification method, HCV is genotype la, genotype lb, genotype 2a, genotype 2b, genotype There are 6 subtypes, 3a genotype and 3b genotype, each of which is further classified into several subtypes (Simmonds, P.
  • the current main treatment for hepatitis C is given by combination therapy with interferon- ⁇ , inhalation-feron- ⁇ , and interferon, a single purine-nucleoside derivative, ribavirin.
  • interferon- ⁇ inhalation-feron- ⁇
  • interferon a single purine-nucleoside derivative
  • ribavirin a single purine-nucleoside derivative
  • RNA having autonomous replication ability has recently been produced as RNA having autonomous replication ability derived from HCV (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-187187; Lomann et al., Science, (1999)). 285, 110-113; Blight et al., Science, (2000) 290, 1972-1974; Friebe et al., (2001) 75, 12047-12057; Ikeda et al., J.
  • Virol., ( 2002) 76 2997-3006;) has made it possible to analyze HCV replication channels using cultured cells.
  • These HCV subgenomic RNA replicons ligate a structural protein downstream of HCV IRES in the 5 'untranslated region of HCV genomic RNA of the clone Con 1 belonging to genotype lb to the neomycin resistance gene and its downstream. Replaced by EMCV-IRES.
  • This RNA replicon has been proven to replicate autonomously in Huh7 cells when introduced into human hepatoma cells Huh7 and cultured in the presence of neomycin.
  • the HCV replication evaluation system using the RNA replicon system is considered to be a powerful tool for the development of anti-HCV drugs.
  • HCV with different genotypes encode different viral proteins, and it is difficult to fully understand the mechanism of HCV replication simply by analyzing subgenomic RNA replicons derived from HCV with genotype lb. it is conceivable that. Furthermore, since the therapeutic effect of interferon varies depending on the genotype of HCV, we will develop anti-HCV drugs that exert effects on various types of HCV using only the HCV replication system containing the subgenomic RNA replicon of HCV genotype lb. Especially difficult it is conceivable that. Therefore, it may be necessary to produce HCV RA replicons of many genotypes and study HCV replication mechanisms and anti-HCV drugs.
  • HCV HCV-related proteins that can be used as vaccines in large quantities can not be produced stably in a form that exists in vivo. Since HCV-related proteins are expressed in the HCV replicon cells described above (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-187187), it is considered possible to use the HCV replicon cells. However, in order to manufacture vaccines industrially, it is necessary to use cells that can be cultured in large amounts. From this point of view, Huh7, which is currently the only HCV RNA replicon-replicating cell, is not considered suitable for vaccine production.
  • cells suitable for vaccine production for example, cells such as HeLa cells which can be cultured in a very large amount in a suspension culture system can be considered.
  • the sequence of HCV differs depending on the genotype, it is necessary to produce vaccines for each genotype.
  • Huh7 cells have not been confirmed to be susceptible to HCV infection also suggests that they are not suitable for establishing a cell culture system in which HCV autonomously replicates. Therefore, it is necessary to establish a cell culture system in which HCV autonomously infects and replicates using other liver cancer cells.
  • An object of the present invention is to provide HCV replicon RNA capable of producing HCV replicon RNA with high probability and high replication efficiency and HCV protein in a continuous mass production.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems.As a result, the use of a replicon derived from HCV strain JFH2.1 or Jra2. Of a fulminant hepatitis C patient has a high probability of high replication efficiency. The present inventors have found that replicon-replicating cells can be obtained, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a nucleic acid comprising the following polynucleotide (a), (b) or (c).
  • the present invention also provides the following nucleic acids (1) to (6) constituting the nucleic acid.
  • a nucleic acid consisting of the following polynucleotide (a) or (b):
  • nucleic acid consisting of the following polynucleotide (a) or (b):
  • nucleic acid comprising the following polynucleotide (a) or (b):
  • nucleic acid consisting of the following polynucleotide (a) or (b):
  • nucleic acid consisting of the following polynucleotide (a) or (b):
  • nucleic acid consisting of the following polynucleotide (a) or (b):
  • the present invention also provides a gene comprising each of the nucleic acids, and a polypeptide encoded by the gene.
  • the present invention also provides a replicon RNA comprising the following RNA (a) or (b).
  • RNA containing the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4
  • the present invention also provides a replicon RNA comprising the following KNA (a) or (b).
  • the present invention also provides a method for producing a replicon-replicating cell by introducing the above-mentioned replicon RNA into an appropriate cell, and a method for producing a replicon-replicating cell.
  • Replicated cells are also provided. Examples of cells used for the replicon-replicating cells include human liver-derived cells, human cervix-derived cells, and human fetal kidney-derived cells, and more specifically, Huh7 cells, HepG2 cells, IMY-N9 cells, HeLa cells or 293 cells are listed.
  • the present invention also provides a method for promoting or suppressing the replication of hepatitis C virus, which comprises culturing the above-mentioned replicon-replicating cells in the presence of a test substance, and detecting the replication of replicon RNA in the obtained culture. Also provided is a method of screening for a substance.
  • the present invention also includes a step of obtaining replication replicon RNA from the replicon-replicating cells, and introducing the obtained replication replicon RNA into another cell to produce a new replicon-replicating cell one or more times.
  • a method for increasing the replication efficiency of the hepatitis virus rev "U-con RNA In this method, the replication efficiency is increased by at least two-fold compared to the replication efficiency of the replicon RNA introduced into the replicon-replicating cells. Is preferred.
  • the present invention also includes one or more steps of obtaining a replication replicon RNA from the replicon-replicating cell, and introducing the obtained replication replicon RNA to a cell different from the replicon-replicating cell to produce a new replicon-replicating cell.
  • a method for producing a replicon RNA of hepatitis C virus having an increased replication efficiency comprising: obtaining a replicon RNA from a finally obtained replicon-replicating cell.
  • the present invention provides a method for detecting a base mutation or an amino acid mutation between a replicon RNA produced by the method and having an increased replication efficiency and a replicon RNTA first introduced into a replicon-replicating cell; and
  • the present invention also provides a method for producing a replicon RNA of hepatitis V virus with increased replication efficiency, which comprises introducing the detected base mutation or amino acid mutation into the replicon RNA to be increased.
  • replicon RNA and replicon-replicating cells having high replication efficiency and high probability can be obtained.
  • This replicon replicating cell Can be used as a culture system for continuously producing HCV-derived RNA and HCV protein. Further, the replicon-replicating cells can also be used as a test system for screening various substances that affect HCV replication or HCV protein translation.
  • FIG. 1 shows the structures of plasmid DNAs pJFH-2.1 and pJFH-2.2 (upper), and the structures of plasmid DNAs PSGREP-JFH2.1 and pSGREP-JFH2.2 (lower).
  • FIG. 2 is a photograph showing the formation of a mouth knee of rSGREP-JFH2.1 or rSGREP_JFH2.2 transfection cells. This description includes part or all of the contents as disclosed in the description of Japanese Patent Application No. 2003-32092, which is a priority document of the present application. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the genome of hepatitis C virus is a single-stranded (+) strand of about 9600 nucleotides.
  • This genomic RNA has a 5 'untranslated region (also referred to as 5' NTR or 5 'UTR), a translated region composed of a structural region and a non-structural region, and a 3' ⁇ translated region (3 'NTR or 3' IITR).
  • the structural region encodes structural proteins of HCV, and the non-structural region encodes multiple non-structural proteins.
  • HCV HCV
  • NS2, NS3, NS4A, NS4B NS5A, and NS5B are translated from the translation region as a series of polypeptides. Released and produced by limited degradation by proteases.
  • Core is the core protein
  • E1 and E2 are envelope proteins
  • nonstructural proteins are proteins involved in the replication of the virus itself. It is.
  • NS2 is meta-oral protease activity
  • NS3 is serine It is known to have oral protease activity (N-terminal third) and helicase activity (C-terminal two-thirds).
  • NS4A is a cofactor for the protease activity of NS3, and that NS5B has RNA-dependent RNA polymerase activity.
  • the present inventors did not classify HCV genotypes in general, but used HCV genomes isolated from patients with fulminant hepatitis and selected them based on the criteria of HCV. RNA capable of autonomous replication in these cells was constructed.
  • RNA having autonomous replication ability and produced by modifying a natural HCV virus genome is referred to as “rebricon RNA” or “RNA replicon”.
  • the term “gene” means “a nucleic acid that carries a specific function or information related to a life activity” among nucleic acids, and includes both RNA and DNA.
  • Nucleic acids and genes may be single-stranded (cDNA, cRNA, etc.) or double-stranded, and may be natural or artificially synthesized. Further, it may be partially modified or a derivative.
  • the base sequence in the sequence listing is shown as RNA, but when the gene is DNA, the base symbol “ ⁇ ” should be read as “ ⁇ ”.
  • fuller hepatitis refers to hepatitis that exhibits encephalopathy of degree II or more and prothrombin time of 40% or less within eight weeks after the onset of symptoms, and acute encephalopathy in which encephalopathy appears within ten days. Type and the subacute type, in which encephalopathy appears thereafter.
  • Hepatitis C virus from a patient with fulminant hepatitis means HCV isolated from a patient with this “fulminant hepatitis” symptom.
  • hepatitis C virus from fulminant hepatitis patients or “fulminant strain HCV” includes not only viruses having naturally-occurring HCV genomic RNA but also artificially derived HCV genomic sequences. It also includes viruses having genomic RNA that has undergone a major modification. Specific examples of fulminant strains of HCV include JFH-1 strain (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-171798), and JFH-2.1 and JFH-2.2 strains. Viruses.
  • 5 'untranslated region (5' NTR or 5 'UTR)
  • sequence encoding NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein "Core protein Coding sequence (Core region or C region) ", “Sequence encoding E1 protein (E1 region)”, “Sequence encoding E2 protein (E2 region)”, “Sequence encoding N2 protein (NS2 region)”, “Sequence encoding NS3 protein (NS3 region) Region), NS4A protein-encoding sequence (NS4A region), NS4B protein-encoding sequence (NS4B region), NS5A protein-encoding sequence (NS5A region), NS5B protein-encoding sequence (NS5B region) "and” 3 'untranslated region (3'11 or 3'1 ⁇ 1) "and other specific regions or sites are JFH-, a hepatitis C virus derived from
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 was obtained by aligning the specific HCV RNA sequence with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOs: 1, 3 and 4. Is the ⁇ 5 'untranslated region' 'of the RNA, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is ⁇ the sequence encoding the NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein.' '
  • the sequence of numbers 1 to 1893 is "sequence encoding NS3 protein”
  • the sequence of base numbers 1894 to 2055 is “sequence encoding NS4A protein”
  • the sequence of base numbers 2056 to 2838 is "sequence encoding NS4B protein”
  • the sequence of base numbers 2839 to 4236 is a “sequence encoding NS5A protein”
  • the sequence of base numbers 4273 to 6012 is “seque
  • the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5 is the ⁇ sequence encoding NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein '', and the sequence having the same nucleotide number from 1 to 1893 is ⁇
  • the sequence encoding the NTS3 protein ", the sequence with nucleotide numbers 1894 to 2055 is the" sequence encoding the NS4A protein ", the sequence with the nucleotide numbers 2056 to 2838 is the" sequence encoding the NS4B protein ", the nucleotide number 2839.
  • the sequence of 44236 is the “sequence encoding the NS5A protein”
  • the sequence of base numbers 4273 to 6012 is the “sequence encoding the NS5B protein”
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the “3 ′ untranslated region” .
  • the gene according to the present invention includes, in addition to the polynucleotide containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NOS: 1 to 6 above, a polynucleotide that hybridizes with the gene under stringent conditions, as described above. As long as the protein is encoded, it is included in the gene of the present invention.
  • the stringent condition means that 6XSSC (the composition of a 1-fold concentration SSC solution is composed of 150 mmol / l sodium chloride and 15 mol / l sodium taenoate) is hybridized at 60 ° C. After washing, conditions are such that washing is performed at 68 ° C in 1 XSSC containing 0.1% SDS.
  • a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a southern hybridization method, or the like can be used. Eds., ⁇ Ambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press.
  • the nucleic acid or gene of the present invention may have gaps, additions, deletions, substitutions, and the like in its sequence as long as they encode the desired protein described above.
  • one or more bases that is, 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, and more preferably Is a polynucleotide comprising a nucleotide sequence in which 1 to 6, most preferably 1 to several (2 to 5) bases have been deleted, replaced or added, As long as you code:
  • the polynucleotide containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 encodes the NS3, NS4A, NS4B, NS5A and NS5B proteins among the HCV proteins, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 5 Is a 5 'untranslated region of the HCV gene, and a polynucleotide containing the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or 6 is a 3' untranslated region of the HCV gene
  • polynucleotide containing a base sequence may also be referred to as "base sequence containing a base sequence”
  • the above “specific HCV” is not limited to the JFH-2.1 strain and the JFH-2.2 strain, but also includes virus strains that are derivatives thereof.
  • HCV replicon RNA comprises a 5 'untranslated region, a genomic RNA of hepatitis C virus derived from fulminant hepatitis, a NS3 protein and an NS4A protein.
  • a replicon RNLA comprising a nucleotide sequence containing at least a sequence encoding a protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein, and a 3 ′ untranslated region.
  • the replicon RNA may further comprise one IRES sequence, which may further comprise one selectable marker gene or reporter gene.
  • this replicon RNA contains a sequence encoding a virus protein other than NS3, NS4A, NS4B, NS5A, or NS5B protein on the genomic RNA of hepatitis C virus other than JFH2.1 and JFH2.2. You may go out.
  • HCV replicon RNA comprises a 5 'untranslated region consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, at least one selectable marker gene or reporter gene, and at least one IRES 3 ′ non-translated sequence comprising a sequence, a nucleotide sequence encoding NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein and NS5B protein on HCV genomic RNA represented by SEQ ID NO: 1, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4
  • a polynucleotide comprising a region: a 5 'untranslated region consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, at least one selectable marker gene and / or reporter gene, and at least one IRES gene;
  • the replicon RNA according to the present invention preferably has a 5 ′ untranslated region on the genomic RNA of HCV of SEQ ID NO: 3 or 5 at the most 5 ′ side, and an H (SEQ ID NO: It has a 3 'untranslated region on the genomic RNA.
  • the selectable marker gene or reporter gene may be linked upstream of the IRES sequence, or may be selected from "NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B.
  • It may be linked upstream or downstream of the ⁇ sequence encoding the protein '' or may be inserted into the ⁇ sequence encoding the NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein and NS5B protein '' .
  • the replicon RNA according to the present invention more preferably has a 5 ′ untranslated region on the H (TV genomic RNA) of SEQ ID NO: 3 or 5, and further comprises a selectable marker gene or reporter gene downstream thereof, and an IRES sequence.
  • H TV genomic RNA
  • NS3 protein, NS4A protein, And a sequence encoding the NS4B protein, the NS5A protein, and the NS5B protein in this order, and the 3'-most region has a 3 'untranslated region on the genomic RNA of HCV derived from a fulminant hepatitis patient.
  • One more preferred embodiment of the HCV replicon RNA according to the present invention is a replicon RNA consisting of an RNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8. Further, it also includes a nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a gene consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 or 8. Furthermore, this SEQ ID NO: 7 is one or more bases, that is, 1 to 50, preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, more preferably 1 to 10 in the base sequence represented by 8.
  • a replicon RNA consisting of up to 6, most preferably 1 to several (2 to 5) bases deleted, substituted or added, and having autonomous replication ability, Suitable embodiments are within the scope of the present invention.
  • “having an autonomous replication ability” means that when the replicon RNA is introduced into a cell, the replicon RNA can replicate the full length of the replicon RNA itself in the meniscus.
  • this autonomous replication ability can be achieved, for example, by transfection of replicon RNA into Huh7 cells, culturing the Huh7 cells, and introducing the transfected replicon RNA from RNA extracted from Itoda cells in the resulting culture. It can be confirmed by performing Northern blot hybridization using a probe capable of specifically detecting RNA to detect the presence of replicon RNA.
  • the specific operation for recognizing the autonomous replication ability can be performed according to the description in Examples of the present specification, such as measurement of colony formation positivity, confirmation of HCV protein expression, detection of replicon RNA, etc. .
  • the replicon RNA according to the present invention may include, in addition to the above-described sequence, RNA containing any foreign gene desired to be expressed in cells into which the replicon RNA is introduced.
  • the foreign gene may be linked downstream of the 5 ′ untranslated region, or may be linked upstream or downstream of the selectable marker gene or reporter gene, or ⁇ NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, It may be linked upstream or downstream of the ⁇ sequence encoding the NS5A protein and NS5B protein '' or in the ⁇ sequence encoding the NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein and NS5B protein ''. May be inserted.
  • Replicon RNA containing foreign gene Can express a protein encoded by the foreign gene when translated in the introduced cell. Therefore, the replicon RNA containing the foreign gene can be suitably used even when the purpose is to produce a specific gene product in a cell, such as in gene therapy.
  • selectable marker gene means a gene capable of imparting selectivity to a cell such that only the meniscus in which the gene is expressed is selected.
  • a common example of a selectable marker gene is an antibiotic resistance gene.
  • suitable selectable marker genes in the present invention include a neomycin ⁇ gene, a thymidine kinase gene, a kanamycin resistance gene, a pyrithiamine resistance gene, an adenylyltransferase gene, a zeocin resistance gene, and a euromycin resistance gene.
  • the neomycin resistance gene and the thymidine kinase gene are preferred, and the neomycin resistance gene is more preferred.
  • reporter gene means a marker gene encoding a gene product that serves as an indicator of the gene expression.
  • a typical example of a reporter gene is a structural gene of an enzyme that catalyzes a luminescence reaction or a color reaction.
  • suitable reporter genes in the present invention include the chloramphenico-l-acetyltransferase gene derived from the transposon Tn9, the jS dalk mouth nidase or jS galactosidase gene derived from Escherichia coli, the luciferase gene, the green fluorescent protein gene, and the jellyfish-derived Iklion.
  • SEAP secretory placental alkaline phosphatase
  • Either one of the above-mentioned selectable marker gene and reporter gene may be contained in the lebricon RNA, or both may be contained.
  • the "IRES sequence" in the present invention means an internal ribosome binding site capable of binding ribosomes to the inside of RNA to initiate translation.
  • Suitable examples of the IRES sequence in the present invention include, but are not limited to, EMCV IRES (internal liposome binding site of encephalomyocarditis virus), FMDV IRES IHCV IRES, and the like. , EMCV IRES, and HCV IRES are more preferred, and EMCV IRES is most preferred.
  • the replicon RNA according to the present invention may further contain a lipozyme.
  • the lipozyme is selected from a selectable marker gene, a ribonucleic acid gene, or a foreign gene in the 5′-side replicon RNA, and a 3 ′ side And the sequence encoding NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein so that they are linked to each other, and both are cleaved and separated by the ribozyme self-cleaving activity. You can do so.
  • a selectable marker gene, a reporter gene, a sequence encoding a viral protein on genomic RNA of hepatitis C virus derived from fulminant hepatitis patient, a foreign gene, and the like as described above are included in the replicon RNA. It is ligated so that it is translated in the correct reading frame from RNA.
  • the sequence encoding the protein is the sequence encoding the NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein of hepatitis C virus derived from fulminant hepatitis patients. After being expressed as a fusion protein together with the polyprotein translated from "", they may be linked to each other via a protease cleavage site or the like so as to be separated into each protein by a protease.
  • HCV replicon RNA can be prepared using any genetic engineering technique known to those skilled in the art. Although not limited, HCV replicon RNA can be produced, for example, by the following method.
  • RNAs of NS3 protein, NS4A protein, NS4B protein, NS5A protein, and NS5B protein SEQ ID NO: 1 or 2 and 3 'untranslated region (SEQ ID NO: 4 or 6).
  • the DNA is inserted into a cloning vector by a conventional method to prepare a DNA clone.
  • the 5 ′ untranslated region (SEQ ID NO: 3 or 5) is inserted downstream of the RNA motor to produce a DNA clone.
  • DNA corresponding to RNA means a DNA consisting of a base sequence in which ⁇ ( ⁇ racil) is replaced with ⁇ (thymine) in the base sequence of the RNA.
  • RNA promoter is preferably contained in a plasmid clone. Suitable RNA promoters include, but are not limited to, the 7 RNA promoter, the SP6 RNA promoter, and the SP3 RNA promoter, with the 7 RNA promoter being particularly preferred.
  • RNA promoters include, but are not limited to, the 7 RNA promoter, the SP6 RNA promoter, and the SP3 RNA promoter, with the 7 RNA promoter being particularly preferred.
  • Insert RES sequence Furthermore, downstream of the IRES sequence, DM consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 1 or 2 and DNi consisting of the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 4 or 6 are ligated in this order.
  • RNA is synthesized by RNA polymerase using the DNA clone prepared above as type II.
  • RNA synthesis can be started from the 5 'untranslated region and the IRES sequence in a conventional manner.
  • the type III DNA is a plasmid clone
  • the above DNA region linked to the downstream of the RNA promoter: ⁇ is excised from the plasmid clone with a restriction enzyme, and the DNA fragment is used as type II to synthesize RNA.
  • You can also.
  • the 3 'end of the synthesized RNA matches the 3' untranslated region of the viral genomic RNA, and no other sequence is added or deleted.
  • a synthesized in this manner is the Levlikon RN according to the present invention.
  • HCV replicon according to the present invention; production of NA-introduced replicon-replicating cells
  • replicon-replicating cells By introducing the replicon RNA prepared as described above into a cell in which the replicon RNA is to be replicated, a cell in which replicon A is continuously replicated can be obtained. As used herein, the replicon RNA is continuously amplified.
  • the cells are referred to as “replicon-replicating cells”.
  • any cells can be used as long as they can be subcultured, but eukaryotic cells are preferable, and human liver-derived cells and human cervix-derived cells are preferable.
  • the cell is more preferably a cell or a cell derived from human fetal kidney, and still more preferably a Huh7 cell, a HepG2 cell, an IMY-N9 cell, a HeLa cell, or a 293 cell. These cells may be commercially available, may be used as obtained from a cell depository institution, or may be a cell established from any cell (eg, a cell or a stem cell). May be.
  • the cells are intended for mass production of HCV proteins, such as in the production of pectin, it is desirable to use cells that can be cultured in large amounts. From such a viewpoint, it is preferable that the cells be cells other than ⁇ 7 cells.
  • Introduction of the lebricon RNA into cells may be performed using any technique known to those skilled in the art. Can be done. Examples of such an introduction method include an electro-volume method, a particle gun method, a lipofection method, a calcium phosphate method, a micro-injection method, and a DEAE sepha-orifice method. Particularly preferred.
  • the target replicon RNA may be introduced alone or a mixture of other nucleic acids may be introduced. If you want to change the amount of replicon RNA with a constant amount of RNA to be introduced, mix the target replicon RNA with total cellular RNA extracted from the cells to be introduced and use it for intracellular introduction. .
  • the amount of replicon RNA to be used for intracellular introduction may be determined according to the introduction method to be used, but is preferably 1 picogram to 100 microgram, more preferably 10 picogram to 10 microgram.
  • a replicon RNA containing a selectable marker gene or reporter gene When a replicon RNA containing a selectable marker gene or reporter gene is used for intracellular introduction, use of the expression of the selectable marker gene or reporter gene in cells into which the replicon RNA has been introduced and continuously replicating is used. Then you can choose. Specifically, for example, cells that have been subjected to such a transfection treatment of replicon RNA may be cultured in a medium that can be selected by the expression of a selection marker gene or a reporter gene.
  • the cells transfected with the replicon RNA are seeded in a culture dish, cultured for 16 to 24 hours, and then cultured.
  • G418 neomycin
  • G418 neomycin
  • the culture is continued twice a week while changing the culture medium.
  • Cells can be cloned from the formed colony by a conventional method.
  • the thus obtained cell clone in which the target replicon RNA is continuously replicated is referred to herein as "rebricon-replicating cell clone”.
  • RNA replicated in the cell clone from the introduced replicon RNA can be performed by any RNA known to those skilled in the art.
  • the detection may be performed according to the method.For example, by performing a Northern hybridization method using a DNA fragment specific to the introduced replicon RNA as a probe for total RNA extracted from the cell clone. Can be detected.
  • the confirmation of the integration of the selectable marker gene or reporter gene in the introduced replicon RNA into the host genome ⁇ A is not limited.
  • the selectable marker gene can be identified.
  • PCR can be performed by amplifying at least a part of the reporter gene, and the presence or absence of the amplified product can be confirmed.
  • the replicon RNA itself is continuously replicated in the cell. May not be. In this case, whether or not the replicon RNA is continuously replicated can be confirmed by the following HCV protein expression confirmation experiment.
  • Confirmation of the expression of the HCV protein can be performed, for example, by reacting an antibody against the HCV protein to be expressed from the introduced replicon RNA with a protein extracted from a cell clone.
  • This method can be performed by any protein detection method known to those skilled in the art. Specifically, for example, a protein sample extracted from a cell clone is plotted on a nitrocellulose membrane, and an antibody against the sample is plotted.
  • the reaction can be carried out by reacting an HCV protein antibody (for example, an anti-NS3 specific antibody, or an antiserum collected from a hepatitis C patient), and detecting the anti-HCV protein antibody. If HCV protein is detected in the protein eluted from a cell clone, the cell clone expresses HCV protein by continuous replication of HCV-derived replicon RNA. Can be determined.
  • the replicon RNA may be obtained from the replicon-replicating cells by any method known to those skilled in the art, for example, by extracting RNA and separating the replicon RNA therefrom by electrophoresis. Can be.
  • the present invention also provides a method for producing such a replicon RNA.
  • the replicon-replicating cell according to the present invention can be suitably used for producing an HCV protein.
  • HCV protein from replicon-replicating cells can be carried out by those skilled in the art according to conventional methods. Specifically, for example, proteins can be obtained from a culture (including cultured cells and a culture medium) obtained by culturing a replicon-replicating cell by a conventional method.
  • the replicon-replicating cell according to the present invention comprises a replicon containing a foreign gene.
  • RNA When RNA is continuously replicated, it can be obtained by expressing the protein encoded by the foreign gene using the replicon-replicating cells. Specifically, for example, culturing replicon-replicating cells, collecting a protein from the resulting culture (including cultured cells and culture medium) by a conventional method, and detecting the protein using an antibody against the target protein Thus, a protein encoded by a foreign gene can be selectively obtained.
  • replicon RNA replicate replicon RNA
  • mutations that improve replication efficiency frequently occur. Such mutations are likely to be compatible mutations.
  • a mutation that improves replication efficiency can be introduced into the lebricon RNA of the present invention at a high frequency.
  • a first replication replicon RNA is obtained from a first replication antigen-replicating cell (preferably, a replication-replicating cell into which the replicon RNA according to the present invention has been introduced) by extraction or the like. Is re-introduced into another cell to produce a second replicon-replicating cell, one or more times, preferably 1 Up to 10 times, more preferably 1 to 5 times, and even more preferably 1 to 2 times, to introduce a mutation at a high frequency into the replicon RNA to increase the replication efficiency in the replicon replication cells. Can be.
  • any cell can be used as the cell into which the replicative replicon RNA is re-introduced, but it is preferably a cell derived from the same species as the cell into which the replicon RNA was first introduced. It is more preferable that the cell is derived from the same organism as the cell and is derived from the same tissue, and it is even more preferable that the cell be the same cell line as the cell into which the replicon RNA was first introduced.
  • a replicon RNA into which a mutation that increases replication efficiency has been introduced can be produced by using the above method. That is, first, the first replicating replicon RNA is obtained from the first replicating replicative cell (replicon replicating cell into which the replicon RNA of the present invention has been introduced) by extraction or the like, and the first replicative replicon RNA is further purified. The step of producing a second replicon replication cell by reintroducing it into another cell is repeated one or more times, preferably 1 to 10 times, more preferably 1 to 5 times, and even more preferably 1 to 2 times.
  • the replicon RNA having an increased replication efficiency can be produced by obtaining the replicative replicon RNA from the final replicon-replicating cell obtained at the end of this repetition step by extraction or the like.
  • the replication efficiency of the lebricon RNA can be increased by at least 2 times, preferably 10 to 100 times, more preferably 100 to 10000 times by the above method.
  • RNA produced by such a method and having an increased replication efficiency it is preferable to determine the nucleotide sequence by a known method such as obtaining cDNA by reverse transcription PCR and subjecting it to nucleotide sequencing. Furthermore, a compatible mutation can be identified by comparing the determined nucleotide sequence or the amino acid sequence encoded thereby with the nucleotide sequence of the replicon RNA first introduced into the cell. A non-synonymous substitution for mutating an amino acid of a viral protein encoded by lebricon RNA is particularly preferable as a compatible mutation for increasing the replication efficiency.
  • the present invention also provides a method for producing a hepatitis C virus replicon RNA having an increased replication efficiency by introducing the matching mutation thus identified into replicon RNA by a conventional method.
  • the replicon RNA having an increased replication efficiency produced as described above can be used for producing a large amount of replicon RNA.
  • the replication efficiency of the replicon RNA according to the present invention can be determined according to a method known to those skilled in the art, for example, the following method.
  • the number of colonies formed is measured.
  • the colony formation rate calculated in this way is used as a value indicating the replication efficiency of the introduced lebricon RNA. That is, the higher the colony formation rate, the higher the replication efficiency of the replicon RNA.
  • the replication efficiency of the replicon RNA can also be expressed by the colony forming ability indicated by the number of copies of the introduced replicon RNA per colony formed. That is, it can be calculated according to the following formula. Colony-forming ability Copy number of introduced replicon RNA [copy] Z colony formation number [pieces] 5.
  • Colony-forming ability Copy number of introduced replicon RNA [copy]
  • the replicon RNA-replicating cells according to the present invention can also be used, for example, as a test system for screening for a substance that promotes or suppresses the replication of hepatitis C virus. Specifically, for example, culturing the replicon-replicating cells in the presence of the test substance, detecting the replication of the replicon RNA in the obtained culture, and determining whether the test substance promotes or suppresses the replication of the replicon RNA. By judging whether or not it is possible to screen for a substance that promotes or suppresses the replication of hepatitis C virus.
  • the detection of the replication of replicon RNA in the obtained culture may be based on detecting the amount or presence or absence of replicon RNA in RNA extracted from the replicon RNA-replicating cells, or in the culture. Or Rebrico contained in the culture It may detect the amount or presence or absence of the HCV protein contained in the protein in the RNA replicating cells.
  • test system can be used for the production or evaluation of a therapeutic or diagnostic agent for hepatitis C virus infection. Specifically, the following examples are given.
  • Substances that suppress the growth of HCV include, for example, organic compounds that directly or indirectly affect the growth of HCV, or growth of HCV or HCV by hybridizing to the target sequence of the HCV genome or its complementary strand.
  • Antisense oligonucleotides that directly or indirectly affect the translation of proteins are included.
  • Examples of the various substances include substances obtained by rational drug design or high-throughput screening (for example, an isolated and purified enzyme) and the like.
  • the replicon replicating cells of the present invention can be used to identify host cellular proteins that play an important role for HCV virus propagation.
  • T7J indicates T7 RNA promoter
  • G indicates dGTP inserted upstream of the 5 ′ end of JFH-2.1 and JFH-2.2 and downstream of the 3 ′ end of the T7RA promoter sequence.
  • 5 ′ NTRJ to“ 3 ′ NTRJ ” are DMs corresponding to the entire genome of hepatitis C virus.
  • neomycin resistance gene neo; also called neomycin phosphotransferase gene
  • EMCV-IRES Liposome binding site of encephalomyocarditis virus
  • DNA PSGREP-JFH2.1 and pSGREP-JFH2.2 were respectively constructed (lower part of FIG. 1). This construction procedure followed a previous report (Lehmann et. A 1., Science, (1999)). Specifically, plasmids pJFH-2.1 and pJFH-2.2 were digested with restriction enzymes Agel and Clal, and 5 'NTR derived from pJFH-2.1 and pJFH-2.2 was added to the cleavage site.
  • the expression vector from the PRSV5NE0 neomycin resistance gene were ligated by PCR amplification and fragmented with the restriction enzymes Agll and Pmel, and the sequence from EMCV IRES to the NS3 region was ligated by PCR amplification. Fragments cut with the enzymes Pmel and al were inserted and ligated.
  • the expression vectors PSGREP-JFH2.1 and PSGREP-JFH2.2 constructed as described above were cut with the restriction enzyme Xtal in order to prepare type I DNA used for the synthesis of the replicon RNA. Then, 10 to 20 S of each of these Xbal cut fragments were further processed by incubating each with 10 to 20 S of Mung Bean Nuclease at 30 ° C. for 30 minutes using a 1 U reaction volume of Mung Bean Nuclease. An enzyme that catalyzes a reaction that selectively degrades the single-stranded portion of double-stranded DNA. The replicon RNA with the extra 4 bases of CUGA added to the 3 'end was synthesized. I will.
  • the Xbal cleaved fragment was treated with Mung Bean Nuc lease to remove the four bases of CUGA from the Xbal cleaved fragment.
  • the Mung Bean Nu C lease-treated solution containing the Xbal cleavage fragment was purified by subjecting the Xbal cleavage fragment from which the 4 bases of CUGA had been removed to a protein removal treatment according to a conventional method.
  • Type DNA Type DNA.
  • RNA was synthesized in vitro from the type I DNA.
  • MEGAscript of Ambion was used for RNA synthesis.
  • the reaction was carried out at 37 ° C. for 3 to 16 hours in a reaction solution 201 containing 0.5 to 1.5 ⁇ g of type I DNA.
  • RNAs rebricon RNAs
  • rSGREP-JFH2.1 and rSGREP-JFH2.2 respectively.
  • the nucleotide sequences of these replicon RNAs are shown in SEQ ID NO: 1 and FIG. 1 for rSGREP-JFH2.1, and in System ij No. 8 and FIG. 1 for rSGREP-JFH2.2.
  • replicon RNA O.01 ng to 10 g was mixed with total cellular RNA extracted from Huh7 cells to obtain RNA. The total amount was adjusted to 10 _ i g.
  • the mixed RNA was introduced into Huh7 cells by the elect-portation method. The electroporated Huh7 cells were seeded on a culture dish, cultured for 16 to 24 hours, and then G418 (neomycin) was added to the culture dish at various concentrations. Thereafter, the culture was continued twice a week while changing the culture medium. After culturing for 21 days from the time of seeding, surviving cells were stained with crystal violet. As a result, as shown in FIG. 2, colony formation was confirmed.
  • the replicon-replicated cells into which the replicon RNA has been introduced can be used as a culture system for continuously producing HCV-derived RNA and HCV protein. Further, the replicon-replicating cells can be used as a test system for screening various substances that affect the replication of HCV and / or the translation of HCV proteins. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 7 Description of artificial sequence: JFH2.1 replicon RNA
  • SEQ ID NO: 8 Delivery of artificial sequence: 1FH2.2 replicon RNA

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Abstract

本発明は、劇症Ｃ型肝炎ウイルスの新規株由来の遺伝子、該遺伝子を利用した複製効率の高いHCVレプリコンRNA及び該レプリコンRNAを導入したHCVレプリコン複製細胞に関する。本発明のHCVレプリコンRNA及びHCVレプリコン複製細胞を用いれば、HCVタンパク質を持続的に大量生産することができる。

Description

明 細 書 新規 HCV株由来の核酸、 遺伝子、 及び該遺伝子を利用したレブリコン複製細胞
技術 分 野
本発明は、 劇症 C型肝炎ウィルスの新規株由来の核酸、 遺伝子、 ならびに該 遺伝子を利用した HCVレプリコン及びレプリコン複製細胞に関する。 背 景 技術
ウィルス研究及び抗ウィルス薬の研究開発にはウィルスを効率よく増幅でき る実験系が必要不可欠である。 さらに、 培養細胞によりウィルスを増幅させる 系、 あるいは培養細胞によりウィルスの増殖を評価する系があれば、 ウィルス 研究及び抗ウィルス薬の研究開発は飛躍的に進歩する。
C型肝炎ウィルス （Hepat i t is C virus, HCV) は、 フラビウィルス科に属す る、一本鎖の（+)鎖センス RNAをゲノムとするウィルスで、 C型肝炎の原因とな ることが知られている。 近年の研究により、 C型肝炎ウィルスは遺伝子型又は 血清型により多数の型に分類されることがわかってきた。 現在主流の HCV遺伝 子型の分類法である、 Sin mdsらによる HCV株の塩基配列を用いた系統解析法 によると、 HCVは遺伝子型 la、 遺伝子型 lb、 遺伝子型 2a、 遺伝子型 2b、 遺伝 子型 3 a、 及び遺伝子型 3bの 6タイプに分類され、 さらにそれらの各タイプが いくつかのサブタイプに分類される (Simmonds, P. et al, Hepatorigy (1994) 10, p 132卜 1324)。 現在では、 HCV の複数の遺伝子型についてゲノム全長の塩 基配列が決定されている (Choo et al. , Science, (1989) 244, p 359-362 ; Kato et al. , J. Med. Vi rol. , (1992) p 334-339 ; Okamoto, H et al. , J. Gen Virol. , (1992) 73 P673-679 ; Yos ioka et al. , Hepatorogy, (1992) 16, 293-299)。
C型肝炎に対する現在の主な治療は、 インタ一フエロン— α、 イン夕一フエ ロン一 β、 及びインターフェロン一ひとプリン一ヌクレオシド誘導体であるリ バビリ ンとの併用療法により行われている。 しかしながら、 これらの治療を行 つても、 全治療者の約 60%に治療効果が認められるだけであり、 効果が出た患 者も治療を中止すると半分以上が再燃する。 インタ一フヱロンの治療効果は、
HCVの遺伝子型と関連することが知られており、遺伝子型 lbに対しては効果が 低ぐ遺伝子型 2aに対してはより効果が高いと言われている（Mori, S.， et al. , Biochem. Biophis. Res. Co腿 un. , (1992) 183, 334-342) 0
工業国において罹患率が高く、 最終的に深刻な結果を招き、 かつ、 現在原因 療法が存在しない C型肝炎に対して、 効果的な治療薬又は予防薬の開発は重要 な課題である。 それゆえ、 HCV特異的な化学療法やワクチン療法の発展、 及び 抗 HCV薬の開発が切望されている。 抗 HCV薬開発のターゲットとしては、 HCV の複製抑制や HCVの細胞感染の抑制が考えられる。
最近まで、 HCVを細胞培養系で増やすこと、 HCVを培養細胞に感染させること は困難であり、 また、 HCV に感染可能かつ実験可能な動物はチンパンジーしか いなかつたため、 HCV の複製機構や感染機構の研究は困難であった。 しかし、 最近 HCV由来の自律複製能を有する RNAとして、 HCVサブゲノム RNAレプリコ ンが作製されたこと （特開 2 0 0 1 - 1 7 1 8 7号公報； Lomann et al.， Sc ience, (1999) 285, 110-113 ; Bl ight et al. , Science, (2000) 290, 1972-1974; Friebe et al. , (2001) 75, 12047-12057 ; Ikeda et al. , J. Vi rol. , (2002) 76 2997-3006 ; ) により、 培養細胞を用いて HCVの複製機溝を解析する ことが可能となった。 これらの HCVサブゲノム RNAレブリコンは、 遺伝子型 lb に属する Con 1というクローンの HCVゲノム RNAの 5'非翻訳領域中の HCV IRES の下流に存在する構造タンパク質を、 ネオマイシン耐性遺伝子、 及びその下流 に連結した EMCV- IRESによって置換したものである。 この RNAレプリコンは、 ヒト肝癌細胞 Huh7に導入してネオマイシン存在下で培養することにより、 Huh7 細胞内で自律複製することが証明されている。 この RNAレブリコンシステムを 用いた HCVの複製評価系は抗 HCV薬の開発の強力なツールになると考えられる。 遺伝子型が異なる HCVではコードされるウィルスタンパク質にも違いがある ことが報告されており、遺伝子型 lbの HCV由来のサブゲノム RNAレプリコンの 解析だけでは、 HCV の複製機構を十分に解明することは難しいと考えられる。 さらに、 インターフェロンの治療効果が HCVの遺伝子型によって異なることか ら、遺伝子型 lbの HCVのサブゲノム RNAレプリコンを含む HCV複製系のみを用 いて様々なタイプの HCVに効果を及ぼす抗 HCV薬を開発することは特に難しい と考えられる。 したがって、 数多くの遺伝子型の HCV R Aレブリコンを作製し て、 HCV複製機構、 及び抗 HCV薬の研究を行う必要があると考えられる。
現在培養細胞内でレブリコンとして複製ができたクローンは数株しかない。 また、 慢性肝炎からクロ一ニングされチンパンジーに感染性が確認できたクロ ーンが必ずしもレプリコンとして複製できるわけではない （Lomaim et al. , Sc ience, (1999) 285, 110-113)。 すなわち、 複製効率がよく、 かつ高確率で HCVレプリコンを作製できる HCV株を選択する方法は未だ見出されておらず、 こうした HCV株の選択方法を確立すれば、 HCV治療薬の研究開発ま飛躍的に前 進すると考えられる。
HCV に関しては、 現在ワクチンが開発されていない。 その原因の一つは、 安 定して、 大量にワクチンとなりうる HCV関連タンパク質を、 生体内で存在する 型で産生できないことにある。 前述の HCVレブリコン細胞において、 HCV関連 タンパク質が発現していることから（特開 2 0 0 1 - 1 7 1 8 7号公報）、 この HCV レプリコン細胞を利用することが可能と考えられる。 しかしながら、 工業 的にワクチンを製造するためには、大量培養が可能な細胞を用いる必要がある。 この観点から、 現在 HCV RNA レブリコン複製細胞として唯一樹立されている Huh7はワクチン製造には適していないと考えられる。ワクチン製造に適した細 胞としては、 例えば、 HeLa細胞のように浮遊培養系で超大量培養力 s可能な細胞 が考えられる。また、前述のように、 HCVは遺伝子型により配列が異なるため、 ワクチンについても遺伝子型ごとに製造することが必要になる。 つまり、 ワク チン製造に適した細胞を用いて、 各種遺伝子型の HCV RNAレブリコン細胞を作 製することが必要となる。一方、 Huh7細胞は HCVの感染に対する感受性が確認 できていないという点でも、 HCVが自律的に感染複製する細胞培養系の樹立に は向いていないと考えられる。 したがって、 他の肝癌細胞を用いて HCVが自律 的に感染複製する細胞培養系を樹立することが必要と考えられる。
さらに、 様々な種類の細胞間で HCV RNAレブリコンの複製機構の差異を比較 することにより、 HCVの複製に必要な細胞性因子の同定が可能となり、 新たな 抗 HCV治療薬のターゲットが発見できると考えられる。 発 明 の 開 示 本発明は、 高確率で複製効率の良い HCVレブリコン RNA、 及び HCVタンパク 質を持続的に大量生産可能な HCVレブリコン細胞の提供を目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、 劇症 C型肝炎 患者の HCV株 JFH2. 1あるいは Jra2. に由来するレブリコンを用いれば、 高確 率で複製効率の良いレブリコン複製細胞が得られることを見出し、 本発明を完 成させた。
すなわち、本発明は、 以下の（a)、 （b)又は（c)のポリヌクレオチドからなる核 酸を提供する。
(a)配列番号 1、配列番号 3及び配列番号 4に示される塩基配列を含むポリヌク レオチド
(b)配列番号 2、配列番号 5及び配列番号 6に示される塩基配列を含むポリヌク レオチド
(c)前記（a)又は (b)記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドとス卜リンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、 かつ HCVタンパクをコ ードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「U に読み替えるもの とする）
本発明はまた、 前記核酸を構成する下記（1)〜（6)の核酸も提供する。
(1) 以下の（a)又は (b)のポリヌクレオチドからなる核酸：
(a)配列番号 1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b) .前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ HCVタンパクのうち NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A及び NS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(2) 以下の（a)又は (b)のポリヌクレオチドからなる核酸：
(a)配列番号 3で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし、かつ HCV遺伝子の 5'非翻訳領域 をコードするポリヌクレオチド
(3) 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸：
(a)配列番号 4で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド (b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス 卜リンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ HCV遺伝子の 3'非番訳領域 をコードするポリヌクレオチド
(4) 以下の（a)又は (b)のポリヌクレオチドからなる核酸：
(a)配列番号 2で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ HCVタンパクのうち NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A及び NS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(5) 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸：
(a)配列番号 5で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ HCV遺伝子の 5'非番羽訳領域 をコードするポリヌクレ才チド
(6) 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸：
(a)配列番号 6で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス 卜リンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HCV遺伝子の 3'非番 δ訳領域 をコードするポリヌクレオチド
(但し、 上記（1)〜（6)のいずれについても、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基 記号 「u」 は 「t」 に読み替えるものとする）
本発明はまた、 前記各核酸からなる遺伝子、 該遺伝子によってコードされる ポリペプチドも提供する。
本発明はまた、以下の（a)又は（b)の RNAからなるレブリコン RNAも提供する。 (a)配列番号 1、 配列番号 3及び配列番号 4に示される塩基配列を含む RNA (b)配列番号 2、 配列番号 5及び配列番号 6に示される塩基配列を含む RNA また、 前記レプリコン RNAは、 さらに IRES配列や、選択マ一カー遺伝子又は リポーター遺伝子を含んでいてもよい。
本発明はまた、以下の（a)又は (b)の KNAからなるレプリコン RNAも提供する。 (a)配列番号 7又は 8に示される塩基配列を含む RNA
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる RNAとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、 かつ自律複製能を有する A 本発明はまた、 前記レブリコン RNAを適当な細胞に導入することにより、 レ プリコン複製細胞を作製する方法と、 該方法によって作製されたレブリコン複 製細胞も提供する。 該レプリコン複製細胞に用いられる細胞としては、 ヒト肝 由来細胞、 ヒト子宮頸由来細胞、 又はヒト胎児腎由来細胞が挙げられ、 より具 体的には、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY- N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293細月包が挙 げられる。
本発明はまた、 被験物質の存在下で、 前記レブリコン複製細胞を培養し、 得 られる培養物中のレブリコン RNAの複製を検出することを含む、 C型肝淡ウイ ルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングする方法も提供する。 本発明はまた、 前記レブリコン複製細胞から複製レブリコン RNAを取得し、 取得した複製レプリコン RNAを別の細胞に導入して新たなレプリコン複製細胞 を作製する工程を 1回以上行うことを含む、 C型肝炎ウィルスのレブ" Uコン RNA の複製効率を増大させる方法も提供する。 該方法において、 複製効率は、 レプリコン複製細胞に導入されたレプリコン RNAの複製効率と比較して、 少な くとも 2倍増大していることが好ましい。
本発明はまた、 前記レプリコン複製細胞から複製レプリコン RNAを取得し、 取得した複製レブリコン RNAを該レプリコン複製細胞とは別の細胞に導久して 新たなレブリコン複製細胞を作製する工程を 1回以上行うこと、 及び最終的に 得られたレプリコン複製細胞から複製レプリコン RNAを取得することを含む、 複製効率が増大した C型肝炎ウィルスのレブリコン RNAを製造する方法ち提供 する。
さらに、 本発明は前記方法によって製造された複製効率が増大したレプリコ ン RNAについて、 レブリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコン RNTAとの 間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、 及び複製効率を増大させよう とするレブリコン RNAにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導スする ことを含む、 複製効率が増大したじ型肝炎ウィルスのレブリコン RNAを製造す る方法も提供する。
本発明の新規 HCV RNA遺伝子を利用すれば、 高確率で複製効率の良いレプリ コン RNAとレブリコン複製細胞を得ることができる。 このレブリコン複製細胞 は、 HCV由来の RNA及び HCVタンパク質を持続的に産生させるための培養系と して利用することができる。 さらに該レプリコン複製細胞は、 HCV の複製又は HCVタンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試 験系として利用することもできる。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミド DNA pJFH - 2. 1、 及び pJFH-2. 2の構造 （上段）、 ならびに プラスミド DNA PSGREP-JFH2. 1、 及び pSGREP- JFH2. 2の構造 (下段) を示す。 図 2は、 rSGREP-JFH2. 1又は rSGREP_JFH2. 2 トランスフエクシヨン細胞のコ 口ニー形成を示す写真である。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2 0 0 3 - 3 2 9 0 8 2号の明 細書に記載された内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳細に説明する。
1 . 本発明に係る HCV由来の核酸、 遺伝子及びレブリコン RNA
C型肝炎ウィルス （HCV) のゲノムは、約 9600ヌクレオチドからなる（+)鎖の 一本鎖 RNAである。 このゲノム RNAは、 5'非翻訳領域 （5' NTR又は 5' UTRとも 表記する）、 構造領域と非構造領域とから構成される翻訳領域、 及び 3 ' ^翻訳 領域 （3' NTR又は 3' IITRとも表記する） からなる。 その構造領域には HCVの構 造夕ンパク質がコードされており、 非構造領域には複数の非構造夕ンパグ質が コードされている。
このような HCVの構造タンパク質 （Core、 El、 及び E2) と非構造タンパク質 (NS2、 NS3、 NS4A、 NS4B NS5A、 及ぴ NS5B) は、 翻訳領域から一続きのポリプ 口ティンとして翻訳された後、 プロテアーゼによる限定分解を受けて遊離、 生 成される。 これらの構造タンパク質及び非構造タンパク質 （すなわち、 HCV の ウィルスタンパク質） のうち、 Coreはコアタンパク質であり、 E1及び E2はェ ンべロープタンパク質であり、 非構造タンパク質はウィルス自身の複製に関与 するタンパク質である。 また、 NS2はメタ口プロテアーゼ活性、 NS3はセリンプ 口テアーゼ活性（N末端側の 3分の 1 )とへリカーゼ活性（C末端側の 3分の 2 ) を有することが知られている。 さらに、 NS4Aは NS3のプロテアーゼ活性に対す るコファクタ一であり、 NS5Bは RNA依存 RNAポリメラーゼ活性を有することも 報告されている。
本発明者らは、 HCV の一般的な遺伝子型の分類ではなく、 劇症肝炎患者から 分離した HCVというクライテリアで選別した HCVゲノム用いて、 高確率で複製 効率が極めて良く、さらには Huh7細胞などの細胞で自律的に複製することが可 能な RNAを構築した。
本明細書では、 自律複製能を有しており天然の HCVウィルスゲノムを改変し て作製された RNAを、 「レブリコン RNA」 又は 「RNAレブリコン」 と呼ぶ。
本明細書中において、 「遺伝子」 とは核酸のうち 「生命活動に関わる特定の 機能や情報を担う核酸」を意味し、 RNAと DNAの両方を含むものとする。 また、 核酸及び遺伝子は 1本鎖 （cDNA、 cRNA等） であっても 2本鎖であってちょく、 天然のものであっても、 人工的に合成されたものであってもよい。 さらに部分 的に修飾されていても、 誘導体であってもよい。 なお、 便宜上、 配列表の塩基 配列は RNAで示すが、 当該遺伝子が DNAである場合、 塩基記号 「ϋ」 は 「Τ」 に 読み替えるものとする。
本発明において、 「劇症肝炎」 とは、 肝炎のうち症状発現後 8週間以内に I I 度以上の脳症とプロトロンビン時間 40%以下を呈したものを意味し、 10 日以内 に脳症の出現する急性型と、それ以後に脳症の出現する亜急性型に分けられる。 「劇症肝炎患者由来の C型肝炎ウィルス」 とは、 この 「劇症肝炎」 症状を呈し た患者から分離した HCVのことを意味する。本発明において、 「劇症肝炎患者由 来の C型肝炎ウィルス」 あるいは 「劇症株の HCV」 には、 天然由来の HCVゲノ ム RNAを有するウィルスだけでなく、 天然由来の HCVゲノム配列に人為的な改 変を加えたゲノム RNAを有するウィルスも包含する。 劇症株の HCVの具体例と しては、 JFH-1株 （特開 2 0 0 2— 1 7 1 9 7 8号）、 ならびに JFH- 2. 1株及び JFH - 2. 2株等のウィルスが挙げられる。
本願明細書において、「5'非翻訳領域（5' NTR又は 5' UTR)」、「NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタンパク質を コ一ドする配列」、「Coreタンパク質をコードする配列（Core領域又は C鎮域）」、 「E1タンパク質をコードする配列 （E1領域)」、 「E2タンパク質をコードする配 列 （E2領域)」、 「N2タンパク質をコードする配列 （NS2領域)」、 「NS3タンパク 質をコードする配列 （NS3 領域）」、 「NS4A タンパク質をコードする配列 （NS4A 領域)」、 「NS4Bタンパク質をコードする配列 （NS4B領域）」、 「NS5Aタンパク質 をコードする配列 （NS5A領域)」、 「NS5Bタンパク質をコードする配列 （NS5B領 域)」、 及び「3'非翻訳領域（3' 11又は3' 1^1 」、 ならびにその他の特定の領域 若しくは部位は、 劇症肝炎患者由来の C型肝炎ウィルスである JFH- 2. 1 及び JFH-2. 2株のゲノム全領域をコードする全長ゲノム RNAあるいはその部分ゲノ ム RNA (JFH-2. 1及び JFH-2. 2クローン) の塩基配列（それぞれ、 配列番号 1〜 6 ) を含むポリヌクレオチドを基準として、 定めるものとする。
具体的には、 JFH- 2. 1 クローンについては、 配列番号 1、 3及び 4で示され る塩基配列に対して特定の HCVの RNA配列をアラインメントしたときに、 配列 番号 3で示される塩基配列がその RNAの「5'非翻訳領域」、配列番号 1に示され る塩基配列が「NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタン パク質、 及び NS5Bタンパク質をコードする配列」 であり、 同塩基番号 1〜1893 の配列が 「NS3タンパク質をコードする配列」、 塩基番号 1894〜2055の配列が 「NS4Aタンパク質をコードする配列」、 同塩基番号 2056〜2838の配列が「NS4B タンパク質をコードする配列」、 同塩基番号 2839〜4236の配列が「NS5Aタンパ ク質をコードする配列」、 塩基番号 4273〜6012の配列が「NS5Bタンパク質をコ ードする配列」、 配列番号 4で示される塩基配列が 「3'非翻訳領域」 である。
JFH-2. 2 クローンについては、 配列番号 2、 5及び 6で示される塩基配 に 対して特定の HCVの RNA配列をアラインメントしたときに、 配列番号 5で示さ れる塩基配列がその RNAの「5'非翻訳領域」、配列番号 2に示される塩基配列が 「NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 反び NS5Bタンパク質をコードする配列」であり、同塩基番号 1〜1893の配列が「NTS3 タンパク質をコードする配列」、 塩基番号 1894〜2055の配列が「NS4Aタンパク 質をコードする配列」、 同塩基番号 2056〜2838の配列が「NS4Bタンパク質をコ —ドする配列」、 同塩基番号 2839〜4236の配列が「NS5Aタンパク質をコードす る配列」、塩基番号 4273〜6012の配列が「NS5Bタンパク質をコードする配列」、 配列番号 6で示される塩基配列が 「3'非翻訳領域」 である。 本発明にかかる遺伝子には、 前記した配列番号 1乃至 6で表される塩基配列 を含むポリヌクレオチドに加えて、 該遺伝子とストリンジェントな条件下でハ ィプリダイズするポリヌクレチドも、 それが前記した所望のタンパク質をコ一 ドする限り、本発明の遺伝子に含まれる。ここでストリンジェントな条件とは、 6 X S S C ( 1倍濃度の S S C溶液の組成は、 150mmol/l 塩化ナトリウム、 15腿 ol/lタエン酸ナトリゥムによりなる) 存在下、 60°Cでハイブリダイゼ——ン ョン後、 0. 1% S D Sを含む 1 X S S Cにて、 68°C条件下で洗浄するような条 件をである。 ハイブリダイゼーシヨン法としては、 コ ロニー .ハイブリダィゼ ーシヨン法、 プラーク ·ハイブリダィゼーション法あるいはサザンハイブリダ ィゼーシヨン法等を用いることができ、 これらの方法は、 例えば Molecular Cloning, A laboratory manual, 20001, Eds.， ^ambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press の記載に準じて行うこと力 Sでさる。
本発明の核酸又は遺伝子は、 それらが前記した所望のタンパク質をコードす る限り、 その配列内にギャップ、 付加、 欠失、 置換等が存在していてもよい。 具体的には、 配列番号 1乃至 6で示される塩基配列において、 1又は複数個の 塩基、 つまり、 1〜50個、 好ましくは 1〜30個、 より好ましくは 1〜10値、 さ らに好ましくは 1〜6個、 最も好ましくは 1〜数個 （2~5個） の塩基が欠失、 置 換又は付カ卩された塩基配列からなるポリヌクレオチドであっても、 それらが所 望のタンパク質をコードする限り ：
すなわち、 配列番号 1又は 2で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドは HCVタンパクのうち NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A及び NS5Bタンパクをコードするも のであり、 配列番号 3又は 5で表される塩基配列を含むポリヌクレオヂドは HCV遺伝子の 5'非翻訳領域をコードするものであり、 配列番号 4又は 6で表さ れる塩基配列を含むポリヌクレオチドは HCV遺伝子の 3'非翻訳領域をコードす るものである限り、本発明の核酸あるいは遺伝子に含まれる （「塩基配列を含む ポリヌクレオチド」は、「塩基配列を含む塩基配列」 とも表示することがある）。 さらに上記の 「特定の HCV」 は JFH-2. 1株、 JFH-2. 2株に限定されず、 それら の誘導体であるウィルス株も包含される。
本発明に係る HCV レプリコン RNAの一つの実施形態は、劇症肝炎由来の C型 肝炎ウィルスのゲノム RNA上の、 5'非翻訳領域と、 NS3タンパク質、 NS4Aタン パク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタンパク質をコードす る配列と、 3'非翻訳領域とを少なくとも含む塩基配列からなる、レブリコン RNLA である。 このレブリコン RNAは、 さらに 1つの IRES配列を含んでもよく、 これ にさらに 1つの選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含んでよい。 ま さらにこのレブリコン RNAは、 JFH2. 1 及ぴ JFH2. 2 以外の C型肝炎ウィルスの ゲノム RNA上の、 NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A、 又は NS5Bタンパク質以外のウイ レ スタンパク質をコードする配列を含んでいてもよい。
本発明に係る HCV レプリコン RNAの別の好適な実施形態は、配列番号 3で^ される塩基配列からなる 5'非翻訳領域と、少なくとも 1つの選択マーカー遺伝 子又はリポーター遺伝子と、少なくとも 1つの IRES配列と、配列番号 1で示さ れる HCVのゲノム RNA上の NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質をコードする塩基配列と、 配列番号 4で 示される塩基配列からなる 3'非翻訳領域とを含むポリヌクレオチド：あるい【ま、 配列番号 5で示される塩基配列からなる 5'非翻訳領域と、少なくとも 1つの還 択マーカー遺伝子及び/又はリポーター遺伝子と、少なくとも 1つの IRES配 ΰ と、 配列番号 2で示される HCVのゲノム RNA上の NS3タンパク質、 NS4A夕ンゾヽ ° ク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク質をコードする塩 基配列と、配列番号 6で示される塩基配列からなる 3'非翻訳領域とを含むポリ ヌクレオチドからなる、 レブリコン RNAである。
本発明に係るレプリコン RNAは、 好ましくは、 最も 5'側に配列番号 3又は 5 の HCVのゲノム RNA上の 5'非翻訳領域を、最も 3'側に配列番号 4又は 6の H(TV のゲノム RNA上の 3'非翻訳領域を有する。選択マーカ一遺伝子又はリポーター 遺伝子は、 IRES配列の上流に連結されてもよいし、 「NS3タンパク質、 NS4Aタ ンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタンパク質をコード する配列」 の上流又は下流に連結されてもよいし、 「NS3タンパク質、 NS4Aタン パク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタンパク質をコードす る配列」 の中に挿入されてもよい。
本発明に係るレブリコン RNAは、 より好ましくは、 配列番号 3又は 5の H(TV のゲノム RNA上の 5'非翻訳領域を有し、それよりも下流に選択マーカー遺伝子 又はリポーター遺伝子と、 IRES配列と、 「NS3タンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタンパク質をコードする配列」 とをこの順番で有し、 さらに最も 3'側に劇症肝炎患者由来の HCVのゲノム RNA 上の 3'非翻訳領域を有する。
本発明に係る HCV レブリコン RNAのさらに好ましい 1つの実施形態は、配列 番号 7又は 8で示される塩基配列からなる RNAからなるレブリコン RNAである。 さらに、 配列番号 7又は 8で表される塩基配列からなる遺伝子とストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする核酸をも含む。 さらに、 この配列番号 7ヌ は 8で示される塩基配列において、 1乃至複数個の塩基、 つまり 1〜50個、 好 ましくは 1〜30個、 より好ましくは 1〜10個、 さらに好ましくは 1〜6個、最も 好ましくは 1〜数個 （2〜5個） の塩基が欠失、 置換又は付加された塩基配列力、 らなるレブリコン RNAであって、 かつ、 自律複製能を有する RNAも、 好適な実 施形態として本発明の範囲に含まれる。本発明において「自律複製能を有する」 とは、 レブリコン R Aを細胞中に導入したときに、 そのレブリコン RNAが細月包 内でそのレブリコン RNA自身の全長を複製することができることを意味する。 限定するものではないが、 この自律複製能は、 例えば、 レブリコン RNAを Huh7 細胞中にトランスフエクシヨンし、 Huh7細胞を培養し、 得られる培養物中の糸田 胞から抽出した RNAについて、 導入したレブリコン RNAを特異的に検出可能な プローブを用いたノーザンブロットハイブリダィゼーションを行ってレプリコ ン RNAの存在を検出することにより、 確認することができる。 自律複製能を ¾雀 認するための具体的な操作は、 本明細書の実施例に記載されたコロニー形成肯 の測定、 HCVタンパク質の発現確認、 レブリコン RNAの検出等の記載に従って 行うことができる。
本発明に係るレブリコン RNAには、 上記したような配列の他に、 レブリコン RNAを導入する細胞内で発現させたい任意の外来遺伝子を含む RNAを含んでも よい。 外来遺伝子は、 5'非翻訳領域の下流に連結してもよいし、 選択マーカー 遺伝子又はリポーター遺伝子の上流又は下流に連結させてもよいし、 「NS3夕ン パク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタン パク質をコードする配列」 の上流又は下流に連結してもよいし、 「NS3タンパク 質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質及び NS5Bタンパク賀 をコードする配列」 の中に挿入してもよい。 外来遺伝子を含むレブリコン RNA は、 導入された細胞内で翻訳される際に、 該外来遺伝子にコードされたタンノ° ク質を発現することができる。 従って外来遺伝子を含むレブリコン RNAは、 遺 伝子治療などの、 特定の遺伝子産物を細胞内で生成させることを目的とする塌 合にも、 好適に使用することができる。
本発明において 「選択マーカー遺伝子」 とは、 その遺伝子が発現された細月包 だけが選択されるような選択性を細胞に付与することができる遺伝子を意味す る。 選択マーカー遺伝子の一般的な例としては抗生物質耐性遺伝子が挙げられ る。 本発明において好適な選択マーカー遺伝子の例としては、 ネオマイシン丽 性遺伝子、 チミジンキナーゼ遣伝子、 カナマイシン耐性遺伝子、 ピリチアミン 耐性遺伝子、 アデ二リルトランスフェラーゼ遺伝子、 ゼォシン耐性遺伝子、 ど ユーロマイシン耐性遺伝子などが挙げられるが、 ネオマイシン耐性遺伝子、 チ ミジンキナーゼ遺伝子が好ましく、ネオマイシン耐性遺伝子がさらに好ましレ 。 但し本発明における選択マ一カー遺伝子はこれらに限定されるものではない。 また本発明において 「リポーター遺伝子」 とは、 その遺伝子発現の指標とな る遺伝子産物をコードするマーカー遺伝子を意味する。 リポーター遺伝子の一 般的な例としては、 発光反応や呈色反応を触媒する酵素の構造遺伝子が挙げら れる。 本発明において好適なリポーター遺伝子の例としては、 トランスポゾン Tn9 由来のクロラムフエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ遺伝子、 大腸菌 由来の jSダルク口ニダ一ゼ若しくは jSガラクトシダーゼ遺伝子、 ルシフェラー ゼ遺伝子、 緑色蛍光タンパク質遺伝子、 クラゲ由来のイクリオン遺伝子、 分祕 型胎盤アルカリフォスファターゼ （SEAP) 遺伝子等が挙げられる。 但し、 本 明におけるリポーター遺伝子はこれらに限定されるものではない。
上記の選択マーカー遺伝子及びリポーター遺伝子は、 レブリコン RNA中にど ちらか一方のみが含まれていてもよいし、 両方が含まれていてもよい。
本発明における 「IRES配列」 とは、 RNAの内部にリボソームを結合させて 3 訳を開始させることが可能な内部リボゾーム結合部位を意味する。 本発明にお ける IRES配列の好適な例としては、以下に限定するものではないが、 EMCV IRES (脳心筋炎ウィルスの内部リポゾ一ム結合部位）、 FMDV IRESゝ HCV IRES, 等カ 挙げられるが、 EMCV IRES, 及び HCV IRESがより好ましく、 EMCV IRESが最も 好ましい。 また本発明に係るレブリコン RNAには、 さらにリポザィムを含んでいてもよ レ^ リポザィムは、 5'側のレブリコン RNA中の選択マーカー遺伝子、 リボー夕 一遺伝子、 又は外来遺伝子と、 それより 3'側の IRES配列、 及び「NS3タンパク 質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5Bタンパク 質をコードする配列」 とを連結するように挿入し、 リボザィムの自己切断活性 により両者が切断されて分離するようにすることができる。
本発明に係るレプリコン RNAにおいては、 上述したような選択マーカー遺伝 子、 リポーター遺伝子、 劇症肝炎患者由来の C型肝炎ウィルスのゲノム RNA上 のウィルスタンパク質をコードする配列、及び外来遺伝子等が、レブリコン RNA から正しい読み枠で翻訳されるように連結される。 それらの配列のうち、 タン パク質をコードする配列は、 劇症肝炎患者由来の C型肝炎ウィルスの 「NS3 タ ンパク質、 NS4Aタンパク質、 NS4Bタンパク質、 NS5Aタンパク質、 及び NS5B夕 ンパク質をコードする配列」 から翻訳されるポリタンパク質とともに融合夕ン パク質として発現させた後で、 プロテアーゼによって各タンパク質へと分離す るように、 プロテアーゼ切断部位等を介して互いに連結させてもよい。
2 . 本発明に係るレブリコン RNAの作製
本発明に係る HCV レブリコン RNAは、当業者に公知である任意の遺伝子工学 的手法を用いて作製することができる。 限定するものではないが、 HCV レプリ コン RNAは、 例えば、 以下のような方法で作製することができる。
まず、 NS3夕ンパク質、 NS4A夕ンパク質、 NS4B夕ンパク質、 NS5A夕ンパク質、 及び NS5Bタンパク質 （配列番号 1又は 2 ) と 3'非翻訳領域 （配列番号 4又は 6 )の RNAに対応する DNAとを、常法によりクローニングベクターに挿入して、 DNAクローンを作製する。 一方、 5'非翻訳領域 （配列番号 3又は 5 ) は RNAプ 口モーターの下流に挿入して、 DNAクローンを作製する。 ここで、 「RNAに対応 する DNA」 とは、 当該 RNAの塩基配列の ϋ (ゥラシル） を Τ (チミン） に置き換 えた塩基配列からなる DNAを意味する。 前記 RNAプロモータ一は、 プラスミド クロ一ン中に含まれるものであることが好ましい。 好適な RNAプロモーターと しては、 限定するものではないが、 Τ7 RNAプロモータ一、 SP6 RNAプロモータ 一、 SP3 RNAプロモーターが挙げられ、 Τ7 RNAプロモーターが特に好ましい。 次に、 作製した 5'非翻訳領域 DNAクローンについて、 例えば、 5'非翻訳領域 の下流に、 選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を揷入し、 その下流に
RES配列を挿入する。さらに、 IRES配列の下流に配列番号 1又は 2で示される 塩基配列からなる DMと配列番号 4又は 6で示される塩基配列からなる DNi を この順で連結する。
次いで、 上記で作製した DNAクロ一ンを铸型として、 RNAポリメラーゼによ り RNAを合成する。 RNA合成は、 5'非翻訳領域及び IRES配列から、 常法に^り 開始させることができる。 铸型 DNAがプラスミドクローンの場合には、 そのプ ラスミドクローンから、 RNAプロモータ一の下流に連結された上記 DNA領：^を 制限酵素によって切り出し、 その DNA断片を铸型として用いて RNAを合成する こともできる。なお、好ましくは合成される RNAの 3 '末端がウィルスゲノム RNA の 3'非翻訳領域と一致し、他の配列が付加されたり削除されたりしないことが 好ましい。 このようにして合成された Aが、 本発明に係るレブリコン RN で ある。
3 . 本発明に関わる HCVのレプリコン; NAを導入したレプリコン複製細胞の作 製
上記のようにして作製されたレプリコン RNAを、 レプリコン RNAを複製させ るべき細胞に導入することにより、 レプリコン Aが持続的に複製される 田胞 を得ることができる。 本明細書では、 レブリコン RNAが持続的に増幅される.細 胞を 「レブリコン複製細胞」 と称する。
レプリコン RNAを導入する細胞としては、 継代培養することが可能な細 I で あれば任意の細胞を用いることができるが、 真核細胞であることが好ましく、 ヒト肝由来細胞、 ヒト子宮頸由来細胞、 又はヒト胎児腎由来細胞であることが より好ましく、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293細胞 であることがさらに好ましい。 これらの細胞は、 市販のものを利用してもよい し、 細胞寄託機関から入手して使用してもよいし、 任意の細胞 （例えば、 瘙細 胞又は幹細胞） から株化した細胞を使用してもよい。
前記細胞は、 ヮクチン製造のように HCV夕ンパクの大量製造を目的とする場 合には、 大量培養が可能な細胞を用いることが望ましい。 そのような観点力 ら は、 ΗιΛ7細胞以外の細胞であることが好ましい。
レブリコン RNAの細胞内への導入は、 当業者には公知の任意の技術を使用し て行うことができる。 そのような導入法としては、 例えば、 エレクトロボレ一 シヨン、 パ一ティクルガン法、 リポフエクシヨン法、 リン酸カルシウム法、 マ イク口インジェクション法、 DEAEセファ口一ス法等が挙げられるが、 エレクト 口ポレーシヨンによる方法が特に好ましい。
レブリコン RNAは、 目的のレブリコン RNAを単独で導入してもよいし、 他の 核酸と混合させたものを導入してもよい。 導入する RNA量を一定にしてレプリ コン RNAの量を変化させたい場合には、 目的のレブリコン RNAを、 導入する細 胞から抽出したトータル細胞性 RNAと混合して、 細胞内導入に用いればよい。 細胞内導入に用いるレプリコン RNAの量は、 使用する導入法に応じて決めれば よいが、 好ましくは 1ピコグラム〜 100マイクログラム、 より好ましくは 10ピ コグラム〜 10マイクログラムの量を使用する。
細胞内導入のために選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含有するレ プリコン RNAを用いる場合には、 そのレプリコン RNAが導入され持続的に複製 している細胞を、選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の発現を利用して、 選択することができる。 具体的には、 例えば、 そのようなレブリコン RNAの細 胞内導入処理を施した細胞を、 選択マ一カー遺伝子又はリポーター遺伝子の発 現により選択可能となる培地において培養すればよい。
—例として、 レプリコン RNAにネオマイシン耐性遺伝子が選択マーカー遺伝 子として含まれる場合には、 そのレブリコン RNAを用いて細胞内導入処理した 細胞を培養ディッシュに播種し、 16〜24時間培養した後に、 培養ディッシュに G418 (ネオマイシン） を 0. 05ミリグラム/ミリリットル〜 3. 0ミリグラム/ミリ リットルの濃度で添加し、 その後、 週に 2回培養液を交換しながら培養を継続 し、播種時から好ましくは 10日間〜 40日間、より好ましくは 14日間〜 28日間 培養した後にクリスタルバイオレツ卜で生存細胞を染色することにより、 レプ リコン RNAが導入され持続的に複製されている細胞を、 コロニーとして選択す ることができる。
形成されたコロニーからは、常法により細胞をクローン化することができる。 こうして得られる目的のレブリコン RNAが持続的に複製される細胞クローンを、 本明細書では 「レブリコン複製細胞クローン」 と称する。
樹立した細胞クローンについては、 導入されたレブリコン RNAから該細胞ク ローン中で複製されているレブリコン RNAの検出、 導入されたレブリコン RNA 中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子の宿主ゲノム DNAへの組み込み の有無の確認、 及び HCVタンパク質の発現の確認を行って、 実際に目的のレプ リコン RNAが持続的に複製されていることを確認することが好ましい。
導入されたレブリコン RNA から該細胞クローン中で複製されたレブリコン RNA (本明細書中では、 以下便宜的に、 「複製レブリコン RNA」 と称する） の検 出は、 当業者には公知の任意の RNA検出法に従って行えばよいが、 例えば、 細 胞クローンから抽出したトータル RNAについて、 導入されたレプリコン RNAに 対して特異的な DNA断片をプローブとして用いるノーザンハイプリダイゼーシ ョン法を実施することにより検出することができる。
また導入されたレプリコン RNA中の選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝 子の宿主ゲノム丽 Aへの組み込みの確認は、限定するものではないが、例えば、 細胞クローンから抽出した宿主ゲノム DNAについて該選択マーカ一遺伝子又ま リポーター遺伝子の少なくとも一部を増幅する PCRを行い、 その増幅産物の有 無を確認することによって行うことができる。 増幅産物が確認された細胞クロ ーンでは、 宿主ゲノム中に選択マ一カー遺伝子又はリポーター遺伝子が組み まれていると判断されることから、 レブリコン RNA自体は該細胞内で持続的に 複製されていない可能性がある。 この場合、 レブリコン RNAが持続的に複製ざ れているか否かを、 次に示す HCVタンパク質の発現の確認実験によって、 確認 することができる。
HCVタンパク質の発現の確認は、 例えば、 導入されたレブリコン RNAから^ 現されるべき HCVタンパク質に対する抗体を、 細胞クローンから抽出したタン パク質と反応させることによって行うことができる。 この方法は、 当業者には 公知の任意のタンパク質検出法によって行うことができるが、 具体的には、 树 えば、 細胞クローンから抽出したタンパク質試料をニトロセルロース膜にプロ ッティングし、 それに対して抗 HCVタンパク質抗体 （例えば、 抗 NS3特異的抗 体、 又は C型肝炎患者から採取した抗血清） を反応させ、 さらにその抗 HCVタ ンパク質抗体を検出することによって行うことができる。 細胞クローンから拍 出したタンパク質中から HCV夕ンパク質が検出されれば、その細胞クローンは、 HCV由来のレプリコン RNAが持続的に複製して HCVタンパク質を発現している ものと判断することができる。
以上のようにして、 目的のレブリコン RNAを持続的に複製していることが確 認された細胞クローン （レブリコン複製細胞クローン） を得ることができる。 また本発明においては、 このレブリコン複製細胞から、 例えば: RNAを抽出しそ の中からレプリコン RNAを電気泳動法により分離する等の当業者には公知の任 意の方法により、 レブリコン RNAを取得することができる。 本発明はそのよう なレブリコン RNAの製造方法をも提供する。 さらに本発明に係るレプリコン複 製細胞は、 HCV タンパク質を製造するために好適に使用することができる。 レ プリコン複製細胞からの HCV夕ンパク質の製造は、 当業者であれば常法に従つ て行うことができる。 具体的には、 例えば、 レブリコン複製細胞を培養し、 得 られる培養物 （培養細胞及び培養培地を含む） から常法によりタンパク質を取 得することができる。
また本発明に係るレブリコン複製細胞が、 外来遺伝子を含有するレプリコン
RNA を持続的に複製している場合には、 そのレブリコン複製細胞を用いて外来 遺伝子にコードされるタンパク質を発現させて取得することができる。 具体的 には、 例えば、 レブリコン複製細胞を培養し、 得られる培養物 （培養細胞及び 培養培地を含む） から常法によりタンパク質を採取し、 さらにそのタンパク質 から、 目的のタンパク質に対する抗体を用いた検出等により外来遺伝子にコー ドされたタンパク質を選択的に取得することができる。
4 . 本発明に関わる HCVのレブリコン RNAへの複製効率を増大させる突然変異 の導入
本発明に係るレブリコン複製細胞において複製され生成されたレブリコン RNA (複製レブリコン RNA) には、 複製効率を向上させる突然変異が頻繁に生ず る。 このような突然変異は適合変異であると思われる。
本発明では、 このことを利用して、 本発明に係るレブリコン RNAに複製効率 を向上させる突然変異を高頻度で導入することができる。
具体的には、 第 1のレブリコン複製細胞 （好ましくは本発明に係るレブリコ ン RNAを導入したレブリコン複製細胞） から、 第 1の複製レブリコン RNAを抽 出等により取得し、 第 1の複製レブリコン RNAをさらに別の細胞に再導入して 第 2のレブリコン複製細胞を作製するという工程を、 1 回以上、 好ましくは 1 〜10回、 より好ましくは 1〜5回、 さらに好ましくは 1〜2回反復的に行うこと により、 レブリコン複製細胞中で、 レブリコン RNAに複製効率を増大させる突 然変異を高頻度に導入することができる。
複製レプリコン RNAを再導入する細胞としては、 任意の細胞を用いることが できるが、 最初にレブリコン RNAを導入した細胞と同じ生物種由来の細胞であ ることが好ましく、 最初にレブリコン RNAを導入した細胞と同じ生物種由来の 同じ組織由来の細胞であることがより好ましく、 最初にレプリコン RNAを導入 した細胞と同じ細胞株の細胞であることがさらにより好ましい。
従って、 本発明では、 上記の方法を用いて、 複製効率を増大させる突然変異 を導入したレブリコン RNAを製造することができる。 すなわち、 まず第 1のレ プリコン複製細胞 （本発明に係るレプリコン RNAを導入したレプリコン複製細 胞） から、 第 1の複製レブリコン RNAを抽出等により取得し、 さらにこの第 1 の複製レプリコン RNAをさらに別の細胞に再導入して第 2のレブリコン複製細 胞を作製する工程を、 1回以上、好ましくは 1〜10回、より好ましくは 1〜5回、 さらに好ましくは 1〜2回反復的に行った後、この反復工程の最後に得られる最 終的なレブリコン複製細胞から、 複製レブリコン RNAを抽出等によつて取得す ることにより、 複製効率が増大したレブリコン RNAを製造することができる。 本発明では、 以上のような方法により、 レブリコン RNAの複製効率を少なく とも 2倍、好ましくは 10〜100倍、 より好ましくは 100〜10000倍に増大させる ことができる。
このような方法で製造された複製効率が増大したレブリコン RNAについては、 逆転写 PCRによって cDNAを得てそれを塩基配列決定に供するなどの公知の方法 により、 塩基配列を決定することが好ましい。 さらに、 決定された塩基配列又 はそれにコードされるアミノ酸配列を、 最初に細胞に導入されたレブリコン RNA の塩基配列と比較することにより、 適合変異を同定することができる。 複 製効率を増大させる適合変異としては、 特に、 レブリコン RNAにコードされた ウィルスタンパク質のアミノ酸を変異させる非同義置換が好ましい。
また本発明は、 そのようにして同定した適合変異を、 レブリコン RNAに常法 により導入することで、 複製効率が増大した C型肝炎ウィルスのレブリコン RNAを製造する方法も提供する。 以上のようにして製造された複製効率が増大したレブリコン RNAはレブリコ ン RNAを大量に製造するために使用することができる。
本発明に係るレブリコン RNAの複製効率は、 当業者に公知の方法、 例えば次 のような方法に従って決定することができる。
例えば、謹細胞に 0. 0001、 0. 0003、 0. 001、 0. 003、 0. 01、 0. 03、 0. 1、 0. 3、 1. 0マイクログラムの量のレプリコン RNAを卜ランスフエクシヨンして、 前述 の実験手法と同様の方法で G418による選択培養を 21日間行った後にコロニー 形成数 （コロニー数） を測定する。 導入した RNA量とコロニー形成数とを比較 して容量依存的にコロニー形成が増加するレプリコン RNA導入量の範囲を決定 し、 その範囲内でのコロニー形成数を、 導入した RNA量で除算して得られる値 を、 1マイクログラムあたりのコロニー形成率とする。 この計算式は、 以下の とおりである。コロニー形成率 [ (Colony forming Uni t ; CFU) /マイクログラム] = コロニー形成数 [個] Z導入した RNA量 [マイクログラム]
こうして算出されたコロニー形成率を、 導入したレブリコン RNAの複製効率 を示す値とする。 すなわち、 コロニー形成率が高いほど、 そのレブリコン RNA の複製効率は高い。
またレブリコン RNAの複製効率は、 形成されたコロニー 1個あたりの導入し たレブリコン RNAのコピ一数で示されるコロニー形成能で表すこともできる。 すなわち、 以下のような計算式に従って算出することができる。 コロニー形成 能二導入したレブリコン RNAのコピー数 [コピー] Zコロニー形成数 [個] 5 . 本発明の他の実施形態
本発明に係るレブリコン RNA複製細胞は、 例えば C型肝炎ウィルスの複製を 促進又は抑制する物質をスクリーニングするための試験系として使用すること もできる。 具体的には、 例えば、 被験物質の存在下でレブリコン複製細胞を培 養し、 得られる培養物中のレブリコン RNAの複製を検出し、 その被験物質がレ プリコン RNAの複製を促進又は抑制するかどうかを判定することにより、 C型 肝炎ウィルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリーニングすることができ る。 この場合、 得られる培養物中のレブリコン RNAの複製の検出は、 レブリコ ン RNA複製細胞から抽出した RNA中のレブリコン RNAの量又は有無を検出する ことによるものであってもよいし、 培養物中又は該培養物に含まれるレブリコ ン RNA複製細胞中のタンパク質に含まれる HCVタンパク質の量又は有無を検出 するものであってもよい。
このような試験系は、 C型肝炎ウィルス感染の治療剤若しくは診断剤の製造 又は評価のために使用することができる。 具体的には、 以下のような例が挙げ られる。
(D HCVの増殖を抑制する物質の探索
HCV の増殖を抑制する物質としては、 例えば、 直接的若しくは間接的に HCV の増殖に影響を及ぼす有機化合物、 あるいは HCVゲノム若しくはその相補鎖の 標的配列にハイプリダイズすることにより HCVの増殖若しくは HCV夕ンパク質 の翻訳に直接的又は間接的に影響を及ぼすアンチセンスオリゴヌクレオチド等 が挙げられる。
(2) 細胞培養中で抗ウィルス作用を有する各種物質の評価
前記各種物質としては、 合理的ドラッグデザイン又はハイスループッ卜スク リーニングを用いて得られた物質 （例えば、 単離精製された酵素） 等が挙げら れる。
(3) HCVに感染した患者の治療のための、 新規攻撃標的の同定
例えば HCVウィルス増殖のために重要な役割を果たす宿主細胞性タンパク質 を同定するために、本発明に係るレブリコン複製細胞を使用することができる。
(4) HCV ウィルスの薬剤等に対する耐性獲得能の評価及び該耐性に関わる変異 の同定
(5) C型肝炎ウィルス感染の診断薬又は治療薬の開発、 製造及び評価のために 使用可能な抗原としてのウィルスタンパク質の製造 本発明を、 以下の実施例及び図面に基づいてさらに具体的に説明する。
[実施例 1 ]
レブリコン RNAの作製
1 . 発現ベクターの構築
劇症肝炎の患者から分離した C型肝炎ウィルス JFH - 2. 1株及び JFH - 2. 2株の ウィルスゲノムの全領域に対応する DNA を、 該ウィルス株のゲノム全長 cDNA を含む JFH-2. 1、及び JFH- 2. 2クローンから取得し、 T7RNAプロモーター配列の 合成 DMをそれぞれのクローンの 5 ' 端に付加し、 プラスミド PUC19プラスミ ドに挿入した。このようにして構築されたプラスミド DNAを、以下、 pJFH- 2. 1、 及び pJFH- 2. 2と称する。 なお、 上記 JFH-2. 1、 及び JFH- 2. 2クローンの作製に ついては、 既報 (Lehmann et. al. , Science, (1999) ) に従った。
このようにして構築したプラスミド DNA pJFH - 2. 1、及び pJFH - 2. 2の構造を、 図 1の上段に示す。 「T7J は T7 RNAプロモータ一、 「G」 は JFH- 2. 1及び JFH-2. 2 の 5' 端の上流及び T7R Aプロモーター配列の 3 ' 端の下流に挿入した dGTPを 示す。 「5 ' NTRJから 「3 ' NTRJ までが C型肝炎ウィルスのゲノム全領域に対応 する DMである。
次に、 プラスミド DNApJFH- 2. 1、 及び pJFH- 2. 2の構造領域と非構造領域の一 部を、ネオマイシン耐性遺伝子（neo ;ネオマイシンホスホトランスフェラ一ゼ 遺伝子とも称する）、 及び EMCV- IRES (脳心筋炎ウィルスの内部リポゾ一ム結合 部位） で置換して、 プラスミ
ド DNA PSGREP-JFH2. 1、及び pSGREP-JFH2. 2をそれぞれ構築した（図 1の下段）。 この構築手順は、 既報 (Lehmann et. a 1. , Science, (1999) ) に従った。 具体的 には、 プラスミド pJFH-2. 1、 及び pJFH- 2. 2を制限酵素 Agel及び Clalで切断 し、 その切断部位に、 pJFH-2. 1、 及び pJFH-2. 2由来の 5' NTRから Core領域に およぶ配列と発現べクタ一 PRSV5NE0由来のネオマイシン耐性遺伝子を PCR増幅 により結合し制限酵素 Agl l と Pmelで切断した断片、 及び EMCV IRESから NS3 領域におよぶ配列を PCR増幅により結合し制限酵素 Pmelと alで切断した断 片を、 挿入し連結した。
2 . レブリコン RNAの作製
レブリコン RNA合成に用いる铸型 DNAを作製するために、 上記のとおり構築 した発現ベクター PSGREP-JFH2. 1及び PSGREP-JFH2. 2を、それぞれ制限酵素 Xtal で切断した。次いで、これらの Xbal切断断片のそれぞれ 10から 20 Sを、 Mung Bean Nuclease 20U ( 1 ^一タル反応液量 を用いて 30°Cで 30分間インキ ュペートして、 さらに処理した。 Mung Bean Nucleaseは、 二本鎖 DNA中の一本 鎖部分を選択的に分解する反応を触媒する酵素である。通常、上記 Xbal切断断 片をそのまま錶型として用いて RNA合成を行うと、 Xbalの認識配列の一部であ る CUGAの 4塩基が 3'末端に余分に付加されたレプリコン RNAが合成されてし まう。 そこで本実施例では、 Xbal切断断片を Mung Bean Nuc leaseで処理する ことにより、 Xbal切断断片から CUGAの 4塩基を除去した。 この後、 Xbal切断 断片を含む Mung Bean Nu C lease処理後の溶液について、 常法に従ったタンパ ク質除去処理により、 CUGAの 4塩基が除去された Xbal切断断片を精製して、 これを錡型 DNAとした。
次に、 この铸型 DNAから、 RNAを in vi t ro合成した。 RNA合成には Amb ion 社の MEGAscr iptを用いた。 铸型 DNAを 0. 5から 1. Ο x g含む反応液 20 1で、 37°Cで 3時間から 16時間反応させた。
RNA合成終了後、 反応溶液に DNAse (2U) を添加して、 37°Cで 15分間反応さ せた後、さらに酸性フエノールによる RNA抽出を行つて、錶型 DNAを除去した。 このようにして pSGREP - JFH2. 1、及び PSGREP-JFH2. 2に由来する上述の踌型 DNA から合成した RNA (レブリコン RNA) を、 それぞれ rSGREP- JFH2. 1、 及び rSGREP- JFH2. 2 と命名した。 これらのレブリコン RNA の塩基配列を、 rSGREP-JFH2. 1については配列番号 Ί及び図 1、 rSGREP- JFH2. 2にっては配歹 ij番 号 8及び図 1に示す。
[実施例 2 ]
レブリコン複製細胞クローンの樹立
実施例 1で作製した合成レプリコン RNA、 rSGREP-JFH2. 1、及び rSGREP-JFH2. 2 のそれぞれについて、 レプリコン RNA O. 01ng〜10 gを Huh7細胞から抽出した トータル細胞性 RNAと混合して、 RNA総量が 10 _i gとなるように調整した。 次 いで、 その混合 RNAをエレクト口ポレーシヨン法により Huh7細胞に導入レた。 エレクトロポレーション処理を行った Huh7細胞を培養ディッシュに播種し、 16 時間から 24時間培養した後に、培養ディッシュに G418 (ネオマイシン)を様々 な濃度で添加した。 その後、 週に 2回培養液を交換しながら培養を継続した。 播種時から 21日間培養した後、クリスタルバイオレツ卜で生存細胞を染色した。 その結果、 図 2に示すように、 コロニー形成が確認できた。
コロニー形成が認められた rSGREP - JFH2. 1又は rSGREP-JFH2. 2 トランスフエ クション細胞については、上記の培養 21日後の培養ディッシュからさらに生存 細胞のコロニーをクローン化し、 培養を継続した。 このようなコロニーのクロ 一二ングにより、 細胞クローンを複数株樹立することができた。 本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考とし て本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明にかかる劇症 C型肝炎患者の HCV株 JFH2. 1あるいは JFH2. 2に由来す る遺伝子を利用することにより、 高確率で複製効率の良い HCVレプリ :ン RNA を作製することができる。該レプリコン RNAを導入したレプリコン複製細胞は、 HCV由来の RNA及び HCVタンパク質を持続的に産生させるための培養系として 利用できる。 さらに前記レブリコン複製細胞は、 HCVの複製及び/又【ま HCV夕 ンパク質の翻訳に影響を及ぼす各種物質をスクリーニングするための試験系と して利用できる。 配列表フリーテキスト
配列番号 7 —人工配列の説明： JFH2. 1レプリコン RNA
配列番号 8—人工配列の説明：； 1FH2. 2レブリコン RNA

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 以下の（a)、 （b)又は（c)のポリヌクレオチドからなる核酸。
(a)配列番号 1、配列番号 3及び配列番号 4に示される塩基配列を含むポリヌク レオチド
(b)配列番号 2、配列番号 5及び配列番号 6に示される塩基配列を含むポリヌク レオチド
(c)前記（a)又は (b)記載の塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオ チドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつ HCVタンパクをコ ードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「t」 に読み替えるもの とする）
2 . 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸。
(a)配列番号 1で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ HCVタンパクのうち NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A及び NS5Bタンパクをコードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「t」 に読み替えるもの とする）
3 . 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸。
(a)配列番号 3で表される塩基配列を含むポリヌクレオチド
(b)前記 (a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ HCV遺伝子の 5'非翻訳領域 をコードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「t」 に読み替えるもの とする） 4 . 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸。 (a)配列番号 4で表される塩基配列を含むポリヌクレ才チド
(b)前記 (a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ HCV遺伝子の 3'非翻訳領域 をコードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 〖ま 「t」 に読み替えるもの とする）
5 . 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸。
(a)配列番号 2で表される塩基配列を含むポリヌクレ才チド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス 1、リンジェントな条件下で八ィブリダイズし、 かつ HCVタンパクのうち NS3、 NS4A、 NS4B、 NS5A及び NS5Bをコードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「t」 に読み替えるもの とする）
6 . 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸。
(a)配列番号 5で表される塩基配列を含むポリヌクレ才チド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HCV遺伝子の 5'非翻訳領域 をコードするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「t」 に読み替えるもの とする）
7 . 以下の（a)又は（b)のポリヌクレオチドからなる核酸。
(a)配列番号 6で表される塩基配列を含むポリヌクレ才チド
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとス トリンジェントな条件下でハイプリダイズし、かつ HCV遺伝子の 3'非翻訳領域 をコ一ドするポリヌクレオチド
(但し、 核酸が DNAの場合、 配列表の塩基記号 「u」 は 「t」 に読み替えるもの とする）
8 . 請求項 1乃至 7のいずれか 1項記載の核酸からなる遺伝子。
9 . 請求項 8記載の遺伝子によってコードされるポリペプチド。
1 0 . 以下の（a)又は（b)の RNAからなるレプリコン RNA。
(a)配列番号 1、 配列番号 3及び配列番号 4に示される塩基配列を含む RNA
(b)配列番号 2、 配列番号 5及び配列番号 6に示される塩基配列を含む RNA 1 1 . さらに IRES配列を含む、 請求項 1 0記載のレブリコン RNA。
1 2 . さらに選択マーカー遺伝子又はリポーター遺伝子を含む、 請求項 1 1 記載のレブリコン RNA。 1 3 . 以下の（a)又は (b)の RNAからなるレプリコン RNA。
(a)配列番号 7又は 8に示される塩基配列を含む RNA
(b)前記（a)記載の塩基配列に相補的な塩基配列からなる RNAとストリンジェン トな条件下でハイプリダイズし、 かつ自律複製能を有する RNA 1 4 . 請求項 1 0乃至 1 3のいずれか 1項記載のレプリコン RNAを細胞に導 入することにより、 レブリコン複製細胞を作製する方法。
1 5 . 請求項 1 0乃至 1 3のいずれか 1項記載のレブリコン RNAを細胞に導 入することにより作製された、 レブリコン複製細胞。
1 6 . 細胞が、 ヒト肝由来細胞、 ヒト子宮頸由来細胞、 又はヒト胎児腎由来 細胞である、 請求項 1 5記載のレブリコン複製細胞。
1 7 . 細胞が、 Huh7細胞、 HepG2細胞、 IMY-N9細胞、 HeLa細胞、 又は 293 細胞である、 請求項 1 5又は 1 6記載のレブリコン複製細胞。
1 8 . 被験物質の存在下で、 請求項 1 5乃至 1 7のいずれか 1項記載のレブ リコン複製細胞を培養し、 得られる培養物中のレプリコン RNAの複製を検出す ることを含む、 C型肝炎ウィルスの複製を促進又は抑制する物質をスクリー二 ングする方法。
1 9 . 請求項 1 5乃至 1 7のいずれか 1項記載のレブリコン複製細胞から複 製レブリコン RNAを取得し、 取得した複製レブリコン RNAを別の細胞に導入し て新たなレブリコン複製細胞を作製する工程を 1回以上行うことを含む、 C型 肝炎ウィルスのレブリコン RNAの複製効率を増大させる方法。
2 0 . 複製効率の増大が、 レブ υコン複製細胞に導入されたレブリコン RNA の複製効率と比較して、少なくとち 2倍の増大である、請求項 1 9記載の方法。 2 1 . 請求項 1 5乃至 1 7のい—ずれか 1項記載のレプリコン複製細胞から複 製レプリコン RNAを取得し、 取得した複製レプリコン RNAを該レプリコン複製 細胞とは別の細胞に導入して新たなレブリコン複製細胞を作製する工程を 1回 以上行うこと、 及び最終的に得られたレプリコン複製細胞から複製レブリコン RNA を取得することを含む、 複製 率が増大した C型肝炎ウィルスのレブリコ ン RNAを製造する方法。
2 2 . 請求項 2 1に記載の方法によって製造された複製効率が増大したレブ リコン RNAについて、 レプリコン複製細胞に最初に導入されたレプリコン RNA との間の塩基変異又はアミノ酸変異を検出すること、 及び複製効率を増大させ ようとするレプリコン RNAにその検出された塩基変異又はアミノ酸変異を導入 することを含む、 複製効率が増大した 型肝炎ウイルスのレブリコン RNAを製 造する方法。
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