WO2005027970A1 - 癌治療用医薬 - Google Patents

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WO2005027970A1
WO2005027970A1 PCT/JP2004/014452 JP2004014452W WO2005027970A1 WO 2005027970 A1 WO2005027970 A1 WO 2005027970A1 JP 2004014452 W JP2004014452 W JP 2004014452W WO 2005027970 A1 WO2005027970 A1 WO 2005027970A1
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WO
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antibody
igf
activity
insulin
inhibits
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PCT/JP2004/014452
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English (en)
French (fr)
Inventor
Atsushi Ochiai
Hideaki Kusaka
Tadakazu Akiyama
Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Japan As Represented By President Of National Cancer Center
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Priority to EP04773540A priority patent/EP1671647A1/en
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/351—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom not condensed with another ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a medicament for treating cancer, which comprises a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-I) and insulin-like growth factor-II (IGF-II), and is administered in combination with irradiation. , And insulin-like growth factor-1 (IGF-I) and insulin-like growth factor
  • the present invention relates to a drug for treating cancer, which comprises a combination of a substance that inhibits the activity of factor-II (IGF-II) and a substance that has antitumor activity.
  • a drug for treating cancer which comprises a combination of a substance that inhibits the activity of factor-II (IGF-II) and a substance that has antitumor activity.
  • IGF Insulin-like growth factor
  • IGF-I insulin-like growth factor-1
  • IGF-II insulin-like growth factor-II
  • IGF receptor IGF receptor
  • IGFBP IGF-binding protein
  • IGF-I and IGF-II are both cancer cells (sarcoma, leukemia, prostate cancer, breast cancer, lung cancer, stomach cancer, esophagus cancer, liver cancer, liver cancer, kidney cancer, kidney cancer, thyroid cancer, brain tumor, ovarian cancer, It has a strong growth-promoting effect on uterine cancer and overexpression has been observed in many cancer cells.
  • IGF-family proteins IGF, IGF-R, IGFBP
  • IGF-I and IGF-II IGF-family proteins
  • IGF-1 and IGF-I IGF-1 and IGF-I.
  • Growth factors II and insulin receptors, IGF-IR and IGF-IR receptors, and IGFBPs are intricately intertwined to control disease. That is, it is difficult to completely suppress the disease even if some of these interactions are inhibited.
  • sml. 2 As a representative antibody against human IGF-1 (anti-MGF-1 antibody), sml. 2 has been reported (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 2389). -2392, 1984). sml. 2 has about 40% cross-reactivity with hIGF-II, and lOOng of hIGF-1 can be detected by estanblotting at l ⁇ 2 ⁇ g / mL concentration.
  • Va M- SmC121 which does not react with human insulin and hIGF-II, and a peptide containing Leu-Vap Asp at the 10th to 12th positions of hIGF_I.
  • 125 1 - WGF- 1 in radioimmuno mediation Si it has been reported that showed sensitivity of HIGF- 1 of Ing / mL (Journal of Endocrinology, 125, 327-335 , 1990).
  • HIGF-IR with lg / mL WGF-1 at a concentration of 30 g / mL that completely inhibits the growth of the mouse fibroblast cell line BALB / C3T3 by hIGF-I at a concentration of 12 g / mL or more.
  • Inhibition of autophosphorylation of HIGF-I, and radioimmunoassay using 125 I-hIGF-1 have been reported to exhibit a hIGF-I detection sensitivity of 0.1 ⁇ (Hybridoma, 16, 513-518, 1997).
  • BPL-M23 exhibits a binding activity of 10.5 litres / dishol for IGF-I, whereas hlGF-II and human insulin have 0.8 and 0.0001% cross-reactivity, respectively. It is responsive to goat, bush, sheep, sheep, magpie, and egret, but not to rat and mouse IGF, and inhibits WGF-I adipogenesis on rat adipocytes (Journal of Molecular Endocrinology, 2, 201-206, 1989).
  • S1F2 has been reported as a typical antibody against human IGF-II (anti-hIGF_II antibody). S1F2 has about 10% cross-reactivity with hIGF-I, and can detect 10-100 ng of hlGF-II by Western plotting at a concentration of 1 g / mL. At a concentration of 100 g / mL, it has been shown that 100 ng / mL of hlGF-II inhibits the DNA synthesis-stimulating effect of human fibroblasts (Diabe tes).
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • IGF-II insulin-like growth factor-II
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • IGF-II insulin-like growth factor-1
  • An object of the present invention is to provide a cancer treatment drug and a cancer treatment method that synergistically enhance the cancer treatment effect by using a substance that inhibits the activity of child-II (IGF-II).
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, irradiated a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-I) and insulin-like growth factor-II (IGF-II). Alternatively, they have found that the combined use with a substance having antitumor activity can increase the therapeutic effect on cancer, and have completed the present invention.
  • IGF-I insulin-like growth factor-1
  • IGF-III insulin-like growth factor-II
  • the present invention includes the following inventions (1) to (15).
  • a drug for treating cancer which comprises a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-I) and insulin-like growth factor-II (IGF-II), and is administered in combination with irradiation.
  • IGF-I insulin-like growth factor-1
  • IGF-II insulin-like growth factor-II
  • a medicament for treating cancer comprising a combination of a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and insulin-like growth factor-II (IGF-II) and a substance that has antitumor activity.
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • IGF-II insulin-like growth factor-II
  • a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and insulin-like growth factor-II (IGF-II) is selected from the group consisting of the following (a) to (d): (1) The medicament for treating cancer according to any of (4).
  • the monoclonal antibody is a monoclonal antibody that binds to an epitope to which a monoclonal antibody produced from Hypridoma KM1468 (FE belly BP-7978) binds.
  • the antibody fragment contains Fab, Fab ⁇ F (ab ') 2 , a single-chain antibody (scFv), a dimerization variable region (Di abody), a disulfide stabilized variable region (dsFv), and a CDR.
  • the medicament for cancer treatment according to any one of (5) to (7), which is an antibody fragment selected from the group consisting of peptides.
  • Low-molecular-weight drugs include DNA alkylating agents, DNA synthesis inhibitors, platinum-based DNA crosslinking agents, antimetabolites, topoisomerase I inhibitors, topoisomerase II inhibitors, tubulin agonists, and hormone antagonists , Aromase inhibitor, immunomodulator, immunosuppressant, steroidal anti-inflammatory, non-steroidal anti-inflammatory, antihistamine, differentiation inducer, proteosome inhibitor, tyrosine kinase inhibitor, adenosine derminer Inhibitors, angiogenesis inhibitors, histone deacetylase inhibitors, matrix protease inhibitors, pharmacosyltransferase inhibitors, bisphosphonate preparations, Hsp90 inhibitors, kinesin Eg5 inhibitors, serine threonine kinase inhibitors
  • Insulin-like growth factor-I IGF-I
  • insulin-like growth factor-I IGF-I
  • a method for treating cancer which comprises administering an effective amount of a substance that inhibits the activity of factor-II (IGF-II) in combination with an effective amount of a substance that has antitumor activity.
  • FIG. 1 shows the specific reactivity of the monoclonal antibody to hIGF- ⁇ (binding ELISA).
  • the horizontal axis shows the combination of the antibody and the antigen, and the vertical axis shows the binding activity (0D415).
  • FIG. 2 shows the reactivity of the monoclonal antibody to hlGF-I having a natural conformation in a liquid phase system (competition ELISA).
  • the horizontal axis indicates the concentration of added MGF-1 and the vertical axis indicates the binding activity (0D415).
  • FIG. 3 shows the responses of antibodies KM1468 and sml. 2 to WGF-1.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration (g / mL), and the vertical axis shows the binding activity (0D415).
  • ⁇ indicates the reactivity of KM1468, and the mouth indicates the reactivity of sml.2.
  • FIG. 4 shows the inhibitory activity of antibodies KM1468 and sml.
  • the horizontal axis indicates the concentration of various factors (g / mL), and the vertical axis indicates the binding activity (A indicates hIGF_I, B indicates hlGF-II, C indicates human insulin, and D indicates the activity by mIGF-1.
  • ⁇ indicates the reactivity of KM1468, and the mouth indicates the reactivity of sml.2.
  • FIG. 5 shows the effect of antibodies KM1468, 31111.2 and 32 on proliferation of human breast cancer cell line MCF7 due to 1116 and human insulin.
  • A indicates the cell growth activity of each factor.
  • the horizontal axis shows various factor concentrations (ig / mL), and the vertical axis shows proliferation (OD450).
  • ⁇ indicates IGF-L
  • ⁇ indicates hIGF_II
  • the mouth indicates the activity of human insulin.
  • B shows the effect of various antibodies on hlGF-1; C, hIGF_II; and D, the proliferation activity of human insulin.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration (/ ig / mL), and the vertical axis shows the proliferation (OD450).
  • the thin dotted line shows the growth without addition of the antibody, and the dotted line shows the growth without addition of each factor.
  • ⁇ indicates activity of KM1468, mouth indicates sml. 2, and ⁇ indicates activity of S1F2.
  • FIG. 6 shows the effects of antibodies KM1468, sml. 2 and S1F2 on the growth of human colon cancer cell line HT-29 by hlGF and human insulin.
  • A is cell proliferation by each factor Show activity.
  • the horizontal axis shows various factor concentrations (ng / mL), and the vertical axis shows proliferation (0D450).
  • ⁇ indicates hlGF-L Hata indicates hlGF-II activity, and mouth indicates human insulin activity.
  • B indicates hlGF-1
  • C indicates hIGF_II
  • D indicates the effect of various antibodies on the proliferative activity of human insulin.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration (g / mL), and the vertical axis shows the proliferation (0D450).
  • the thin dotted line indicates the growth without the addition of the antibody, and the dotted line indicates the growth without the addition of each factor.
  • ⁇ indicates activity of KM1468, mouth indicates sml. 2, and ⁇ indicates activity of S1F2.
  • FIG. 7 shows the effects of antibodies KM1468, sml. 2 and S1F2 on the growth of human osteosarcoma cell line MG63 by hlGF and human insulin.
  • A shows the cell proliferation activity of each factor.
  • the horizontal axis shows various factor concentrations (ng / mL), and the vertical axis shows proliferation (OD450).
  • ⁇ has IGF-L ⁇ ha! iIGF-II I, mouth indicates human insulin activity, respectively.
  • B shows the effect of WGF-1
  • C shows hlGF-II
  • D shows the effect of various antibodies on the proliferative activity of human insulin.
  • the horizontal axis shows the antibody concentration (g / mL), and the vertical axis shows the proliferation (0D450).
  • the thin dotted line shows the growth without addition of the antibody, and the dotted line shows the growth without addition of each factor.
  • ⁇ indicates the activity of KM1468
  • the mouth indicates the activity of sml. 2
  • FIG. 8 shows the inhibitory activity of various peptides on the binding of antibody KM1468 to hIGF- ⁇ .
  • the horizontal axis shows the concentration of various peptides (ig / mL), and the vertical axis shows the binding activity.
  • the various peptides used are shown in the figure.
  • This application claims the priority of Japanese Patent Application No. 2003-332346 filed on September 24, 2003 and includes the contents described in the description and Z or drawings of the patent application.
  • the drug for treating cancer of the present invention contains a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-1) and insulin-like growth factor-II (IGF-II), and is administered in combination with irradiation. For the treatment of cancer.
  • IGF-1 insulin-like growth factor-1
  • IGF-II insulin-like growth factor-II
  • the medicament for treating cancer of the present invention also comprises a substance that inhibits the activity of insulin-like growth factor-1 (IGF-I) and insulin-like growth factor-II (IGF-II), and a substance that has antitumor activity. And a pharmaceutical for treating cancer.
  • the "substance inhibiting the activity of IGI and IGF-II” may be a single substance or a composition comprising a plurality of substances. In the case of a composition comprising the above substances, each substance may be used simultaneously or separately.
  • Substances that inhibit the activity of IGF-1 and IGF-II include:
  • IGF-1 and IGF-II refers to inhibiting any activity of IGF-I and IGF-II, specifically, IGF-1 and IGF-II.
  • -II inhibits the cell growth promoting activity.
  • the “antibody or antibody fragment that specifically binds to IGF-I and IGF-II and inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II” used in the present invention refers to both IGF-1 and IGF- ⁇ .
  • An antibody or antibody fragment that specifically binds to and inhibits the activity of both IGF-1 and IGF-II Specifically, antibodies or antibody fragments that recognize the epitopes present in native IGF-I and IGF-II, and antibodies or antibody fragments that recognize the three-dimensional structure of IGF-I and IGF-II, etc. can give.
  • the above-mentioned antibody or antibody fragment used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • monoclonal antibodies include “antibodies produced by Hypridoma” "Body”, “recombinant antibody”, and antibody fragments thereof.
  • recombinant gene antibody includes a humanized antibody and a human antibody.
  • Humanized antibody includes a human chimeric antibody and a human complementarity determining region (hereinafter, referred to as "humanized antibody”). CDRs) transplant antibodies and the like.
  • Hyperidoma refers to the production of a monoclonal antibody with the desired antigen specificity, obtained by cell fusion of B cells obtained by immunizing a non-human mammal with an antigen and myeloma cells Cells.
  • Human chimeric antibody refers to the heavy chain variable region (hereinafter referred to as VH) and light chain variable region (hereinafter referred to as VL) of a non-human animal antibody and the heavy chain constant region (hereinafter referred to as VL) of a human antibody.
  • the antibody is composed of a light chain constant region (hereinafter referred to as CL) and a light chain constant region (hereinafter referred to as CL).
  • CL light chain constant region
  • CL light chain constant region
  • CL light chain constant region
  • CL light chain constant region
  • CL light chain constant region
  • any CH may be used as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter, referred to as hlg), but the hlgG class is suitable, and further, gGl and hIgG2 belonging to the MgG class are suitable.
  • HI gG3 and M gG4 can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and a ⁇ class or ⁇ class antibody can be used.
  • Animals other than humans include mice, rats, hamsters, and rabbits.
  • Human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting VH and VL CDRs of a non-human animal antibody into appropriate positions of VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention encodes a V region in which VH and VL CDRs of a non-human animal antibody are linked to a VH and VL framework (hereinafter, referred to as FR) of any human antibody.
  • FR VH and VL framework
  • any CH may be used as long as it belongs to hlg, but those of the MgG class are preferable, and any of the subclasses such as gGl, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to the WgG class are used. be able to.
  • the CL of the human CDR-grafted antibody may be any CL as long as it belongs to Mg, and a ⁇ class or ⁇ class antibody can be used.
  • “Human antibody” originally refers to an antibody naturally occurring in the human body, but is a human antibody protein produced by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering. Also included are dilibraries and antibodies obtained from human antibody-producing transgenic animals.
  • Antibodies present in the human body include, for example, isolation of human peripheral blood lymphocytes, immortalization by infection with EB virus, etc., cloning to obtain lymphocytes that produce the antibodies, and culturing the lymphocytes Then, the antibody can be obtained by purifying the antibody from the culture supernatant.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting an antibody gene prepared from human B cells into the phage gene. From the library, phages expressing antibody fragments having the desired antigen-binding activity on the surface can be recovered using the binding to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule consisting of two complete H chains and two complete L chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal refers to an animal in which a human antibody gene has been integrated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be prepared by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, transplanting the ES cells into an early mouse embryo, and then developing the embryo.
  • Human antibody-producing transgenic animals can be prepared from human antibody-producing hybridomas by the usual method for preparing hybridomas in non-human animals. Human antibodies can be produced and accumulated.
  • Antibodies or antibody fragments that can be preferably used in the present invention bind to monoclonal antibody thigh 1468 produced by Hypridoma KM1468 (FERM BP-7978) and monoclonal antibody KM1468 produced by Hypridoma KM1468 (FERM BP-7978). Reacts with a monoclonal antibody that binds to
  • a monoclonal antibody that binds to a binding epitope, a recombinant antibody or an antibody fragment containing the amino acid sequences of CDR1, CD2, and CDR3 of VH and VL of the above-mentioned monoclonal antibody can be used.
  • composition includes antibodies or antibody fragments that specifically bind to IGF-I and inhibit IGF-1 activity, and antibodies or antibody fragments that specifically bind to IGF-II and inhibit IGF-II activity
  • the composition may be any composition as long as the composition contains any one of an antibody or antibody fragment that inhibits the activity of IGF-I and any one of the antibody or antibody fragment that inhibits the activity of IGF-II. .
  • an antibody or antibody fragment that specifically binds to IGF-1 and inhibits the activity of IGF-1 refers to a substance that specifically binds to IGF-1 but does not specifically bind to IGF-II.
  • AF791 manufactured by R & D
  • mIGF-I mouse IGF-1
  • hIGF-1 human IGF-1
  • a monoclonal antibody that binds to the epitope that binds AF791 a monoclonal antibody that binds to the epitope that binds 56408, a monoclonal antibody that binds to the epitope that binds M23 / ILG1-001, and the monoclonal antibody described above.
  • Examples include a recombinant antibody or an antibody fragment containing the amino acid sequences of CDR1, CDR2, and CDR3 of VH and VL possessed by the oral antibody.
  • an antibody or an antibody fragment that specifically binds to IGF-II and inhibits the activity of IGF-II refers to an antibody or antibody fragment that specifically binds to IGF-II but does not specifically bind to IGF-1.
  • composition refers to an agent comprising "an antibody or an antibody fragment that specifically binds to IGF-1 and inhibits the activity of IGF-I” and "an agent that specifically binds to IGF-II and An agent containing an "antibody or antibody fragment that inhibits the activity” is separately prepared, and refers to a composition for combining these agents and using them simultaneously or sequentially.
  • ⁇ Complexation of an antibody or antibody fragment that specifically binds to IGF-1 and inhibits IGF-1 activity and an antibody or antibody fragment that specifically binds to IGF-II and inhibits IGF-II activity As a ⁇ body, '' a complex obtained by binding any of the antibody or antibody fragment that inhibits the activity of IGF-I and any of the antibody or antibody fragment that inhibits the activity of IGF-II can be used. Anything is acceptable. Specific examples include an antibody complex in which the above two types of antibodies or antibody fragments are bound by the following means.
  • Examples of the method of binding the antibody include a method of chemically binding and a method of using a protein engineering technique.
  • two kinds of antibody molecules are bonded using a cross-linking agent such as N-succ inimidyl-3-(2-pyridyldithiol) -propionate or S-ace tylmercaptosucc inic acid id anhydride. And the like.
  • a cross-linking agent such as N-succ inimidyl-3-(2-pyridyldithiol) -propionate or S-ace tylmercaptosucc inic acid id anhydride.
  • any method can be used as long as there is a method in which a plurality of antibodies or antibody fragments are expressed by binding using a protein engineering technique.
  • An antibody complex produced by a binding method using a protein engineering technique includes a molecule in which two types of scFvs are bound via a suitable linker, and a type in which two types of antibody Fab 'fragments are bound via a suitable linker.
  • an Fc fusion protein in which two types of scFvs are linked to the N-terminus and C-terminus a heteromolecule of an Fc fusion protein in which two types of scFvs are linked, diabody, and diabody are linked to the N-terminus or C-terminus.
  • Antibody fragments used in the present invention include Fab, Fab ⁇ F (ab ') 2 , scFv, diabody, dsFv, and peptides including CDRs.
  • Fa is a fragment obtained by treating an IgG-type antibody molecule with the protease papain (which is cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain). It is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having antigen-binding activity, which is linked by a disulfide bond.
  • Fab used in the present invention can be obtained by treating an antibody with proteolytic enzyme papain. Or encoding the Fab of the antibody]) NA is inserted into a prokaryotic or eukaryotic expression vector, and the vector is expressed by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism to produce Fab can do.
  • F (ab ') 2 is a fragment obtained by treating an IgG type antibody molecule with the protease pepsin (which is cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain), and Fab is a disulfide in the hinge region. It is an antibody fragment having a molecular weight of about 100,000 and having an antigen-binding activity, which is slightly larger than that linked via a bond.
  • F (ab ') 2 used in the present invention can be obtained by treating an antibody with the protease pepsin. Alternatively, it can be prepared by linking the following Fab's with a cheese bond or a disulfide bond.
  • Fab ' is an antibody fragment having a molecular weight of about 50,000 and having an antigen-binding activity, in which the disulfide bond in the hinge region of F (ab') 2 is cleaved.
  • Fab ′ used in the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 with a reducing agent dithiothreitol.
  • DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is expressed by introducing the vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter, referred to as P), and binds to antigen.
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL of an antibody, constructing a DNA encoding the scFv, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector,
  • the scFv can be produced by introducing the expression vector into a prokaryote or eukaryote and expressing it.
  • diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the divalent antigen-binding activities can be the same, or one can be a different antigen-binding activity.
  • the diabody used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding VH and VL of an antibody, constructing a DNA encoding scFv such that the amino acid sequence of the linker has a length of 8 residues or less, and Can be inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector can be introduced into a prokaryotic ⁇ or eukaryotic organism to express it, thereby producing a diabody.
  • dsFv replaces each amino acid residue in VH and VL with a cysteine residue.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the predicted structure of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Prote in Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • the dsFv used in the present invention is obtained by obtaining cDNAs encoding the VH and VL of the antibody, constructing a DNA encoding the dsFv, and inserting the thigh A into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector.
  • dsFv can be produced by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism and expressing it.
  • the peptide containing CDR comprises at least one region of CDR of VH or VL.
  • Peptides containing multiple CDRs can be linked either directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing the CDR used in the present invention comprises constructing DNA encoding the VH and VL CDRs of an antibody, inserting the DNA into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, One can be expressed by introducing it into a prokaryote or a eukaryote to produce a peptide containing CDR.
  • the peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), and the like.
  • Antibodies or antibody fragments used in the present invention include ELISA (Antibodies: A
  • the radiation when the above-mentioned substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II is used in combination with radiation, the radiation is administered once or before or after administration of a drug containing the substance. Times can be done. Irradiation is performed at a dose of 1 Gy to 10 Gy, preferably 2 to 5 Gy, and more preferably 4 Gy. When performing multiple irradiations, irradiation may be performed by dividing one irradiation amount.
  • radiation irradiation refers to a broad concept including irradiation of photons (electromagnetic waves) such as X-rays and ⁇ -rays, and irradiation of particle beams such as electron beams, proton beams, and heavy ion beams.
  • photons electromagns
  • particle beams such as electron beams, proton beams, and heavy ion beams.
  • the substance having an antitumor activity when a substance having an antitumor activity is used in combination with the above substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II, the substance having an antitumor activity is a protein or a small molecule drug. Etc. are included.
  • anti-tumor activity includes a selective growth-suppressing action or a damaging action on a tissue or a cell of a malignant tumor, and an action of reducing or eliminating a tumor tissue or a cell, and is to be interpreted in the broadest sense.
  • Proteins include, but are not limited to, antibodies or cytodynamics.
  • TNF lymphotoxin
  • interleukin_1 3, 4, 7, 8, 12, 15, 18, 21, granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), macrophage colony stimulating factor (M-CSF) ), Granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF), interferon-inducible protein-10 (IP-10), fractal force-in and the like.
  • protein preparations such as growth hormone receptor antagonists are included.
  • the antibody may be any antibody against an antigen expressed on tumor cells or an antigen involved in tumor pathogenesis such as tumor cell proliferation and metastasis.
  • examples include interleukin 6 (IL-6) receptor Body, GD2, GD3, GM2, HER2, CD20, CD22, CD33, CD52, MAGE, HM1.24, parathyroid hormone-related protein (PTHrP), basic fibroblast growth factor, fibroblast growth factor 8, basic Fibroblast growth factor receptor, fibroblast growth factor 8 receptor, epidermal growth factor receptor (EGFR), epithelial cell adhesion molecule (EpCam), insulin-like growth factor, insulin-like growth factor receptor, PMSA And antibodies against vascular endothelial cell growth factor, vascular endothelial cell growth factor receptor and the like.
  • IL-6 interleukin 6
  • PTHrP parathyroid hormone-related protein
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • EpCam epithelial cell adhesion molecule
  • insulin-like growth factor insulin-like growth
  • the scope of the present invention is not limited, and the anti-IL-6 receptor antibody is an anti-cancer research (Anticancer Res.), 18, 1217 (1998), Anti-GD2 antibody is Anticancer Research (Anticancer Res.), 13, 331 (1993), and anti-GD3 antibody is Cancer Immonology (Cancer Immunol. I thigh imother.), 36, 260 (1993), anti-GM2 antibody is Cancer Research (cancer Res.), 54, 1511 (1994), and anti-HER2 antibody is Procedureing Op. National Academy of Sciences (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992), anti-CD20 antibody is Blood, 83, 435.
  • anti-CD22 antibodies include Seminar's 'in' oncology (Se Thigh in.
  • anti-CD33 antibody is published in the journal 'Ob Clinical Oncol. (J. Clin. Oncol.), 19, 3244 (2001), anti-CD52 antibody is published in Proceedings Obb. The National Academy of Sciences (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992), anti-MAGE antibody is available from the British 'Janal-Ob' Cancer (British J. Cancer).
  • Anti-anti-1.24 antibody is Molecular-Immunologic., 36, 387 (1999), Anti-parathyroid hormone-related protein (PTHrP) antibody is Cancer, 88 , 2909 (2000), Anti-fibroblast growth factor 8 antibody is available from Procedin's' Ob 'The' National 'Academy'Ob' Science (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 86, 9911 (1989). The anti-fibroblast growth factor 8 receptor antibody is available from Journal of Biological 'Chemistry (J. Biol. Cem.
  • Anti-epithelial cell growth factor receptor antibody is Cancer Res., 59, 1236 (1999), Anti-epithelial cell adhesion molecule antibody is Proceedings-of-the- National Academy of Sciences (Pro Natl. Acad. Sci. USA), 76, 1438 (1979), anti-insulin-like growth factor antibody is available from Journal of Neuroscience and Research (J. Neurosci. Res.), 40, 647 (1995), Anti-insulin-like growth factor receptor antibodies are published in the journal 'OB' Neuroscience 'Research (J. Neurosci. Res.), 40, 647 (1995), anti-PMSA Antibodies are published by Journal of Urology (L Urology), 160, 2396 (1998), Anti-vascular endothelial cell growth factor antibody is Cancer Research
  • low-molecular-weight drug examples include, but are not limited to, DNA alkylating agents such as cyclophosphamide, diphosphamide, melphalan, dacarbazine, procarbazine, dimustine, carmustine, oral mucin, estramustine, busulfan, and thiotepa.
  • DNA alkylating agents such as cyclophosphamide, diphosphamide, melphalan, dacarbazine, procarbazine, dimustine, carmustine, oral mucin, estramustine, busulfan, and thiotepa.
  • Bleomycin, dipromycin, mitomycin (:, DNA synthesis inhibitors such as mitoxantrone; platinum-formulated DNA cross-linking agents such as cisplatin, carpoplatin, oxaliplatin, nedaplatin, etc.); 5-fluorouracil, medicrebin, methotrexetone , Gemushibin, fludarapine, cilatabine, cladribine, mercaptopurine, hydroxycarbamide, Ara-C, etc .; antimetabolite I inhibitors such as irinotecan and nogitecan; doxorubici Topoisomerase II inhibitors such as epirubicin, daunorubicin, etoposide; tubulin agonists such as vincristine, vinblastine, vindesine, vinorelbine, paclitaxel, docetaxel; hormone antagonists such as evening moxifen, goserelin, leuprorelin, flutamide; Aromatas
  • Abl inhibitor Flt3 inhibitor, Tyrosine kinase inhibitor such as ZD6474 (VEGFR inhibitor), PD17034 (FGFR inhibitor); Adenosine deminase inhibitor such as pentosuvin; Radicicol, 17- Hsp90 inhibitors such as arylamino-17-demethoxygeldanamycin; angiogenesis inhibitors; histone deacetylase inhibitors; matrix meta-oral protease inhibitors; pharmacosyltransferase inhibitors; bisphosphone preparations; Eg5 inhibitor; UCN-01, rapamycin, etc. Threonine kinase inhibitors and derivatives of these compounds.
  • drugs preferably cisplatin, carboblatin, oxaliplatin, 5-fluorouracil, irinotecan, paclitaxel, gefitinib, melphalan, doxorubicin, portezomib, rapamycin, herceptin, mitoxantrone, dexamethasone, UCN-01, precnilone Thalidomide, more preferably, melphalan, cisplatin, mitoxantrone, irinotecan, rapamycin, dexamethasone, UCN-01 and the like.
  • a ⁇ medicine for cancer treatment comprising a combination of a substance that inhibits the activity of riGF-I and IGF-II and a substance that has antitumor activity '' refers to ⁇ a substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II '' or It refers to a medicament for simultaneously administering the preparation and the “substance having antitumor activity” or the preparation to a subject to be administered, or for sequentially administering with a time lag.
  • the administration form of the medicament may be a combination of “a substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II” and “a substance that has antitumor activity” at the time of administration.
  • a substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II a substance that has antitumor activity at the time of administration.
  • administration of a single preparation obtained by simultaneously preparing a “substance that inhibits the activity of IGF-I and IGF-II” and a “substance having antitumor activity” ii)
  • the time lag depends on the active ingredient to be administered, the dosage form, the administration method, and the like.
  • the dosage of the medicament for cancer treatment of the present invention depends on the presence or absence of concurrent irradiation, the type of the substance having anti-tumor activity used, the degree of symptoms, the administration method, the age-sex-weight of the administration target, and the treatment. Depends on the period, etc., and is not particularly limited, but is usually a mammal
  • the target disease of the cancer therapeutic drug of the present invention includes various malignant and benign tumors, for example, malignant melanoma, malignant lymphoma, digestive organ cancer, lung cancer, esophagus cancer, stomach cancer, colorectal cancer, rectum cancer, colon cancer, ureter Tumor, gallbladder cancer, bile duct cancer, biliary tract cancer, breast cancer, liver cancer, renal cancer, testicular tumor, maxillary cancer, tongue cancer, lip cancer, oral cancer, pharyngeal cancer, laryngeal cancer, ovarian cancer, uterine cancer, prostate cancer, Thyroid cancer, brain tumor, positiosarcoma, hemangiomas, leukemia, polycythemia vera, neuroblastoma, retinoblastoma, myeloma, cystoma, sarcoma, osteosarcoma, sarcoma, skin cancer, kidney cancer, urinary cancer, Infant cancer, glioma and the like
  • the medicament for treating cancer of the present invention is particularly effective for suppressing tumors caused by “WGF-dependent proliferative cancer”.
  • HIGF-dependent proliferating cancer refers to a cancer that grows in the presence of hlGF and whose growth rate increases depending on the hlGF concentration, such as prostate cancer, colon cancer, breast cancer, osteosarcoma, and myeloma. can give.
  • the medicament for treating cancer of the present invention may be a medicament containing a substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II and a substance that has antitumor activity alone as active ingredients, or both. May be used as the active ingredient, but it is usually mixed with one or more pharmacologically acceptable carriers, and any drug well-known in the technical field of pharmaceuticals is used. It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by the method described above.
  • a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of salt, glycine, glucose, human albumin or the like is used.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and tonicity agents to bring the formulation solution closer to physiological conditions, for example, sodium acetate, sodium chloride, sodium lactate, potassium chloride, quencher Sodium acid or the like can also be added. It can also be stored after lyophilization and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • formulation suitable for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, and granules.
  • liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol, and fructose; dalicols such as polyethylene glycol and propylene glycol; oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil; It can be manufactured using preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • sugars such as sucrose, sorbitol, and fructose
  • dalicols such as polyethylene glycol and propylene glycol
  • oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil
  • preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch, sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polypi It can be produced using a binder such as nyl alcohol, hydroxypropylcellulose, or gelatin, a surfactant such as a fatty acid ester, or a plasticizer such as glycerin as an additive.
  • Formulations suitable for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats or carboxylic acids.
  • Sprays are prepared using the inhibitor itself or a carrier that does not irritate the oral and respiratory mucosa of the recipient and disperses the inhibitor as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • the components exemplified as additives for oral preparations can be added.
  • a mammal is administered in combination with an effective amount of a substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II and an effective amount of a substance having antitumor activity.
  • a method of treating cancer and administering, simultaneously or sequentially, an effective amount of a substance that inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II and an effective amount of a substance that has antitumor activity.
  • a method of treating cancer is also provided.
  • the term "mammal” refers to mammals such as humans, dogs, cats, cats, sheep, goats, goats, pests, horses, and the like having cancer
  • the "effective amount” refers to It refers to an amount that, by administration of the above substance to cancer cells, stops the growth of cancer cells and reduces or eliminates the size of a tumor.
  • IGF-1 and IGF which are ones of the substances used in the present invention that specifically bind to IGF-I and IGF-II and inhibit the activity of IGF-I and IGF-II, -A method for preparing an antibody or antibody fragment that specifically binds to II and inhibits the activity of IGF-1 and IGF-II, and the activity evaluation.
  • An expression vector containing a cDNA encoding IGF can be introduced and expressed in E. coli, yeast, insect cells, animal cells, and the like to obtain a recombinant IGF protein, which can be used as an antigen.
  • a synthetic peptide having an IGF partial sequence can be used as an antigen.
  • the antigenic moiety peptide in order to obtain an antibody which recognizes the protein in a state of a native structure protein partial sequence of approximately 5 to 30 residues is not D denatured is selected, It is necessary to select a partial sequence existing on the surface of the protein in a three-dimensional structure as an antigen peptide.
  • the portion present on the protein surface in the three-dimensional structure can be estimated by predicting a highly hydrophilic partial sequence using commercially available protein sequence analysis software such as Genetyx Mac.
  • the part with low hydrophilicity is often present inside the protein due to its three-dimensional structure, and the part with high hydrophilicity is often present on the surface of the protein.
  • the selected partial peptide is not always the antigen that establishes the desired antibody.
  • a cysteine is added to the end of the partial peptide to crosslink with the protein.
  • the N-terminal of the peptide is acetylated and the C-terminal is amidated as necessary.
  • the partial peptide can be synthesized by a general liquid phase, solid phase peptide synthesis method, a method of appropriately combining them, or a method analogous thereto (The Peptides, Analys is, Synthes is, Biolgy, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press; Basics and Experiments on Peptide Synthesis, Maruzen, 1985; Development of Continuing Pharmaceuticals, Vol.
  • a commercially available peptide synthesizer such as a peptide synthesizer manufactured by Biosystems, In (hereinafter referred to as ABI) or a peptide synthesizer manufactured by Advanced ChemTech Inc. (hereinafter referred to as ACT) It can be carried out according to the respective synthesis programs using a chain-protected N «-Fmoc-amino acid or ⁇ -Boc-amino acid.
  • Protected amino acids and carrier resins as raw materials can be obtained from ABI, Shimadzu, Kokusan Chemical, Nova Biochem, Watanabe Chemical, ACT, Peptide Research Institute, and the like.
  • the protected amino acids, protected organic acids, and protected organic amines used as raw materials can be synthesized according to or according to the reported synthetic methods (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979). Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press; Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Maruzen, 1985; Development of Continuing Drugs, Vol. 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten, 1991; International Journal of Peptide ⁇ Protein Research, 35, 161-214, 1990).
  • the animal used for immunization may be any animal, such as a mouse, a rat, a hamster, or a rabbit, as long as it can produce a hybridoma.
  • a mouse or rat aged 3 to 20 weeks is immunized with the antigen prepared in 1 (1) above, and antibody-producing cells are collected from the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animal. Immunization is performed by subcutaneously, intravenously or intraperitoneally administering the antigen several times to the animal with an appropriate adjuvant.
  • an adjuvant As an adjuvant, Freund's complete adjuvant
  • BSA Plasma Freund "s Adjuvant
  • KLH Keyhole Limpet Hemocyanin
  • Conjugates can be prepared as an immunogen by preparing a conjugate with a carrier protein, such as, etc. Blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal 3 to 7 days after administration of each antigen and used as an antigen. The reactivity to the used hlGF is confirmed by ELISA or the like, and the mouse or rat whose serum shows a sufficient antibody titer is used as the source of the antibody-producing cells.
  • myeloma cells a cell line obtained from a mouse, 8-azaguanine-resistant myeloma cell line P3-X63Ag8-Ul (P3-U1) (European Journal of Immunology, 6, 511-519, 1976), SP2 / 0-Agl4 (SP-2) (Nature, 276, 269-270, 1978), P3-X63-Ag8653 (653) (Journal of Immunology, 123, 1548-1550, 1979), P3-X63-Ag8 ( X63) (Nature, 256, 495-497, 1975) and any other myeloma cells that can grow in vitro. Culture and passage of these cell lines are performed according to a known method (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), and a cell number of 2 ⁇ 10 7 or more is secured by the time of cell fusion.
  • a cell-aggregating medium such as polyethylene glycol-1000 (hereinafter abbreviated as PEG-1000) is added, and the cells are fused to form a cell culture medium.
  • PEG-1000 polyethylene glycol-1000
  • MEM Modified Eagle's Medium
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • a HAT medium normal medium [1.5 mM glutamine, 50 M 2_mercaptoethanol, 10 M medium containing g / mL gentamicin and 10% fetal bovine serum (hereinafter referred to as FBS)] containing 0.4 lmM hypoxanthine, 15 M thymidine and 0.4 ⁇ aminopterin).
  • FBS fetal bovine serum
  • the culture After the culture, a part of the culture supernatant is removed, and a sample that reacts with the antigen protein by ELISA and does not react with the non-antigen protein is selected. Next, the cells were converted into single cells by the limiting dilution method, and those with a stable high antibody titer confirmed by ELISA were monoclonal antibodies. Select as a production hybridoma.
  • the antigen is immobilized on a 96-well ELISA plate and reacted with the culture supernatant of a hybridoma or purified antibody as the primary antibody. After the first antibody reaction, wash the plate and add the second antibody.
  • an antibody that can recognize the first antibody and that is labeled with biotin, an enzyme, a chemiluminescent substance, a radioisotope, or the like is used. Specifically, if a mouse is used for preparing the hybridoma, an antibody that can recognize the mouse antibody is used as the second antibody. After the reaction, a reaction is performed according to the labeling substance of the second antibody, and the antibody is selected as a hybridoma that produces a monoclonal antibody that specifically reacts with the antigen.
  • hybridoma KM1468 Specific examples include hybridoma KM1468.
  • Hypri-Dorma KM1468 was registered on March 26, 1994 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary (Tsukuba-Higashi 1-1-chome, Ibaraki Pref. It has been deposited as FERM BP-7978 on 5 6 6).
  • pristane (2,6,10,14-tetramethylpentyldecane) was intraperitoneally administered to 8- or 10-week-old mice or nude mice reared for 2 weeks.
  • the anti-hIGF monochromator port one monoclonal antibody-producing High Priestess dormer cells 5 X 10 S ⁇ 2 X 10 7 cells / animal that was injected intraperitoneally.
  • the hybridoma becomes ascites cancer.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein concentration can be calculated by the Lowry method or from the absorbance at 280 ⁇ .
  • the antibody subclass refers to an isotype within the class, and includes IgGl, IgG2a, IgG2b, and IgG3 for mice and IgGK IgG2, IgG3, and IgG4 for humans.
  • the binding activity of the anti-hlGF monoclonal antibody in the culture supernatant or purified to hlGF was determined by ELISA and surface plasmon resonance (Journal of
  • the reactivity with hlGF and the antigen epitope can be analyzed by competitive ELISA using hlGF and a partial peptide of hlGF.
  • Whether or not the antibody recognizes the three-dimensional structure of hlGF can be estimated by commonly used three-dimensional structural analysis methods or by combining various immunological methods. Examples of the three-dimensional structure analysis method include X-ray crystallography and nuclear magnetic resonance. Examples of a method for combining various immunological measurement methods include a method for combining an ELISA method for a non-denatured antigen and an ELISA method for a denatured antigen.
  • an antibody that shows reactivity only to the non-denatured antigen has a high possibility of recognizing the three-dimensional structure of the antigen.
  • the ELISA method for a non-denatured antigen include an ELISA method in which a non-denatured antigen is reacted with an antibody in a liquid layer.
  • any ELISA method can be used as long as the antibody reacts in a state where the antigen does not retain the original three-dimensional structure.
  • directly immobilized on a hydrophobic reaction plate ELISA methods for antigens that have been converted, or partial peptides that have been digested to an appropriate length are examples of the ELISA method for a non-denatured antigen.
  • the antibody used in the present invention can be obtained by selecting an antibody having a binding activity to hIGF- ⁇ and a binding activity to MGF-1 by the binding activity measurement method or competition ELISA. Further, by examining the effect on a cell line showing hIGF-dependent proliferation, the activity of inhibiting the activity of MGF in vitro can be measured.
  • Cell lines showing hIGF-1 or hIGF-II-dependent proliferation include human breast cancer cell line MCF7 (ATCC HTB-22), human colon cancer cell line HT-29 (ATCC HTB-38) and the like.
  • an activity of inhibiting hIGF activity in vivo can be measured by establishing an hIGF-dependent cell proliferation measurement system using an animal such as a mouse and examining the effect on the measurement system.
  • Polyclonal antibodies can be prepared from sera of animals whose sera showed a sufficient antibody titer among animals immunized by the method described in 1. (2) above.
  • a serum fractionated by centrifugation from blood collected from the animal, or an immunoglobulin fraction from the serum according to a conventional method can be purified to prepare a polyclonal antibody.
  • the activity of the polyclonal antibody can be evaluated for its antigen-binding activity by the method described in 1. (7) above.
  • the humanized antibody expression vector may be any expression vector for animal cells into which a gene encoding human antibody CH, Z or CL is incorporated.
  • the humanized antibody expression vector can be constructed by cloning the genes encoding the human antibody CH and CL into animal cell expression vectors, respectively.
  • the C region of the human antibody can be CH and CL of any human antibody.
  • the C region of the IgGl subclass of the H chain of the human antibody hereinafter, referred to as liCrl
  • hCK the L chain of the human antibody / c class C region
  • genes encoding CH and CL of the human antibody chromosomal DNA consisting of exon and intron can be used, and cDNA can also be used.
  • Any expression vector for animal cells can be used as long as it can integrate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • PAGE 107 (Cytotechnol ogy, 3, 133-140, 1990)
  • pAGE103 (Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987)
  • pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984)
  • pKCR Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531, 1981
  • pSGl / 3 d2-4 Cyto technology, 4, 173-180, 1990.
  • Promoters and enhancers used in animal cell expression vectors include the SV40 early promoter and enhancer.
  • tandem type As the humanized antibody expression vector, either the type in which the antibody H chain and the L chain are present on separate vectors or the type in which the antibody H and L chains are present on the same vector (hereinafter, referred to as tandem type) can be used. However, tandem humanization is achieved due to the ease of construction of a humanized antibody expression vector, ease of introduction into animal cells, and the balance of antibody H chain and L chain expression levels in animal cells. Antibody expression vectors are preferred (Journal of Immunological Methods, 167, 271-278, 1994). As a vector for expressing an evening humanized antibody, PKANTEX93 (W097 / 10354),
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used for expression of a human chimeric antibody and a human CDR-transplanted antibody in animal cells.
  • CDNAs encoding non-human animal antibodies for example, VH and VL of mouse antibodies, are obtained as follows.
  • Extract mRNA from hybridomas producing mouse antibodies and synthesize cDNA Cloning the synthesized cDNA into a vector such as a phage or a plasmid creates a cDNA library. A recombinant phage or a recombinant plasmid containing cDNA encoding VH and a cDNA encoding VL using the C region or V region of the mouse antibody as a probe The isolated recombinant phage or recombinant plasmid is isolated.
  • the entire nucleotide sequence of VH and VL of the target mouse antibody on the recombinant phage or recombinant plasmid is determined, and the entire amino acid sequence of VH and VL is deduced from the nucleotide sequence.
  • Methods for preparing total A from hybridomas include guanidine thiocyanate-cesium trifluoroacetate method (Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987), and methods for preparing mRNA from total RNA include oligo (dT ) Immobilized cellulose force column method (Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989).
  • Kits for preparing mRNA from hybridomas include Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia) and the like.
  • any vector can be used as a vector for incorporating a cDNA synthesized as a type III mRNA extracted from a hybridoma, as long as the vector can incorporate the cDNA.
  • ZAP Express (Strategies, 5, 58-61, 1992), pBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989), AZAP II (Stratagene), AgtlO, Agtll (DNA Cloning: A
  • Escherichia coli to which a cDNA library constructed by a phage or a plasmid vector is introduced can be introduced, expressed and maintained. Any one can be used as long as For example, XU-Blue MRF '
  • Methods for selecting cDNA clones encoding VH and VL of non-human animal antibodies from the cDNA library include colony hybridization using radioisotope or fluorescently labeled probes or plaque hybridization. Pressing New York, 1989) can be selected according to the solution method (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989).
  • a primer or a cDNA library or a cDNA library synthesized from mRNA is prepared as a type III and subjected to Polymerase Chain Reaction (hereinafter referred to as PCR method;
  • VH and VL can also be prepared.
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, cloned into a plasmid vector such as pBluescript SK (-) (manufactured by Stratagene), and subjected to a commonly used nucleotide sequence analysis method, for example, the dideoxy method ( Proceedings of the
  • the BLAST method (Journal of Japan) can be performed on any database, for example, SWISS-PR0T or PIR-Protein.
  • a cDNA encoding VH and VL of a non-human animal antibody is cloned upstream of the gene encoding CH and CL of the human antibody in the humanized antibody expression vector described in 2 (1) above, and a human chimera is obtained.
  • An antibody expression vector can be constructed.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the antibody of a non-human animal can be obtained by combining the nucleotide sequence at the 3 'end of the VH and VL of the antibody of a non-human animal with the nucleotide at the 5' end of CH and CL of the human antibody.
  • VH and VL of the human CDR-grafted antibody can be constructed as follows. First, the VH and VL antibodies of the target non-human animal Select the FR amino acid sequence of VH and VL of the human antibody to which the CDR amino acid sequence is to be transplanted. As the amino acid sequence of FR of human antibody VH and VL, any amino acid sequence can be used as long as it is derived from human antibody.
  • amino acid sequences of the FRs of VH and VL of human antibodies registered in databases such as Protein in Data Bank, and the common amino acid sequence of each subgroup of FR of VH and VL of human antibodies (I ( Sequences of Proteins of Immunological Interfaces, US Dep.Health and Human Services, 1991) .
  • amino acid sequences of the FRs of VH and VL of human antibodies registered in databases such as Protein in Data Bank, and the common amino acid sequence of each subgroup of FR of VH and VL of human antibodies (I ( Sequences of Proteins of Immunological Interfaces, US Dep.Health and Human Services, 1991) .
  • VH and VL CDR amino acid sequences of the target non-human animal antibody are grafted to the FR amino acid sequence, and the VH and VL amino acid sequences of the human CDR-grafted antibody are designed.
  • Design a base sequence encoding the amino acid sequence of VH and VL Based on the designed base sequence, synthesize several synthetic DNAs each having a length of about 100 bases and use them for PCR. In this case, it is preferable to design six synthetic DNAs for both VH and VL in view of the reaction efficiency in PCR and the length of DNA that can be synthesized.
  • a human CDR-grafted antibody is obtained by transplanting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody to the human antibody VH and VL FRs, and the antigen-binding activity of the non-human animal is not Is known to be reduced compared to other antibodies (BIO / TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). This is due to the fact that not only the CDRs but also some amino acid residues of FR are directly or indirectly involved in antigen-binding activity in VH and VL of the original non-human animal antibody. It is considered that amino acid residues are changed to different amino acid residues in FR of human antibody VH and VL with CDR transplantation.
  • human CDR-grafted antibodies have the amino acid residues involved in direct binding to antigens and the amino acid residues of CDR in the amino acid sequence of FRs of VH and VL of human antibodies. Identify amino acid residues that act or maintain the antibody conformation and indirectly participate in antigen binding, and modify them to those found in the original non-human animal antibody. It has been reported to increase the decreased antigen binding activity (BI0 / TECHN0L0GY, 9, 266-271, 1991). In the production of human-type CDR-grafted antibodies, the most important point is how to efficiently identify the amino acid residues of FR involved in the antigen-binding activity.
  • the modification of FR amino acid residues of VH and VL of a human antibody can be achieved by performing the PCR method described in 2 (4) above using synthetic DNA for modification. Determine the nucleotide sequence of the amplified product after PCR by the method described in 2 (2) above, and confirm that the desired modification has been performed.
  • cDNAs encoding VL and VL can be cloned to construct a human CDR-grafted antibody expression vector.
  • the humanized antibody expression vector described above can be cloned upstream of the genes encoding CH and CL of the human antibody so that they can be expressed in an appropriate form.
  • the humanized antibody expression vectors described in 2 (3) and (6) above or expression vectors modified from them were used. Transient expression of a humanized antibody can be performed. As the host cell into which the expression vector is introduced, any cell can be used as long as it can express the humanized antibody.However, COS-7 cells (ATCC CRL1651) can be used due to the high expression level. Commonly used (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991).
  • Methods for introducing the expression vector into COS-7 cells include the DEAE-dextran method (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991) and the Lipofexion method (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America). , 84, 7413-7417, 1987). After the introduction of the expression vector, the expression level and antigen-binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant were determined by ELISA (Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor
  • transformed cells that stably express the humanized antibody can be obtained.
  • a method for introducing an expression vector into a host cell there is an electoporation method (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990).
  • the host cell into which the humanized antibody expression vector is introduced any cell can be used as long as it can express the humanized antibody.
  • mouse SP2 / 0-Agl4 cells ATCC CRL1581
  • mouse P3X63-Ag8.653 cells ATCC CRL1580
  • CH0 cells deficient in dihydrofolate reductase gene hereinafter referred to as dMr
  • dMr dihydrofolate reductase gene
  • the transformant that stably expresses the humanized antibody contains a drug such as G418 sulfate (hereinafter, referred to as G418) according to the method disclosed in JP-A-2-257891. It can be selected by culturing in an animal cell culture medium.
  • RPMI1640 medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • GIT medium manufactured by Nippon Yakuhin
  • EX-CELL302 medium manufactured by JRH
  • IMDM manufactured by GIBCO BRL
  • Hybridoma-SFM Manufactured by GIBCO BRL
  • a medium obtained by adding various additives such as FBS By culturing the obtained transformed cells in a medium, humanized antibodies can be expressed and accumulated in the culture supernatant. The expression level and antigen-binding activity of the humanized antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA.
  • the transformed cells can increase the expression level of the humanized antibody using a dMr amplification system or the like according to the method disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-2577891.
  • Humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of transformed cells using a protein A column (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996).
  • protein A column Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996.
  • other purification methods usually used for protein purification can be used.
  • purification can be performed by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography, and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified humanized antibody H-chain, L-chain or the entire antibody molecule can be determined by polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as PAGE: Nature, 227, 680-685, 1970) or Western blotting (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996).
  • the activity of the humanized antibody can be evaluated in the same manner as in 1 (7) above. 4. Preparation of antibody fragments
  • Antibody fragments can be prepared by genetic engineering techniques or protein chemical techniques based on the anti-hlGF antibodies described in 1 and 2 above.
  • Examples of genetic engineering techniques include constructing a gene encoding the desired antibody fragment, and expressing and purifying it using an appropriate host such as animal cells, plant cells, insect cells, and Escherichia coli. .
  • proteochemical techniques include site-specific cleavage and purification using proteolytic enzymes such as pepsin and papain.
  • a method for producing a peptide containing Fab, F (ab ') 2 , Fab', scFv, diabody, dsFv, and CDR as antibody fragments will be specifically described below.
  • Fabs can be produced proteinically by treating IgG with proteolytic enzyme papain. After papain treatment, if the original antibody is an IgG subclass having protein A binding, it can be separated from IgG molecules and Fc fragments by passing through a protein A column and recovered as a homogeneous Fab ( Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995). In the case of IgG subclass antibodies without protein A binding, Fab can be recovered in fractions eluted at low salt concentration by ion exchange chromatography.
  • Fabs can be produced by genetic engineering, mostly using Escherichia coli, or using insect cells or animal cells. For example, 2 (2), 2 (4) and 2 above
  • the DNA encoding the V region of the antibody described in (5) can be cloned into a Fab expression vector to prepare a Fab expression vector.
  • a Fab expression vector any vector can be used as long as it is capable of incorporating and expressing NA)] NA for Fab.
  • An example is IT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988).
  • the Fab expression vector can be introduced into an appropriate Escherichia coli to produce and accumulate Fab in an inclusion body or periplasm. Active Fabs can be converted from inclusion bodies into active Fabs by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in periplasm, active Fabs leak into the culture supernatant. . Rifo After one rounding or from the culture supernatant, a homogeneous Fab can be purified by using an antigen-bound column (Antibody Engineering, A.
  • F (ab ') 2 can be produced proteinically by treating IgG with the protease pepsin. '' After treatment with pepsin, it can be recovered as homogeneous F (ab ') 2 by the same purification procedure as Fab (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995) ⁇
  • it can also be produced by a method of performing SS bonding (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
  • Fab ′ can be obtained by treating F (ab ′) 2 described in 3 (2) above with a reducing agent such as dithiothreitol.
  • Fab ′ can be produced by genetic engineering, mostly using Escherichia coli, or insect cells or animal cells. For example, clone the DNA encoding the V region of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above into a Fal) 'expression vector to prepare a Fab' expression vector. Can be.
  • the Fab 'expression vector any vector can be used as long as it can incorporate and express Fab' DNA.
  • An example is PAK19 (BIO / TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992).
  • the Fab 'expression vector can be introduced into an appropriate E.
  • the inclusion bodies can be converted into active Fab's by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in periplasm, lysozyme partial digestion, osmotic shock, sonication, etc.
  • the bacteria can be crushed by the treatment and collected outside the cells. Uniform Fab 'can be purified after refolding or from bacterial lysate by using a protein G column, etc.
  • Preparation of scFv ScFv can be produced by genetic engineering using phage or Escherichia coli, or insect cells or animal cells. For example, 2 (2), 2 (4) and 2 above
  • the thigh A encoding the V region of the antibody described in (5) can be cloned into a scFv expression vector to prepare a scFv expression vector.
  • Any scFv expression vector can be used as long as it can incorporate and express scFv DNA.
  • PCANTAB5E Pulacia
  • pHFA Human Fatty Acid
  • scFv expression vector By introducing the scFv expression vector into a suitable E. coli and infecting it with a helper phage, it is possible to obtain a phage that expresses the scFv on the phage surface in a form fused with the phage surface protein.
  • scFv can be produced and accumulated in the inclusion body or periplasm of Escherichia coli into which the scFv expression vector has been introduced.
  • the inclusion body can be converted into an active scFv by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in periplasm, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, sonication Bacteria can be crushed by such treatments and collected outside the cells. Uniform scFv can be purified from lysate after refolding or by using cation exchange chromatography, etc.
  • diabody can be prepared using Escherichia coli, insect cells or animal cells.
  • a DNA is prepared by linking VH and VL of the antibodies described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above so that the number of amino acid residues encoded by the linker is 8 or less.
  • a diabody expression vector can be prepared.
  • any vector can be used as long as it can incorporate and express diabody DNA.
  • CANTAB5E Pulacia
  • pHFA Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994
  • the diabody can be produced and accumulated in the inclusion body or periplasm of E.
  • an active diabody can be obtained by the refolding method usually used for proteins, and when expressed in periplasm, Bacteria can be disrupted by partial digestion with zozyme, osmotic shock, sonication, etc., and collected outside the cells. After refolding or from the lysate of bacteria, a uniform scFv can be purified by cation exchange chromatography (Antibody Engineering, A Practical
  • dsFv can be prepared using Escherichia coli, insect cells or animal cells. First, a mutation is introduced at an appropriate position in the DNA encoding VH and VL of the antibody described in 2 (2), 2 (4) and 2 (5) above, and the encoded amino acid residue is substituted with cysteine. Make DNA. Each of the prepared DNAs can be cloned into a dsFv expression vector to prepare VH and VL expression vectors.
  • the dsFv expression vector any vector can be used as long as it can incorporate and express dsFv DNA. For example, pULI9 (Prote in Engineering, 7, 697-704, 1994) can be mentioned. VH and VL expression vectors can be introduced into appropriate E.
  • VH and VL can be obtained from inclusion bodies or periplasm, mixed, and converted into active dsFv by the refolding method usually used for proteins. After refolding, it can be further purified by ion exchange chromatography and gel filtration (Prote in Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • the peptide containing the CDR can be prepared by a chemical synthesis method such as the Fmoc method or the tBoc method. Also, a DNA encoding a peptide containing CDR can be prepared, and the prepared DNA can be cloned into an appropriate expression vector to prepare a CDR peptide expression vector. Any expression vector can be used as long as it can incorporate and express ⁇ A encoding the CDR peptide. Examples include LEX (Invitrogen) and AX4a + (Invitrogen). The expression vector can be introduced into an appropriate Escherichia coli to produce and accumulate in an inclusion body or periplasm. CDR peptide is obtained from inclusion body or periplasm. Purified by on-exchange chromatography and gel filtration
  • Example 1 Examination of the combined effect of radiation and anti-IGF-1 monoclonal antibody
  • the epidermoid carcinoma cell line A431 cells (ATCC CRL-1555) were cultured in a 10 cm dish and became 703 ⁇ 4 confluent.
  • Example 2 Examination of the combined effect of a low-molecular-weight drug and an anti-IGF-1 monoclonal antibody A 96-well culture plate was mixed with a serially diluted drug and a serially diluted anti-IGF monoclonal antibody KM1468. L / Pell was added at a time. Furthermore, multiple myeloma cell line LP-1 cells (DSMZ ACC41) were added at 100 / xL / well (10000 cells) and cultured at 37 ° C for 3 days. After culturing, add Cell Proliferation Reagent WST-1 (Roche) at 20 / iL / well and incubate at 37 ° C for 2-3 hours.
  • DSMZ ACC41 multiple myeloma cell line LP-1 cells
  • Concomitant medications include melphalan, 'Dimustine, doxorubicin,' mitoxantrone, vinorelbine, etoposide, paclitaxel, dexamethasone, 5-fluorouracil, methotrexate, gemcitabine, cisbratin, thalidomide, 7-ethyl- 10- Hydroxycamptothecin (active form of irinotecan; hereinafter abbreviated as SN-38; Cancer Researc, 50, 1715-1721, 1990), rapamycin, radicicol, 17-arylamino-17-demethoxygeldanamycin (hereinafter, referred to as Abbreviated as 17AAG; Cancer Cliemot erapy & Pharmacology, 42, 273-279, 1998), UCN-01 (Journal of Antibiotics, 40, 1782-1784, 1987), PD173074 (EMB0 Journal, 17, 5896-5904, 1998) ), Z
  • Example 3 Examination of administration method in combination use of low-molecular-weight drug and anti-IGF-1 monoclonal antibody Multiple myeloma cell line LP-1 cells (DSMZ ACC41) were placed in a 96-well culture plate using IOO L / well. (10000 cells) were seeded, doxorubicin and anti-IGF monoclonal antibody KM1468 were added, and the cells were cultured at 37 ° C for 3 days. Doxorubicin and KM1468 were added to the medium by the following three methods.
  • Method 1 Cells were cultured on day 1 in 150 xL medium supplemented with doxorubicin alone, and on days 2 and 3 cells were cultured in 200 zL medium supplemented with doxorubicin and KM1468
  • Method 2 Day 1 The cells were cultured in 150 iL of medium supplemented with KM1468 alone, and on the second and third days in 200 / zL of medium supplemented with doxorubicin and KM1468.
  • Method 3 Cells were cultured for 3 days in a medium containing doxorubicin and KM1468 (the medium volume on the first day was 150 iL, and the second and third days were 200 / L each).
  • doxorubicin and KM1468 were added so that the final concentrations were 1 mol / L and 1 g / mL.
  • the cells were added with a cell proliferation reagent WST-1 (manufactured by Roche) at 20 ⁇ 17 ⁇ l each and cultured for 2 to 3 hours, and the OD450 was measured using a microplate reader M-SPmax250 (manufactured by Molecular Devices).
  • WST-1 cell proliferation reagent
  • M-SPmax250 manufactured by Molecular Devices
  • Method 3 In any of the administration methods, cell proliferation was more strongly inhibited when used together than when used alone. From the above, it was confirmed that both the administration methods of the low-molecular-weight drug and the anti-IGF monoclonal antibody are useful for cancer treatment.
  • methylated BSA-hIGF-I (equivalent to 100 / ig of hIGF-1) prepared as above using complete Freund's adjuvant was administered, and 2 weeks later.
  • Blood was collected from the fundus venous plexus, and the antibody titer in the serum was examined by the binding ELISA shown in Reference Example 1 (4).
  • the spleen was extracted 3 days after the last immunization from the rat showing a sufficient antibody titer.
  • the spleen is shredded in MEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.), loosened with forceps, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), the supernatant is discarded, and Tris-ammonium chloride buffer (pH 7.65) For 1-2 minutes to remove red blood cells, washed three times with MEM, and used for cell fusion.
  • the 8-azaguanine-resistant mouse myeloma cell line P3-U1 was cultured in a normal medium to secure 2 ⁇ 10 7 or more cells at the time of cell fusion and used as a parent strain for cell fusion.
  • Rat splenocytes obtained in (1) and myeloma cells obtained in (2) were mixed at a ratio of 10: 1, centrifuged (1200 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed. discarded, precipitated with stirring at 37 ° C for the cells, 10 per two rat splenocytes 0.. 2 to 1.
  • OML of fusion medium (2g of PEG-1000, 2 mL of MEM, dimethyl sulfoxide 0. 7 mL was added, and 1 to 2 mL of MEM was added several times every 1 to 2 minutes, and then MEM was further added so that the total volume became 50 mL. After centrifugation (900 rpm, 5 minutes), the supernatant was discarded, the cells were loosened gently, and suspended in 100 mL of HAT medium.
  • the methylated BSA-hIGF- ⁇ prepared in Reference Example 1 (1) and methylated BSA-BSA as a negative control were used.
  • the above antigen was dispensed at a concentration of lOg / mL in 50 L / well into a 96-well ELISA plate (manufactured by Greiner) at a concentration of hlGF-1 or BSA, and allowed to stand at 4 ° C for adsorption. After washing with PBS, PBS containing 1% BSA (hereinafter referred to as BSA-PBS) was added at 100 iL / well, and reacted at room temperature for 1 hour to block the remaining active groups.
  • BSA-PBS PBS containing 1% BSA
  • Tween-PBS PBS containing 0.05% Tween 20
  • a 4000-fold diluted peroxidase-labeled heron anti-rat Ig antibody manufactured by DAK0 was used as a secondary antibody. And reacted at room temperature for 1 hour.
  • FIG. 3 shows the results of the binding ELISA shown in Reference Example 1 (4), which showed that antibody KM1468 and a commercially available anti-hlGF-1 antibody sml.2 (Upstate
  • hlGF-1 manufactured by Pepro Tech EC
  • hIGF-II manufactured by Pepro Tech EC
  • human insulin manufactured by Wako Pure Chemical Industries
  • mIGF- The inhibitory activity by I was examined by the following competitive ELISA. Prepare a plate on which the antigen is immobilized as shown in Reference Example 1 (4), dispense various antibodies diluted to 4.0 zg / mL at 50 L / well, and serially dilute 3 times from 20 zg / niL.
  • the reaction was performed for 1 hour.
  • the plate was washed with Tween-PBS, and in the case of KM1468, a 4000-fold diluted peroxidase-labeled heron anti-rat Ig antibody (manufactured by DAK0), and in the case of sml.
  • Ig antibody manufactured by DAK0
  • the plate is washed with Tween-PBS and the ABTS substrate solution [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) ammonium] 0.55 is added to 1 L of 0.1 M citrate buffer.
  • Concentration 50 is about 0.3 xg / mL (approximately 39 nM)
  • IC 5 by hIGF- II indicated a value substantially equal to that of about 0.4 g / mL (approximately 58 nM).
  • no inhibition was observed with human insulin and mlGF-1. From the above results, it was clarified that antibody 1468 reacts specifically with both hIGF-1 and hIGF-II with similar strength. The binding of commercially available anti-IGF-1 antibody sml.2 to hIGF-1 was strongly inhibited by MGF-I (FIG.
  • hIGF_II the inhibitory activity by hIGF_II (FIG. 4B) was weak. While IC 5 by IilGF- 1 of sml.2 () was about 1 ⁇ 2 ng / mL (approximately 156nM), hIGF- II Nyoru 1 5. Was> 10 ⁇ / ⁇ (> 1.45 M). On the other hand, no inhibition was observed with human insulin and ml GF-I.
  • the effect of the purified antibody KM1468 on hIGF-dependent cell proliferation was examined.
  • the antibody used was KM1468, a commercially available anti-hIGF-I antibody sml.2 (Upstate biotechnology 3 ⁇ 4 And S1F2 (Upstate Biotechnology), which is a commercially available anti-hlGF-II antibody.
  • Human breast cancer cell line MCF7 (ATCC HTB-22), human colon cancer cell line HT-29 (ATCC HTB-38) or human osteosarcoma cell line MG-63 (ATCC CRL-1427) in TF / BSA medium (D-MEM / F-12 (Gibco BRL) supplemented with 10 g / mL human transferrin (Gibco BRL) and 200 ⁇ g / mL BSA] to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • TF / BSA medium D-MEM / F-12 (Gibco BRL) supplemented with 10 g / mL human transferrin (Gibco BRL) and 200 ⁇ g / mL BSA] to a concentration of 0.5 to 1 ⁇ 10 5 cells / mL.
  • each factor of MGF-I, hIGF-II or human insulin diluted to various concentrations in TF / BSA medium was diluted at 50 / z L / well, and each antibody diluted to various concentrations in TF / BSA medium was isolated. It was added at 50 / iL / Ueru, 37 ° C, and cultured for 5 days at 53 ⁇ 4 C0 2 incubator within one. After culture, cell proliferation reagent WST-1
  • FIG. 5A shows a growth curve of each factor of the human breast cancer cell line MCF7.
  • Figure 5B shows the results in the presence of 40 ng / mL hlGF-1
  • Figure 5C shows the results in the presence of 100 ng / mL MGF-II
  • Figure 5D shows the results in the presence of 100 ng / mL human insulin.
  • proliferation was observed when each antibody was added.
  • KM1468 strongly inhibited cell proliferation by WGF-I and hIGF-II, and its activity was sml.2, a commercially available anti-hIGF_I antibody, and commercially available anti-! It was higher than the IIGF-II antibody S1F2.
  • FIG. 6A shows a growth curve of each factor of the human colon cancer cell line HT-29.
  • Figure 6B shows the presence of 10 ng / mL hIGF-II
  • Figure 6C shows the presence of 10 ng / mL hlGF-II
  • Figure 6D shows the presence of 20 ng / mL human insulin. However, the growth was observed when each antibody was added.
  • KM1468 inhibited cell proliferation by MGF-I and hIGF-II equally strongly, and its activity was determined by the commercial anti-WGF-I antibody sml.2 and commercial Higher than that of S1F2, which is an anti-hIGF-II antibody. On the other hand, none of the antibodies had any effect on the proliferation by human insulin. The above results are shown in Reference Example 2.
  • FIG. 7A shows a growth curve of each factor of the human osteosarcoma cell line MG-63.
  • Figure 7B shows the presence of 20 ng / mL hlGF-1
  • Figure 7C shows the presence of 20 ng / mL WGF-II
  • Figure 7D shows the presence of 20 ng / mL human insulin.
  • the growth was shown when each antibody was added.
  • thigh 1468 inhibited cell proliferation by hIGF-I and hlGF-II equally strongly, and its activity was similar to that of commercial anti-WGF-1 antibody sml. It was higher than S1F2, which is an anti-WGF-II antibody.
  • none of the antibodies had any effect on proliferation by human insulin.
  • the above results correlated well with the binding specificity observed in the competitive ELISA of Reference Example 2 (2), and clearly showed that the binding of each antibody inhibited the function of each factor. Things.
  • the synthesized peptides include GF-I at positions 1-18 (SEQ ID NO: 1; hereinafter, referred to as pi-18), 14-30 (SEQ ID NO: 2, hereinafter referred to as P14-30), 24- 35th (SEQ ID NO: 3; hereinafter referred to as p24-35), 29-41 (SEQ ID NO: 4; hereinafter referred to as p29-41), 36-47 (SEQ ID NO: 5; hereinafter, p36-47) ), 41-56 (sequence number 6; hereinafter, referred to as p4 56), 52-70 (sequence number 7; hereinafter, referred to as p52_70), 53-61 (sequence number 8) ; Hereinafter referred to as P53-61) and peptides corresponding to the 61st to 70th positions (SEQ ID NO: 9;
  • Cys a sequence substituted with Ser or Ala was synthesized.
  • p4-56C a sequence having an internal Cys
  • ABTS substrate solution [2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 0.55 g of ammonium is added to 1 L of 0.1 M citrate buffer
  • the pharmaceutical composition for treating cancer of the present invention comprises insulin-like growth factor-1 (IGF-I) and insulin-like growth factor-1.
  • IGF-I insulin-like growth factor-1
  • Combining a substance that inhibits the activity of IGF-II with a substance that has radiation or anti-tumor activity can enhance the therapeutic effect on cancer compared to when each is administered alone. it can.
  • the dose of the drug can be reduced as compared with the case of administering alone, and the combination substance can be selected according to the patient's symptoms (type of cancer, severity of cancer).
  • Advantageous effects can be obtained, such as being able to do so and maintaining the treatment period by selecting concomitant substances with different mechanisms of action.

Abstract

本発明は、インスリン様成長因子-I(IGF-I)およびインスリン様成長因子-II(IGF-II)の活性を阻害する物質を用い、癌治療効果を相乗的に増大させた癌治療用医薬を提供することを課題とする。　本発明によれば、IGF-IおよびIGF-IIの活性を阻害する物質を含み、放射線照射と併用して投与するための癌治療用医薬；IGF-IおよびIGF-IIの活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる癌治療用医薬が提供される。

Description

癌治療用医薬
技術分野
本発明は、 ィンスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン様成長因子 - I I (IGF- II)の活性を阻害する物質を含み、 放射線照射と併用して投与するための 癌治療用医薬、 およびィンスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン様成長 明
因子 -I I (IGF-I I)の活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わ せてなる癌治療用医薬に関する。
書 背景技術
ィンスリン様成長因子 ( insul in- l ike growth factor ; 以下、 IGFと表記す る） は約 70個のアミノ酸配列からなるペプチドホルモンであり、 プロインスリ ンと類似した構造をとり、 分子内に 3個のジスルフイ ド結合を有する。 IGFには、 構造が類似する 2種類のぺプチドが存在し、 ィンスリン様成長因子- 1 (IGF-I)お よびィンスリン様成長因子- I I (IGF-I I)と呼ばれている。 IGF-Iは成長ホルモン の刺激により、 主に肝臓で合成 ·分泌され、 軟骨の形成、 タンパク質合成、 細胞 の増殖や分化を促進するなど動物の成長促進に重要な機能を担う。 一方、 IGF - I I は胎児期の器官形成や発達に関与する。 IGFの生理作用は骨や筋肉に存在する
IGF受容体 （IGF receptor ; IGF- Rと表記する）を介して発揮される。 また、 IGF 結合蛋白質（IGF- bind ing protein ;以下、 IGFBPと表記する） と呼ばれる蛋白質 が存在し、 IGFの作用を促進的あるいは抑制的に制御していることが知られてい る。
IGF-Iおよび IGF- I Iは、 ともに多数の癌細胞 （肉腫、 白血病、 前立腺癌、 乳 癌、 肺癌、 胃癌、 食道癌、 肝臓癌、 塍臓癌、 腎臓癌、 甲状腺癌、 脳腫瘍、 卵巣癌、 子宮癌） に対して強い増殖促進作用を有し、 多くの癌細胞において過剰発現が認 められている。
IGFと癌の関連性は、 これまで臨床学的 ·疫学的研究から検討されており、 癌 の罹患率と血中 IGF濃度の高さに正に相関があることがわかっている。 従って、 IGF-Iおよび IGF-I Iを含めて IGF-ファミリ一タンパク質 （IGF、 IGF- R、 IGFBP) は、 癌の発生 .増殖に重要な役割を果たしており、 インスリン、 IGF- 1および IGF- I Iの増殖因子とインスリン受容体、 IGF- IRおよび IGF-IRの受容体、 ならび に IGFBPが複雑に絡み合って疾患を制御している。 すなわち、 これらの相互作用 の一部を阻害しても疾患を完全に抑制することが困難である。
これまで IGFに対する抗体、 すなわち抗 IGF抗体としては、 既にいくつかの抗 体が報告されている。 代表的なヒト IGF- 1に対する抗体 （抗 MGF- 1抗体） とし ては、 sml. 2が報告されている (Proceed ings of the Nat ional Academy of Sc iences of the Uni ted States of America, 81, 2389-2392, 1984) 。 sml. 2 は、 hIGF-I Iと 40%程度の交差反応性を有していること、 l〜2 ^ g/mLの濃度でゥ エスタンブロッテイング法により、 lOOngの hIGF- 1を検出可能であること、 10 〜30 g/mLの濃度で 20ng/mLの hIGF- 1によるマウス繊維芽細胞株 BALB/c3T3の 増殖を阻害すること、 が明らかとなっている （Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America, 81, 389-2392, 1984、 Journal of Cl inical Inves t igat ion, 99, 2961-2970, 1997) 。
その他、 抗 hIGF- 1抗体としては、 VaM- SmC 121があり、 該抗体は、 ヒトインス リンおよび hIGF- I Iとは反応しないこと、 hIGF_Iの 10〜12番目の Leu - Va卜 Asp を含むぺプチドを認識すること、 1251 - WGF- 1を用いたラジオイムノアツセィで は、 Ing/mLの hIGF- 1の検出感度を示したことが報告されている （Journal of Endocrinology, 125, 327-335, 1990) 。 41/81は、 hlGF-I Iとは 3%の反応性を 有しており、 また、 I- hIGF-Iを用いたラジオィムノアッセィでは、 Ing/mLの WGF- 1の検出感度を示す (FEBS Let ters, 149, 109-112, 1982) 。 35117は、 hIGF-I Iと 0. 5%程度の交差反応性を有していること、 l /z g/mLの濃度でのウェス タンブロッテイング法により、 1 z gの hIGF- 1を検出可能であること、 12 g/mL 以上の濃度で hIGF-Iによるマウス繊維芽細胞株 BALB/C3T3の増殖を完全に阻害 すること、 30 g/mLの濃度で l g/mLの WGF- 1による hIGF-IRの自己リン酸化 を阻害すること、 また、 125I- hIGF - 1を用いたラジオィムノアッセィでは、 0. ΙηΜ の hIGF-Iの検出感度を示すことが報告されている （Hybridoma, 16, 513-518, 1997) 。 BPL-M23は、 IGF-Iに対して 10. 5 l i t res/皿 olの結合活性を示し、 一 方、 hlGF-I Iおよびヒトインスリンには、 それぞれ 0. 8 および 0. 0001%の交差反 応性を示すこと、 ャギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 ゥサギの IGFとは反応性を示すが、 ラットおよびマウスの IGFとは反応しないこと、 ラット脂肪細胞に対する WGF - Iによる脂肪形成を抑制することが報告されている （Journal of Mol ecul ar Endocrinology, 2， 201-206, 1989) 。 7A1、 1B3、 4C1、 5A7は、 hlGF - 1の Cおよ び D ドメインの異なるェピトープを認識すること、 hlGF- Π とはそれぞれ 6. 6%、 0. 83%、 12%、 1. 2%の交差反応性を示すことが報告されている （Hybridoma, 12, 737-744, 1993) 。 3D1/2/1は、 ヒトおよびモルモットの IGF-Iとは反応を示す が、 ゥサギ、 ラット、 マウスの IGF- 1とは反応しないこと、 hlGF- I Iとは、 7%の 交差反応性を示すことが報告されている （Journal of Cl inical and Metabol i sm, 54, 474-476, 1982) 。
代表的なヒト IGF- I Iに対する抗体 （抗 hIGF_I I抗体） としては、 S1F2が報告 されている。 S1F2は、 hIGF-Iと 10%程度の交差反応性を有していること、 1 g/mLの濃度でのウエスタンプロッティング法により、 10〜100ngの hlGF- I Iを検 出可能であること、 100 g/mLの濃度で 100ng/mLの hlGF- I Iによるヒト繊維芽 細胞の DNA合成促進作用を阻害することが明らかとなっている （Diabe tes
Research and Cl inical Prac t ice, 7, S21-S27, 1989、 Endocrinology, 124, 870-877, 1989) 。 2H1 K 2B11、 ID5、 ID9は、 hIGF_I Iと反応し、 liIGF- 1とは反 応しないこと、 競合酵素免疫測定法 （以下、 ELISAと表記する） により、 lng/mL の hlGF- I Iを定量可能であることが報告されている （特開平 5- 252987号） 。
しかしながら、 インスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン様成長因子- I I (IGF-II)の両方に結合し、 両方の活性を阻害する抗体はこれまでのところ知ら れていない。
また、 上述の性質を有する抗体の他の癌療法との併用効果についても知られて いない。 発明の開示
本発明の課題は、 ィンスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン様成長因 子- II (IGF-II)の活性を阻害する物質を用い、 癌治療効果を相乗的に増大させた 癌治療用医薬、 癌治療方法を提供することにある。
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 ィンスリン様成長 因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の活性を阻害する物質を 放射線照射または抗腫瘍活性を有する物質と併用することにより、 癌治療効果を 増大できること見出し、.本発明を完成させるに至った。
即ち、 本発明は、 以下の（1)〜（15)の発明を包含する。
(1) ィンスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質を含み、 放射線照射と併用して投与するための癌治療用医薬。
(2) 放射線照射が、 癌治療用医薬の投与時または投与前後に、 単回または複数回 行われる、 （1)に記載の癌治療用医薬。
(3) ィンスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる癌治療用医 薬。
(4) ィンスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを、 同時に又は逐次的に投与す るための（3)に記載の癌治療用医薬。
(5) ィンスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質が、 以下の （a) 〜 （d) からなる群より選ばれる、 （1)力 ら（4)のいずれかに記載の癌治療用医薬。
(a) IGF- 1および IGF-IIに特異的に結合し、 IGF-Iおよび IGF-IIの活性を 阻害する抗体または抗体断片
(b) IGF-Iに特異的に結合し、 IGF- 1の活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF- II に特異的に結合し、 IGF- IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 を含む組成物
(c) IGF-Iに特異的に結合し、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF- II に特異的に結合し、 IGF- IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 を組み合わせてなる組成物
(cl) IGF-Iに特異的に結合し、 IGF- 1の活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF-I I に特異的に結合し、 IGF- I Iの活性を阻害する抗体または抗体断片 の複合体
(6) 抗体がモノクローナル抗体である、 （5)に記載の癌治療用医薬。
(7) モノクローナル抗体が、 ハイプリ ドーマ KM1468 (FE腹 BP - 7978) より生産 されるモノクローナル抗体が結合するェピト一プに結合するモノクローナル抗体 である、 （6)に記載の癌治療用医薬。
(8) 抗体断片が、 Fab、 Fab\ F (ab' ) 2、 一本鎖抗体 （scFv) 、 二量体化可変領 域 （Di abody) 、 ジスルフイド安定化可変領域 （dsFv) および CDRを含むぺプチ ドからなる群から選ばれる抗体断片である、 （5) ~ (7)のいずれかに記載の癌治療 用医薬。
(9) 抗腫瘍活性を有する物質が、 蛋白質または低分子の薬剤である（1)〜 ）に記 載の医薬。
(10) 蛋白質が、 抗体またはサイト力インである、 （9)に記載の医薬。
(11) 低分子の薬剤が、 DNAアルキル化剤、 DNA合成阻害剤、 白金製剤型 DNA架橋 剤、 代謝拮抗剤、 トポイソメラ一ゼ I阻害剤、 トポイソメラーゼ I I阻害剤、 チ ユーブリン作用薬、 ホルモン拮抗薬、 ァロマ夕ーゼ阻害剤、 免疫調節剤、 免疫抑 制剤、 ステロイド型抗炎症剤、 非ステロイド型抗炎症剤、 抗ヒスタミン剤、 分化 誘導剤、 プロテオゾーム阻害剤、 チロシンキナーゼ阻害剤、 アデノシンデァミナ ーゼ阻害剤、 血管新生阻害剤、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤、 マトリックスメ 夕口プロテアーゼ阻害剤、 フアルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、 ビスホスホ ネート製剤、 Hsp90阻害剤、 キネシン Eg5阻害剤、 セリンスレオニンキナーゼ阻 害剤ならびにこれらの化合物の誘導体からなる群から選ばれる薬剤である、 （9) に記載の医薬。
(12) 哺乳動物に対し、 インスリン様成長因子- UIGF-I)およびインスリン様成長 因子 -I I (IGF-I I)の活性を阻害する物質の有効量を、 放射線照射と併用して投与 することを特徴とする、 癌の治療方法。
(13) 放射線照射が、 癌治療用医薬の投与時または投与前後に、 単回または複数 回行われる、 （12)に記載の癌の治療方法。
(14) 哺乳動物に対し、 インスリン様成長因子- I (IGF-I)およびインスリン様成長 因子- I I (IGF- I I)の活性を阻害する物質の有効量と、 抗腫瘍活性を有する物質の 有効量とを組み合わせて投与することを特徴とする、 癌の治療方法。
(15) ィンスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン様成長因子 - I I (IGF-I I) の活性を阻害する物質の有効量と、 抗腫瘍活性を有する物質の有効量とを、 同時 に又は逐次的に投与することを特徴とする、 （14)に記載の癌の治療方法。 図面の簡単な説明
図 1は、 モノクローナル抗体の hIGF-Ιに対する特異的な反応性を示す （結合 ELISA) 。 横軸は、 抗体と抗原の組み合わせを、 縦軸は結合活性 （0D415)を示す。 図 2は、 モノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有する hlGF - Iに対する反応性を示す （競合 ELISA) 。 横軸は添加した MGF- 1濃度を、 縦軸は 結合活性 （0D415) を示す。
図 3は、 抗体 KM1468および sml. 2の WGF- 1に対する反応を示す。 横軸は抗体 濃度 （ g/mL) 、 縦軸は結合活性 （0D415) を示す。 〇は KM1468、 口は sml. 2の 反応性をそれぞれ示す。
図 4は、 抗体 KM1468および sml. の hlGF- 1に対する結合における各種因子に よる阻害活性を示す。 横軸は各種因子濃度 （ g/mL) 、 縦軸は結合活性 （ を 示す。 Aは hIGF_I、 Bは hlGF- I I、 Cはヒトインスリン、 Dは mIGF- 1によるそれ ぞれの活性を示す。 〇は KM1468、 口は sml. 2の反応性をそれぞれ示す。
図 5は、 抗体 KM1468、 31111. 2ぉょび3 2の1116?ぉょびヒトィンスリンにょる ヒト乳癌細胞株 MCF7の増殖に対する影響を示す。 Aは各因子による細胞増殖活 性を示す。 横軸は各種因子濃度 （ i g/mL) 、 縦軸は増殖 （OD450) を示す。 〇は IGF-L ·は hIGF_I I、 口はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。 Bは hlGF- 1、 Cは hIGF_I I、 Dはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示 す。 横軸は抗体濃度 （/i g/mL) 、 縦軸は増殖 （OD450) を示す。 細点線は抗体非 添加時の増殖を、 点線は各因子非添加時の増殖を示す。 〇は KM1468、 口は sml. 2、 讕は S 1F2の活性をそれぞれ示す。
図 6は、 抗体 KM1468、 sml. 2および S 1F2の hlGFおよびヒトインスリンによる ヒト大腸癌細胞株 HT- 29の増殖に対する影響を示す。 Aは各因子による細胞増殖 活性を示す。 横軸は各種因子濃度 （ng/mL) 、 縦軸は増殖 （0D450) を示す。 〇は hlGF-L 秦は hlGF- I I、 口はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。 Bは hlGF - 1、 Cは hIGF_I I、 Dはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示 す。 横軸は抗体濃度 （ g/mL) 、 縦軸は増殖 （0D450) を示す。 細点線は抗体非 添加時の増殖を、 点線ば各因子非添加時の増殖を示す。 〇は KM1468、 口は sml. 2、 鬭は S 1F2の活性をそれぞれ示す。
図 7は、 抗体 KM1468、 sml. 2および S 1F2の hlGFおよびヒトインスリンによる ヒト骨肉腫細胞株 MG63の増殖に対する影響を示す。 Aは各因子による細胞増殖 活性を示す。 横軸は各種因子濃度 （ng/mL) 、 縦軸は増殖 （OD450) を示す。 〇は IGF-L ·は！ iIGF- I I、 口はヒトインスリンの活性をそれぞれ示す。 Bは WGF - 1、 Cは hlGF- I I、 Dはヒトインスリンによる増殖活性に対する各種抗体の影響を示 す。 横軸は抗体濃度 （ g/mL) 、 縦軸は増殖 （0D450) を示す。 細点線は抗体非 添加時の増殖を、 点線は各因子非添加時の増殖を示す。 〇は KM1468、 口は sml. 2、 園は S 1F2の活性をそれぞれ示す。
図 8は、 抗体 KM1468の hIGF-Ιに対する結合における各種ペプチドによる阻害 活性を示す。 横軸は各種ペプチド濃度 （ i g/mL) 、 縦軸は結合活性 «) を示す。 用いた各種べプチドについては、 図中に示した。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本願は、 2003年 9月 24日に出願された日本 国特許出願 2003-332346号の優先権を主張するものであり、 該特許出願の明細書 及び Z又は図面に記載される内容を包含する
I . 本発明の癌治療用医薬および癌治療方法
本発明の癌治療用医薬は、 ィンスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびィンスリン 様成長因子- I I (IGF-I I)の活性を阻害する物質を含み、 放射線照射と併用して投 与するための癌治療用医薬である。
本発明の癌治療用医薬はまた、 ィンスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンス リン様成長因子- I I (IGF-I I)の活性を阻害する物質と、 抗腫瘍活性を有する物質 とを組み合わせてなる癌治療用医薬である。 本発明の癌治療用医薬において、 「IG Iおよび IGF- IIの活性を阻害する物 質」 は、 単一の物質であってもよく、 複数の物質からなる組成物であってもよく、 複数の物質からなる組成物の場合にはそれぞれの物質を同時にまた別々に使用し てもよい。
IGF- 1および IGF- IIの活性を阻害する物質としては、
(a) IGF- 1および IGF- IIに特異的に結合し、 IGF-Iおよび IGF- IIの活性を 阻害する抗体または抗体断片
(b) IGF-Iに特異的に結合し 、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF- II に特異的に結合し、 IGF-IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 を含む組成物
(c) IGF-Iに特異的に結合し 、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF-II に特異的に結合し、 IGF-IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 を組み合わせてなる組成物
(d) IGF-Iに特異的に結合し 、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF-II に特異的に結合し、 IGF-IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 の複合体
などがあげられる。
上記の 「IGF- 1および IGF- IIの活性を阻害する」 とは、 IGF-Iおよび IGF - II が有するいずれかの活性を阻害することをいうが、 具体的には、 IGF- 1および IGF-IIが有する細胞増殖促進活性を阻害することがあげられる。
本発明で使用される 「IGF-Iおよび IGF-IIに特異的に結合し、 IGF- 1および IGF- IIの活性を阻害する抗体または抗体断片」 とは、 IGF- 1と IGF- Πの両方に 特異的に結合し、 かつ IGF- 1と IGF- IIの両方の活性を阻害する抗体または抗体 断片をいう。 具体的には、 天然型 IGF-Iおよび天然型 IGF- IIに存在するェピト ープを認識する抗体または抗体断片、 IGF-Iおよび IGF- IIの立体構造を認識す る抗体または抗体断片などがあげられる。
本発明で使用される上記の抗体または抗体断片は、 ポリクローナル抗体または モノク口一ナル抗体のいずれであつてもよいが、 好ましくはモノクローナル抗体 である。 また、 モノクローナル抗体としては、 「ハイプリ ドーマが産生する抗 体」 、 「遺伝子組換え抗体」 、 それらの抗体断片なども含まれる。 ここで、 「遺 伝子組換え抗体」 としては、 ヒト化抗体、 ヒト抗体などがあげられ、 また、 「ヒ ト化抗体」 としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型相補性決定領域 （以下、 CDRと 表記する） 移植抗体などがあげられる。 「ハイプリ ドーマ」 とは、 ヒト以外の哺 乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、 ミエローマ細胞とを細胞融合させ て得られる、 所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を生産する細胞をい 。
「ヒト型キメラ抗体」 とは、 ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域 （以下、 VH と表記する） および軽鎖可変領域 （以下、 VLと表記する） とヒト抗体の重鎖定 常領域 （以下、 CHと表記する） およぴ軽鎖定常領域 （以下、 CLと表記する） と からなる抗体をいう。 ヒト型キメラ抗体の CHとしては、 ヒトイムノグロブリン (以下、 hl gと表記する） に属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのも のが好適であり、 さらに M gGクラスに属する gGl、 hIgG2、 hI gG3、 M gG4とい つたサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の CL としては、 hlgに属すればいずれのものでもよく、 κクラスあるいは λクラスの ものを用いることができる。 また、 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ラビットなどがあげられる。
「ヒト型 CDR移植抗体」 とは、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRを ヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をいう。 本発明のヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRを任意のヒト抗体 の VHおよび VLのフレームワーク （以下、 FRと表記する） と連結した V領域を コードする cDNAを設計、 構築し、 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする cMAを 有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現べク 夕一を構築し、 動物細胞へ導入することにより発現させ、 製造することができる。 ヒト型 CDR移植抗体の CH としては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 M gGクラスのものが好適であり、 さらに WgGクラスに属する gGl、 hIgG2、 hIgG3、 hI gG4といったサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト 型 CDR移植抗体の CLとしては、 M gに属すればいずれのものでもよく、 κクラ スあるいは λクラスのものを用いることができる。 「ヒト抗体」 とは、 元来、 ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、 最近の遺 伝子工学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体フ ァ一ジライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジエニック動物から得られる抗 体なども含まれる。 ヒト体内に存在する抗体は、 例えば、 ヒト末梢血リンパ球を 単離して EBウィルスなどを感染させて不死化し、 クローニングすることにより 該抗体を産生するリンパ球を取得し、 そして該リンパ球を培養し、 該培養上清中 から該抗体を精製することにより得ることができる。 ヒト抗体ファージライブラ リーは、 ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することに より Fab、 scFvなどの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。 該ライブラリ一より、 抗原を固定化した基質に対する結合 性を指標として所望 の抗原結合活性を有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収すること ができる。 該抗体断片は、 さらに、 遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖お よび 2本の完全な L鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。 ヒト抗 体産生トランスジエニック動物は、 ヒト抗体遺伝子が細胞内に組込まれた動物を 意味する。 具体的には、 例えば、 マウス ES細胞ヘヒト抗体遺伝子を導入し、 該 ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒト抗体産生トラン スジエニックマウスを作製することができる。 ヒト抗体産生トランスジエニック 動物からのヒト抗体の作製方法は、 通常のヒト以外の動物で行われているハイブ リドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイプリ ドーマを取得し、 培養することで 培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
本発明において好ましく使用できる抗体または抗体断片としては、 ハイプリド 一マ KM1468 (FERM BP-7978) が生産するモノクローナル抗体腿1468、 ハイプリ ドーマ KM1468 (FERM BP- 7978) が生産するモノクローナル抗体 KM1468が結合す るェピトープに結合するモノクローナル抗体、 または WGF-Iに反応し、 約
40 %hIGF-I Iにも交差反応する抗 hlGF- 1 モノクローナル抗体 sml. 2 (Ups t at e B iology社） 、 抗 hIGF-Ι モノクロ一ナル抗体 sml. 2 (Upstate B io l ogy社） が 結合するェピト一プに結合するモノクローナル抗体、 さらに、 上述のモノクロ一 ナル抗体が有する VHおよび VLの CDR1、 CD 2, および CDR3のアミノ酸配列を含 む遺伝子組換え抗体または抗体断片などがあげられる。 「IGF-Iに特異的に結合し、 IGF- 1の活性を阻害する抗体または抗体断片、 お よび IGF- I Iに特異的に結合し、 IGF- I Iの活性を阻害する抗体または抗体断片を 含む組成物」 としては、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれか と、 IGF- IIの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかを含む組成物であ ればいかなるものでもよい。
ここで用いる 「IGF- 1に特異的に結合し、 IGF - 1の活性を阻害する抗体または 抗体断片」 とは、 IGF- 1に特異的に結合するが、 IGF- I Iに特異的に結合しない
(交差反応性がない） 抗体をいい、 例えば、 マウス IGF-1 (以下 mIGF-Iと表記 する） に対する抗体である AF791 (R&D社製） 、 ヒト IGF- 1 (以下 hIGF- 1と表記 する） に対するモノクローナル抗体である 56408 (R&D社製） 、 M23/ILG卜 001
(Biogenes is社製） 、 AF791が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗 体、 56408が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体、 M23/ILG1- 001 が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体、 さらに、 上述のモノク口 ーナル抗体が有する VHおよび VLの CDR1、 CDR2、 および CDR3のアミノ酸配列を 含む遺伝子組換え抗体または抗体断片などがあげられる。
また、 「IGF- I Iに特異的に結合し、 IGF-I Iの活性を阻害する抗体または抗体 断片」 とは、 IGF- I Iに特異的に結合するが、 IGF- 1に特異的に結合しない （交差 反応性がない） 抗体をいい、 例えば、 ml'GF- IIに対する抗体である AF792 (R &D 社製） 、 MGF-I I に対するモノクロ一ナル抗体である S1F2 (Ups tate Biology社 製） 、 AF792が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体、 S1F2が結合 するェピトープに結合するモノクローナル抗体、 さらに、 上述のモノクローナル 抗体が有する VHおよび VLの CDR1、 CDR2, および CDR3のアミノ酸配列を含む遺 伝子組換え抗体または抗体断片などがあげられる。
「IGF_Iに特異的に結合し、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 お よび IGF- II に特異的に結合し、 IGF- I Iの活性を阻害する抗体または抗体断片を 組み合わせてなる組成物」 とは、 「IGF- 1に特異的に結合し、 IGF-Iの活性を阻 害する抗体または抗体断片」 を含む剤と、 「IGF- I Iに特異的に結合し、 IGF - I I の活性を阻害する抗体または抗体断片」 を含む剤を別々に調製し、 これらの剤を 組み合わせて同時にまたは逐次的に用いるための組成物をいう。 「IGF- 1に特異的に結合し、 IGF- 1の活性を阻害する抗体または抗体断片、 お よび IGF- I Iに特異的に結合し、 IGF- I Iの活性を阻害する抗体または抗体断片の 複合体」 としては、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかと、 IGF-I Iの活性を阻害する抗体または抗体断片のいずれかとを結合させることに より得られる複合体であればいかなるものでもよい。 具体的には、 上記の二種類 の抗体または抗体断片を下記の手段で結合させた抗体複合体があげられる。
抗体の結合方法としては、 化学的に結合させる方法、 または蛋白質工学的手法 を用いる方法があげられる。
化学的に結合させる方法としては、 二種類の抗体分子を N- succ inimidyl - 3 - (2-pyridyld i thiol) -propionat eや S-ace tylmercaptosucc inic ac id anhydr ide などの架橋剤を用いて結合する方法などがあげられる。
蛋白質工学的な手法を用いる結合方法としては、 蛋白質工学的手法を用いて複 数個の抗体あるいは抗体断片を結合した形で発現させられる方法があれば、 いか なる方法でも用いることができる。 蛋白質工学的手法を用いる結合方法で作製さ れる抗体複合体としては、 二種類の scFvを適当なリンカーを介して結合させた 分子、 二種類の抗体 Fab ' 断片を適当なリンカ一を介して結合させた分子、 二種 類の scFvを N末端と C末端に連結した Fc融合蛋白質、 二種類の scFvを連結し た Fc融合蛋白質のヘテロ分子、 d iabody、 d iabodyが N末端あるいは C末端に連 結した F c融合蛋白質などがあげられる。
本発明で使用される抗体断片としては、 Fab、 Fab\ F (ab' ) 2、 scFv、 di abody, d s F vおよび CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fa は、 IgG型抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片の うち （H鎖の 224番目のアミノ酸残基で切断される） 、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗 体断片である。
本発明で使用される Fabは、 抗体を蛋白質分解酵素パパィンで処理して得るこ とができる。 または、 該抗体の Fabをコードする ]) NAを原核生物用発現ベクター あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該ベクタ一を原核生物あるいは真核 生物へ導入することにより発現させ、 Fabを製造することができる。 F (ab' ) 2は、 IgG型抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断 片のうち （H鎖の 234番目のアミノ酸残基で切断される） 、 Fabがヒンジ領域の ジスルフィ ド結合を介して結合されたものよりやや大きい、 分子量約 10万の抗 原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用される F (ab' ) 2は、 抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得 ることができる。 または、 下記の Fab'をチォェ一テル結合あるいはジスルフィ ド結合させ、 作製することができる。
Fab'は、 上記 F (ab' ) 2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約 5 万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用される Fab'は、 F (ab' ) 2を還元剤ジチオスレィトール処理して得 ることができる。 または、 該抗体の Fab'断片をコードする DNAを原核生物用発 現ベクターあるいは真核生物用発現べクターに挿入し、 該ベクターを原核生物あ るいは真核生物へ導入することにより発現させ、 Fab'を製造することができる。 scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一 （以下、 Pと表記 する） を用いて連結した、 VH- P- VLないしは VL- P- VHポリペプチドで、 抗原結合 活性を有する抗体断片である。
本発明で使用される scFvは、 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真 核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ 導入することにより発現させ、 scFvを製造することができる。
d iabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片で、 二価の抗原結合活性を有する抗 体断片である。 二価の抗原結合活性は、 同一とすることもできるし、 一方を異な る抗原結合活性とすることもできる。 本発明で使用される d i abodyは、 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scFvをコードする DNAをリンカーの アミノ酸配列の長さが 8残基以下となるように構築し、 該 DNAを原核生物用発現 ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現ベクターを原核生物 あるぃは真^¾生物へ導入することにより発現させ、 d i abodyを製造することがで きる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換し たポリべプチドを該システィン残基間のジスルフイ ド結合を介して結合させたも のをいう。 システィン残基に置換するアミノ酸残基は Re i terらにより示された 方法 （Prote in Engineering, 7, 697-704, 1994) に従って、 抗体の立体構造予 測に基づいて選択することができる。 本発明で使用される dsFvは、 抗体の VHお よび VLをコードする cDNAを取得し、 dsFvをコードする DNAを構築し、 該腿 A を原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現べ クタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 dsFvを製 造することができる。
CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで 構成される。 複数の CDRを含むペプチドは、 直接または適当なペプチドリンカ一 を介して,結合させることができる。 本発明で使用される CDRを含むペプチドは、 抗体の VHおよび VLの CDRをコードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現 ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、 該発現べクタ一を原核生物 あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 CDRを含むペプチドを製造す ることができる。 また、 CDRを含むペプチドは、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォ キシカルポニル法） 、 tBoc法 （t -プチルォキシカルボニル法） などの化学合成 法によって製造することもできる。
本発明で使用される抗体または抗体断片は、 ELISA (Ant ibod ies : A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapt er 14, 1988； Monoc lonal Ant ibod ies : Princ ipl es and Pract ice, Academic Press L imi t ed, 1996) 、 IGF- 1および IGF- I Iによる細胞増殖に対する阻害活性 （Cancer
Research, 48, 4083-4092, 1988) などを測定することにより、 in vi t roでの IGF- 1および IGF- I Iに対する結合活性、 IGF- 1および IGF-I Iの活性を阻害する 活性を評価することができる。
本発明の一態様として、 上記の IGF- 1および IGF- I Iの活性を阻害する物質に 放射線照射を併用する場合、 放射線は、 前記物質を含む医薬の投与時または投与 前後に、 単回または複数回行うことができる。 また、 放射線照射は、 1回の照射 量として、 l Gy〜10Gy、 好ましくは 2〜5Gy、 より好ましくは 4Gy があげられる。 複数回の照射を行う際は、 1回の照射量を分割して照射すればよい。 本発明において、 放射線照射とは X線、 ァ線などの光子 （電磁波） 照射、 電子 線、 陽子線、 重粒子線などの粒子線照射を含む広い概念をいう。
本発明の他の態様として、 上記の IGF- 1および IGF- I Iの活性を阻害する物質 に抗腫瘍活性を有する物質を併用する場合、 抗腫瘍活性を有する物質としては、 蛋白質又は低分子の薬剤などが包含される。
ここで、 「抗腫瘍活性」 とは、 悪性腫瘍の組織又は細胞に対する選択的な増殖 抑制作用や傷害作用、 腫瘍組織又は細胞の縮小や消失作用を含み、 最も広義に解 釈するものとする。 ，
蛋白質としては、 限定はされないが、 抗体またはサイト力インなどが挙げられ る。
サイト力インとしては、 インタ一フエロン- 、 βヽ τ、 腫瘍壌死因子
(TNF) - , リンフォトキシン、 インターロイキン _ 1、 、 3、 4、 7、 8、 12、 15、 18、 21、 顆粒球コロニー刺激因子 （G- CSF) 、 マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF) 、 顆粒球-マクロファージ-コロニー刺激因子 （GM-CSF) 、 インターフ エロン-ァ誘導性蛋白質- 10 (IP- 10) 、 フラクタル力インなどが挙げられる。 ま た、 成長ホルモン受容体拮抗薬などの蛋白質製剤なども包含される。
抗体としては、 腫瘍細胞に発現する抗原、 もしくは腫瘍細胞の増殖や転移など、 腫瘍の病態形成に関わる抗原に対する抗体であればいかなるものでも良いが、 例 としてはインターロイキン 6 (IL-6) 受容体、 GD2、 GD3、 GM2、 HER2、 CD20、 CD22、 CD33、 CD52、 MAGE, HM1. 24、 副甲状腺ホルモン関連蛋白 （PTHrP) 、 塩基 性線維芽細胞増殖因子、 線維芽細胞増殖因子 8、 塩基性繊維芽細胞増殖因子受容 体、 線維芽細胞増殖因子 8受容体、 上皮細胞成長因子受容体 （EGFR) 、 上皮性細 胞接着分子 （EpCam) 、 インスリン様増殖因子、 インスリン様増殖因子受容体、 PMSA、 血管内皮細胞増殖因子、 血管内皮細胞増殖因子受容体などに対する抗体が 挙げられる。
なお、 上記の抗体の具体例としては、 本発明の範囲を限定するものではないが、 抗 IL- 6受容体抗体はアンチ 'キャンサー ' リサーチ （Ant icancer Res. ) ， 18, 1217 ( 1998) 、 抗 GD2抗体はアンチ ·キャンサー · リサーチ （Ant icancer Res. ) , 13, 331 (1993)、 抗 GD3抗体はキャンサー ·ィムノロジー ·ィムノセラ ピー （Cancer Immunol. I腿 imother. ) , 36, 260 (1993)、 抗 GM2抗体はキャン サー . リサーチ （cancer Res. ) , 54, 1511 (1994)、 抗 HER2抗体はプロシーデ ィングス .ォプ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992)、 抗 CD20抗体はブラッド (Blood) , 83, 435
(1994)、 抗 CD22抗体としてはセミナ一ズ 'イン 'オンコロジ一 （Se腿 in.
Oncol. ) , 30, 253 (2003)、 抗 CD33抗体はジャーナル 'ォブ ·クリニカル ·ォ ンコロジ一 （J. Clin. Oncol. ) , 19, 3244 (2001)、 抗 CD52抗体はプロシーデ ィングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. USA), 89, 4285 (1992)、 抗 MAGE抗体はプリティッシュ ' ジャ一ナ ル -ォブ 'キャンサー （British J. Cancer) ， 83, 493 (2000)、 抗丽 1.24抗体 はモレキュラー -ィムノロジ一 （Molecular I讓 unol. ) , 36, 387 (1999)、 抗副 甲状腺ホルモン関連蛋白 （PTHrP) 抗体はキャンサー （Cancer) ， 88, 2909 (2000)、 抗線維芽細胞増殖因子 8抗体はプロシーディンダス 'ォブ 'ザ 'ナショ ナル 'アカデミー ·ォブ 'サイエンス （Pro Natl. Acad. Sci. USA) , 86， 9911 (1989)、 抗線維芽細胞増殖因子 8受容体抗体はジャーナル ·ォブ ·バイオ ロジカル 'ケミストリー （J. Biol. C em. ) , 265, 16455 (1990)、 抗上皮細胞 成長因子受容体抗体はキャンサー · リサーチ （Cancer Res.) , 59, 1236 (1999)、 抗上皮性細胞接着分子抗体はプロシーディングス ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカ デミ一 -ォブ 'サイエンス（Pro Natl. Acad. Sci. USA), 76, 1438 (1979)、 抗ィンスリン様増殖因子抗体はジャーナル ·ォブ ·ニューロサイエンス · リサ一 チ （J. Neurosci. Res. ) , 40, 647 (1995)、 抗インスリン様増殖因子受容体抗 体はジャーナル 'ォブ 'ニューロサイエンス ' リサーチ （J. Neurosci. Res. ) ， 40, 647 (1995)、 抗 PMSA抗体はジャーナル 'ォブ 'ゥロロジー （L Urology) ， 160, 2396 (1998)、 抗血管内皮細胞増殖因子抗体はキャンサー · リサーチ
(Cancer Res.) , 57, 4593 (1997)、 抗血管内皮細胞増殖因子受容体抗体はオン コジーン （Oncogene) , 19, 2138 (2000)などに記載の抗体が挙げられる。
具体的な抗体名としては、 ハ一セプチン（Herceptin)、 リツキサン（Rituxan)、 キャンパス（Campath)、 ァバスチン（Avastin)、 ベクサ一（Bexxar)、 リンフォサイ ド（Ly即 hoCide)、 マイ口ターグ（Mylotarg)、 パノレックス（Panorex)、 ゼバリン (Zeval in) [ネイチヤー ' レビューズ 'キャンサー （Nat. Rev. Cancer) , 1, 118 (2001) ]などが挙げられる。
低分子の薬剤としては、 限定はされないが、 例えば、 シクロホスフアミド、 ィ ホスフアミド、 メルファラン、 ダカルバジン、 プロカルバジン、 二ムスチン、 力 ルムスチン、 口ムスチン、 エストラムスチン、 ブスルファン、 チォテパなどの DNAアルキル化剤；ブレオマイシン、 ぺプロマイシン、 マイトマイシン（：、 ミト キサントロンなどの DNA合成阻害剤； シスブラチン、 カルポプラチン、 ォキサリ プラチン、 ネダプラチンなどの白金製剤型 DNA架橋剤； 5-フルォロウラシル、 力 ぺシ夕ビン、 メトトレキセ一卜、 ゲムシ夕ビン、 フルダラピン、 シラタビン、 ク ラドリビン、 メルカプトプリン、 ヒドロキシカルバミド、 Ara- Cなどの代謝拮抗 剤；イリノテカン、 ノギテカンなどのトポイソメラーゼ I阻害剤； ドキソルビシ ン、 ェピルビシン、 ダウノルビシン、 エトポシドなどのトポイソメラーゼ I I阻 害剤； ビンクリスチン、 ビンブラスチン、 ビンデシン、 ビノレルビン、 パクリタ キセル、 ドセタキセルなどのチューブリン作用薬；夕モキシフェン、 ゴセレリン、 リュープロレリン、 フルタミドなどのホルモン拮抗薬；アナストロゾール、 ファ ドロゾ一ル、 レトロゾール、 ェキセメスタンなどのァロマターゼ阻害剤；金チォ マレ一ト、 D-ぺニシラミン、 ブシラミン、 サリ ドマイドなどの免疫調節剤；ァザ チォプリン、 ミゾリビン、 シクロスポリン、 ラパマイシンなどの免疫抑制剤； ヒ ドロコルチゾン、 プレドニゾロン、 デキサメタゾンなどのステロイド型抗炎症 剤；アスピリン、 インドメタシン、 セレコキシブなどの非ステロイド型抗炎症 剤；クロルフエ二ラミン、 クレマスチンなどの抗ヒスタミン剤； トレチノイン、 ベキサロテン、 砒素などの分化誘導剤；ポルテゾミブなどのプロテオソーム阻害 剤；ゲフイチニブ （EGFR阻害剤） 、 エル口チニブ （EGFR阻害剤） 、 イマチニブ
(Abl阻害剤） 、 Fl t 3阻害剤、 ZD6474 (VEGFR阻害剤） 、 PD17034 (FGFR阻害 剤） などのチロシンキナーゼ阻害剤；ペントス夕チンなどのアデノシンデァミナ ーゼ阻害剤； ラデイシコール、 17-ァリルアミノ -17 -デメトキシゲルダナマイシ ンなどの Hsp90阻害剤；血管新生阻害剤； ヒストンデァセチラーゼ阻害剤；マト リックスメタ口プロテアーゼ阻害剤； フアルネシルトランスフェラーゼ阻害剤； ビスホスホネ一ト製剤；キネシン Eg5阻害剤； UCN- 01、 ラパマイシンなどのセリ ンスレオニンキナーゼ阻害剤ならびにこれらの化合物の誘導体などがあげられる。 上記の薬剤のうち、 好ましくはシスブラチン、 カルボブラチン、 ォキサリブラ チン、 5—フルォロウラシル、 イリノテカン、 パクリ夕キセル、 ゲフイチニブ、 メルファラン、 ドキソルビシン、 ポルテゾミブ、 ラパマイシン、 ハーセプチン、 ミトキサントロン、 デキサメタゾン、 UCN- 01、 プレドニゾロン、 サリ ドマイドが あげられ、 より好ましくはメルファラン、 シスブラチン、 ミ トキサントロン、 ィ リノテカン、 ラパマイシン、 デキサメタゾン、 UCN-01などがあげられる。
riGF-Iおよび IGF- I Iの活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを 組み合わせてなる癌治療用医薬」 とは、 「IGF- 1および IGF- I Iの活性を阻害す る物質」 またはその製剤と、 「抗腫瘍活性を有する物質」 またはその製剤とを、 投与対象に同時に投与するための、 または、 時間差をおいて逐次的に投与するた めの医薬をいう。
すなわち、 上記医薬の投与形態としては、 投与時に 「IGF- 1および IGF-I Iの 活性を阻害する物質」 と 「抗腫瘍活性を有する物質」 とが組み合わされていれば よい。 例えば、 （i) 「IGF-Iおよび IGF- I Iの活性を阻害する物質」 と 「抗腫瘍 活性を有する物質」 とを同時に製剤化して得られる単一の製剤の投与、 （i i)
「IGF-Iおよび IGF- I Iの活性を阻害する物質」 と 「抗腫瘍活性を有する物質」 とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の同一投与経路での同時投与、 （i i i)
「IGF-Iおよび IGF- I Iの活性を阻害する物質」 と 「抗腫瘍活性を有する物質」 とを別々に製剤化して得られる 2種の製剤の同一投与経路での時間差をおいての 投与、 例えば、 「IGF- 1および IGF- I Iの活性を阻害する物質」 、 「抗腫瘍活性 を有する物質の順序での投与、 あるいは逆の順序での投与、 （iv) 「IGF- 1およ び IGF-I Iの活性を阻害する物質」 と 「抗腫瘍活性を有する物質」 とを別々に製 剤化して得られる 2種の製剤の異なる投与経路での同時投与、 （V) 「IGF- 1およ び IGF- I Iの活性を阻害する物質」 と 「抗腫瘍活性を有する物質」 とを別々に製 剤化して得られる 2種の製剤の異なる投与経路での時間差をおいての投与などが 挙げられる。
時間差をおいて投与する場合、 その時間差は投与する有効成分、 剤型、 投与方 法などにより異なる。 本発明の癌治療用医薬の投与量は、 併用する放射線照射の有無、 併用する 「抗 腫瘍活性を有する物質」 の種類、 症状の程度、 投与方法、 投与対象の年齢 -性 別 -体重、 治療期間などによって異なり、 特に限定はされないが、 通常哺乳動物
1 日当たり 10 ^ g /kg〜10mg/kgである。
本発明の癌治療用医薬の対象疾患としては、 各種悪性及び良性腫瘍、 例えば、 悪性黒色腫、 悪性リンパ腫、 消化器癌、 肺癌、 食道癌、 胃癌、 大腸癌、 直腸癌、 結腸癌、 尿管腫瘍、 胆嚢癌、 胆管癌、 胆道癌、 乳癌、 肝臓癌、 臈臓癌、 睾丸腫瘍、 上顎癌、 舌癌、 口唇癌、 口腔癌、 咽頭癌、 喉頭癌、 卵巣癌、 子宮癌、 前立腺癌、 甲状腺癌、 脳腫瘍、 力ポジ肉腫、 血管腫、 白血病、 真性多血症、 神経芽腫、 網膜 芽腫、 骨髄腫、 膀胱腫、 肉腫、 骨肉腫、 筋肉腫、 皮膚癌、 腎臓癌、 泌尿器癌、 小 児癌、 神経膠腫などがあげられる。
本発明の癌治療用医薬は、 特に、 「WGF依存性増殖癌」 による腫瘍抑制に有 効である。 「hIGF依存性増殖癌」 とは、 hlGF存在下で増殖し、 hlGF濃度に依存 して増殖度が増加する癌のことをいい、 たとえば前立腺癌、 大腸癌、 乳癌、 骨肉 腫、 骨髄腫などがあげられる。
本発明の癌治療用医薬は、 IGF- 1および IGF-I Iの活性を阻害する物質と抗腫 瘍活性を有する物質とをそれぞれ単独で有効成分として含む医薬であつてもよい し、 両物質を混合させたものを有効成分として含む医薬であってもよいが、 通常 は薬理学的に許容される一つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の 技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供す るのが望ましい。 好ましくは水、 あるいは食塩、 グリシン、 グルコース、 ヒトァ ルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な溶液が用いられる。 また、 製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝化剤や等張化剤のような、 薬理学的 に許容される添加剤、 例えば、 酢酸ナトリウム、 塩化ナトリウム、 乳酸ナトリウ ム、 塩化カリウム、 クェン酸ナトリウム等を添加することもできる。 また、 凍結 乾燥して貯蔵し、 使用時に適当な溶媒に溶解させて用いることもできる。
'本発明の癌治療用医薬の投与経路は、 治療に際し最も効果的なものを使用する のが望ましく、 経口投与、 あるいは口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内およ ぴ静脈内等の非経口投与をあげることができるが、 静脈内投与が好ましい。 経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等があげられる。 例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレング リコ一ル等のダリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油などの油類、 p —ヒド ロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ペパーミント 等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン、 ァ ルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシウム、 タルク等の滑沢剤、 ポリピニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて 製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。 例 えば、 注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 あるいは両者の混合物からなる担体等 を用いて調製する。 座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用 いて調製される。 また、 噴霧剤は該阻害物質そのもの、 ないしは受容者の口腔お よび気道粘膜を刺激せず、 かつ該阻害物質を微細な粒子として分散させ吸収を容 易にさせる担体等を用いて調製する。 担体として具体的には乳糖、 グリセリン等 が例示される。 該阻害物質および用いる担体の性質により、 エアロゾル、 ドライ パウダー等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経口剤で添 加剤として例示した成分を添加することもできる。
本発明によれば、 哺乳動物に対し、 IGF- 1および IGF- I Iの活性を阻害する物 質の有効量と、 抗腫瘍活性を有する物質の有効量とを組み合わせて投与すること を特徴とする、 癌の治療方法、 ならびに、 IGF- 1および IGF- I Iの活性を阻害す る物質の有効量と、 抗腫瘍活性を有する物質の有効量とを、 同時に又は逐次的に 投与することを特徴とする、 癌の治療方法もまた提供される。
ここで、 「哺乳動物」 とは、 癌を有するヒト、 ィヌ、 ネコ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥ シ、 ゥマ、 ブ夕等の哺乳動物をいい、 「有効量」 とは、 増殖中の癌細胞に対する 上記物質の投与によって、 癌細胞の増殖の停止、 腫瘤サイズの縮小又は消失をも たらす量をいう。 I I . 本発明の癌治療用医薬に使用する抗体または抗体断片の調製
以下に、 本発明で使用される、 IGF-Iおよび IGF- I Iに特異的に結合し、 かつ IGF-Iおよび IGF-I Iの活性を阻害する物質の一つである、 IGF- 1および IGF- I I に特異的に結合し、 かつ IGF- 1および IGF-I Iの活性を阻害する抗体または抗体 断片の作製方法ならびに活性評価について記す。
1. IGFに対するハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体の作製
(1) 抗原の調製
IGFをコードする cDNAを含む発現べクタ一を大腸菌、 酵母、 昆虫細胞、 動物 細胞などに導入、 発現させ、 組換え型 IGF蛋白質を得、 これを抗原に用いること ができる。 あるいは、 IGF部分配列を有する合成ペプチドを抗原に用いることも できる。
抗原用部分ペプチドとしては、 5〜30 残基程度の蛋白質部分配列が選択される D 変性していない天然の構造を有している状態の該蛋白質を認識する抗体を取得す るためには、 立体構造上蛋白質の表面に存在している部分配列を抗原ペプチドと して選択する必要がある。 立体構造上蛋白質表面に存在する部分は、 ジエネティ ック "マック （Genetyx Mac) など市販の蛋白質配列解析ソフトを用い、 親水性 の高い部分配列を予測することで推測することができる。 すなわち、 一般的に親 水性の低い部分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、 親水性の高い 部分は蛋白質表面に存在する場合が多いためである。 また、 蛋白質の N末端、 C 末端は蛋白質表面に存在する場合が多い。 しかしながら、 このように選択した部 分べプチドが目的通りの抗体を確立する抗原となるとは限らない。
部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、 システィンを末端に付加する。 蛋 白質の内部配列を部分ペプチドとして選択した場合には、 必要に応じペプチドの N末端はァセチル化、 C末端はアミド化する。 部分ペプチドは一般的な液相、 固 相ペプチド合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、 またはそれらに準じる 方法によって合成することができる （The Pep t ides, Analys is, Synthes i s, Bi o l ogy, Vo l. 1, 1979 ; Vol. 2, 1980 ; Vol. 3, 1981, Academic Press ; ぺプ チド合成の基礎と実験、 丸善、 1985 ; 続医薬品の開発、 第 14 巻、 ペプチド合成、 廣川書店、 1991; International Journal of Peptide &Protein Research, 35, 161-214, 1990) 。 また、 自動ペプチド合成機を用いることもできる。 ペプチド 合成機によるペプチドの合成は、 島津製作所製ペプチド合成機、 Applied
Biosystems, In 社 （以下、 ABI社と表記する） 製ペプチド合成機、 Advanced ChemTech Inc.社 （以下、 ACT社と表記する） 製ペプチド合成機などの市販のぺ プチド合成機上で、 適当に側鎖を保護した N«-Fmoc -アミノ酸あるいは Να - Boc-アミノ酸などを用い、 それぞれの合成プログラムに従って実施することがで きる。
原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、 ABI社、 島津製作所、 国産化学 (株） 、 Nova Biochem社、 渡辺化学 （株） 、 ACT社またはペプチド研究所 （株） などから入手することができる。 また、 原料となる保護アミノ酸、 保護有機酸、 保護有機アミンは報告されている合成法に従って、 あるいはそれに準じて合成す ること力 sできる （The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press; ペプチド合成の基礎と実 験、 丸善、 1985；続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 廣川書店、 1991; International Journal of Peptide ^Protein Research, 35, 161-214, 1990) 。
(2) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ラビットなどハイ プリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなるものでもよい。 下記に、 マ ウスおよびラットを用いる例について説明する。
3〜20週令のマウスまたはラットに、 上記 1 (1) で調製した抗原を免疫し、 その動物の脾臓、 リンパ節、 末梢血より抗体産生細胞を採取する。 免疫は、 動物 の皮下、 静脈内または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与する ことにより行う。 アジュバントとしては、 フロインドの完全アジュバント
(Co plete Freund" s Adjuvant) または、 水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ヮ クチンなどがあげられる。 また、 ゥシ血清アルブミン （以下、 BSAと表記する） や Keyhole Limpet Hemocyanin (以下、 KLHと表記する） などのキャリア蛋白質 とコンジュゲートを作製し、 これを免疫原として用いることができる。 各抗原の 投与後 3 〜7日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血し、 抗原とし て用いた hlGFに対する反応性を ELISAなどで確認し、 その血清が十分な抗体価 を示したマウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。 抗原の最終投与後 3 〜7 日目に、 免疫したマウスまたはラットより公知の方法 （Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) に準じて脾臓など を摘出し、 抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを融合させる。
(3) 骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、 マウスから得られた株化細胞である 8 -ァザグァニン耐 性骨髄腫細胞株 P3- X63Ag8- Ul (P3-U1) (European Journal of Immunology, 6, 511-519, 1976) 、 SP2/0- Agl4 (SP-2) (Nature, 276, 269-270, 1978) 、 P3- X63-Ag8653 (653) (Journal of Immunology, 123, 1548-1550, 1979) 、 P3- X63-Ag8 (X63) (Nature, 256, 495-497, 1975) など、 in vi troで増殖可能な 骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい。 これらの細胞株の培養および継代に ついては公知の方法 (Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) に従い、 細胞融合時までに 2x 107個以上の細胞数を確保す る。
(4) 細胞融合
上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、 ポリエチレング リコール- 1000 (以下、 PEG- 1000と表記する） などの細胞凝集性媒体を加え、 細 胞を融合させ、 培地中に懸濁する。 細胞の洗浄には Modified Eagle's Medium (以下、 MEMと表記する） または Phosphate Buffered Saline (以下、 PBSと表 記する） などを用いる。 また、 融合細胞を懸濁する培地としては、 目的の融合細 胞のみを選択的に得られるように、 HAT培地 {通常培地 [RPMI- 1640培地に 1.5mMグルタミン、 50 M 2_メルカプトエタノール、 10 g/mLジェンタマイシン および 10% 牛胎児血清 （以下、 FBSと表記する） を加えた培地] に 0. lmM ヒポ キサンチン、 15 M チミジンおよび 0· 4μΜ アミノプテリンを加えた培地） を用 いる。
培養後、 培養上清の一部を取り、 ELISAにより抗原蛋白質に反応し、 非抗原蛋 白質に反応しないサンプルを選択する。 次いで、 限界希釈法により単一細胞化を 行い、 ELISAにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体 産生ハイプリ ドーマとして選択する。
(5) ハイプリ ドーマの選択
抗 WGFモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマの選択は、 公知の方法 (Ant ibod ies-A Laboratory Manual, Cold Spr ing Harbor Laboratory, 1988) に 従い、 以下に述べる ELISAにより行う。 これらの方法により、 後述する抗 hIGF キメラ抗体、 抗 hIGF CDR移植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換 株の培養上清中に含まれる抗体あるいはすべての精製抗体の結合活性を測定する ことができる。
ELI SA
抗原を 96穴 ELISAプレートに固定化し、 ハイプリドーマなどの培養上清ある いは精製抗体を第一抗体として反応させる。 第一抗体反応後、 プレートを洗浄し て第二抗体を添加する。 第二抗体としては、 第一抗体を認識することができる抗 体を、 ピオチン、 酵素、 化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗 体を用いる。 具体的にはハイプリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、 第二抗体としてはマウス抗体を認識できる抗体を用いる。 反応後、 第二抗体の標 識物質に応じた反応を行ない、 抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産 生するハイプリ ドーマとして選択する。
当該ハイブリドーマの具体例としては、 ハイブリドーマ KM1468などがあげら れる。 ハイプリ ドーマ KM1468は、 平成 1 4年 3月 2 6日付けで独立行政法人産 業技術総合研究所 特許生物寄託センター （茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 郵便番号 3 0 5— 8 5 6 6 ) に FERM BP- 7978として寄託されている。
(6) モノクローナル抗体の精製
0. 5mLのプリスタン （2, 6, 10, 14 -テトラメチルペン夕デカン） を腹腔内投 与し、 2 週間飼育した 8〜10週令のマウスまたはヌードマウスに、 1 (4) で得ら れた抗 hIGFモノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマ 胞 5 X 10S〜2 X 107細胞/匹 を腹腔内に注射する。 10〜2 1 日間でハイプリドーマは腹水癌化する。 該マウス またはヌードマウスから腹水を採取し、 遠心分離、 40〜50% 飽和硫酸アンモニゥ ムによる塩析、 力プリル酸沈殿法、 DEAE- セファロースカラム、 プロテイン A - カラムあるいはセル口ファイン GSL2000 (生化学工業社製） のカラムなどを用い て、 IgG あるいは IgM画分を回収し、 精製モノクローナル抗体とする。
精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、 マウスモノクローナル抗体夕 ィピングキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて 行うことができる。 蛋白質濃度は、 ローリー法あるいは 280ηπιでの吸光度より算 出することができる。
抗体のサブクラスとは、 クラス内のアイソタイプのことで、 マウスでは、 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 ヒトでは、 IgGK IgG2、 IgG3、 IgG4があげられる。
(7) モノクローナル抗体の活性評価
(7-1) hlGFへの結合活性評価
培養上清中あるいは精製した抗 hlGFモノクローナル抗体の hlGFに対する結合 活性は、 上記 1 (5) の ELISAおよび表面プラズモン共鳴 （Journal of
I讓 unol ogical Methods, 145, 229-240, 1991) などにより測定することができ る。 また、 hlGFおよび hlGFの部分ペプチドを用いた競合 ELISAにより、 hlGFと の反応性および抗原ェピトープを解析することができる。 抗体が hlGFの立体構 造を認識しているか否かは、 通常行われる立体構造的解析法、 あるいは種々の免 疫学的測定法を組み合わせることにより、 推測することができる。 立体構造解析 法としては、 例えば、 X線結晶解析、 核磁気共鳴法などがあげられる。 種々の免 疫学的測定法を組み合わせる方法としては、 例えば、 非変性状態の抗原に対する ELISA法と変性状態の抗原に対する ELISA法を組み合わせる方法があげられる。 このとき、 非変性状態の抗原にのみ反応性を示す抗体は、 抗原の立体構造を認識 している可能性が高いものと推測できる。 非変性状態の抗原に対する ELISA法と は、 液層中で非変性抗原と抗体を反応させる ELISA法などがあげられる。 変性状 態の抗原に対する ELISA法としては、 抗原がもとの立体構造を保持していない状 態で抗体を反応させる ELISA法であればいずれでもよく、 例えば、 疎水性の反応 プレート上に直接固定化した抗原や、 適当な長さに消化した部分ペプチドなどに 対する ELISA法があげられる。
本発明で使用される抗体は、 該結合活性測定法または競合 ELISAにより、 hIGF-Πに対する結合活性と MGF- 1に対する結合活性とを有する抗体を選択す ることにより取得することができる。 また、 hIGF依存的な増殖を示す細胞株に対する影響を検討することにより、 in vi t roにおける MGFの活性を阻害する活性を測定することができる。 hIGF - 1 または hIGF- I I依存的な増殖を示す細胞株としては、 ヒト乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HTB-22) 、 ヒト大腸癌細胞株 HT- 29 (ATCC HTB-38) などがあげられる。 さらに、 マウスなどの動物を用いて hIGF依存的な細胞増殖測定系を確立し、 該測定系に対する影響を検討することにより、 in vivoにおける hIGFの活性を 阻害する活性を測定することができる。
2. IGFに対するヒト以外の動物のポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体は、 上記 1. (2)に示された方法で免疫を施した動物のうち、 その血清が十分な抗体価を示した動物の血清から調製することができる。
即ち、 該動物から回収した血液から遠心分離法により分画した血清、 あるいは 該血清から常法に従って免疫グロプリン画分を精製し、 ポリクローナル抗体を調 製することができる。 該ポリクローナル抗体の活性は、 上記 1. (7)に記載の方法 により、 抗原に対する結合活性を評価することができる。
3. ヒト化抗体の作製
(1) ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、 ヒト抗体の CHおよび Zまたは CLをコ一 ドする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればいかなるものでも よい。 ヒト化抗体発現用ベクターは、 動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CH および CLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築する ことができる。
ヒ卜抗体の C領域は任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、 例えば、 ヒト抗体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域 （以下、 liC r lと表記する） および ヒト抗体の L鎖の/ cクラスの C領域 （以下、 hC Kと表記する） などがあげられる。 ヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子としてはェキソンとィントロンから なる染色体 DNAを用いることができ、 また、 cDNAを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、 ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組 込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 PAGE 107 (Cytotechnol ogy, 3, 133-140, 1990) 、 pAGE103 (Journal of Biochemis t ry, 101, 1307-1310, 1987) 、 pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984) 、 pKCR (Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America, 78, 1527-1531, 1981) 、 pSGl /3 d2-4 (Cyto technology, 4, 173-180, 1990) などがあげられる。 動物細胞用発現ベクターに用いるプロモー ターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーターとェンハンサ一
(Journal of Biochemis try, 101, 1307-1310, 1987) 、 モロニ一マウス白血病 ウィルスの LTRプロモーターとェンハンサー （Biochemical ^Biophys ical
Research Co匪 unicat ions, 149, 960-968, 1987) 、 ィムノグロブリン H鎖のプ 口モーター （Ce l I, 41, 479-487, 1985) とェンハンサー （Cel l, 33, 717-728, 1983) などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクタ一は、 抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在 するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ （以下、 タンデム型と表 記する） のどちらでも用いることができるが、 ヒト化抗体発現ベクターの構築の 容易さ、 動物細胞への導入の容易さ、 動物細胞内での抗体 H鎖および L鎖の発現 量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの 方が好ましい (Journal of Immunological Methods, 167, 271-278, 1994) 。 夕 ンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、 PKANTEX93 (W097/10354) 、
PEE18 (Hybridoma, 17, 559-567, 1998) などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、 ヒト型キメラ抗体およびヒト型 CDR移 植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
(2) ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得およびアミノ酸配 列の解析
ヒト以外の動物の抗体、 例えば、 マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以下のようにして取得する。
マウス抗体などを産生するハイプリドーマより mRNAを抽出し、 cDNAを合成す る。 合成した cDNAをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニン グして cDNAライブラリーを作製する。 ί亥ライブラリーより、 マウス抗体の C領 域部分あるいは V領域部分をプローブとして用い、 VHをコードする cDNAを有す る組換えファージあるいは組換えプラスミドおよび VLをコードする cDNAを有す る組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。 組換えファー ジあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体の VHおよび VLの全塩基 配列を決定し、 塩基配列より VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラット、 ハムスター、 ラビットなど、 ハイ プリ ドーマを作製することが可能であれば、 いかなるものも用いることができる。 ハイプリドーマから全 Aを調製する方法としては、 チォシアン酸グァニジン 一トリフルォロ酢酸セシウム法 （Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987) 、 また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、 オリゴ（d T)固定化セルロース力 ラム法 (Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989) などがあげられる。 また、 ハイプリドーマから mRNAを 調製するキットとしては、 Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 社製） 、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社製） などがあげられる。
c丽 Aの合成および cDNAライブラリ一作製法としては、 常法 （Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34) 、 あるレ は市販のキット、 例えば、 Super Script™Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製) や ZAP - cDNA Synthesis Kit
(Stratagene社製） を用いる方法などがあげられる。
cDNAライブラリーの作製の際、 ハイプリドーマから抽出した mRNAを鍀型とし て合成した cDNAを組み込むベクターは、 該 cDNAを組み込めるベクターであれば いかなるものでも用いることができる。 例えば、 ZAP Express (Strategies, 5, 58-61, 1992) 、 pBluescript II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989) 、 AZAP II (Stratagene社製） 、 AgtlO、 Agtll (DNA Cloning: A
Practical Approach, I, 49, 1985) 、 Lambda BlueMid (Clontecli社製） 、 λ ExCelK pT7T3 18U (Pharmacia社製） 、 cD2 (Molecular &Cellular Biology, 3, 280-289, 1983) および pUC18 (Gene, 33, 103-119， 1985) などのファージ あるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリ一を 導入する大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、 発現および維持できるも のであればいかなるものでも用いることができる。 例えば、 XU- Blue MRF'
(Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992) 、 C600 (Genetics, 59, 177-190, 1968) 、 Y1088、 Y1090 (Science, 222, 778-782, 1983) 、 腸 22
(Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983) 、 K802 (Journal of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966) および JM105 (Gene, 38, 275-276, 1985) などが用いられる。
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAクローンの選択法としては、 放射性同位元素あるいは蛍光標識したプロ一 ブを用いたコロニー ·ハイブリダィゼーション法あるいはプラーク ·ハイブリダ ィゼーシヨン法 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989) により選択することができる。 また、 プラ イマ一を調製し、 mRNAから合成した cDNAあるいは cDNAライブラリーを錶型と して、 Polymerase Chain Reaction (以下、 PCR法と ¾記する ； Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34) により VH および VLをコードする cDNAを調製することもできる。
上記方法により選択された cDNAを、 適当な制限酵素等で切断後、 pBluescript SK (-) (Stratagene社製） などのプラスミドベクターにクローニングし、 通常用 いられる塩基配列解析方法、 例えば、 ジデォキシ法 （Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463- 5467, 1977) などの反応を行い、 塩基配列自動分析装置 ABI PRISM 377 (ABI社 製） などを用いて解析することで該 c蘭 Aの塩基配列を決定することができる。 決定した塩基配列から VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、 既知の抗体の VHおよび VLの全アミノ酸配歹1 J (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991) と比較することにより、 取得した cDNAが分泌のためのシグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全な アミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。 シグナル配列を含む 抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列に関しては、 既知の抗体の VHおよび VLの全アミノ酸配歹1 J (Seauences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Heal th and Human Services, 1991) と比較することにより、 シグナル配 列の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、 さらにはそれらが属するサブグ ループを知ることができる。 また、 VHおよび VLの各 CDRのアミノ酸配列につい ても、 既知の抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列 （Seduences of Prote ins of Immunological Interest, US Dept. Heal th and Human Services, 1991) と比較 することによって見出すことができる。 .
さらに、 VHおよび VLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、 例 えば、 SWISS- PR0Tや PIR- Prote inなどに対して BLAST法 (Journal of
Molecul ar Biology, 215, 403-410, 1990) などの配列の相同性検索を行い、 配 列の新規性を検討することができる。
(3) ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記 2 (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクローニングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができ る。 例えば、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、 ヒト 以外の動物の抗体の VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の CHおよび CLの 5'末端側の塩基配列とから成り、 かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に 有する合成 DNAとそれぞれ連結し、 それぞれを上記 2 (1) に記載のヒト化抗体 発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが 適切な形で発現するようにクローニングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構 築することができる。 また、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを含むプラスミドを銪型として、 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を有 するプライマーを用いて PCR法により VHおよび VLをコードする cDNAを増幅し、 それぞれを上記 2 (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよ び CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクロー二 ングし、 ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
(4) ヒト型 CDR移植抗体の V領域をコ一ドする cDNAの構築
ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、 以下のようにして 構築することができる。 まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体の VHおよび VLの FRのァミノ酸配列を 選択する。 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列としては、 ヒト抗体由 来のものであれば、 いかなるものでも用いることができる。 例えば、 Pro te in Dat a Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体の VHおよび VLの FR のアミノ酸配列、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サブグループの共通アミノ 酸酉己歹 (I (Sequences of Prote ins of Immunological Int eres t, US Dep t. Heal th and HumanServices, 1991) などがあげられるが、 その中でも、 十分な活性を有 するヒト型 CDR移植抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性 （少なくとも 60%以 上） を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。 次に、 選択したヒト抗体 の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を移植し、 ヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのアミ ノ酸配列を設計する。 設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られ るコドンの使用頻度 (Seauences of Prote ins of Immunol ogical Interes t, US Dept. Heal th and Human Services, 1991) を考慮して塩基配列に変換し、 ヒト 型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。 設計した塩基配列に基づき、 100塩基前後の長さからなる数本の合成丽 Aを合成 し、 それらを用いて PCR法を行う。 この場合、 PCRでの反応効率および合成可能 な DNAの長さから、 VH、 VLとも 6本の合成 DNAを設計することが好ましい。
また、 両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入 することで、 上記 2 (1) で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクロ一 ニングすることができる。 PCR反応後、 増幅産物を pBluescript SK (-）
(St rat agene社製） などのプラスミドにクローニングし、 上記 2 (2) に記載の 方法により、 塩基配列を決定し、 所望のヒト型 CDR移植抗体の VHおよび VLのァ ミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取得する。
(5) ヒト型 CDR移植抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型 CDR移植抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRの みをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、 その抗原結合活性は元 のヒ卜以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている (BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991) 。 この原因としては、 元のヒト以外の動 物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみならず、 FRのいくつかのアミノ酸残基が 直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与しており、 それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴い、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRの異なるアミノ酸残基へと変 化してしまうことが考えられている。 この問題を解決するため、 ヒト型 CDR移植 抗体では、 ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列の中で、 直接抗原との 結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、 抗体 の立体構造を維持し、 間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定 し、 それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、 低 下した抗原結合活性を上昇させることが行われている （BI0/TECHN0L0GY， 9， 266-271, 1991) 。 ヒト型 CDR移植抗体の作製においては、 それら抗原結合活性 に関わる FRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、 最も重要な点であ り、 そのために X線結晶解析 (Journal of Molecul ar Biology, .112, 535-542, 1977) あるいはコンピューターモデリング （Prote in Engineering, 7, 1501- 1507, 1994) などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。 これ ら抗体の立体構造の情報は、 ヒト型 CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をも たらして来たが、 その一方、 あらゆる抗体に適応可能なヒト型 CDR移植抗体の作 製法は未だ確立されておらず、 現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を 作製し、 それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必 要である。
ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸残基の改変は、 改変用合成 DNAを用 いて上記 2 (4) に記載の PCR法を行うことにより、 達成できる。 PCR後の増幅産 物について上記 2 (2) に記載の方法により、 塩基配列を決定し、 目的の改変が 施されたことを確認する。
(6) ヒト型 CDR移植抗体発現ベクターの構築
上記 2 (1) に記載のヒト化抗体発現用べクタ一のヒト抗体の CHおよび CLを コードする遺伝子の上流に、 上記 2 (4) および （5) で構築したヒト型 CDR移植 抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクローニングし、 ヒト型 CDR移植抗体 発現ベクターを構築することができる。 例えば、 上記 2 (4) および （5) でヒト 型 CDR移植抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合成 MAのうち、 両端に位 置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、 上記 2 (1) に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードす る遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることがで きる。
(7) ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、 上記 2 (3) および （6) に記載のヒト化抗体発現ベクター、 あるいはそれらを改変し た発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。 発現べク ターを導入する宿主細胞としては、 ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができるが、 その発現量の高さから、 COS- 7細胞 (ATCC CRL1651) が一般に用いられる (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991) 。 COS- 7細胞への発現べクタ一の導入法としては、 DEAE-デキストラン法 (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991) 、 リポフエクシヨン法 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United Statesof America, 84, 7413-7417, 1987) などがあげ られる。 発現べクタ一の導入後、 培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合 活性は ELISA (Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Chapter 14, 1988;Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice, Academic Press Limited, 1996) などにより測定できる。
(8) ヒ卜化抗体の安定発現
上記 2 (3) および （6) に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に 導入することによりヒ卜化抗体を安定に発現する形黉転換細胞を得ることができ る。 宿主細胞への発現べクタ一の導入法としては、 エレクト口ポレーシヨン法 (Cytotec nology, 3, 133-140, 1990) などがあげられる。 ヒト化抗体発現べク ターを導入する宿主細胞としては、 ヒト化抗体を発現させることができる宿主細 胞であれば、 いかなる細胞でも用いることができる。 例えば、 マウス SP2/0 - Agl4細胞 (ATCC CRL1581) 、 マウス P3X63- Ag8.653細胞 (ATCC CRL1580) 、 ジ ヒドロ葉酸還元酵素遺伝子 （以下、 dMrと表記する） が欠損した CH0細胞 (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 4216-4220, 1980) 、 ラット YB2/3HL. P2. Gl 1.16Ag.20細胞 .
(ATCC CRL1662, 以下、 YB2/0細胞と表記する） などがあげられる。
発現べクタ一の導入後、 ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、 特開平 2 - 257891に開示されている方法に従い、 G418 sulfate (以下、 G418と表記す る） などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。 動 物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地 （日水製薬社製） 、 GIT培地 （日本製 薬社製） 、 EX- CELL302培地 (JRH社製) 、 IMDM (GIBC0 BRL社製） 、 Hybridoma- SFM (GIBC0 BRL社製） 、 またはこれら培地に FBSなどの各種添加物を添加した 培地などを用いることができる。 得られた形質転換細胞を培地中で培養すること で培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。 培養上清中のヒト化 抗体の発現量および抗原結合活性は、 ELISAにより測定できる。 また、 形質転換 細胞は、 特開平 2- 257891に開示されている方法に従い、 dMr増幅系などを利用 してヒ卜化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、 形質転換細胞の培養上清よりプロテイン Aカラムを用いて精製 すること力 sできる (Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) 。 また、 その他に通常、 蛋白質の精 製で用いられる精製方法を使用することができる。 例えば、 ゲル濾過、 イオン交 換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、 精製することがで きる。 精製したヒト化抗体の H鎖、 L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、 ポリ アクリルアミドゲル電気泳動 （以下、 PAGEと表記する ： Nature, 227, 680-685, 1970) やウエスタンブロッテイング法 （Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996) などで測定するこ とができる。
(9) ヒト化抗体の活性評価
ヒト化抗体の活性評価は、 上記 1 (7)と同様にして行うことができる。 4. 抗体断片の作製
抗体断片は、 上記 1および 2に記載の抗 hlGF抗体をもとに遺伝子工学的手法 あるいは蛋白質化学的手法により、 作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、 目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 動 物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、 精製を行 うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、 ペプシン、 パパインなどの蛋白質分解酵素を用い た部位特異的切断、 精製などの方法があげられる。
抗体断片として、 Fab、 F(ab')2、 Fab'、 scFv、 diabody、 dsFv、 CDRを含むぺ プチドの製造法について以下に具体的に説明する。
(1) Fabの作製
Fabは、 蛋白質化学的には IgGを蛋白質分解酵素パパィンで処理することによ り、 作製することができる。 パパインの処理後は、 元の抗体がプロテイン A結合 性を有する IgGサブクラスであれば、 プロテイン Aカラムに通すことで、 IgG分 子や Fc断片と分離し、 均一な Fabとして回収することができる （Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995) 。 プロテイン A 結合性を持たない IgGサブクラスの抗体の場合は、 イオン交換クロマトグラフィ 一により、 Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる
(Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995) 。 また、 Fabは遺伝子工学的には、 多くは大腸菌を用いて、 また、 昆虫細胞や動物 細胞などを用いて作製することができる。 例えば、 上記 2 (2) 、 2 (4) および 2
(5) に記載の抗体の V領域をコードする DNAを、 Fab発現用ベクターにクロー ニングし、 Fab発現ベクターを作製することができる。 Fab発現用ベクターとし ては、 Fab用の]) NAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いるこ とができる。 例えば、 IT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988) などがあげら れる。 Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリブラズム に Fabを生成蓄積させることができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用いられる リフォールデイング法により、 活性のある Fabとすることができ、 また、 ペリプ ラズムに発現させた場合は、 培養上清中に活性を持った Fabが漏出する。 リフォ 一ルディング後あるいは培養上清からは、 抗原を結合させたカラムを用いること により、 均一な Fabを精製することができる （Antibody Engineering, A
Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992) 。
(2) F(ab')2の作製
F(ab')2は、 蛋白質化学的には IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理すること により、 作製することができる。' ペプシンの処理後は、 Fabと同様の精製操作に より、 均一な F(ab')2として回収することができる （Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995) □ また、 下 記 3 (3) に記載の Fab'を o-PDMやビスマレイミドへキサンなどのようなマレイ ミドで処理し、 チォエーテル結合させる方法や、 DTNB[5, 5'- dithiobis (2- nitrobenzoic acid)]で処理し、 S-S結合させる方法によっても作製することが できる （Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996) 。
(3) Fab'の作製
Fab'は、 上記 3 (2) に記載の F(ab')2をジチオスレィトールなどの還元剤で処 理して得ることができる。 また、 Fab'は遺伝子工学的には、 多くは大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。 例えば、 上記 2 (2) 、 2 (4) および 2 (5) に記載の抗体の V領域をコードする DNAを、 Fal)'発現用べ クタ一にクローニングし、 Fab'発現ベクターを作製することができる。 Fab'発現 用ベクターとしては、 Fab'用の DNAを組み込み発現できるものであればいかなる ものも用いることができる。 例えば、 PAK19 (BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992) などがあげられる。 Fab'発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あ るいはペリブラズムに Fab'を生成蓄積させることができる。 封入体からは、 通 常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、 活性のある Fab'とするこ とができ、 また、 ペリブラズムに発現させた場合は、 リゾチームによる部分消化、 浸透圧ショック、 ソニケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、 菌体外へ回収さ せることができる。 リフォールデイング後あるいは菌の破砕液からは、 プロティ ン Gカラムなどを用いることにより、 均一な Fab'を精製することができる
(Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996) 。
(4) scFvの作製 scFvは遺伝子工学的には、 ファージまたは大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細 胞などを用いて作製することができる。 例えば、 上記 2 (2) 、 2 (4) および 2
(5) に記載の抗体の V領域をコードする腿 Aを、 scFv発現用ベクターにクロー ニングし、 scFv発現べクタ一を作製することができる。 scFv発現用べクタ一と しては、 scFvの DNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いる ことができる。 例えば、 PCANTAB5E (Pharmac i a社製） 、 pHFA (Human
Ant ibod ies fflybridomas, 5, 48-56, 1994) などがあげられる。 scFv発現べク ターを適当な大腸菌に導入し、 ヘルパーファージを感染させることで、 ファージ 表面に scFvがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ること ができる。 また、 scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプ ラズムに scFvを生成蓄積させることができる。 封入体からは、 通常蛋白質で用 いられるリフォールデイング法により、 活性のある scFvとすることができ、 ま た、 ペリブラズムに発現させた場合は、 リゾチームによる部分消化、 浸透圧ショ ック、 ソニケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、 菌体外へ回収することがで きる。 リフォールデイング後あるいは菌の破砕液からは、 陽イオン交換クロマト グラフィーなどを用いることにより、 均一な scFvを精製することができる
(Ant ibody Engineering, A Prac t ical Approach, IRL PRESS, 1996) 。
(5) d iabodyの作製
d iabodyは遺伝子工学的には、 多くは大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細胞など を用いて作製することができる。 例えば、 上記 2 (2) 、 2 (4) および 2 (5) に 記載の抗体の VHと VLをリンカーがコードするアミノ酸残基が 8残基以下となる ように連結した DNAを作製し、 d i abody発現用ベクターにクローニングし、 d iabody発現ベクターを作製することができる。 d iabody発現用べクタ一として は、 d iabodyの DNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いるこ とができる。 例えば、 CANTAB5E (Pharmac i a社製) 、 pHFA (Human Ant ibod ies Hybridomas, 5, 48, 1994) などがあげられる。 d iabody発現ベクターを導入し た大腸菌の封入体あるいはペリブラズムに d i abodyを生成蓄積させることができ る。 封入体からは、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、 活性 のある di abodyとすることができ、 また、 ペリブラズムに発現させた場合は、 リ ゾチームによる部分消化、 浸透圧ショック、 ソニケーシヨンなどの処理により菌 を破碎し、 菌体外へ回収することができる。 リフォールデイング後あるいは菌の 破砕液からは、 陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、 均一 な scFvを精製することができる （Ant ibody Engineering, A Pract ical
Approach, I L PRESS, 1996) 。
(6) dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、 多くは大腸菌、 また、 昆虫細胞や動物細胞などを 用いて作製することができる。 まず、 上記 2 (2) 、 2 (4) および 2 (5) に記載 の抗体の VHおよび VLをコードする DNAの適当な位置に変異を導入し、 コードす るアミノ酸残基がシスティンに置換された DNAを作製する。 作製した各 DNAを dsFv発現用ベクターにクロー: ϋングし、 VHおよび VLの発現ベクターを作製する ことができる。 dsFv発現用ベクターとしては、 dsFv用の DNAを組み込み発現で きるものであればいかなるものも用いることができる。 例えば、 pULI9 (Prote in Engineer ing, 7, 697-704, 1994) などがあげられる。 VHおよび VLの発現べク ターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリブラズムに dsFvを生成蓄積 させることができる。 封入体あるいはペリブラズムから VHおよび VLを得、 混合 し、 通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、 活性のある dsFvと することができる。 リフォールデイング後は、 イオン交換クロマトグラフィーお よびゲル濾過などにより、 さらに精製することができる （Prote in Engineering, 7, 697-704, 1994) 。
(7) CDRペプチドの作製
CDRを含むぺプチドは、 Fmoc法あるいは tBoc法等の化学合成法によつて作製 することができる。 また、 CDRを含むペプチドをコードする DNAを作製し、 作製 した DNAを適当な発現用ベクターにクローニングし、 CDRぺプチド発現ベクター を作製することができる。 発現用ベクターとしては、 CDRペプチドをコードする 丽 Aを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。 例 えば、 LEX (Invi t rogen 社製） 、 AX4a+ (Invi t rogen 社製） などがあげられる。 発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、 封入体あるいはペリブラズムにを生成蓄 積させることができる。 封入体あるいはペリブラズムから CDRペプチドを得、 ィ オン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、 精製することができる
(Pro te in Engineering, 7, 697-704, 1994) 。
(8) 抗体断片の活性評価
精製した抗体断片の活性評価は、 上記 1 (7)と同様にして行うことができる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例によって本発明を更に具体的に説明するが、 これらの実施例は本 発明を何ら限定するものでない。
(実施例 1 ) 放射線と抗 IGF- 1モノクローナル抗体との併用効果の検討 類表皮癌細胞株 A431細胞 （ATCC CRL-1555) を 10cmディッシュで培養し、 70¾ コンフルェントになった状態で、 後記参考例 1で作製されたハイプリ ドーマ FERM BP- 7978により生産された IGF- 1および IGF-I Iに結合し、 IGF- 1および IGF-I Iの活性を阻害するモノクローナル抗体 （以下、 抗 IGFモノクローナル抗 体と称す） 腿 1468を最終濃度 100ng/mLになるようにディッシュに添加したのち、 4Gyの X線を照射した。 その際にあらかじめ X線照射しないディッシュも X線非 照射の細胞として残した。 X線照射 30分後に、 A431細胞をトリプシン処理によ りディッシュからはがし、 A431細胞を回収した。 さらに 10000個/ディッシュの 細胞密度で、 培養開始時に最終濃度 100ng/mLになるように抗 IGFモノクローナ ル抗体腿 1468を添加し 10日間培養した。 培養後、 形成されるコロニー数を測定 した。 コロニー数の相対値を下記表 1に示す。
表 1
Figure imgf000040_0001
線非照射に比べ、 L線照射単独ではコロニー数は約 50%に低下した。 抗 IGF モノクローナル抗体腿 1468を添加することで、 コロニー数は 20%以下に減少し た。 以上のことから、 放射線と抗 IGF-1モノクローナル抗体との併用は、 癌治療 に有用であることが確認された。
(実施例 2) 低分子薬剤と抗 IGF-1モノクローナル抗体との併用効果の検討 96ゥエル培養用プレートに、 段階的に希釈した薬剤と段階的に希釈した抗 IGF モノクロ一ナル抗体 KM1468とを 50 L/ゥエルずつ加えた。 さらに、 多発性骨髄 腫細胞株 LP-1細胞 （DSMZ ACC41) を 100/xL/ゥエル （10000個） ずつ加えて 3 7°Cで 3日間培養した。 培養後、 細胞増殖試薬 WST- 1 (Roche社製） を 20/iL/ゥ エルずつ加えて 37°Cで 2〜3時間培養し、 マイクロプレートリーダー M-SPmax250
(Molecular Devices社製） で 0D45Gを測定した。 薬剤の増殖阻害濃度は、 細胞 のみを添加したときの 0D450を 100%としたときの相対値で表した。 薬剤のみあ るいは抗体のみを添加したときの 5〜70%増殖阻害濃度 （IC5〜IC7()) 、 および薬 剤と抗体とを併用したときの IC5Q、 IC7。をそれぞれ算出し、 併用効果についてァ イソホログラム法 (International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics, 5， 85-91, 1979) を用いて解析した。 併用した薬剤としては、 メルフ ァラン、'二ムスチン、 ドキソルビシン、'ミトキサントロン、 ビノレルビン、 エト ポシド、 パクリタキセル、 デキサメタゾン、 5-フルォロウラシル、 メトトレキセ ート、 ゲムシタビン、 シスブラチン、 サリ ドマイド、 7-ェチル -10-ヒドロキシカ ンプトテシン （イリノテカンの活性体；以下、 SN- 38と略記する ； Cancer Resea rc , 50, 1715-1721, 1990) 、 ラパマイシン、 ラデイシコール、 17 -ァリルアミ ノ- 17 -デメトキシゲルダナマイシン （以下、 17AAGと略記する ； Cancer Cliemot erapy & Pharmacology, 42, 273-279, 1998) 、 UCN-01 (Journal of Antibioti cs, 40, 1782-1784, 1987) 、 PD173074 (EMB0 Journal, 17, 5896-5904, 1998) 、 ZD6474 (Cancer Research, 62, 4645-4655, 2002) 、 N— (3— amino—propyl)—N— [卜 (3-benzyl-7-chloro-4-oxo-3, 4-di ydro-Quinazol in-2-yl) -2-methyl-propyl] - 4-raet yl-benz amide (GlaxoSmi thKl ine社、 W001/98278, W003/070701) 、 N4 Quinolin-3-yl-N2- (3, 4, 5-trimethoxyphenyl) pyrimidine-2, 4 - diamine (Amgen 社、 W003/018021) をそれぞれ用いた。
低分子の薬剤と抗 IGFモノクローナル抗体との併用は、 いずれも癌治療に有用 であることが確認された。 (実施例 3) 低分子薬剤と抗 IGF- 1モノクローナル抗体との併用における投与方 法の検討 96ゥエル培養用プレートに、 多発性骨髄腫細胞株 LP-1細胞 （DSMZ ACC41) を IOO L/ゥェル （10000個） 播種し、 ドキソルビシンと抗 IGFモノクロ —ナル抗体 KM1468とを添加して、 37°Cで 3日間培養した。 ドキソルビシンと KM1468との培地への添加は、 以下の 3つの方法で行った。
方法 1 ： 1 日目にドキソルビシンのみを添加した培地 150 xL で細胞を培養し、 2日目と 3日目にドキソルビシンと KM1468とを添加した培地 200 zLで細胞を培 方法 2,： 1 日目に KM1468のみを添加した培地 150 iLで細胞を培養し、 2日目 と 3日目にドキソルビシンと KM1468とを添加した培地 200/zLで培養した。
方法 3 ： ドキソルビシンと KM1468とを含む培地 （1 日目の培地量は 150 iL、 2 日目と 3日目は各 200/ L) で 3日間、 細胞を培養した。
上述のいずれの方法において、 ドキソルビシンと KM1468の最終濃度が 1 mol/Lおよび 1 g/mLとなるように添加した。
培養後、 細胞増殖試薬 WST- 1 (Roche社製） を 20^17ゥエルずつ加えて で 2〜3時間培養し、 マイクロプレートリーダ一 M-SPmax250 (Molecular Devices社 製） で OD450を測定した。 薬剤処理後の生存細胞数は、 細胞のみを添加したとき の 0D450 を 100%としたときの相対値でそれぞれ表した。 結果を下記表 2に示す。
表 2
処理方法 細胞数相対値 ドキソルビシン単 40%
独
KM1468単独 49¾
方法 1 21¾ 処理方法 細胞数相対値 ドキソルビシン単 57%
独
KM1468単独 29¾
方法 2 19¾ 処理方法 細胞数相対値 ドキソルビシン単 44¾
独
KM1468単独 26¾
方法 3 ' 11% いずれ投与方法の場合においても、 単独より併用したときのほうが細胞の増殖 が強く阻害された。 以上より、 低分子の薬剤と抗 IGFモノクローナル抗体とのい ずれの投与方法においても、 癌治療に有用であることが確認された。
(参考例 1) 抗 hlGFモノクローナル抗体の作製
(1) 動物の免疫と抗体産生細胞の調製
組換え型 hIGF-I (R&D社製） は、 免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル 化 BSA (SIGMA社製） とのコンジユゲー卜を作製し、 免疫原とした。 すなわち、 2 回蒸留水に溶解したメチル化 BSAを、 メチル化 BSA : hIGF- 1=1 : 4 (重量比） にな るように 4°Cで混合し、 10秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。 その後、 連結 針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインド アジュバントと容量比 1 : 1で混合し、 免疫原 （以下、 メチル化 BSA - hIGF-Iと表 記する） とした。
5週令雌 SDラッ卜に、 完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調 製したメチル化 BSA - hIGF-I (hIGF- 1の 100 /i g相当量） を投与し、 2週間後より 不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を 1週間に 1回、 計 4回投与した。
眼底静脈叢より採血し、 その血清中の抗体価を参考例 1 (4) に示す結合 ELISA で調べ、 十分な抗体価を示したラットから最終免疫 3 日後に脾臓を摘出した。 脾臓を MEM培地 （日水製薬社製） 中で細断し、 ピンセットでほぐし、 遠心分離 ( 1200 rpm、 5分間） した後、 上清を捨て、 卜リス-塩化アンモニゥム緩衝液 (pH7. 65) で 1〜2分間処理し、 赤血球を除去し、 MEMで 3回洗浄し、 細胞融合 に用いた。
(2) マウス骨髄腫細胞の調製
8 -ァザグァニン耐性マウス骨髄腫細胞株 P3-U1を通常培地で培養し、 細胞融合 時に 2 X 107以上の細胞を確保し、 細胞融合に親株として供した。
(3) ハイプリドーマの作製
参考例 1 ( 1) で得られたラット脾細胞と （2) で得られた骨髄腫細胞とを 10 : 1 になるよう混合し、 遠心分離 （1200 rpm、 5分間） した後、 上清を捨て、 沈澱し た細胞に 37°Cで攪拌しながら、 102個のラット脾細胞あたり 0. 2〜 1. OmLの融合 培地 （2gの PEG- 1000、 2mLの MEM、 0. 7mLのジメチルスルホキシドの混液） を加 え、 1〜2分間毎に l〜2mLの MEMを数回加えた後、 さらに、 MEMを加えて全量が 50mLになるようにした。 遠心分離 （900 rpm、 5分間） した後、 上清を捨て、 緩 やかに細胞をほぐした後、 l OOmLの HAT培地に懸濁した。
この懸濁液を 96ゥエル培養用プレートに I OO L/ゥエルずつ分注し、 5%(；02ィ ンキュベー夕一中、 37°Cで 10〜14日間培養した。 この培養上清を参考例 1 (4) に示す結合 ELISAを用いて、 メチル化 BSA- hIGF- 1に反応して、 陰性対照である メチル化 BSA- BSA [BSAを用いて上記参考例 1 ( 1) と同様の反応を行い作製した コンジュゲート]に反応しないゥエルを選び、 さらに HT培地と通常培地に換え、 2回の単一細胞化を行い、 抗 hIGF- 1モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを 確立した。
その結果、 図 1に示した反応性を有する KM1468、 KM1469、 KM1470、 KM147 K KM1472および KM1473の 6クローンのハイプリ ドーマを取得した。 各ハイプリ ド 一マが産生する抗体のサブクラスを、 サブクラスタイピングキットを用いた ELISAにより検討した結果、 いずれも IgG2bであった。
(4) モノクローナル抗体の選択 （結合 ELISA)
ELISAプレートに固定化する抗原としては、 参考例 1 (1) で作製したメチル化 BSA-hIGF-Ιおよび陰性対照としてメチル化 BSA- BSAを用いた。 96ゥエル ELISA プレート （Greiner社製） に、 上述の抗原を hlGF- 1あるいは BSAの濃度として lO g/mLで 50 L/ゥエルで分注し、 4°Cでー晚放置して吸着させた。 PBSで洗浄 後、 1%BSAを含む PBS (以下、 BSA- PBSと表記する） を 100 iL/ゥエルで加え、 室 温で 1時間反応させて残存する活性基をブロックした。 BSA- PBSを捨て、 被免疫 ラット抗血清、 抗 hi GF-Iモノクローナル抗体産生ハイプリ ドーマの培養上清あ るいは精製した抗 hIGF- 1モノクローナル抗体を 50^17ゥエルで分注し、 室温で 2時間反応させた。 反応後、 各ゥエルを 0.05%Tween 20を含む PBS (以下、 Tween- PBSと表記する） で洗浄後、 4000倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ゥサ ギ抗ラット Ig抗体 （DAK0社製） を二次抗体として ゥエルで加えて室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween - PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2, 2' -アジノ- ビス （3-ェチルベンゾチアゾリン- 6-スルホン酸） アンモニゥムの 0.55gを 1Lの 0.1Mクェン酸緩衝液 （PH4.2) に溶解し、 使用直前に過酸化水素水を 1 /mLで 添加した溶液] を 50 1 ゥエルで加えて発色させ、 415皿の吸光度 （以下、 0D415と表記する） をプレートリーダ一 Emax (Molecular Devices社製） を用い て測定した。
(5) モノクローナル抗体の精製
プリスタン処理した 8週令 Balb/cヌード雌マウスに参考例 1 (3) で得られた ハイプリドーマクローンを 5〜20X 106細胞/匹でそれぞれ腹腔内注射した。 10〜 21 日後に、 ハイプリドーマが腹水癌化したマウスから、 腹水を採取 （l〜8mL/ 匹） し、 遠心分離 （3000 rpffl、 5分間） して固形分を除去した。 その後、 カプリ ル酸沈殿法 (Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, 1988) により IgG画分を精製し、 精製モノクローナル抗体とした。
(参考例 2 ) 抗 hIGFモノクローナル抗体の反応性の検討
(1) hIGF_Iの天然の立体構造に対する反応性 参考例 1 (3) で選択された抗 hlGFモノクローナル抗体の液相系における天然 の立体構造を保つ hlGF- 1に対する反応性を、 下記に示す競合 ELISAで調べた。 参考例 1 (4) に示した、 参考例 1 (1) で作製したメチル化 BSA- hlGF- 1を固定 化したプレートを準備し、 20/ g/jiiLより 5倍希釈で段階的に希釈した hlGF- 1を 502L/ゥエルで分注後、 抗 hlGFモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液
(KM1468:6. O /mL, KM1470:1.0 ιι g/ml, KM1471 :0· 16 g/mL、 KM1472:7.0 /i g/mL、 KM1473:1.2 g/mL) を 50 /L/ゥエルで分注し、 混合して室温で 2時間反 応させた。 反応後、 Tween_PBSで洗浄後、 4000倍に希釈したペルォキシダーゼ標 識ゥサギ抗ラット Ig抗体 （DAK0社製） を 50 iL/ゥエルで加えて室温で 1時間反 応させた。 反応後、 Tween - PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2， 2'-アジノ-ビス （3- ェチルベンゾチアゾリン- 6 -スルホン酸） アンモニゥムの 0.55gを 1Lの 0.1Mク ェン酸緩衝液 （PH4.2) に溶解し、 使用直前に過酸化水素水を I L/ΠΙしで添加し た溶液] を 50 L/ゥエルで加えて発色させ、 0D415をプレートリーダー Emax
(Molecular Devices社製） を用いて測定した。
図 2に示したように、 本発明の 6種の抗 hlGFモノクローナル抗体はいずれも hlGF- 1の天然の立体構造に反応性を示した。 また、 本系において、 最も高い感 度を示した腿 1468を用いた場合、 液相系に含まれる 16ng/mLまでの濃度の天然 の立体構造を有する hlGF- 1を検出可能であった。
(2) 抗 MGFモノクローナル抗体の hlGFファミリーに対する反応性
精製した抗 hlGFモノクローナル抗体 KM1468 (以下、 抗体 KM1468と記す） の hlGFに対する反応性を検討した。 図 3に、 参考例 1 (4) に示した結合 ELISAに より、 抗体 KM1468および市販の抗 hlGF- 1抗体である sml.2 (Upstate
biotechnology社製） の hlGF- 1との反応性を検討した結果を示した （抗体濃度 は、 30 g/mLから 3倍希釈で段階的に希釈） 。 ただし、 sml.2の場合は、 二次抗 体として 2000倍に希釈したペルォキシダ一ゼ標識ゥサギ抗マウス Ig抗体 （DAK0 社製） を用いた。 図 3に示したように、 いずれの抗体も抗体濃度依存的な hlGF- I結合活性を示したが、 その活性の強さは、 抗体 KM1468の方が高かった。
次に、 各抗体の hlGF- 1 に対する結合における hlGF- 1 (Pepro Tech EC社製） 、 hIGF-II (Pepro Tech EC社製） 、 ヒトインスリン （和光純薬社製） および mIGF - I (Pepro Tech EC 社製） による阻害活性を以下に示した競合 ELISA で検討した。 参考例 1 (4) に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、 4.0 zg/mL に希釈した各種抗体を 50 L/ゥエルで分注後、 20 zg/niLより 3倍希釈で段階的 に希釈した hIGF- 1あるいは hIGF- II、 または、 10 ^ g/mLより 5倍希釈で段階的 に希釈したヒトインスリンあるいは mlGF- 1を 50 L/ゥエルで分注し、 混合して 室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween- PBSで洗浄し、 KM1468の場合は、 4000 倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗ラット Ig抗体 （DAK0社製） 、 sml.2の場合は、 2000倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウス Ig抗 体 （DAK0社製） を 50 L/ゥエルで加えて室温で 1時間反応させた。 反応後、 . Tween- PBSで洗浄し、 ABTS基質液 [2， 2 '-アジノ-ビス （3-ェチルベンゾチァゾ リン- 6-スルホン酸） アンモニゥムの 0.55 を 1Lの 0.1Mクェン酸緩衝液
(pH4.2) に溶解し、 使用直前に過酸化水素水を 1 zL/mLで添加した溶液] を 50 L/ゥエルで加えて発色させ、 0D415をプレートリーダー Emax (Molecular
Devices社製） を用いて測定した。 結果は、 抗体のみを添加した時の 0D415を 100 として相対値 （％) で表示した。 結果を図 4に示した。 図 4に示したように、 抗体 KM1468の hIGF-Iに対する結合は、 hIGF- 1 (図 4A) および hIGF- II (図 4 B) で強く阻害され、 hIGF_Iによる結合の 50%阻害の濃度 （inhibition
concentration 50；以下、 K5Qと表記する） は約 0.3 xg/mL (約 39nM) 、 hIGF- IIによる IC5()は約 0.4 g/mL (約 58nM) と同程度の値を示した。 一方、 ヒトイ ンスリンおよび mlGF - 1では阻害は認められなかった。 以上の結果から、 抗体 腹 1468は、 hIGF- 1と hIGF- IIの両方に特異的、 かつ同程度の強さで反応するこ とが明らかとなった。 市販の抗 IGF- 1抗体である sml.2 の hIGF- 1に対する結合 は、 MGF-I (図 4A) により強く阻害され、 hIGF_II (図 4 B) による阻害活性 は弱かった。 sml.2の iilGF- 1による IC5()は約 1· 2 n g/mL (約 156nM) であったの に対し、 hIGF- IIにょる 1 5。は〉10 §/^ (>1.45 M) であった。 一方、 ヒト インスリンおよび ml GF-Iでは阻害は認められなかった。
(3) 抗 hIGFモノクローナル抗体の MGF依存性細胞増殖に対する影響
精製した抗体 KM1468の hIGF依存性細胞増殖に対する影響を検討した。 抗体と しては、 KM1468、 市販の抗 hIGF-I抗体である sml.2 (Upstate biotechnology ¾ 製） および市販の抗 hlGF- II抗体である S1F2 (Upstate biotechnology社製） を 用いた。
ヒト乳癌細胞株 MCF7 (ATCC HTB-22) 、 ヒト大腸癌細胞株 HT-29 (ATCC HTB- 38) あるいはヒト骨肉腫細胞株 MG - 63 (ATCC CRL-1427) を TF/BSA培地 [D- MEM/F - 12 (Gibco BRL社製） に 10 g/mLのヒトトランスフェリン （Gibco BRL社 製） 、 200^g/mLの BSAを添加した培地]で 0, 5〜1X105細胞/ mLに調製し、 96ゥ エル培養用プレートに lOO^L/ゥエルで分注した。 さらに、 TF/BSA培地で各種濃 度に希釈した MGF-I、 hIGF-IIあるいはヒトインスリンの各因子を 50/z L/ゥェ ルで、 TF/BSA培地で各種濃度に希釈した各抗体を 50/iL/ゥエルで添加し、 37°C、 5¾ C02インキュベータ一内で 5日間培養した。 培養後、 細胞増殖試薬 WST - 1
(Roche社製） を 20 L/ゥエルで分注し、 さらに、 37° (：、 5% C02インキュベータ 一内で 2.5〜4時間培養した後に、 0D450Mの吸光度 （以下、 OD450と表記する） をプレートリーダ一 Emax (Molecular Devices社製） を用いて測定した。
図 5Aには、 ヒト乳癌細胞株 MCF7 の各因子による増殖曲線を示した。 さらに、 図 5 Bには、 40ng/mLの hlGF- 1存在下、 図 5 Cには、 lOOng/mLの MGF- IIの存 在下、 図 5Dには、 100ng/mLのヒトインスリン存在下での、 各抗体添加時の増 殖を示した。 図 5に示したように、 KM1468は、 WGF-Iおよび hIGF - IIによる細 胞増殖を同程度に強く阻害し、 その活性は、 市販の抗 hIGF_I抗体である sml.2 および市販の抗！ IIGF- II抗体である S1F2よりも高かった。 一方、 ヒトインスリ ンによる増殖に対しては、 いずれの抗体も影響を与えなかった。 以上の結果は、 参考例 2 (2) の競合 ELISAで認められた各抗体の結合特異性と良く相関してお り、 また、 各抗体の結合により、 MGF-Iおよび hIGF-IIの活性が阻害されるこ とを明確に示したものである。
図 6Aには、 ヒト大腸癌細胞株 HT-29の各因子による増殖曲線を示した。 さら に、 図 6 Bには、 10ng/mLの hIGF-Ι存在下、 図 6 Cには、 10ng/mLの hlGF- IIの 存在下、 図 6Dには、 20ng/mLのヒトインスリン存在下での、 各抗体添加時の増 殖を示した。
図 6に示したように、 KM1468は、 MGF-Iおよび hIGF- IIによる細胞増殖を同 程度に強く阻害し、 その活性は、 市販の抗 WGF-I抗体である sml.2および市販 の抗 hIGF-Ι Ι抗体である S 1F2よりも高かった。 一方、 ヒ卜インスリンによる増 殖に対しては、 いずれの抗体も影響を与えなかった。 以上の結果は、 参考例 2
(2) の競合 ELI SAで認められた結合特異性と良く相関しており、 また、 各抗体 の結合により、 hlGF- 1および hlGF- I Iの活性が阻害されることを明確に示した ものである。 さらに、 図 6 Bの KM1468、 図 6 Cの KM1468および S 1F2を反応さ せた場合には、 hlGF- 1および hlGF-I Iを添加しない場合よりも細胞増殖が抑制 された。 このことから、 HT - 29細胞は、 自ら hlGF - 1および MGF - I Iを産生して 増殖しており、 その増殖効果も抗体の添加によって阻害できることが明らかとな つた。
図 7 Aには、 ヒト骨肉腫細胞株 MG- 63の各因子による増殖曲線を示した。 さら に、 図 7 Bには、 20ng/mLの hlGF- 1存在下、 図 7 Cには、 20ng/mLの WGF- I Iの 存在下、 図 7 Dには、 20ng/mLのヒトインスリン存在下での、 各抗体添加時の増 殖を示した。 図 7に示したように、 腿 1468は、 hIGF-Iおよび hlGF- I Iによる細 胞増殖を同程度に強く阻害し、 その活性は、 市販の抗 WGF- 1抗体である sml. 2 および市販の抗 WGF- I I抗体である S 1F2よりも高かった。 一方、 ヒトインスリ ンによる増殖に対しては、 いずれの抗体も影響を与えなかった。 以上の結果は、 参考例 2 (2) の競合 ELISA で認められた結合特異性と良く相関しており、 また、 各抗体の結合により、 各因子の機能が阻害されることを明確に示したものである。
(参考例 3 ) 抗 hlGFモノクローナル抗体の抗原認識部位の解析
(1) hIGF-Iの部分ペプチドの合成
W001/64754に記載の方法に従って、 hlGF- 1の部分ペプチドを合成した。 合成 したペプチドは、 GF-I の 1-18番目 （配列番号 1；以下、 pi- 18 と表記する） 、 14- 30番目 （配列番号 2 ;以下、 P 14-30と表記する） 、 24-35番目 （配列番号 3；以下、 p24 - 35と表記する） 、 29 - 41番目 （配列番号 4；以下、 p29 - 41と表記 する） 、 36- 47番目 （配列番号 5 ;以下、 p36- 47と表記する） 、 41- 56番目 （配 列番号 6 ;以下、 p4卜 56と表記する） 、 52-70番目 （配列番号 7；以下、 p52_70 と表記する） 、 53- 61番目 （配列番号 8 ;以下、 P53-61と表記する） 、 61-70番 目 （配列番号 9 ;以下、 p6卜 70と表記する） に相当するペプチドであり、 hlGF - 1 の全長を網羅するように設計した。 上記ペプチドにおいては、 内部に存在する
Cysについては、 Serあるいは Al aに置換した配列を合成した。 また、 4卜 56番 目に相当する配列については、 内部の Cysを有する配列 （配列番号 10；以下、 p4卜 56Cと表記する） も合成した。
(2) 抗 hIGFモノクローナル抗体の抗原認識部位の解析
上記 （1 ) で合成した各種ペプチドを用いて、 抗 WGFラット抗体 KM1468の抗 原認識部位の解析を以下に示す競合 ELISAで検討した。
参考例 1 (4) に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、 4. 0 g/mL に希釈した各種抗体を 50 L/ゥエルで分注後、 50 /z g/mLより 3倍希釈で段階的 に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、 あるいは hI GF_Iを 50 ^ L/ゥエルで分注し、 混合して室温で 1時間反応させた。 反応後、 Tween - PBS で洗浄後、 4000倍に希釈したペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗ラット Ig抗体
(DAK0社製） を ゥエルで加えて室温で 1時間反応させた。 反応後、
Tween- PBSで洗浄後、 ABTS基質液 [2， 2' -アジノ-ビス （3-ェチルベンゾチァゾ リン- 6 -スルホン酸） アンモニゥムの 0. 55gを 1Lの 0. 1Mクェン酸緩衝液
(pH4. 2) に溶解し、 使用直前に過酸化水素水を 1 L/mLで添加した溶液] を 50 L/ゥエルで加えて発色させ、 0D415をプレートリーダー Emax (Mo l ecu l ar Devi ces社製） を用いて測定した。 結果は、 抗体のみを添加した時の 0D415を 100 とした相対値 （％) で表示した。 結果を図 8に示した。 図 8に示したように、 KM1468の hIGF- 1に対する結合は、 hIGF-Ιにより濃度依存的に阻害されたが、 各 種ペプチドでは、 単独あるいは組合せに拘わらず、 阻害活性は認められなかった。 以上の結果は、 KM1468が、 hIGF-Iの単なるアミノ酸一次配列ではなく、 hIGF - 1 の立体構造を認識していることを強く示唆する結果である。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に組み入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明の癌治療用医薬は、 ィンスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン 様成長因子- I I (IGF- I I)の活性を阻害する物質と、 放射線照射又は抗腫瘍活性を 有する物質と組み合わせることにより、 それぞれを単独で投与する場合に比べて 癌治療効果を増強させることができる。 このような併用治療によれば、 単独で投 与する場合に比べて薬物の投与量を軽減できること、 患者の症状 （癌の種類、 癌 の重篤度） に応じて併用物質を選択することができること、 作用機序の異なる併 用物質を選択することにより治療期間の持続が図れること、 などの有利な効果が 得られる。

Claims

請求の範囲
1 - インスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質を含み、 放射線照射と併用して投与するための癌治療用医薬。
2. 放射線照射が、 癌治療用医薬の投与時または投与前後に、 単回または複数回 行われる、 請求項 1に記載の癌治療用医薬。
3. インスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およびィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを組み合わせてなる癌治療用医 薬。
4. インスリン様成長因子- 1 (IGF- 1)およびインスリン様成長因子 -II (IGF-II)の 活性を阻害する物質と抗腫瘍活性を有する物質とを、 同時に又は逐次的に投与す るための請求項 3に記載の癌治療用医薬。
5. インスリン様成長因子- 1 (IGF-I)およぴィンスリン様成長因子- II (IGF-II)の 活性を阻害する物質が、 以下の （a) 〜 （d) からなる群より選ばれる、 請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の癌治療用医薬。
(a) IGF- 1および IGF-IIに特異的に結合し、 IGF-Iおよび IGF- IIの活性を 阻害する抗体または抗体断片
(b) IGF-Iに特異的に結合し 、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF- II に特異的に結合し、 IGF-IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 を含む組成物
(c) IGF-Iに特異的に結合し 、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF- II に特異的に結合し、 IGF-IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 を組み合わせてなる組成物
(d) IGF-Iに特異的に結合し 、 IGF-Iの活性を阻害する抗体または抗体断片、 および IGF-II に特異的に結合し、 IGF-IIの活性を阻害する抗体または抗体断片 の複合体
6. 抗体がモノクローナル抗体である、 請求項 5に記載の癌治療用医薬。
7. モノクローナル抗体が、 ハイプリドーマ KM1468 (FERM BP-7978) より生産 されるモノクローナル抗体が結合するェピトープに結合するモノクローナル抗体 である、 請求項 6に記載の癌治療用医薬。
8 . 抗体断片が、 Fab、 Fab'、 F (ab' ) 2、 一本鎖抗体 （scFv) 、 二量体化可変領域 (D i abody) 、 ジスルフイ ド安定化可変領域 （dsFv) および CDRを含むペプチド からなる群から選ばれる抗体断片である、 請求項 5〜 7のいずれか 1項に記載の 癌治療用医薬。
9 . 抗腫瘍活性を有する物質が、 蛋白質または低分子の薬剤である請求項 1〜8 に記載の医薬。
1 0 . 蛋白質が、 抗体またはサイト力インである、 請求項 9に記載の医薬。
1 1 . 低分子の薬剤が、 丽 Aアルキル化剤、 DNA合成阻害剤、 白金製剤型 DNA架 橋剤、 代謝拮抗剤、 トポイソメラーゼ I阻害剤、 トポイソメラーゼ I I阻害剤、 チューブリン作用薬、 ホルモン拮抗薬、 ァロマ夕ーゼ阻害剤、 免疫調節剤、 免疫 抑制剤、 ステロイド型抗炎症剤、 非ステロイド型抗炎症剤、 抗ヒスタミン剤、 分 化誘導剤、 プロテオゾーム阻害剤、 チロシンキナーゼ阻害剤、 アデノシンデアミ ナ一ゼ阻害剤、 血管新生阻害剤、 ヒストンデァセチラーゼ阻害剤、 マトリックス メタ口プロテアーゼ阻害剤、 フアルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、 ビスホス ホネート製剤、 Hsp90阻害剤、 キネシン Eg5阻害剤、 セリンスレオニンキナーゼ 阻害剤ならびにこれらの化合物の誘導体からなる群から選ばれる薬剤である、 請 求項 9記載の医薬。
1 2 . 哺乳動物に対し、 インスリン様成長因子- UIGF-I)およびインスリン様成 長因子- I I (IGF-I I)の活性を阻害する物質の有効量を、 放射線照射と併用して投 与することを特徵とする、 癌の治療方法。
1 3 . 放射線照射が、 瘙治療用医薬の投与時または投与前後に、 単回または複数 回行われる、 請求項 1 2に記載の癌の治療方法。
1 4 . 哺乳動物に対し、 インスリン様成長因子- I (IGF_I)およびインスリン様成 長因子- I I (IGF-I I)の活性を阻害する物質の有効量と、 抗腫瘍活性を有する物質 の有効量とを組み合わせて投与することを特徴とする、 癌の治療方法。
1 5 . インスリン様成長因子- UIGF-I)およびインスリン様成長因子- I I (IGF- I I) の活性を阻害する物質の有効量と、 抗腫瘍活性を有する物質の有効量とを、 同時 に又は逐次的に投与することを特徴とする、 請求項 1 4に記載の癌の治療方法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010045315A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Dyax Corp. Use of igf-ii/igf-iie binding for the treatment and prevention of systemic sclerosis associated pulmonary fibrosis
US8318159B2 (en) 2008-12-12 2012-11-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
US8410058B2 (en) 2005-12-13 2013-04-02 Medimmune Limited Methods of using insulin-like growth factor antibodies to treat tumors
US8580254B2 (en) 2007-06-19 2013-11-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
US9498540B2 (en) 2013-03-15 2016-11-22 Novartis Ag Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof
US10377828B2 (en) 2013-03-07 2019-08-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005016970A2 (en) * 2003-05-01 2005-02-24 Imclone Systems Incorporated Fully human antibodies directed against the human insulin-like growth factor-1 receptor
CN101613409B (zh) * 2005-06-17 2014-06-04 英克隆有限责任公司 抗-PDGFRα抗体
CA2625773C (en) * 2005-10-14 2015-05-12 Fukuoka University Inhibition of interleukin-6 (il-6) receptor promotes pancreatic islet transplantation
BRPI0617664B8 (pt) * 2005-10-21 2021-05-25 Chugai Pharmaceutical Co Ltd uso de um anticorpo que reconhece a il-6 para a produção de uma composição farmacêutica para tratar o enfarte do miocárdio ou suprimir a remodelagem ventricular esquerda depois do enfarte do miocárdio
AR057582A1 (es) * 2005-11-15 2007-12-05 Nat Hospital Organization Agentes para suprimir la induccion de linfocitos t citotoxicos
EP1990060B1 (en) * 2006-01-27 2016-09-28 Keio University Therapeutic agents for diseases associated involving choroidal neovascularization
CA2641310C (en) * 2006-02-03 2013-08-20 Imclone Systems Incorporated Igf-ir antagonists as adjuvants for treatment of prostate cancer
WO2007116962A1 (ja) * 2006-04-07 2007-10-18 Osaka University 筋再生促進剤
CA2661024A1 (en) * 2006-08-28 2008-03-06 The Regents Of The University Of California Small molecule potentiator of hormonal therapy for breast cancer
TWI438208B (zh) * 2007-01-23 2014-05-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd 抑制慢性排斥反應之藥劑
US8642067B2 (en) 2007-04-02 2014-02-04 Allergen, Inc. Methods and compositions for intraocular administration to treat ocular conditions
US20110165145A1 (en) * 2008-05-09 2011-07-07 Dransfield Daniel T Igf-ii/igf-iie binding proteins
CA2728243C (en) * 2008-06-05 2020-03-10 National Cancer Center Il-6 inhibitor for suppressing neuroinvasion in pancreatic cancer
US20100316639A1 (en) 2009-06-16 2010-12-16 Genentech, Inc. Biomarkers for igf-1r inhibitor therapy
EP4115906A1 (en) 2010-05-28 2023-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antitumor t cell response enhancer
JP7185884B2 (ja) 2017-05-02 2022-12-08 国立研究開発法人国立精神・神経医療研究センター Ｉｌ－６及び好中球の関連する疾患の治療効果の予測及び判定方法
KR20200074160A (ko) 2017-10-20 2020-06-24 가꼬우호우징 효고 이카다이가쿠 항il-6 수용체 항체를 함유하는 수술 후의 유착을 억제하기 위한 의약 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09501411A (ja) * 1993-06-11 1997-02-10 アイ ビチャー，ハイム 抗−新生物組成物及びその使用方法
JP2002512792A (ja) * 1998-04-23 2002-05-08 ジェネセンス テクノロジーズ インコーポレイテッド インスリン様増殖因子ｉｉアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および細胞増殖を調節するためのその使用方法
JP2003520195A (ja) * 1999-05-14 2003-07-02 イムクローン システムズ インコーポレイティド 上皮成長因子受容体アンタゴニストによる難治性ヒト腫瘍の処理

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5476779A (en) * 1992-09-30 1995-12-19 University Of Maryland At College Park DNA encoding insulin-like growth factor II isolated from rainbow trout
US6048534A (en) * 1993-07-15 2000-04-11 Board Of Regents The University Of Texas System Methods and compositions for the selective regulation of chorionic prostanoids

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09501411A (ja) * 1993-06-11 1997-02-10 アイ ビチャー，ハイム 抗−新生物組成物及びその使用方法
JP2002512792A (ja) * 1998-04-23 2002-05-08 ジェネセンス テクノロジーズ インコーポレイテッド インスリン様増殖因子ｉｉアンチセンスオリゴヌクレオチド配列および細胞増殖を調節するためのその使用方法
JP2003520195A (ja) * 1999-05-14 2003-07-02 イムクローン システムズ インコーポレイティド 上皮成長因子受容体アンタゴニストによる難治性ヒト腫瘍の処理

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUNN S. E. ET AL.: "A Dominant Negative Mutant of the Insulin-like Growth Factor-I Receptor Inhibits the Adhesion, Invasion, and Metastasis of Breast Cancer", CANCER RESEARCH, vol. 58, no. 15, 1998, pages 3353 - 3361, XP002982677 *
GOYA M. ET AL.: "Growth Inhibition of Human Prostate Cancer Cells in Human Adult Implanted into Nonobese Diabetic/Severe Combined Immunodeficient Mice by a Ligand-Specific Antibody to Human Insulin-Like Growth Factors", CANCER RESEARCH, vol. 64, no. 17, 2004, pages 6252 - 6258, XP002982679 *
WANG Y. ET AL.: "Insulin-like growth factor receptor-1 as an anti-cancer target: blocking transformation and inducing apoptosis", CURRENT CANCER DRUG TARGETS, vol. 2, no. 3, 2002, pages 191 - 207, XP002982678 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8410058B2 (en) 2005-12-13 2013-04-02 Medimmune Limited Methods of using insulin-like growth factor antibodies to treat tumors
US9181336B2 (en) 2005-12-13 2015-11-10 Medimmune Limited Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof
US9796779B2 (en) 2005-12-13 2017-10-24 Medimmune Limited Binding proteins specific for insulin-like growth factors and uses thereof
US8580254B2 (en) 2007-06-19 2013-11-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
WO2010045315A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Dyax Corp. Use of igf-ii/igf-iie binding for the treatment and prevention of systemic sclerosis associated pulmonary fibrosis
US8318159B2 (en) 2008-12-12 2012-11-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
EP3064219A2 (en) 2008-12-12 2016-09-07 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-igf antibodies
US10179810B2 (en) 2008-12-12 2019-01-15 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
US11299538B2 (en) 2008-12-12 2022-04-12 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-IGF antibodies
US10377828B2 (en) 2013-03-07 2019-08-13 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combination therapy for neoplasia treatment
US9498540B2 (en) 2013-03-15 2016-11-22 Novartis Ag Cell proliferation inhibitors and conjugates thereof

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