WO2005024430A1 - タンパク質の分析方法およびそれに用いるタンパク質分析試薬 - Google Patents

タンパク質の分析方法およびそれに用いるタンパク質分析試薬 Download PDF

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chaotropic
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protein
analysis
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Susumu Nishino
Masashi Okamoto
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Arkray, Inc.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/683—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving metal ions
    • G01N33/6833—Copper, e.g. Folin-, Lowry-, biuret methods

Definitions

  • the present invention relates to a protein analysis method and a protein analysis reagent used for the method.
  • the Biuret method is a protein analysis method utilizing the fact that a protein reacts with copper ions to form a complex and thereby develop a purple color.
  • concentration of the protein can be measured by optically measuring the color reaction as absorbance or reflectance (for example, see Non-Patent Document 1).
  • O Copper sulfate is used as the copper ion source.
  • Non-patent document 1 "Chemistry for Experimental Chemistry, Protein I Separation and Purification'Properties" The Japan Biochemical Society, Tokyo Chemical Co., Ltd. 1990 p. 91
  • the Biuret method has a problem that the viscosity of the reaction solution increases due to aggregation of proteins. This problem of increased viscosity is a serious problem for high-concentration protein samples.
  • a sample analysis device hereinafter also referred to as a test strip
  • a biological sample such as urine or blood is supplied as it is. Because of the reaction, the protein concentration in the reaction solution is high. Therefore, if the color of the Biuret reaction is analyzed optically in a highly viscous state, a problem arises in the accuracy of the analysis. [0005] Therefore, an object of the present invention is to provide a method for analyzing a protein having excellent analysis accuracy.
  • a method for analyzing a protein of the present invention is a method for analyzing a protein in a sample, wherein the sample is alkaline and contains salts containing chaotropic ions and divalent salts.
  • Biuret reaction is caused by adding copper salts, and this Biuret reaction is analyzed optically.
  • the protein analysis method of the present invention is excellent in analysis accuracy because protein aggregation is prevented and the resulting increase in viscosity is prevented. According to the present invention, in particular, even if the protein sample has a high concentration, the viscosity of the reaction solution can be prevented from increasing, and the protein concentration can be analyzed with high accuracy.
  • FIG. 1 is a graph showing a correlation between Example 1 and Comparative Example 1.
  • the present inventors have repeated a series of studies, mainly on elucidation of the cause of protein aggregation, in order to achieve the above object.
  • copper sulfate which is conventionally used in the Biuret method, is the cause of aggregation of proteins.
  • salts containing strong pick ions prevents protein aggregation, and the present invention has been achieved.
  • chaotropic ion divalent copper salts as the salts containing chaotropic ions and the divalent copper salts.
  • examples of the chaotropic ion include SCN ion, I ion, NO ion, CIO ion, Br ion, C1 ion and the like. Preferred in this
  • the divalent copper salts include CuSO, Cu (C10), Cu
  • the divalent copper salts of the chaotropic ion include, for example, Cu (NO 2), Cu (C 10), CuBr and CuCl. Of these, the preferred
  • the amount of the chaotropic ion to be added is, for example, in the range of 0.5 mM to 100 mM, and preferably in the range of ImM to 10 mM.
  • the amount of the divalent copper salt added is, for example, in the range of 0.5 mM to 100 mM, preferably ImM It is in the range of 10 mM.
  • the amount of the divalent copper salt of the chaotropic ion added is, for example, in the range of 0.5 mM to 100 mM. , Preferably in the range of ImM-lOmM.
  • the dilution concentration of the sample is, for example, 1Z50 dilution.
  • the sample may be used without dilution in the liquid analysis, or the sample may be diluted and used in the dry analysis.
  • the liquid analysis is an analysis technique using a reagent solution, and is used, for example, in general experiments and the like.
  • the dry analysis is an analysis method using a reagent or the like in a dry state, for example, an analysis method applied to a sample analysis tool (or a test piece) used in a clinical test or the like.
  • the amount of the chaotropic ion to be added is, for example, 100 mM to 2000 mM. Range, preferably in the range of 500 mM to 100 mM.
  • the amount of the divalent copper salt added is, for example, in the range of lOOmM to lOOOOmM, and is preferably Is in the range of 200mM-500mM.
  • the amount of the divalent copper salt of the chaotropic ion added is, for example, in the range of 100 mM-1000 mM, and is preferably Is in the range of 200mM-500mM.
  • alkaline agent examples include NaOH, KOH, LiOH, Ca (OH) and the like. Any of these alkaline agent
  • a particularly useful force for processing into analytical tools is LiOH.
  • the sample is alkaline at the time of the reaction between the chaotropic ion and divalent copper ion and the protein in the sample.
  • the alkaline agent as described above may be mixed at the time of mixing the chaotropic ion and the divalent copper ion with the sample.
  • the pH of the alkaline sample during the reaction is, for example, in the range of pH 9 or higher, preferably in the range of pH 11 or higher.
  • the protein concentration in the sample is, for example, in the range of 0 to 15 g / dL (100 mL). This range is equivalent to the concentration range for protein measurement in the normal Biuret reaction.
  • protein is intended to include a polypeptide.
  • the optical analysis method includes, for example, analysis of the degree of coloring of the sample by a Biuret reaction.
  • the analysis of the degree of coloring of the sample may be a visual determination, or may be an absorbance measurement or a reflectance measurement by an apparatus.
  • the optical analysis method may be either qualitative analysis or quantitative analysis.
  • the reagent of the present invention is a protein analysis reagent used in the protein analysis method of the present invention, wherein the reagent contains a chaotropic ion-containing salt and a divalent copper salt. It is.
  • the chaotropic ions and the divalent copper salts include those described above.
  • the reagent may contain other reagents such as an alkaline agent in addition to salts containing chaotropic ions and divalent copper salts. Examples of other reagents such as the alkaline agent include those described above.
  • the reagent of the present invention is a protein analysis reagent used in the protein analysis method of the present invention, and is a reagent containing a divalent copper salt of a chaotropic ion.
  • examples of the divalent copper salts of the chaotropic ion include those described above.
  • the reagent may contain other reagents such as an alkaline agent in addition to the divalent copper salts of chaotropic ions.
  • examples of other reagents such as the alkaline agent include those described above.
  • the reagent of the present invention can be used, for example, by dripping it onto a sample, freeze-drying it on a microplate to dry it, and placing it on a sample analysis tool as described later.
  • the sample analysis device of the present invention is used for the protein analysis method of the present invention, and includes a carrier and a reagent, and the reagent includes salts containing chaotropic ions and divalent copper salts. It is a sample analysis tool including.
  • the chaotropic ions and the divalent copper salts include those described above.
  • the reagent may contain other reagents such as an alkaline agent, in addition to salts containing chaotropic ions and copper (II) salts.
  • Other reagents such as the alkaline agent include those described above.
  • the sample analysis device of the present invention is used for the protein analysis method of the present invention, and includes a carrier and a reagent, and the reagent includes a divalent copper salt of a chaotropic ion. It is a tool.
  • the divalent copper salts of chaotropic ions include those described above.
  • the reagent may include another reagent such as an alkaline agent in addition to the divalent copper salts of chaotropic ions.
  • Previous Other reagents such as the alkaline agent include those described above.
  • the method for analyzing a protein according to the present invention can be carried out, for example, as follows.
  • a sample containing a protein such as blood is suspended in water if necessary, and an alkaline agent is added to adjust the pH to the above-mentioned predetermined range.
  • an alkaline agent is added to the sample solution and stirred, the protein and copper ion in the sample form a complex, and after the addition of the reagent, for example, 10 seconds. Color develops in 15 minutes. This change may be confirmed visually or may be measured using an optical system measuring device such as a spectrophotometer. By measuring the degree of this color development, qualitative or quantitative analysis of the protein is possible.
  • the protein concentration can be determined from the degree of coloring of the Biuret reaction.
  • the reaction temperature ranges, for example, from room temperature to about 37 ° C., which is a normal adjustment temperature in a general analyzer.
  • a reagent solution is prepared by dissolving a divalent copper salt of a picky ion in alkaline water. The pH of this reagent solution is adjusted to the above-mentioned range when the sample is added. Then, a porous carrier such as a filter paper is impregnated with the reagent solution, and then dried.
  • the carrier is not particularly limited. For example, a plastic porous sheet may be used in addition to the filter paper.
  • the carrier supporting the reagent as described above may be used as a sample analysis tool as it is, or the carrier may be further supported on another substrate sheet or the like to be used as a sample analysis tool.
  • the color develops, for example, for 10 seconds and 15 minutes after the sample is supplied.
  • Qualitative or quantitative analysis of the protein is possible by visually confirming the degree of the color development or by measuring with a reflectometer. For example, if a calibration curve is prepared in advance, the concentration of protein can be determined by the coloring degree of the Biuret reaction.
  • the carrier may be, for example, a substance having a flow path of a sample solution formed of a light-transmitting substance.
  • a reagent containing a divalent copper salt of a chaotropic ion in the flow path of the solution You should place ⁇ .
  • microplate reagents were prepared, and 50 ⁇ L each was dispensed into a 96-well mic opening plate and lyophilized.
  • Example 2 5 ⁇ L of the same sample as in Example 1 and 350 ⁇ L of the following solution-based reagent were mixed and reacted at room temperature for 10 minutes, and then the absorbance at a wavelength of 546 nm was measured.
  • an automatic analyzer (trade name: 7070, manufactured by Hitachi, Ltd.) was used.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of correlation between Example 1 and Comparative Example 1, and FIG. The equation shows an equation representing the correlation, and R 2 shows a correlation coefficient.
  • Example 1 is a dry method
  • Comparative Example 1 is a solution method.
  • Example 1 As shown in FIG. 1, a high correlation was observed between Example 1 and Comparative Example 1.
  • HSA human serum albumin
  • the following reagent solution A was prepared, and 200 ⁇ L of the reagent solution A and 400 ⁇ L of the sample were reacted at room temperature for 8 minutes. Then, the reaction solution was dispensed into a transparent cell having a cell length of lmm, and the absorbance at a wavelength of 550 nm was measured with a spectrophotometer (trade name: V-550, manufactured by JASCO Corporation). The results are shown in Table 1 below.
  • Lithium hydroxide 1.89g (10. OOOM)
  • Lithium hydroxide 1.89g (10. OOOM)
  • a force that could not be dispensed was a force that could not be moved and a force that could not aspirate the reaction solution with a pipette.
  • the protein analysis method of the present invention is excellent in analysis accuracy because protein aggregation is prevented and the resulting increase in viscosity is prevented. Therefore, according to the analysis method of the present invention, it is possible to improve the accuracy of protein analysis in all fields such as medicine, pharmacy, and biochemistry, and in particular, fields where high-concentration proteins need to be analyzed, for example, It is useful for protein analysis using a sample analysis device in a clinical test.

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Abstract

　高濃度のタンパク質試料であっても、タンパク質の凝集が防止され、それに起因する反応液の粘性の高まりが防止された、Biuret反応によるタンパク質の分析方法を提供する。 　タンパク質を含む試料を、水酸化ナトリウム溶液等を添加することによってアルカリ性にし、これにカオトロピックイオンを含む塩類および２価銅塩類を加えてBiuret反応を起こし、その着色程度を測定することによりタンパク質の分析を行う。前記カオトロピックイオンとしては、例えば、ＳＣＮイオン、Ｉイオン、ＮＯ３イオン、ＣｌＯ４イオン、ＢｒイオンおよびＣｌイオンがある。

Description

明 細 書
タンパク質の分析方法およびそれに用いるタンパク質分析試薬
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質の分析方法およびそれに使用するタンパク質分析試薬に関 する。
背景技術
[0002] 医学、薬学、生物学、農学等のさまざまな分野において、試料中のタンパク質の分 祈が行われている。タンパク質の分析方法としては、例えば、乾燥重量法、 Kjedahl法 、 Biuret法、 Lowry法、ビジンコニン酸法、紫外線吸収法、色素結合法および比濁法 等がある。これらの中でも、 Biuret法は、操作が簡便であること、試料中のタンパク質 の種類が異なった場合においても単位重量あたりの発色率にあまり差異がないこと 等力 汎用されている。
[0003] Biuret法とは、タンパク質と銅イオンとが反応することにより、錯体を形成し、それに よって紫色に呈色することを利用したタンパク質の分析方法である。この呈色反応を 、吸光度や反射率として光学的に測定することで、タンパク質の濃度が測定できる（ 例えば、非特許文献 1参照。 ) o前記銅イオン源としては、硫酸銅が使用される。 非特許文献 1 :「新生化学実験講座 タンパク質 I 分離 ·精製'性質」 （社）日本生化 学会 （株)東京化学同人 1990年 91頁
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] し力しながら、 Biuret法では、タンパク質の凝集に起因して反応液の粘性が高まると いう問題がある。この粘性が高まるという問題は、高濃度のタンパク質試料において 深刻な問題である。例えば、臨床検査で使用される検体分析用具 (以下、試験片とも いう）は、ろ紙等の担体に Biuret試薬を乾燥状態で担持させ、ここに、尿や血液等の 生体試料をそのまま供給し、反応させることから、反応液中のタンパク質濃度は高濃 度である。したがって、粘性が高い状態で Biuret反応の呈色を光学的に分析すると、 その分析精度に問題が生じる。 [0005] そこで、本発明の目的は、分析精度に優れるタンパク質の分析方法を提供すること である。
課題を解決するための手段
[0006] 前記目的を達成するために、本発明のタンパク質の分析方法は、試料中のタンパ ク質の分析方法であって、前記試料がアルカリ性であり、これにカオトロピックイオン を含む塩類および 2価銅塩類を加えて Biuret反応を起こし、この Biuret反応を光学的 に分析する方法である。
発明の効果
[0007] 本発明のタンパク質の分析方法は、タンパク質の凝集が防止され、これに起因する 粘性の高まりも防止されるため、分析精度に優れる。本発明によれば、特に、高濃度 のタンパク質試料であっても、反応液の粘性の高まりが防止でき、高精度でタンパク 質濃度を分析できる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]実施例 1と比較例 1との相関関係を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明者らは、前記目的を達成するために、タンパク質凝集の原因解明を中心に 、一連の研究を重ねた。その過程で、従来力 Biuret法で使用される硫酸銅力 タン ノ ク質の凝集の原因であることを突き止めた。そして、さらに研究を重ねたところ、力 オト口ピックイオンを含む塩類を使用すれば、タンパク質の凝集を防止することを見出 し、本発明に到達した。
[0010] カオトロピックイオン力タンパク質の凝集を防止する理由は、次のように推察される。
すなわち、タンパク質の凝集は、疎水結合が大きく寄与している。一方、カオトロピッ クイオンは、水中において疎水性分子の水溶性を高め、疎水結合を弱める作用があ る。したがって、カオトロピックイオンがタンパク質の疎水結合を弱めることによって、タ ンパク質の凝集が防止されると考えられる。
[0011] 本発明のタンパク質の分析方法において、カオトロピックイオンを含む塩類および 2 価銅塩類として、カオトロピックイオンの 2価銅塩類を使用することが好ま 、。 [0012] 本発明の分析方法において、前記カオトロピックイオンとしては、例えば、 SCNィォ ン、 Iイオン、 NOイオン、 CIOイオン、 Brイオン、 C1イオン等がある。この中で好まし
3 4
いのは、 SCNイオン、 Iイオン、 NOイオン、 CIOイオン、 Brイオンであり、より好まし
3 4
いのは、 SCNイオン、 NOイオン、 CIOイオンである。
3 4
[0013] 本発明の分析方法において、前記 2価銅塩類としては、 CuSO、 Cu (C10 ) 、 Cu
4 4 2
(NO ) 、 CuBr、 CuClおよび Cu (CH COO) 等がある。この中で好ましいのは C
3 2
u (C10 ) 、 Cu (NO ) 、 CuBr、 CuClであり、より好ましいのは、 Cu(C10 )である
4 2 3 2 2 2 4 2
[0014] 本発明の分析方法において、前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類としては、例え ば、 Cu(NO ) 、 Cu (C10 ) 、 CuBrおよび CuCl等がある。この中で好ましいのは
3 2 4 2 2 2
、 Cu(NO ) 、 Cu (C10 ) 、 CuBrであり、より好ましいのは、 Cu (C10 )である。
3 2 4 2 2 4 2
[0015] 本発明の分析方法において、液系分析の場合若しくは試料を希釈して用いる場合
、前記カオトロピックイオンの添加量は、例えば、 0. 5mM— lOOmMの範囲であり、 好ましくは ImM— 10mMの範囲である。
[0016] 本発明の分析方法において、液系分析の場合若しくは試料を希釈して用いる場合 、前記 2価銅塩類の添加量は、例えば、 0. 5mM— lOOmMの範囲であり、好ましく は ImM— 10mMの範囲である。
[0017] 本発明の分析方法において、液系分析の場合若しくは試料を希釈して用いる場合 、前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類の添カ卩量は、例えば、 0. 5mM— lOOmMの 範囲であり、好ましくは ImM— lOmMの範囲である。
[0018] なお、前記試料の希釈濃度としては、例えば、 1Z50希釈があげられる。また、本 発明において、液系分析においても、試料を希釈せずに用いる場合もあるし、ドライ 系分析においても、試料を希釈して用いる場合もある。液系分析とは、試薬液を用い た分析手法であり、例えば、一般の実験等で使用される。ドライ系分析とは、試薬等 を乾燥状態で使用する分析手法であり、例えば、臨床検査等で用いる検体分析用 具 (若しくは試験片）に適用される分析手法である。
[0019] 本発明の分析方法にぉ ヽて、ドライ系分析の場合若しくは試料を希釈することなく 用いる場合、前記カオトロピックイオンの添加量は、例えば、 lOOmM— 2000mMの 範囲であり、好ましくは 500mM— lOOOmMの範囲である。
[0020] 本発明の分析方法にお!ヽて、ドライ系分析の場合若しくは試料を希釈することなく 用いる場合、前記 2価銅塩類の添加量は、例えば、 lOOmM— lOOOmMの範囲で あり、好ましくは 200mM— 500mMの範囲である。
[0021] 本発明の分析方法において、ドライ系分析若しくは試料を希釈することなく用いる 場合、前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類の添カ卩量は、例えば、 lOOmM— 1000 mMの範囲であり、好ましくは 200mM— 500mMの範囲である。
[0022] 本発明にお 、て、カオトロピックイオンを含む塩類および 2価銅塩類、もしくは力オト 口ピックイオンの 2価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を用いてもよい。前記 アルカリ性剤としては、 NaOH、 KOH、 LiOH、 Ca (OH) 等がある。このうちどれでも
2
好ましく使用できる力 分析用具へ加工する際に特に有用なのは、 LiOHである。
[0023] 本発明の分析方法にお!、て、前記試料が、カオトロピックイオンおよび 2価の銅ィォ ンと試料中のタンパク質との反応時にアルカリ性であればよぐ例えば、試料を予め アルカリ性に調整してぉ 、ても、カオトロピックイオンおよび 2価の銅イオンと試料との 混合時に、前述のようなアルカリ性剤を混合してもよい。本発明の分析方法において 、前記アルカリ性試料の反応時の pHは、例えば、 pH9以上の範囲であり、好ましくは pH 11以上の範囲である。
[0024] 本発明の分析方法において、前記試料中のタンパク質濃度は、例えば、 0— 15g /dL (lOOmL)の範囲である。通常の Biuret反応でタンパク質測定を行う濃度範囲と 同等の範囲である。
[0025] また、本発明において、タンパク質という語は、ポリペプチドを含む趣旨である。
[0026] 本発明の分析方法にお!ヽて、前記光学的に分析する方法としては、例えば、 Biuret 反応による前記試料の着色程度の分析がある。また、前記試料の着色程度の分析 は、 目視判定でもよいし、装置による吸光度測定若しくは反射率測定であってもよい 。また、前記光学的に分析する方法は、定性分析若しくは定量分析のいずれであつ てもよい。
[0027] つぎに、本発明の試薬は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用するタンパク 質分析試薬であって、カオトロピックイオンを含む塩類および 2価銅塩類を含む試薬 である。
[0028] 本発明の試薬において、前記カオトロピックイオンおよび前記 2価銅塩類としては前 述のものがあげられる。また、前記試薬は、カオトロピックイオンを含む塩類および 2 価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤 等の他の試薬としては、前述のものがあげられる。
[0029] さらに、本発明の試薬は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用するタンパク質 分析試薬であって、カオトロピックイオンの 2価銅塩類を含む試薬である。
[0030] 本発明の試薬において、前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類としては、例えば、 前述のものがあげられる。また、前記試薬は、カオトロピックイオンの 2価銅塩類の他 に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤等の他の試薬 としては、前述のものがあげられる。
[0031] 本発明の試薬は、例えば、試料に滴下することや、マイクロプレート上で凍結乾燥 させてドライ化すること、後述するように検体分析用具に配置すること等により使用で きる。
[0032] つぎに、本発明の検体分析用具は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用する ものであって、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンを含む塩類 および 2価銅塩類を含む検体分析用具である。
[0033] 本発明の検体分析用具において、前記カオトロピックイオンおよび前記 2価銅塩類 としては、前述のものがあげられる。また、本発明の検体分析用具は、前記試薬が、 カオトロピックイオンを含む塩類および 2価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試 薬を含んでいてもよい。前記アルカリ性剤等の他の試薬としては、前述のものがあげ られる。
[0034] さらに、本発明の検体分析用具は、前記本発明のタンパク質分析方法に使用する ものであって、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンの 2価銅塩 類を含む検体分析用具である。
[0035] 本発明の検体分析用具において、前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類としては、 前述のものがあげられる。また、本発明の検体分析用具は、前記試薬が、カオトロピ ックイオンの 2価銅塩類の他に、アルカリ性剤等の他の試薬を含んでいてもよい。前 記アルカリ性剤等の他の試薬としては、前述のものがあげられる。
[0036] つぎに、本発明によるタンパク質の分析方法は、例えば、以下のようにして実施でき る。
[0037] まず、本発明の分析方法を液系分析に適用した例を説明する。例えば、血液等の タンパク質を含む試料を、必要に応じて水に懸濁し、さらにアルカリ性剤を添加し、 p Hを前記所定の範囲に調整する。前記試料溶液に、カオトロピックイオンを含む塩類 および 2価銅塩類を含む試薬を添加し、撹拌すると、前記試料中のタンパク質と銅ィ オンとが錯体を形成し、前記試薬添加後、例えば、 10秒一 15分間で発色する。この 変化は、目視で確認してもよいし、分光光度計等の光学系測定装置を用いて測定し てもよい。この発色の程度を測定することにより、タンパク質の定性若しくは定量分析 が可能である。例えば、予め検量線を作成しておけば、 Biuret反応の着色程度からタ ンパク質の濃度を決定することができる。反応温度は、例えば、一般の分析装置にお ける通常の調節温度である、室温から 37°C前後までの範囲があげられる。
[0038] つぎに、本発明の分析方法を検体分析用具に適用した例を説明する。例えば、力 オト口ピックイオンの 2価銅塩類をアルカリ性の水に溶解して試薬溶液を調製する。こ の試薬溶液の pHは、試料を添加した時に前記所定の pHになるような範囲に調整し ておく。そして、ろ紙等の多孔質の担体に、前記試薬溶液を含浸させ、その後乾燥さ せる。前記担体としては、特に制限されないが、ろ紙の他に、例えば、プラスチック製 の多孔質シートを使用してもよい。このように前記試薬を担持した担体を、そのまま検 体分析用具としてよいし、この担体をさらに別の基板シート等に担持させて検体分析 用具としてもよい。このような検体分析用具の担体に、血液等のタンパク質を含む試 料を供給すると、試料供給後、例えば、 10秒一 15分間で発色する。この発色の程度 を、目視で確認したり、反射率計等で測定したりすることにより、タンパク質の定性若 しくは定量分析が可能である。例えば、予め検量線を作成しておけば、 Biuret反応の 着色程度力もタンパク質の濃度を決定することができる。
また、前記担体は、例えば、光透過性物質で形成された試料溶液の流路を有する 物であってもよぐこの場合、前記溶液の流路に、カオトロピックイオンの 2価銅塩類を 含む試薬を配置すればょ ヽ。 実施例 1
[0039] 以下に示すようにして、試薬を調製し、タンパク質分析を行った。
[0040] ヒト血清アルブミン (シグマ社製)を添加したヒト血清および無添加のヒト血清（120 例）を検体として用いた。
[0041] 下記マイクロプレート試薬を調製し、っ 、で、 96ウェルマイク口プレートに 50 μ Lず つ分注して凍結乾燥させた。
[0042] (マイクロプレート試薬）
酒石酸 9. Og
水酸化リチウム 12. 6g
過塩素酸銅 14. 8g
蒸留水 100. Og
[0043] つぎに、凍結乾燥させたぞれぞれの試薬に、前記検体 50 μ Lを加え、室温で 8分 間反応させ、ついで、波長 540nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定には、 マイクロプレート吸光測定装置（サーモラボシステムズ社製：商品名マルチスキャンァ セン)を使用した。
[0044] (比較例 1)
実施例 1と同様の検体 5 μ Lと下記溶液系試薬 350 μ Lとを混合して、室温で 10分 間反応させ、ついで、波長 546nmにおける吸光度を測定した。吸光度の測定には、 自動分析装置（日立社製：商品名 7070形)を使用した。
[0045] (溶液系試薬）
酒石酸 9. Og
水酸ィ匕ナトリウム 12. 6g
硫酸銅 14. 8g
ヨウ化カリウム 0. lg
蒸留水 100. Og
[0046] つぎに、既知濃度のゥシ血清アルブミン溶液および蒸留水から検量線を求め、タン パク質濃度を算出した。
[0047] 図 1は、実施例 1と比較例 1とを比較した相関性の結果を示すグラフであり、図中の 式は前記相関関係を表す式を示し、 R2は相関係数を示す。なお、図 1において、実 施例 1がドライ法であり、比較例 1が溶液法である。
[0048] 図 1に示すように、実施例 1と比較例 1との間には高い相関性がみられた。
実施例 2
[0049] 以下に示すように、試薬と試料溶液とを調製し、タンパク質分析を行った。
[0050] ヒト血清アルブミン (HSA)溶液 (シグマ社製)の濃度を 30gZdL (lOOmL)に調製し
、それを用いて、後述する濃度の HSA溶液を作製した。
[0051] まず、下記試薬溶液 Aを調製し、前記試薬溶液 A200 μ Lと、試料 400 μ Lとを室 温で 8分間反応させた。そして、その反応液をセル長 lmmの透明セルに分注し、波 長 550nmにおける吸光度を、分光光度計（日本分光株式会社製:商品名 V-550) により吸光度測定を行った。その結果を下記表 1に示す。
[0052] (試薬溶液 A)
酒石酸 1. 35g (2. OOOM)
水酸ィ匕リチウム 1. 89g (10. OOOM)
過塩素酸銅 2. 22g (l. 333M)
蒸留水 5. OOg
[0053] (比較例 2)
試薬溶液として下記試薬溶液 Bを使用した以外は、実施例 2と同様にして吸光度測 定を行った。その結果を下記表 1に示す。
[0054] (試薬溶液 B)
酒石酸 1. 35g (2. OOOM)
水酸ィ匕リチウム 1. 89g (10. OOOM)
硫酸銅 1. 50g (l. 333M)
蒸留水 5. OOg
[0055] [表 1] H S A濃度 （g/ lL) 実施例 2 比較例 2
希釈濃度 終濃度 粘性 吸光度 粘性 吸光度
0 0 0 3 3 3 2
3 2 0 9 7 9 7
6 4 1 5 2 5 2
9 6 1 9 7 0 上
1 2 8 2 3 2 4 0
1 5 ] 0 2 , 5 9 6 8
1 6 . 1 1 2 . 6 5
1 8 1 2 2 7 7
〇〇〇〇〇〇〇〇
1 9 . 1 3 0 2 . 9 2 前記表 1において、〇は、反応液をセルに分注可能であったことを示し、 Xは、反 応液の粘性が高かったため、セルに分注できなかったことを示し、一は、セルに分注 できなかったため、吸光度が測定できな力つたことを示す。なお、反応液がセル内を 〇〇o 〇〇〇x X X
移動できな力つた状態およびピペットにより反応液を吸引できな力つた状態を、分注 できな力つたとした。
[0056] 前記表 1に示すように、比較例 2 (従来法)では、 HSA (タンパク質)終濃度が l lgZ dL以上であると、セルに分注できない程度にまで粘性が高まった。これに対し、実施 例 2に示すように、 HSA (タンパク質)終濃度が lOgZdLを超える高濃度の試料にお いても、高い分析精度で測定できた。これにより、本発明によれば、ドライ試薬が仕込 まれた分析用具においても、ドライ試薬が完全に溶解し、試料と試薬とをムラなく均 一に混和できた。
産業上の利用可能性
[0057] 本発明のタンパク質の分析方法は、タンパク質の凝集が防止され、これに起因する 粘性の高まりも防止されるため、分析精度に優れる。したがって、本発明の分析方法 によれば、医学、薬学、生化学などのあらゆる分野におけるタンパク質分析の精度を 向上させることができ、特に、高濃度のタンパク質を分析する必要がある分野、例え ば、臨床検査における検体分析用具を用いたタンパク質分析に有用である。

Claims

請求の範囲
[I] 試料中のタンパク質の分析方法であって、前記試料がアルカリ性であり、これに力 オト口ピックイオンを含む塩類および 2価銅塩類を加えて Biuret反応を起こし、この Biuret反応を光学的に分析する方法。
[2] 前記カオトロピックイオンを含む塩類および 2価銅塩類として、カオトロピックイオン の 2価銅塩類を使用する請求の範囲第 1項に記載の方法。
[3] 前記カオトロピックイオン力 SCNイオン、 Iイオン、 NOイオン、 CIOイオン、 Brィ
3 4
オンおよび C1イオン力 なる群力 選択される少なくとも一つである請求の範囲第 1 項に記載の方法。
[4] 前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類力 Cu (NO ) 、 Cu (C10 ) 、 CuBrおよび
3 2 4 2 2
CuCl力 なる群力 選択される少なくとも一つである請求の範囲第 2項に記載の方
2
法。
[5] 前記カオトロピックイオンの添カ卩量が、 0. 5mM— lOOmMの範囲である請求の範 囲第 1項に記載の方法。
[6] 前記カオトロピックイオンの添カ卩量が、 lOOmM— 2000mMの範囲である請求の範 囲第 1項に記載の方法。
[7] 前記 2価銅塩類の添加量が、 0. 5mM— lOOmMの範囲である請求の範囲第 1項 に記載の方法。
[8] 前記 2価銅塩類の添加量が、 lOOmM— 2000mMの範囲である請求の範囲第 1 項に記載の方法。
[9] 前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類の添カ卩量力 0. 5mM— lOOmMの範囲で ある請求の範囲第 2項に記載の方法。
[10] 前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類の添カ卩量力 lOOmM— 2000mMの範囲で ある請求の範囲第 2項に記載の方法。
[II] 前記アルカリ性の試料の pH力 pH9以上の範囲である請求の範囲第 1項に記載 の方法。
[12] 前記試料中のタンパク質濃度が、 0— 15gZl00mLの範囲である請求の範囲第 1 項に記載の方法。
[13] 前記光学的に分析する方法が、前記試料の着色程度の分析である請求の範囲第 1項に記載の方法。
[14] 前記試料の着色程度の分析が、目視判定または装置による吸光度測定若しくは反 射率測定である請求の範囲第 13項に記載の方法。
[15] 前記光学的に分析する方法が、定性分析若しくは定量分析である請求の範囲第 1 項に記載の方法。
[16] 請求の範囲第 1項に記載のタンパク質分析方法に使用するタンパク質分析試薬で あって、カオトロピックイオンを含む塩類および 2価銅塩類を含む試薬。
[17] 請求の範囲第 2項に記載のタンパク質分析方法に使用するタンパク質分析試薬で あって、カオトロピックイオンの 2価銅塩類を含む試薬。
[18] 前記カオトロピックイオン力 SCNイオン、 Iイオン、 NOイオン、 CIOイオン、 Brィ
3 4
オンおよび C1イオン力もなる群力も選択される少なくとも一つである請求の範囲第 16 項に記載の試薬。
[19] 前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類力 Cu (NO ) 、 Cu (C10 ) 、 CuBrおよび
3 2 4 2 2
CuCl力 なる群力 選択される少なくとも一つである請求の範囲第 17項に記載の
2
[20] 請求の範囲第 1項に記載のタンパク質分析方法に使用する検体分析用具であって 、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンを含む塩類および 2価銅 塩類を含む検体分析用具。
[21] 請求の範囲第 2項に記載のタンパク質分析方法に使用する検体分析用具であって 、担体および試薬を含み、前記試薬が、カオトロピックイオンの 2価銅塩類を含む検 体分析用具。
[22] 前記カオトロピックイオン力 SCNイオン、 Iイオン、 NOイオン、 CIOイオン、 Brィ
3 4
オンおよび C1イオン力 なる群力 選択される少なくとも一つである請求の範囲第 20 項に記載の検体分析用具。
[23] 前記カオトロピックイオンの 2価銅塩類力 Cu (NO ) 、 Cu (C10 ) 、 CuBrおよび
3 2 4 2 2
CuCl力もなる群力も選択される少なくとも一つである請求の範囲第 21項に記載の
2
検体分析用具。
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