JP2001099826A - 錯体の発色方法および発色用試薬 - Google Patents
錯体の発色方法および発色用試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 検体中の蛋白質と銅イオンとによって錯
体を生成させ、該錯体を発色させて検体中の蛋白質を定
量するに際して、水酸化リチウムによってアルカリ条件
とすることによって錯体を発色させることを特徴とする
錯体の発色方法。 【効果】 アルカリとして水酸化リチウムを用いること
により、アルカリ濃度を低減化でき、それによって、反
応液の粘度を低下させることができる。従って誤差を少
なくし、高い再現性が期待でき、且つ高感度、高精度の
総蛋白質の定量が可能になる。
体を生成させ、該錯体を発色させて検体中の蛋白質を定
量するに際して、水酸化リチウムによってアルカリ条件
とすることによって錯体を発色させることを特徴とする
錯体の発色方法。 【効果】 アルカリとして水酸化リチウムを用いること
により、アルカリ濃度を低減化でき、それによって、反
応液の粘度を低下させることができる。従って誤差を少
なくし、高い再現性が期待でき、且つ高感度、高精度の
総蛋白質の定量が可能になる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質と銅イオン
とからなる錯体の発色方法に関する。
とからなる錯体の発色方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】総蛋白質の定量方法としては屈折計法、
２８０ｎｍでの特異的な吸収に基づく方法、比濁法、ケ
ルダール法、ペプチド結合をアルカリ性で銅と結合させ
て比色するビウレット法などがある。特にビウレット法
は、蛋白質の種類に関係なく発色感度が一定であり簡単
に比色定量できる。このビウレット法は感度が低い欠点
を持っているが、血清中の総蛋白質を定量する場合には
むしろ好都合で、臨床検査においては繁用されてきた。
２８０ｎｍでの特異的な吸収に基づく方法、比濁法、ケ
ルダール法、ペプチド結合をアルカリ性で銅と結合させ
て比色するビウレット法などがある。特にビウレット法
は、蛋白質の種類に関係なく発色感度が一定であり簡単
に比色定量できる。このビウレット法は感度が低い欠点
を持っているが、血清中の総蛋白質を定量する場合には
むしろ好都合で、臨床検査においては繁用されてきた。
【０００３】ビウレット法の反応原理はアルカリ性条件
下で銅が蛋白質のペプチド結合と錯体を形成することに
より、赤紫色（５５０ｎｍ付近）に発色することによ
る。この発色を標準液の吸光度と比較して、検体中の蛋
白質量を定量する。アルカリ性条件下での水酸化銅の沈
澱が生成しないようにキレート剤が加えられ、さらに銅
が還元されないようにヨウ化カリウムが添加される場合
もある。
下で銅が蛋白質のペプチド結合と錯体を形成することに
より、赤紫色（５５０ｎｍ付近）に発色することによ
る。この発色を標準液の吸光度と比較して、検体中の蛋
白質量を定量する。アルカリ性条件下での水酸化銅の沈
澱が生成しないようにキレート剤が加えられ、さらに銅
が還元されないようにヨウ化カリウムが添加される場合
もある。
【０００４】しかしながら、これらの方法には例えば日
常検査でしばしば遭遇する乳び、溶血、ビリルビンなど
による検体の混濁、すなわち共存物質による干渉という
問題があった。ビウレット法については過去いくつかの
干渉回避方法に関する報告があるが、いずれもキレート
剤に関しての報告であり、主に輸液に使用するデキスト
ランによる混濁を回避する方法に関する報告、銅を含ま
ない別の試薬で乳び、溶血色素などの検体盲検をとる方
法などであった（Doumasら、Clin. Chem. 27/10, 1642-
1650, 1981）。このDoumasらの方法では、１２ｍＭ硫酸
銅、３２ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウム、３０ｍＭヨウ
化カリウム、０．６Ｍ水酸化ナトリウムをそれぞれ含む
１種類の溶液を用いる。
常検査でしばしば遭遇する乳び、溶血、ビリルビンなど
による検体の混濁、すなわち共存物質による干渉という
問題があった。ビウレット法については過去いくつかの
干渉回避方法に関する報告があるが、いずれもキレート
剤に関しての報告であり、主に輸液に使用するデキスト
ランによる混濁を回避する方法に関する報告、銅を含ま
ない別の試薬で乳び、溶血色素などの検体盲検をとる方
法などであった（Doumasら、Clin. Chem. 27/10, 1642-
1650, 1981）。このDoumasらの方法では、１２ｍＭ硫酸
銅、３２ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウム、３０ｍＭヨウ
化カリウム、０．６Ｍ水酸化ナトリウムをそれぞれ含む
１種類の溶液を用いる。
【０００５】最近の自動分析装置は試薬を２つに分ける
ことにより（２試薬系）、第１試薬中での吸光度測定
と、第２試薬添加後本反応を行い再度吸光度測定し、２
つの吸光度差から目的物質の定量を行う２ポイント測定
が主流となっている。この方法では検体の色、濁りを差
し引くことができるため、より正確な測定ができると言
われている。
ことにより（２試薬系）、第１試薬中での吸光度測定
と、第２試薬添加後本反応を行い再度吸光度測定し、２
つの吸光度差から目的物質の定量を行う２ポイント測定
が主流となっている。この方法では検体の色、濁りを差
し引くことができるため、より正確な測定ができると言
われている。
【０００６】総蛋白質の定量は古くから行われていたに
もかかわらず、現在の臨床化学の生化学検査において最
も干渉の影響を受け易い項目とされている。その最大の
理由は、１つの試薬で反応、測定する系（１試薬系）で
あるため１ポイント測定しかできないことにあった。市
場の総蛋白質定量用試薬は、ほとんどが１試薬系であり
干渉を回避することはできないが、唯一、デュポンaca
用テストパック総蛋白TP（体外診断用医薬品（01AM輸）
第0015号）が２試薬に分かれている。この試薬は第１試
薬に水酸化ナトリウム、第２試薬に硫酸銅が含まれる構
成で、はじめに水酸化ナトリウムを添加し、その後で硫
酸銅を加え反応、測定する。この場合、検体盲検をとる
必要性もなく、乳びによる干渉、溶血による干渉は回避
できるが、ビリルビンの干渉が回避できない。なぜな
ら、検体中のビリルビンは、銅イオンを添加すると速や
かにビリベルジンに変化し、副波長を７００ｎｍ付近に
設定すると、負の干渉を受けることになるからである
（臨床化学（20）補冊２号51b（1991））。現在ビリル
ビンの干渉を完全に回避する方法は見つかっていない。
また、このように後で第２試薬である銅イオンを含む溶
液を添加する方法では、副波長である７００ｎｍ付近の
吸光度が高く、測定値が第２試薬の分注精度の影響をう
けやすくなり再現性が悪くなる。
もかかわらず、現在の臨床化学の生化学検査において最
も干渉の影響を受け易い項目とされている。その最大の
理由は、１つの試薬で反応、測定する系（１試薬系）で
あるため１ポイント測定しかできないことにあった。市
場の総蛋白質定量用試薬は、ほとんどが１試薬系であり
干渉を回避することはできないが、唯一、デュポンaca
用テストパック総蛋白TP（体外診断用医薬品（01AM輸）
第0015号）が２試薬に分かれている。この試薬は第１試
薬に水酸化ナトリウム、第２試薬に硫酸銅が含まれる構
成で、はじめに水酸化ナトリウムを添加し、その後で硫
酸銅を加え反応、測定する。この場合、検体盲検をとる
必要性もなく、乳びによる干渉、溶血による干渉は回避
できるが、ビリルビンの干渉が回避できない。なぜな
ら、検体中のビリルビンは、銅イオンを添加すると速や
かにビリベルジンに変化し、副波長を７００ｎｍ付近に
設定すると、負の干渉を受けることになるからである
（臨床化学（20）補冊２号51b（1991））。現在ビリル
ビンの干渉を完全に回避する方法は見つかっていない。
また、このように後で第２試薬である銅イオンを含む溶
液を添加する方法では、副波長である７００ｎｍ付近の
吸光度が高く、測定値が第２試薬の分注精度の影響をう
けやすくなり再現性が悪くなる。
【０００７】ビウレット法では他にアミノ酸、糖、クレ
アチニンなどの内因性物質、デキストラン、ブロムスル
ファレン（ＢＳＰ）などの薬剤の影響を受ける。ＢＳＰ
は肝機能検査の一つとして色素吸収負荷試験に使用され
るものであり、アルカリ性条件下で波長５８０ｎｍに最
大吸収を持つ。従って、負荷試験後、採血された検体
は、ビウレット試薬による総蛋白質の定量ができないと
言われていた。
アチニンなどの内因性物質、デキストラン、ブロムスル
ファレン（ＢＳＰ）などの薬剤の影響を受ける。ＢＳＰ
は肝機能検査の一つとして色素吸収負荷試験に使用され
るものであり、アルカリ性条件下で波長５８０ｎｍに最
大吸収を持つ。従って、負荷試験後、採血された検体
は、ビウレット試薬による総蛋白質の定量ができないと
言われていた。
【０００８】また、アミノ酸、糖、クレアチニンはいず
れも銅イオンと何らかの複合体を形成して干渉を与える
と考えられている。ビウレット試薬の銅をニッケルに変
えることによりこれらの妨害は回避できるが（臨床化学
（19），300-306，1990）、ニッケルを使用すると反応
が遅いため、自動分析装置で測定することができず、ま
た測定波長がビリルビンと重なるためビリルビンの干渉
を受けてしまうなどの問題点がある。
れも銅イオンと何らかの複合体を形成して干渉を与える
と考えられている。ビウレット試薬の銅をニッケルに変
えることによりこれらの妨害は回避できるが（臨床化学
（19），300-306，1990）、ニッケルを使用すると反応
が遅いため、自動分析装置で測定することができず、ま
た測定波長がビリルビンと重なるためビリルビンの干渉
を受けてしまうなどの問題点がある。
【０００９】Doumasらの方法ではキレート剤に酒石酸ナ
トリウムカリウムを使用しているため、輸液に含まれる
デキストランにより不溶性沈澱を生じ、測定不可能とな
る。そのため、最近ではキレート剤としてＥＤＴＡなど
が使用されているが、このようなキレート力の大きなも
のを使用すると、総蛋白質の定量において、アルカリ度
を高くしないと十分発色しない欠点がある。高濃度のア
ルカリ性物質は取扱いが危険であるだけでなく、環境汚
染物質として有害であり、廃液処理が難しくなるなどの
問題がある。
トリウムカリウムを使用しているため、輸液に含まれる
デキストランにより不溶性沈澱を生じ、測定不可能とな
る。そのため、最近ではキレート剤としてＥＤＴＡなど
が使用されているが、このようなキレート力の大きなも
のを使用すると、総蛋白質の定量において、アルカリ度
を高くしないと十分発色しない欠点がある。高濃度のア
ルカリ性物質は取扱いが危険であるだけでなく、環境汚
染物質として有害であり、廃液処理が難しくなるなどの
問題がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、検体
中の蛋白質と銅イオンとによって錯体を生成させ、該錯
体を発色させて検体中の蛋白質を定量するに際して、高
感度で定量し得る発色方法を提供することにある。
中の蛋白質と銅イオンとによって錯体を生成させ、該錯
体を発色させて検体中の蛋白質を定量するに際して、高
感度で定量し得る発色方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の課
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アルカリと
して水酸化リチウムを用いることで、優れた発色感度を
得られること、それによりアルカリ濃度の低減化が可能
なことを見出した。かかる発色方法を用いることで、ア
ルカリ濃度の低減化、それに基づく反応液の粘度の低下
が可能となり、誤差の少ない、再現性の高い蛋白質の定
量方法を確立することに成功した。
題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、アルカリと
して水酸化リチウムを用いることで、優れた発色感度を
得られること、それによりアルカリ濃度の低減化が可能
なことを見出した。かかる発色方法を用いることで、ア
ルカリ濃度の低減化、それに基づく反応液の粘度の低下
が可能となり、誤差の少ない、再現性の高い蛋白質の定
量方法を確立することに成功した。
【００１２】本発明は以下の通りである。 （１）検体中の蛋白質と銅イオンとによって錯体を生成
させ、該錯体を発色させて検体中の蛋白質を定量するに
際して、水酸化リチウムによってアルカリ条件とするこ
とによって錯体を発色させることを特徴とする錯体の発
色方法。
させ、該錯体を発色させて検体中の蛋白質を定量するに
際して、水酸化リチウムによってアルカリ条件とするこ
とによって錯体を発色させることを特徴とする錯体の発
色方法。
【００１３】本発明においては、蛋白質が発色しない条
件下で検体を銅イオンと混合した後、アルカリ溶液と混
合して蛋白質と銅イオンの錯体を形成させて発色させ
る。主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度差を
測定し、標準液の吸光度と比較して検体中の総蛋白質量
を定量する。
件下で検体を銅イオンと混合した後、アルカリ溶液と混
合して蛋白質と銅イオンの錯体を形成させて発色させ
る。主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度差を
測定し、標準液の吸光度と比較して検体中の総蛋白質量
を定量する。
【００１４】ここで、「検体」とは、蛋白質の定量を実
施し得るものであれば、その由来、形状等、特に限定さ
れず、蛋白質を含有するか否かは問わない。具体的には
血液、血漿、血清、尿、腹水、汗、涙等の体液や各種抽
出物等が挙げられる。
施し得るものであれば、その由来、形状等、特に限定さ
れず、蛋白質を含有するか否かは問わない。具体的には
血液、血漿、血清、尿、腹水、汗、涙等の体液や各種抽
出物等が挙げられる。
【００１５】本発明の総蛋白質の定量方法においては、
まず最初に銅イオンを含む試薬と検体を反応させた後に
アルカリ溶液を含む試薬と反応させる。銅イオンを含む
試薬としては、本発明の目的に適合するものであれば全
て用いることが出来る。例えば、硫酸銅溶液、塩化銅溶
液、硝酸銅溶液などが例示される。銅イオンの反応液中
での最終濃度は通常、例えば硫酸銅を使用した場合３〜
３０ｍＭ、好ましくは６〜２０ｍＭ程度である。該溶液
はｐＨが１０〜１３であることが好ましい。実施例１お
よび２（図１および２）に示すようにｐＨを１０以上に
することによりヘモグロビン色素、ヘモグロビン蛋白質
およびＢＳＰのようなアルカリ側で発色する色素の干渉
を回避することができる。しかしながらｐＨが１３より
も高くなると蛋白質が発色し、測定が妨害される。
まず最初に銅イオンを含む試薬と検体を反応させた後に
アルカリ溶液を含む試薬と反応させる。銅イオンを含む
試薬としては、本発明の目的に適合するものであれば全
て用いることが出来る。例えば、硫酸銅溶液、塩化銅溶
液、硝酸銅溶液などが例示される。銅イオンの反応液中
での最終濃度は通常、例えば硫酸銅を使用した場合３〜
３０ｍＭ、好ましくは６〜２０ｍＭ程度である。該溶液
はｐＨが１０〜１３であることが好ましい。実施例１お
よび２（図１および２）に示すようにｐＨを１０以上に
することによりヘモグロビン色素、ヘモグロビン蛋白質
およびＢＳＰのようなアルカリ側で発色する色素の干渉
を回避することができる。しかしながらｐＨが１３より
も高くなると蛋白質が発色し、測定が妨害される。
【００１６】銅イオンを含む試薬は総蛋白質定量用試薬
において、第１試薬として含めることができる。該第１
試薬には所望により適宜キレート剤を含めることができ
る。使用できるキレート剤としてはＥＤＴＡ、酒石酸ナ
トリウムカリウム、グリコールエーテル、ジアミン四酢
酸などが例示される。キレート剤の反応液中での最終濃
度は通常、銅イオンの１〜１０倍、好ましくは１．２〜
３倍である。検体中に混在する可能性のある輸液由来の
デキストランによる不溶性沈澱の形成を回避するために
は、好ましくはＥＤＴＡが用いられる。
において、第１試薬として含めることができる。該第１
試薬には所望により適宜キレート剤を含めることができ
る。使用できるキレート剤としてはＥＤＴＡ、酒石酸ナ
トリウムカリウム、グリコールエーテル、ジアミン四酢
酸などが例示される。キレート剤の反応液中での最終濃
度は通常、銅イオンの１〜１０倍、好ましくは１．２〜
３倍である。検体中に混在する可能性のある輸液由来の
デキストランによる不溶性沈澱の形成を回避するために
は、好ましくはＥＤＴＡが用いられる。
【００１７】本発明において後で添加するアルカリ溶液
も本発明の目的に適合するものであれば全て用いること
が出来る。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化リチ
ウム、水酸化カリウムなどが挙げられ、より好ましくは
水酸化リチウムが用いられる。アルカリ濃度が高いほ
ど、発色感度は高くなるが、本発明においては２試薬法
を用いているため第２試薬のアルカリ溶液のアルカリ度
が高いとその分粘性も増加し、分注時の誤差を生じ再現
性が低下する。しかしながら、水酸化リチウムは例えば
水酸化ナトリウムと比較した場合約１／３の濃度で同じ
感度が得られ、第２試薬の粘度を低く抑えることがで
き、結果として、再現性の低下を抑えることができる。
も本発明の目的に適合するものであれば全て用いること
が出来る。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化リチ
ウム、水酸化カリウムなどが挙げられ、より好ましくは
水酸化リチウムが用いられる。アルカリ濃度が高いほ
ど、発色感度は高くなるが、本発明においては２試薬法
を用いているため第２試薬のアルカリ溶液のアルカリ度
が高いとその分粘性も増加し、分注時の誤差を生じ再現
性が低下する。しかしながら、水酸化リチウムは例えば
水酸化ナトリウムと比較した場合約１／３の濃度で同じ
感度が得られ、第２試薬の粘度を低く抑えることがで
き、結果として、再現性の低下を抑えることができる。
【００１８】アルカリ溶液を含む試薬は総蛋白質定量用
試薬において、第２試薬として含めることができる。反
応液中のアルカリの最終濃度としては、水酸化ナトリウ
ムを使用した場合０．２〜２Ｍ、好ましくは０．３〜１
Ｍ程度であり、水酸化リチウムを使用した場合０．２〜
０．５Ｍ、好ましくは０．３５〜０．４５Ｍ程度であ
る。
試薬において、第２試薬として含めることができる。反
応液中のアルカリの最終濃度としては、水酸化ナトリウ
ムを使用した場合０．２〜２Ｍ、好ましくは０．３〜１
Ｍ程度であり、水酸化リチウムを使用した場合０．２〜
０．５Ｍ、好ましくは０．３５〜０．４５Ｍ程度であ
る。
【００１９】自動分析装置の分注精度に影響されず、再
現性を低下させないためには、本発明においてはじめに
加える第１試薬である銅イオンを含む試薬の液量の方が
後で加える第２試薬であるアルカリ溶液を含む試薬の液
量よりも多いことが好ましい。
現性を低下させないためには、本発明においてはじめに
加える第１試薬である銅イオンを含む試薬の液量の方が
後で加える第２試薬であるアルカリ溶液を含む試薬の液
量よりも多いことが好ましい。
【００２０】
【実施例】本発明をより詳細に説明するために、以下に
実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定され
るものではない。
実施例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定され
るものではない。
【００２１】実施例１ 第１試薬には１５ｍＭ硫酸銅、３０ｍＭＥＤＴＡ、０．
１Ｍグリシンを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを７〜１
３まで変化させて調整したものを用いた。第２試薬は２
Ｍ水酸化リチウムになるように調製した。５ｇ／ｄｌヘ
モグロビンを蛋白質濃度既知（７．７ｇ／ｄｌ）のヒト
血清に１／１０容量添加した。調製したヘモグロビン添
加検体（ヒト血清蛋白質：７．７ｇ／ｄｌ×０．９＝
６．９３ｇ／ｄｌ、ヘモグロビン蛋白質：５ｇ／ｄｌ×
０．１＝０．５ｇ／ｄｌ）、８ｇ／ｄｌ蛋白質標準液お
よび生理食塩水各々１０μｌに第１試薬４００μｌを加
え、３７℃で５分間反応後、試薬ブランク（生理食塩
水）を対照に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍにお
ける各々の吸光度差を測定する。次に第２試薬１００μ
ｌを加え３７℃で５分間反応後、再度各々の吸光度差を
測定する。前後の吸光度差を容量補正して吸光度差を求
める。ヘモグロビン添加検体の吸光度差と蛋白質標準液
の吸光度差を比較してヘモグロビン添加検体の蛋白質濃
度を求める。各ｐＨにおけるヘモグロビン添加検体の総
蛋白質濃度をプロットした（図１）。
１Ｍグリシンを加え、水酸化ナトリウムでｐＨを７〜１
３まで変化させて調整したものを用いた。第２試薬は２
Ｍ水酸化リチウムになるように調製した。５ｇ／ｄｌヘ
モグロビンを蛋白質濃度既知（７．７ｇ／ｄｌ）のヒト
血清に１／１０容量添加した。調製したヘモグロビン添
加検体（ヒト血清蛋白質：７．７ｇ／ｄｌ×０．９＝
６．９３ｇ／ｄｌ、ヘモグロビン蛋白質：５ｇ／ｄｌ×
０．１＝０．５ｇ／ｄｌ）、８ｇ／ｄｌ蛋白質標準液お
よび生理食塩水各々１０μｌに第１試薬４００μｌを加
え、３７℃で５分間反応後、試薬ブランク（生理食塩
水）を対照に主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍにお
ける各々の吸光度差を測定する。次に第２試薬１００μ
ｌを加え３７℃で５分間反応後、再度各々の吸光度差を
測定する。前後の吸光度差を容量補正して吸光度差を求
める。ヘモグロビン添加検体の吸光度差と蛋白質標準液
の吸光度差を比較してヘモグロビン添加検体の蛋白質濃
度を求める。各ｐＨにおけるヘモグロビン添加検体の総
蛋白質濃度をプロットした（図１）。
【００２２】第１試薬のｐＨを１１付近にすることによ
り、ヘモグロビン色素だけでなくヘモグロビン蛋白質の
影響も受けなくなる。ヘモグロビン蛋白質の影響を受け
ないことは測定方法としては問題であるが、臨床的な診
断に使用される場合、ヘモグロビン蛋白質の影響を受け
ないほうが良い。本発明は第１試薬のｐＨを調節するこ
とにより、溶血による（ヘモグロビン色素＋ヘモグロビ
ン蛋白質）の干渉を回避できる。
り、ヘモグロビン色素だけでなくヘモグロビン蛋白質の
影響も受けなくなる。ヘモグロビン蛋白質の影響を受け
ないことは測定方法としては問題であるが、臨床的な診
断に使用される場合、ヘモグロビン蛋白質の影響を受け
ないほうが良い。本発明は第１試薬のｐＨを調節するこ
とにより、溶血による（ヘモグロビン色素＋ヘモグロビ
ン蛋白質）の干渉を回避できる。
【００２３】実施例２ ５ｇ／ｄｌヘモグロビンに代えて１０ｍＭＢＳＰ溶液を
用いる以外は実施例１と同様に操作した。ＢＳＰ添加検
体の吸光度差と蛋白質標準液の吸光度差を比較してＢＳ
Ｐ添加検体の総蛋白質濃度を求める。各ｐＨにおけるＢ
ＳＰ添加検体の蛋白質濃度をプロットした（図２）。
用いる以外は実施例１と同様に操作した。ＢＳＰ添加検
体の吸光度差と蛋白質標準液の吸光度差を比較してＢＳ
Ｐ添加検体の総蛋白質濃度を求める。各ｐＨにおけるＢ
ＳＰ添加検体の蛋白質濃度をプロットした（図２）。
【００２４】第１試薬のｐＨを１０以上にすることによ
り、ＢＳＰの干渉を受けなくなる。ただし、ｐＨ１３以
上では蛋白質が発色することからｐＨは１０〜１３の範
囲で使用することが望ましい。
り、ＢＳＰの干渉を受けなくなる。ただし、ｐＨ１３以
上では蛋白質が発色することからｐＨは１０〜１３の範
囲で使用することが望ましい。
【００２５】実施例３ 第１試薬には１５ｍＭ硫酸銅、３０ｍＭＥＤＴＡ、０．
１Ｍグリシン、０．８Ｍ炭酸ナトリウムを加えｐＨ１
１．３に水酸化ナトリウムにて調整したものを用いた。
第２試薬は２Ｍ水酸化リチウムになるように調製した。
２ｇ／ｄｌヒト血清アルブミンに１／１０量の生理食塩
水、乳び、ヘモグロビン、ビリルビン、ＢＳＰおよびビ
ウレット反応陽性と言われているグリシルグリシン、グ
リシン、クレアチニン、尿素、硫酸アンモニウム、グル
コースおよびガラクトースを添加した。各物質はそれぞ
れ表１に記載の添加濃度（検体中濃度）になるように添
加した。各検体について実施例１と同様に操作した。生
理食塩水添加検体を蛋白質濃度１．８０ｇ／ｄｌの標準
液として、各々の検体の総蛋白質濃度を求めた。
１Ｍグリシン、０．８Ｍ炭酸ナトリウムを加えｐＨ１
１．３に水酸化ナトリウムにて調整したものを用いた。
第２試薬は２Ｍ水酸化リチウムになるように調製した。
２ｇ／ｄｌヒト血清アルブミンに１／１０量の生理食塩
水、乳び、ヘモグロビン、ビリルビン、ＢＳＰおよびビ
ウレット反応陽性と言われているグリシルグリシン、グ
リシン、クレアチニン、尿素、硫酸アンモニウム、グル
コースおよびガラクトースを添加した。各物質はそれぞ
れ表１に記載の添加濃度（検体中濃度）になるように添
加した。各検体について実施例１と同様に操作した。生
理食塩水添加検体を蛋白質濃度１．８０ｇ／ｄｌの標準
液として、各々の検体の総蛋白質濃度を求めた。
【００２６】比較例１ （Doumasらの方法による定量） １２ｍＭ硫酸銅、３２ｍＭ酒石酸ナトリウムカリウム、
３０ｍＭヨウ化カリウム、０．６Ｍ水酸化ナトリウムを
含む溶液をDoumas試薬として調製する。実施例３で調製
した各検体それぞれ１０μｌにDoumas試薬５００μｌを
加え３７℃で１０分間反応させた後、試薬ブランクを対
照に波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。また、
上記のDoumas試薬から銅を除いた試薬を調製し、同様に
操作して検体盲検を測定した。Doumas試薬を用いた測定
値より検体盲検を差し引いた値を測定した。実施例３の
本発明による各検体の総蛋白質濃度および比較例１のDo
umas試薬による各検体の総蛋白質濃度および該総蛋白質
濃度から検体盲検を差し引いた後の各検体の総蛋白質濃
度の結果を表１に示す。
３０ｍＭヨウ化カリウム、０．６Ｍ水酸化ナトリウムを
含む溶液をDoumas試薬として調製する。実施例３で調製
した各検体それぞれ１０μｌにDoumas試薬５００μｌを
加え３７℃で１０分間反応させた後、試薬ブランクを対
照に波長５４６ｎｍにおける吸光度を測定した。また、
上記のDoumas試薬から銅を除いた試薬を調製し、同様に
操作して検体盲検を測定した。Doumas試薬を用いた測定
値より検体盲検を差し引いた値を測定した。実施例３の
本発明による各検体の総蛋白質濃度および比較例１のDo
umas試薬による各検体の総蛋白質濃度および該総蛋白質
濃度から検体盲検を差し引いた後の各検体の総蛋白質濃
度の結果を表１に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】Doumas試薬を用いた検体盲検を差し引く方
法は、差し引かない方法に比べて明らかに干渉の受け方
に改善が観られた。しかしながら、ビリルビンの干渉に
ついては効果が観られない。検体中のビリルビンは銅イ
オンによりビリベルジンに変化するが、Doumas試薬を用
いた検体盲検を差し引く方法では試薬に銅イオンが入っ
ていないためビリルビンのままであるので検体盲検を差
し引いても補正できないからである。２試薬系で反応、
測定するデュポン社の総蛋白TPも、検体盲検を必要とせ
ず、乳びや溶血による干渉は回避できる。しかしながら
この方法でもビリルビンによる干渉が回避できない。な
ぜなら、デュポン社の総蛋白TPでは、はじめにアルカリ
溶液を、後で銅イオンを添加しているので発色前ではビ
リルビンのままであるが発色後はビリベルジンに変化し
ているため吸光度差にビリルビン−ビリベルジンの干渉
がおこるためである。本発明は２試薬とすること、尚且
つはじめに銅イオンを添加することで乳び、ヘモグロビ
ン、ビリルビン、ＢＳＰおよびビウレット反応陽性物質
に対して干渉を受けなくなる。本発明では発色前後とも
ビリベルジンに変換して測定しているため発色前後の吸
光度差にビリルビン−ビリベルジンの干渉がおこらな
い。
法は、差し引かない方法に比べて明らかに干渉の受け方
に改善が観られた。しかしながら、ビリルビンの干渉に
ついては効果が観られない。検体中のビリルビンは銅イ
オンによりビリベルジンに変化するが、Doumas試薬を用
いた検体盲検を差し引く方法では試薬に銅イオンが入っ
ていないためビリルビンのままであるので検体盲検を差
し引いても補正できないからである。２試薬系で反応、
測定するデュポン社の総蛋白TPも、検体盲検を必要とせ
ず、乳びや溶血による干渉は回避できる。しかしながら
この方法でもビリルビンによる干渉が回避できない。な
ぜなら、デュポン社の総蛋白TPでは、はじめにアルカリ
溶液を、後で銅イオンを添加しているので発色前ではビ
リルビンのままであるが発色後はビリベルジンに変化し
ているため吸光度差にビリルビン−ビリベルジンの干渉
がおこるためである。本発明は２試薬とすること、尚且
つはじめに銅イオンを添加することで乳び、ヘモグロビ
ン、ビリルビン、ＢＳＰおよびビウレット反応陽性物質
に対して干渉を受けなくなる。本発明では発色前後とも
ビリベルジンに変換して測定しているため発色前後の吸
光度差にビリルビン−ビリベルジンの干渉がおこらな
い。
【００２９】
【発明の効果】本発明の総蛋白質の定量方法は２試薬系
の測定方法であるので検体盲検の必要性がなくなり、乳
びおよび溶血の干渉を回避することができる。はじめに
加える試薬に銅イオンを添加することにより、ビリルビ
ンの干渉、ビウレット反応陽性物質であるアミノ酸、糖
類、クレアチニンなどの影響を回避することができる。
さらにはじめに加える試薬のｐＨを１０〜１３に調製す
ることによりヘモグロビン蛋白やＢＳＰなどのアルカリ
側で発色する物質の影響も受けない。また、後で加える
アルカリ溶液を水酸化リチウムで調製することにより少
ないアルカリ量で感度良く測定できるため粘度を低く抑
えることができ、分注時の誤差による再現性の低下が抑
えられる。また使用するアルカリ溶液が少量ですむため
廃液処理が容易で安全な試薬を供給できる。銅イオンを
含む試薬を第１試薬、アルカリ溶液を第２試薬とするこ
とで総蛋白質の定量用試薬を作製することができる。
の測定方法であるので検体盲検の必要性がなくなり、乳
びおよび溶血の干渉を回避することができる。はじめに
加える試薬に銅イオンを添加することにより、ビリルビ
ンの干渉、ビウレット反応陽性物質であるアミノ酸、糖
類、クレアチニンなどの影響を回避することができる。
さらにはじめに加える試薬のｐＨを１０〜１３に調製す
ることによりヘモグロビン蛋白やＢＳＰなどのアルカリ
側で発色する物質の影響も受けない。また、後で加える
アルカリ溶液を水酸化リチウムで調製することにより少
ないアルカリ量で感度良く測定できるため粘度を低く抑
えることができ、分注時の誤差による再現性の低下が抑
えられる。また使用するアルカリ溶液が少量ですむため
廃液処理が容易で安全な試薬を供給できる。銅イオンを
含む試薬を第１試薬、アルカリ溶液を第２試薬とするこ
とで総蛋白質の定量用試薬を作製することができる。
【図１】溶血干渉のｐＨによる影響を示したグラフであ
る。
る。
【図２】ＢＳＰ干渉のｐＨによる影響を示したグラフで
ある。
ある。
Claims (1)
- 【請求項１】 検体中の蛋白質と銅イオンとによって錯
体を生成させ、該錯体を発色させて検体中の蛋白質を定
量するに際して、水酸化リチウムによってアルカリ条件
とすることによって錯体を発色させることを特徴とする
錯体の発色方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000256520A JP3809991B2 (ja) | 2000-08-25 | 2000-08-25 | 錯体の発色方法および発色用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000256520A JP3809991B2 (ja) | 2000-08-25 | 2000-08-25 | 錯体の発色方法および発色用試薬 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17109196A Division JP3220378B2 (ja) | 1996-07-01 | 1996-07-01 | 総蛋白質の定量方法および定量用試薬 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001099826A true JP2001099826A (ja) | 2001-04-13 |
| JP2001099826A5 JP2001099826A5 (ja) | 2004-07-22 |
| JP3809991B2 JP3809991B2 (ja) | 2006-08-16 |
Family
ID=18745117
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| JP2000256520A Expired - Fee Related JP3809991B2 (ja) | 2000-08-25 | 2000-08-25 | 錯体の発色方法および発色用試薬 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3809991B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002350448A (ja) * | 2001-05-30 | 2002-12-04 | Kanto Chem Co Inc | 総蛋白質の定量方法及び定量用試薬 |
| WO2005024430A1 (ja) * | 2003-09-03 | 2005-03-17 | Arkray, Inc. | タンパク質の分析方法およびそれに用いるタンパク質分析試薬 |
| KR102139002B1 (ko) * | 2019-02-27 | 2020-07-28 | 가천대학교 산학협력단 | 구리 화합물을 이용한 세척제 성분 에티드론산의 신속 및 미량 검출 방법 |
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2000
- 2000-08-25 JP JP2000256520A patent/JP3809991B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP2002350448A (ja) * | 2001-05-30 | 2002-12-04 | Kanto Chem Co Inc | 総蛋白質の定量方法及び定量用試薬 |
| JP4602595B2 (ja) * | 2001-05-30 | 2010-12-22 | 関東化学株式会社 | 総蛋白質の定量方法及び定量用試薬 |
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| KR102139002B1 (ko) * | 2019-02-27 | 2020-07-28 | 가천대학교 산학협력단 | 구리 화합물을 이용한 세척제 성분 에티드론산의 신속 및 미량 검출 방법 |
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