WO2005021012A1

WO2005021012A1 - ゲムシタビン封入薬剤担体

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Publication number: WO2005021012A1
Application number: PCT/JP2004/012871
Authority: WO
Inventors: Keisuke Yoshino; Kyoko Shimamura; Shigenori Nozawa; Yasuo Kurosaki
Original assignee: Terumo Kabushiki Kaisha
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2004-08-30
Publication date: 2005-03-10
Also published as: JPWO2005021012A1

Abstract

　ゲムシタビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシタビンの局所濃度を維持することができるゲムシタビン封入薬剤担体の提供。膜で形成される担体であって、前記膜を構成する脂質成分として、リン脂質類とともに、コレステロール類を０～３５ｍｏｌ％未満の比率で含む担体に、ゲムシタビンおよび／またはその塩を封入してなる薬剤担体。　

Description

ίン封入薬剤担体技術分野

本発明は、ゲムシ夕ビンおよび/またはその塩を封入した薬剤担体に関する。背景技術 .

近年、薬剤、 D NA、ペプチドおよびタンパク質を、目的の部位たとえば癌、肺炎、肝炎、腎炎、リンパ腫、血管内皮損傷部位などの病巣部位に、確実に、効率良くかつ安全に薬剤をターゲッティングするためのドラッグデリバリ一システム（D D S ) の研究が盛んになってきている。

たとえば D D Sの薬剤運搬体として、リボソーム、ェマルジヨン、リピッドマイクロスフェア、ナノパーティクルなどの閉鎖小胞を利用し、閉鎖小胞内に薬 IJ を内包させる方法、また高分子合成ポリマーミセルゃ多糖体等の高分子運搬体を利用し、薬剤を包含または結合させる方法、さらにはこれら閉鎖小胞や高分子運搬体の標的指向性を高めるために、抗体、蛋白質等の高分子機能性分子あるいは特定の糖鎖、ぺプチド等の低分子機能性分子で表面修飾する方法などが研究されている。

しかしながら、これら薬剤運搬体の実用化に際しては、克服すべき様々な問題点があり、中でも生体側の異物認識機構からの回避、体内動態の制御の困難さが問題となり、実用性を向上させるための様々な検討がなされている。たとえばリン脂質からなるリポソーム膜にコレステロールを取り込ませると、リン脂質の平均分子専有面積は低下し、脂質分子のパッキングが密になることにより、膜安定化効果を示す。リン脂質とコレステロールとのモル比 1 ： 1のものが血清中でも酵素に対しても安定である（寺田弘ら、「ライフサイエンスにおけるリポソ一ム」シュプリンガー ·フエアラーク東京（1992) ) 。

またたとえば薬剤の標的とするや細胞への選択性の高い送達性の問題は、薬剤運搬体の親水性高分子による修飾により解決することが可能になっている。具体的には、特に閉鎖小胞は、血液中のォプソニン蛋白質や血漿蛋白質との相互作用による凝集、あるいは肝臓、脾臓等の細網内皮系組織 (R E S) での捕捉のため、標的とする組織や細胞への選択性の高い送達が困難であるという問題に対し、これら閉鎖小胞および高分子運搬体の表面をポリエチレングリコール（P E G) 等の親水性高分子で被覆することにより、血漿蛋白やォプソニン蛋白質などの吸着を防止して血中安定性を高め、 R E Sでの捕捉を回避することが可能となってきていた ( "LIPOSOMES from Phys ics to Appl i cat i ons" Elsevi er, D. D. Las i c著（1993) ) 。このように親水性高分子で被覆されることにより、リポソ一ムなどの閉鎖小胞は、高い血中滞留性が得られるため、腫瘍組織や炎症部位などの血管透過性が亢進したに受動的に集積させられるようになっている。

ところで、細胞周期特異的代謝拮抗物質を用いて最適の钪癌治療を行うには、長期間にわたって薬剤の局所濃度を維持することが必要とされるが、このような薬剤は静脈内または皮下投与後の半減期が数時間と短いという事実がある。これらの薬剤は、治療的濃度の医薬を送達するのに使用できる制御放出製剤が有用であり、このアプローチの 1つとしてリボソームへの封入が研究されている。たとえば、代謝拮抗物質であるシトシンァラビノシド（別称シ夕ラビンまたは

Ar a-C) などのいくつかの低分子量の薬剤を封入したリボソームの報告がある (Kim ら、 Biochim. Biophys. Acta, 728:339-348(1983) ) 。ここでは、脂質膜中にコレステロールを含有するリボソームを調製しているが、ここで報告される封入効率は比較的低く、生物学的流体中への封入分子の放出速度は速い。ゲムシタビンなどの代謝拮抗剤をリポゾームに封入した場合、代謝拮抗剤がリポソ一ムの脂質成分を加水分解することにより、封入した薬剤の外部への放出を促進する（R.Moog ら、 International Journal of Pharmaceutics, 206:43-53(2000)) 。また、抗 HI V薬剤として知られるジデォキシシチジン（別称ザルシタビン）をリボソーム化した場合、コレステロール非存在下では放出速度が抑えられると報告しているが、 Kim らの報告と同様に放出速度は速い（Body Makabi-Panzu ら、 Cellular and Molecular Biology 44(2), 277-284(1998))。

以上のように、低分子量の薬剤を封入したリボソームは薬剤の放出速度が速いことが知られており、これを改善する方法として、リボソーム脂質濃度の高いリポソ一ム製剤を高圧均質化によりゲル化し、リボソームに内封されていない遊離薬剤たとえばゲムシ夕ビンと、リポソ一ムに内封された薬剤とが混在するリポソ一ムゲル（Vesicular Phospholipid Gel, VPG) の調製方法の開示がある' (R.Moog ら、 Cancer Chem. ¾&01,49:356-366(2002)ぉょび特表2002-50 9866号公報）。この方法では、リボソームの内部と外部の薬剤の濃度を同じにすることで拡散による薬剤のリポソ一ム内部から外部への放出速度を抑えることはできるが、投与後リボソーム外部の薬剤が急速に血中に拡散する。放出速度を抑えていた薬剤濃度を維持することができず、リポソーム内部からの薬剤の急速な拡散が生じ、血中での放出速度を抑えるという根本的解決には至っていない。発明の開示

本発明者は、薬剤として、長期間にわたって局所濃度の維持が必要とされる代謝拮抗物質のうちでも、特にゲムシ夕ビンを封入する薬剤担体のゲムシ夕ビン放出速度について検討し、それを抑制するという課題を、担体の膜構成成分によつて克服し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明では、ゲムシ夕ビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシ夕ビンの局所濃度を維持することができるゲムシ夕ビン封入薬剤担体を提供することを目的としている。上記課題は以下の本発明により解決される。

(1) 膜で形成される担体であって、前記膜を構成する脂質成分として、リン月旨質類とともに、コレステロール類を 0〜 35 mo 1 %未満の比率で含む担体に、ゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を封入してなる薬剤担体。

(2) 前記コレステロール類の比率が 13〜35mo 1 %未満である上記（1) の薬剤担体。

(3) 前記コレステロール類がコレステロールおよび Zまたはコレスタノ一ルである上記（1) または（2) の薬剤担体。

(4) 前記担体がリボソームである上記（1) ないし（3) のいずれかの薬剤担体。

すなわちリボソーム膜構成成分中にコレステロール類を含まないか、または 3 5mo 1 %未満、好ましくは 13mo 1 %以上ないし 35mo 1 %未満の量でコレステロール類を含むゲムシ夕ビンおよび/またはその塩のリポソーム製剤が提供される。

(5) 前記膜が、前記リン脂質類およびコレステロール類以外の脂質類、および表面修飾剤からなる群から選ばれる少なくとも一つの構成成分をさらに含有する上記（1) ないし（4) のいずれかの薬剤担体。

(6) 前記表面修飾剤が、ポリエチレングリコール誘導体および Zまたは荷電物質である上記（5) の薬剤担体。

ポリエチレンダリコール誘導体は、ポリエチレンダリコールの脂質誘導体が好ましく挙げられる。このポリエチレングリコール部分の分子量は、通常、 500 〜10, 000程度である。

荷電物質としては、カチオン化脂質が好ましく挙げられる。

(7) 前記薬剤担体が、安定化剤おょ«化防止剤からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに含有する上記（1) ないし（6) のいずれかの薬剤担体。

(8) 上記（1) ないし（7) のいずれかの薬剤担体を含有する医薬組成物。

(9) 予防および/または治療有効量の（1) ないし（7) のいずれかの薬剤担体を宿主に投与することからなる、疾患の予防および Zまたは治療方法。

(10) (1) ないし（7) のいずれかの薬剤担体を宿主に投与することからなる、有効量のゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を宿主内で放出する方法。

(11) (1) ないし（7) のいずれかの薬剤担体を宿主に投与することからなる、有効量のゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を標的部位に暴露する方法。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 1および比較例 1で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リポソ一ムの 3 緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシ夕ピン放出率で示す図である。図 2は、実施例 1および比較例 1で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リポソ一ムの 1 0 %ゥシ胎児血清存在下での 3 7 °C緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシ夕ビン放出率で示す図である。

図 3は、実施例 2〜 3および比較例 2〜 3で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リポソ一ムの 3 7 °C緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシ夕ビン放出率で示す図である。

図 4は、実施例 4および比較例 4で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リボソームの 3 7 °C緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシ夕ビン放出率で示す図である。図 5は、実施例 4および比較例 4で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リポソームの 1 0 %ゥシ胎児血清存在下での 3 7 °C緩衝液中における安定性を塩酸ゲムシ夕ビン放出率で示す図である。

図 6は、実施例 5および比較例 5で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リボソームをマウスに静脈注射した後の採血時間における血漿中の塩酸ゲムシ夕ビン濃度を示す図である。

図 7は、実施例 6で得られた塩酸ゲムシ夕ビン封入リポソームをマウスに静脈注射した後の採血時間における血漿中の塩酸ゲムシ夕ビン濃度を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に、より詳細に本発明を説明する。

本発明は、基本的にリン脂質類からなる膜に、コレステロール類を所定の範囲の特定比率で含ませた担体に、薬剤として特にゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を封入させた薬剤担体を提供する。

ゲムシ夕ビン（gemcitabine ) は、特異性の高い代謝拮抗作用を有するデォキシシチジン誘導体である。既存物質として、 CAS No.95058- 81- 4のゲムシ夕ビン（化学名（土） -2'-デォキシ- 2'，2'-ジフルォロシチジン（分子式 C ₉H₁₁F₂N₃0₄ 分子量 263.20) 、および CASNo.122111-03- 9のゲムシ夕ビン塩酸塩 (gemc itabine · HC 1) (分子量 299.66) がある。本発明では、ゲムシ夕ビンとして、通常、ゲムシ夕ビン: ¾塩（以下、塩酸ゲムシ夕ビンと称することがある。）を担体に封入させる。

本明細書において、「ゲムシ夕ビンおよび Zまたはその ¾J を、単に「ゲムシ夕ビン」または「薬剤」と称することがある。

ゲムシタビンの合成方法は、たとえば米国特許 4， 526, 988号明細書、同 4, 808, 614号明細書、同 5, 223, 608号明細書に記載されており、これら記載の引用により本明細書にも記載されているものとする。

本発明において、ゲムシ夕ビンを封入する担体の主膜材は、閉鎖小胞体形成能を有するものが望ましく、リン脂質類が選択される。主膜材とは、脂質膜の構成成分中最も高い含率を示す成分である。

リン脂質類は、生体膜の主要構成成分であり、分子内に長鎖アルキル基より構成される疎水性基とリン酸基より構成される親水性基のグループを持つ両親媒性物質である。

リン脂質類としては、リン脂質またはその誘導体が挙げられ、特に限定されないが、たとえばフォスファチジルコリン（レシチン）、フォスファジルグリセロール、フォスファチジン酸、ジステアロイルフォスファチジルコリン - - Distearoyl Phosphatidylcholine, DSPC) 、ジパルミトイルフォスファチジルコリン (DP PC) 、ジミリストイルフォスファチジルコリン (DMPC) 、卵黄フォスファチジルコリン (EPC) 、フォスファチジルエタノールァミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフインゴミエリン、カルジォリピン等の天然あるいは合成のリン脂質、またはこれらを常法にしたがって水素添加したもの、たとえば水素添加大豆レシチン（Hydrogenated soybean phosphatidylcholine, HSPC) 、水素添加卵黄レシチン（HEP C) 等を挙げることができる。

本発明において、担体の膜を形成する脂質成分は、上記リン脂質類とともに特定比率のコレステロール類を含有している。

本発明において、「コレステロール類」とは、コレステロールまたはその誘導体であり、シクロペンタノヒドロフエナントレン環を有するステロール類である。コレステロ一ル類の具体例としては特に限定されないが、コレステロールまたはコレスタノ一ルが挙げられる。これらは、以下に示すコレステロール類の量範囲であれば、脂質膜中に、コレステロール類として異なるコレステロール類が複数混在していてもよいし、単一のコレステロ一ル類が含有されていてもよい。リン脂質類とコレステロール類とは、薬剤担体を閉鎖小胞として形成する脂質二重層（膜）の構成成分である。

本発明において、担体の膜を構成する脂質成分中、コレステロール類の占める比率（含有比率； Cho 1比率）は、所定の範囲の「特定比率」であり、 0〜3 5 mo 1 %未満（具体的にはコレステロール類/脂質成分 =32Z92mo 1 % (=34.78mo 1 %) 程度以下）である。 35mo 1 %より高いと、薬剤担体に封入される薬剤（ゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩）の放出性が望まれる範囲より高くなり、好ましくない。上記コレステロール類の含有比率（C h o 1 比率）は、好ましくは 1〜3 5 m o 1 %未満（= 3 4. 7 8 m o 1 %以下）であり、より好ましくは 1 3〜3 5 m o 1 %未満であり、さらに好ましくは 2 4〜3 5 m o 1 %未満である。

なお上記「担体の膜を構成する脂質成分 j 量は、脂質の合計量であり、このうちに脂質の表面修飾剤などは含まれない。

また本発明において、膜構成成分に、後述するカチオン化剤を含む場合（すなわち力テオン化脂質膜の場合）には、上記「脂質成分」の語に対し、リン脂質類、コレステロール類およびカチオン化脂質を含む「総脂質」の語が使用される。ただし、表面修飾剤のうち、後述の P E G誘導体（たとえば P E G-P E) は、この総脂質には含まれない。

上記脂質二重層（膜）は、リン脂質類およびコレステロール類以外の物質を一または二以上含有していてもよい。膜に含ませる他の物質としては、本発明の効果を発揮し得るものであればよく、特に限定されないが、その安全性、生体内における安定性などを考慮すると、リン脂質類以外の脂質類、表面修飾剤などが挙げられる。

リン脂質類以外の脂質類とは、分子内に長鎖アルキル基等より構成される疎水性基を有し、リン酸基を分子内に含有しない脂質およびその誘導体であり、特に限定されないが、グリセ口糖脂質、スフインゴ糖脂質等を挙げることができる。表面修飾剤としては、特に限定されないが、荷電物質、親水性高分子、ダルク口ン酸、シアル酸、デキストランなどの水溶性多糖類の誘導体が挙げられる。 12871

10 荷電物質の中でも正に荷電する物質（脂質のカチオン化剤）としては、ステアリルァミンおよび W0 9 7 /4 1 6 6 (この記載の引用により本明細書に記載されているものとする）に開示されるアミジン類たとえば 3， 5-ジペン夕デシ口キシベンズアミジン塩酸塩などの塩基性物質、 N-ァシル -アルギニン等の塩基性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。 '

負に荷電する物質としては、ォレイン酸、ステアリン酸等の脂肪酸、ガンダリオシド GM 1 、ガンダリオシド GM 3 等のシアル酸を有するガングリオシド類、 N -ァシル -グルタミン等の酸性アミノ酸系界面活性剤などが挙げられる。

親水性高分子としては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール（P E G) 、デキスト^ン、プルラン、フイコール、ポリビニルアルコール、スチレン-無水マレイン酸交互共重合体、ジビニルエーテル-無水マレイン酸交互共重合体、合成ポリアミノ酸、アミロース、アミロぺクチン、キトサン、マンナン、シクロデキストリン、ぺクチン、カラギ一ナンなどが挙げられる。これらの中でも、ポリエチレングリコールは血中滞留性を向上させる効果があり、好ましい。

薬剤担体の表面に親水性高分子を存在させるために、前記の親水性高分子を疎水性ィ匕合物と結合させた誘導体を用いることができる。このような誘導体とすることにより、疎水性化合物部位が疎水性の脂質膜に挿入された状態で安定に存在する。それに伴い、親水性高分子部位が担体の膜表面（外側）に安定化される。疎水性ィ匕合物としては、特に限定されないが長鎖脂肪族アルコール、ステロール、ポリオキシプロピレンアルキル、またはダリセリン脂肪酸エステル等が挙げられる。親水性高分子と疎水性化合物とを結合させた誘導体としては、 P E G誘導体が挙げられ、特に限定されないが、ポリエチレングリコール-フォスファチジルエタノールァミン（PEG- PE) 等が例示される。

PEG誘導体を構成する PEGの分子量としては、特に限定されないが、通常 500〜； 10, 000程度であり、好ましくは 1, 000〜 7, 000、より好ましくは 1> 00ひ〜 5, 000である。

担体中の PEG誘導体は、上記総脂質量に対する比率で、通常 0〜20mo 1 %で存在することができ、好ましくは 0.1〜1 Omo 1 %、より好ましくは 0. l〜5mo 1 %、さらに好ましくは 0.5〜5mo 1 %である。

本発明において、担体は、ゲムシ夕ビンを封入することができれば、様々な形態をとることができる。

ここで、「封入」とは、薬剤 (ゲムシ夕ビン) が、脂質膜で形成される担体の閉鎖空間に内封された状態、膜を構成する脂質層内に一部または全ての部分が含まれて担持されている状態、または担体の外表面に薬剤が付着して担持された状態であることを意味する。

本発明では、特に限定されないが、薬剤を内封する構造を有することが望ましい。特に好ましい担体は、膜構成成分の疎水性基と親水性基の極性に基づいて生ずる膜により外界から隔てられた空間を形成する構造を有する閉鎖小胞であり、特に限定されないがたとえばリボソームである。リボソームとはリン脂質類を基本とする質二重層からなる閉鎖小胞である。

また担体の形状は、球状またはそれに近い形態をとることができ、その粒径の大きさ（粒子外径の直径）は、特に限定されないが、 0.02〜250 m, 好ましくは 0.03〜0.4 mの大きさであり、より好ましくは 0.05〜0.2 m (50~200 nm) である。本発明の薬物担体は、投与経路次第で医薬的に許容される安定化剤および Zまたは酸化防止剤をさらに含むものであってもよい。安定化剤としては、特に限定されないが、グリセロール、シュクロースなどの糖類が挙げられる。酸化防止剤としては、特に限定されないがァスコルビン酸、尿酸あるいはトコフエロール同族体たとえばビタミン Eなどが挙げられる。トコフエロールには、、 β、了、 δの 4個の異性体が存在するが本発明においてはいずれも使用できる。

本発明の薬剤担体は、投与経路次第で医薬的に許容される添加物をさらに含むものであってもよい。このような添加物の例として、 7 生理食塩水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、力ルポキシビ二ルポリマ一、カルポキシメチルセル口一スナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルポキシメチルスターチナトリウム、ぺクチン、メチルセルロース、ェチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコ一ル、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン (H S A) 、マンニ 1 ル、ソルビトール、ラク！ ^一ス、 P B S、生体内分解性ポリマー、無血清培地、医薬添加物として許容される界面活性剤あるいは生体内で許容し得る生理的 P Hの緩衝液などが挙げられる。

添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜選択され、あるいはそれらを組合せて使用されるが、これらに限定されるものではない。

本発明では、これら添加物を含む態様の薬物担体を、医薬組成物として供することができる。本発明の医薬組成物は、通常の方法、たとえば 0〜8 °Cでの冷蔵保存することができる。

本発明の薬剤担体は、常法によって得ることができる。薬剤担体の一例として、リポソ一ムである場合の製造方法を以下に示すが、これに限定されない。

フラスコ内で、リン脂質類およびコレステロール類、さらに必要に応じて他の担体の膜構成成分を、クロ口ホルム等の有機溶媒により混合し、有機溶媒を留去後に真空乾燥することによりフラスコ内壁に薄膜を形成させる。次に、このフラスコ内に薬剤を加え、激しく撹拌することにより、リボソーム分散液を得る。得られたリボソーム分散液を遠心分離し、上清をデカンテーションし封入されなかった薬剤を除去することにより、薬剤担体を分散液として得ることができる。またリボソームは、上記方法以外にも、上記の各構成成分を混合し、高圧吐出型乳化機により高圧吐出させることにより得ることもできる（寺田、吉村ら、「ライフサイエンスにおけるリポソ一ム J シュプリンガー ·フエアラーク東京 (1992) )

薬剤を担体に封入するために P H勾配法を用いることができる（G. Gregoriadis 編「Liposome Technology Liposome Preparation and Related Techniques 」 2nd edition, Vol.1- III, CRC Press) 。

なお上記各文献の記載は、これを弓 I用することにより本明細書に記載されているものとする。

また、 PEG-PEを脂質膜に結合した物質を脂質二重層に含む薬剤担体としては以下の方法によって得ることができるが、これに限定されるものではない。リポゾーム形成脂質と P EG-PEを予め均一に混合してリポソームを形成させてもよく、 PEG- PEを含まないリボソーム形成脂質を混合して得られた混合脂質を用いて常法によりリポソ一ムを形成させた後に P E G- P Eを添加してもよい。

本発明の薬剤担体は、ゲルろ過、透析、膜分離および遠心分離等の通常用いられる方法で精製することにより、薬剤担体に封入されなかった薬剤を除去することができる。薬剤担体は封入されなかった薬剤を除去するための段階を経て供される。したがって、薬剤担体の内部と薬剤担体の外部とでは、脂質二重層（膜）を介して薬剤の濃度勾配が生じ得る。好ましくは、本発明の薬剤担体は、調製後に脂質二重層の外部に、脂質二重層に封入されなかった薬剤を有さない。そして、薬剤担体に封入された薬剤を内部から外部環境へ放出する。

なお「封入率」とは、担体の構成成分とゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩とを混入して、それを封入した薬剤担体を形成する際に、混入した薬剤（仕込み量）に対する担体に封入された薬剤の比率（重量比または m o 1比）をいう。本発明の薬剤担体は、薬剤を封入した状態で標的部位まで到達し、その結果封入する薬剤を標的部位まで送達する。薬剤の標的部位への送達は、担体に封入された薬剤を標的部位へ取りこませることであってもよいし、標的部位に取りこまれずとも薬剤の影響を標的部位またはその近傍へ及ぼすことであってもよい。本発明において、「放出」とは、薬剤担体に封入された薬剤が薬剤担体を構成する脂質膜を通過することにより、または脂質膜の一部の構造が変わることにより閉鎖小胞の外部へ出てくることを意味する。

「放出率」とは、担体の構成成分とゲムシ夕ビンおよび/またはその塩を封入した薬剤担体から閉鎖小胞の外部へ出てくる薬剤と、担体に封入された薬剤との比率（重量比または m o 1比）をいう。 4 012871

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「放出率が低い」とは単位時間あたりに閉鎖小胞の外部へ出てくる薬剤量が少ないことを意味する。本発明の薬剤担体は、膜構成成分としてコレステロール類を特定比率で含有することにより、好適な放出率を示す。薬剤担体を宿主に投与する場合、特に標的部位に局所的に投与される場合、コレステロール類を上記の範囲とすることにより、好ましい効果が期待される。

実施例に示すように、本発明の薬剤担体について封入された薬剤の放出率を測定レたところ、低い放出率が認められた。放出率は、本発明の薬剤担体を遠心にて沈降させ、上清に存在する薬剤の量と藥剤担体を測定することにより計算することができる。

本発明において、「血中滞留性」とは、薬剤担体を投与した宿主において、担体に封入された状態の薬剤が血液中に存在する性質を意味する。薬剤が担体から放出されると速やかに血中から消失し、薬剤が暴露した部位へ作用する。血中滞留性が良いとより少ない量の薬剤を投与することが可能である。本発明の薬剤担体は、膜構成成分としてコレステロール類を特定比率で含有することにより、好適な血中滞留性を示す。

本発明において、「標的部位」とは薬剤担体が封入する薬剤 (ゲムシ夕ビン) が放出されて作用する特定の部位であり、部位ごとに特定された細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部を意味する。細胞、糸織、器官または臓器およびそれらの内部などの標的部位は薬剤による治療の対象となる部位であることができ、放出された薬剤が暴露することにより、その効果を発揮する。

本発明における標的部位としては、特に限定されないが腫瘍が挙げられる。治療の対象となる腫瘍としては、特に限定されないが固形腫瘍であり、具体的には 2004/012871

16 食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、喉頭癌、肺癌、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌または卵巣癌が挙げられる。標的部位は、腫瘍の細胞、組織、器官または臓器およびそれらの内部などである。したがって、本発明において、疾患とは前記の腫瘍を意味し、薬剤はそれらに対し抗腫瘍効果を示すことが期待される。本発明において、「暴露」とは、薬剤担体の外部へ放出された薬剤が外部環境へ作用を及ぼすことを意味する。具体的には、放出された薬剤（ゲムシ夕ビン）は、標的部位に近接し、接触することによりその作用である抗腫瘍効果を発揮する。薬剤が標的部位に作用することにより、標的部位の D N A合成が行われている細胞周期にある細胞に局所的に作用し、期待された効果を示す。このような効果を示すために、薬剤担体からの薬剤の放出率と薬剤担体の血中滞留性との均衡を保つ必要がある。

本発明の薬剤担体は、ゲムシ夕ビンおよび/またはその塩を好ましい放出速度にて放出し、所望の標的部位を暴露するために使用される。したがって、本発明において、有効量のゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を封入する薬剤担体を宿主に投与することにより、宿主の疾患の予防および Zまたは治療のため、宿主内で有効量のゲムシ夕ビンおよび/またはその塩を放出するため、または有効量のゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を標的部位に暴露するために、宿主（患者）に非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。投与対象の宿主としては、哺乳動物、好ましくはヒト、サル、ネズミ、家畜等が挙げられる。

非経口的投与の経路としては、たとえば点滴などの静脈内注射（静注）、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。本発明の薬剤担体は、病気に既に悩まされる患者に、疾患の症状を治癒する力あるいは少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。たとえば、薬剤担体に封入される薬剤の有効投与量は、一日につき体重 1 kgあたり 0. O lmgから 10 Omgの範囲で選ばれる。しかしながら、本発明の薬剤担体はこれらの投与量に制限されるものではない。投与時期は、疾患が生じてから投与してもよいし、あるいは疾患の発症が予測される時に発症時の症状緩和のために予防的に投与してもよい。また、投与期間は、患者の年齢、症状により M:選択することができる。

具体的な投与方法としては、医薬組成物をシリンジゃ点滴によって投与することができる。また、カテーテルを患者または宿主の体内、たとえば管腔内、たとえば血管内に挿入して、その先端を標的部位付近に導き、当該カテーテルを通して、所望の標的部位またはその近傍あるいは標的部位への血流が期待される部位から投与することも可能である。実施例

次に実施例および試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例および試験例に限定されるものではない。

以下の各実施例では、薬剤として塩酸ゲムシ夕ビンを封入したいくつかの種類のリボソームを調製した。

(実施例 1および比較例 1)

<混合脂質の調製 >

水素添加大豆レシチン（HSPC、分子量： 790) (Lipoid社）およびコレステロール（Cho l、分子量 386.65) (Solvay社）を、表 1に示す所定量秤量し、 60 で加温した卜ブ夕ノール（関東化学） 25mlに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表 1に示す組成の混合脂質を調製した。

<塩酸ゲムシタピン内封リポソームの調製〉

得られた混合脂質に、 67 °Cに加温した塩酸ゲムシ夕ビン（Eli Lilly社） / リン酸緩衝液（pH7.4) (2 Omg/ml) を 10ml加え、充分膨潤させた。ポルテックスミキサーにて攪拌し、 67°Cで、押出機（The Extruder T.10 、 Lipex biomembranes Inc.) に取り付けたフィルタ一（孔径 0.4 mX3 回、 0.2 mX5 回、 0.1 mX 10回）（Whatman社）を順次通過させ、リポソ一ムを調製した。

このリボソームに、総脂質量の 0.75 mo 1 %に相当する表面修飾剤としてポリエチレングリコール (分子量 5000) -フォスファチジルエタノールアミン（PEG— PE、分子量 5938) (Genzyme社）（生食溶液： 36.74mg /ml) を 1.2 lml加え、 60。Cで 30分加温することにより PEG- PEを導入した。ゲル濾過で未封入の塩酸ゲムシ夕ビンを除去した。

上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤/脂質比および枰量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表 1に示す。

なお以下の表 1〜 6中、

「脂質成分比」は、脂質（以下の実施例では、リン脂質類およびコレステロール類）のモル比で示す。

「総脂質組成」は、下記の「総脂質」の組成をモル比で示す。

「総脂質」は、脂質またはカチオン化脂質膜の場合には表面修飾剤のカチオン化剤を含む脂質の総量をモル濃度 (mM) で示す。ただし、表面修飾剤のうち、 P EG誘導体（たとえば PEG-PE) は、この総脂質には含まれない。

「薬剤濃度」は、薬剤担体分散液中の塩酸ゲムシ夕ビン濃度である。

「薬剤 Z脂質比」は、上記総脂質濃度と、リボソームに内封された塩酸ゲムシ夕ビンの濃度とのモル比である。

「粒子径」とは、薬剤担体を粒度分布計（Zetasizer3000HS 、 Malvern Instruments 社）にて測定して得られた平均粒子径を意味する。表 1

(試験例 1)

< 37で緩衝液中での安定性〉

実施例 1および比較例 1で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソームを、当量のリン酸緩衝液（pH7.4) に希釈し、 37°Cで、 1、 2および 7日間加温した。加温終了後のリン酸緩衝液中のリボソームに、生理食塩水を加えて 4倍希釈した後、超遠心（lX 10⁵g、 2時間、 10°C) をかけ、塩酸ゲムシ夕ビンを内封するリポソ一ムを沈降させた。上清中に存在する塩酸ゲムシ夕ビン量を定量することでリボソームからの薬剤放出率（％) を算出した。結果を図 1に示す。 (試験例 2)

<37°C緩衝液中、 10%ゥシ胎児血清存在下での安定性 >

上記塩酸ゲムシ夕ビン内封リボソームを希釈するリン酸緩衝液を、 10%ゥシ胎児血清（Trace社）を含むリン酸緩衝液 (pH7.4) に代えた以外は、試験例 1と同様にして安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシ夕ビン量を定量し、薬剤放出率（％) を算出した。結果を図 2に示す。

上記各試験の結果、薬剤（塩酸ゲムシ夕ビン）の放出率は、リン酸緩衝液中および 10 %ゥシ胎児血清を含むリン酸緩衝液中のいずれの場合においても、 C 01比率の低い実施例 1のリボソーム（HSPC： Cho 1 =74： 26) の方が、 Cho 1比率の高い比較例 1のリポソ一ム（HSPC： Cho 1=54： 4 6) よりも、薬剤放出率が低かった。

(実施例 2および比較例 2)

ぐカチオン化脂質を含む混合脂質の調製 >

3,5-ジペン夕デシロキシベンズアミジン塩酸塩（カチオン化脂質） (TRX- 20、分子量 609.41) (合成方法は W〇 97/42166の記載に準拠）、水素添加大豆レシチン（HSPC、分子量： 790) (Lipoid社）およびコレステロール（Cho i) (Solvay社）を表 2に示す所定量秤量し、 60°Cで加温した t-ブ夕ノール（関東化学） 25mlに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表 2に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。ぐ塩酸ゲムシタピン内封リポソームの調製 > '

上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用いた以外は、実施例 1 と同様にして塩酸ゲムシタビン内封リポソ一ムを調製した。上記で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソ一ムについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤/脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表 2に示す。表 2

(実施例 3および比較例 3)

<力チォン化脂質を含む混合脂質の調製 >

3， 5-ジペン夕デシロキシベンズアミジン塩酸塩（TRX- 20、分子量 609. 41) 、ジステアロイルフォスファチジルコリン (DSPC、分子量 790.2)

(日本油脂）およびコレステロール（Cho i) (Solvay社）を表 3に示す所定量抨量し、 60°Cで加温した t -ブタノール (関東化学） 25mlに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表 3に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。

<塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソ一ムの調製 >

上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用いた以外は、実施例 1 と同様にして塩酸ゲムシ夕ビン内封リボソームを調製した。

上記で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤 !旨質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表 3に示す。

(試験例 3)

<37 °C緩衝液中での安定性 >

実施例 2〜 3および比較例 2〜 3で調製した塩酸ゲムシ夕ピン内封リポソ一ムを、前記試験例 2< 37°C緩衝液中での安定性 >と同様にして安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシ夕ビン量を定量し、薬剤放出率 (%) を算出した。結果を図 3に示す。

その結果、 3， 5-ジペン夕デシロキシベンズアミジン塩酸塩 (TRX-20) を 8mo 1 %の量で含有させ、カチオン化脂質を含むリボソームにおいても、 Ch 01比率の低下により、内封させた塩酸ゲムシ夕ビン薬剤の放出率が低下すること力確認された。

このことはリン脂質の種類にかかわらず、 HSPC、 DSPCいずれにおいても同様の結果が得られた。 (実施例 4および比較例 4)

<カチォン化脂質を含む混合脂質の調製 >

3,5-ジペン夕デシロキシベンズアミジン塩酸塩 (TRX-20) 、水素添加大豆レシチン（HSPC) 、およびコレステロール（Cho 1) を、表 4に示す所定量秤量した以外は、実施例 2と同様にして、表 4に示す組成の混合脂質（カチオン化 J3旨質を含む）を調製した。

ぐ塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソ一ムの調製 >

上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用い、表 4に示す塩酸ゲムシ夕ビンの薬剤濃度とした以外は、実施例 1と同様にして塩酸ゲムシ夕ビン内封リボソームを調製した。

上記で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソ一ムについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤 Z脂質比および抨量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表 4に示す。表 4

* 65:35=65.22:34.78 (試験例 4)

ぐ 37 緩衝液中での安定性 >

実施例 4および比較例 4で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソ一ムを、前記試験例 1と同様にして 37 °C緩衝液中での安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシ夕ビン量を定量し、薬剤放出率（％) を算出した。結果を図 4に示す。

(試験例 5)

<37 °C緩衝液中、 10 %ゥシ胎児血清存在下での安定性 >

実施例 4および比較例 4で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソームを、前記試験例 2と同様にして 37 °C緩衝液中、 10 %ゥシ胎児血清存在下での安定性試験を行い、上清中に存在する塩酸ゲムシ夕ビン量を定量し、薬剤放出率 ( ) を算出した。結果を図 5に示す。

脂質組成のリボソームからの薬剤放出率は、緩衝液中において Cho 1比率が低下するに従つて低下することが確認された。

10 %ゥシ胎児血清を含むリン酸緩衝液中の薬剤放出率も、 Cho i比率の低下に伴い低下した。この試験では、〇^101比率ひ0101 % (含まない）リポゾームは増加の傾向が認められたため、塩酸ゲムシ夕ビンを内封するリポソ一ム脂質膜構成成分中のコレステロールの含有比率を 0〜 35mo 1 %未満 (=34. 78 mo 1 %以下）としたことにより、薬剤担体からの塩酸ゲムシ夕ビンの放出率を抑えられることが明らかになつた。

(実施例 5および比較例 5)

ぐローダミン DHPEを含む混合脂質（カチオン化脂質を含む）の調製 >

3,5-ジペン夕デシロキシベンズアミジン塩酸塩 (TRX-20) 、水素添加大豆レシチン (HSPC) 、およびコレステロール (Ch 01) を、表 5に示す所定量秤量し、さらにローダミンジへキサデ力ノィルフォスファチジルエタノ一ルァミン（Rhodamine DHPE) (Molecular Probes 社） 2.5mgを加えた。 6 0°Cで加温した卜ブ夕ノール（関東化学） 25mlに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表 5に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。

ぐ塩酸ゲムシ夕ビン内封リポゾームの調製 >

上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用い、表 5に示す塩酸ゲムシタビンの薬剤濃度とした以外は、実施例 1と同様にしてゲムシ夕ビン内封リボソームを調製した。

上記で調製した塩酸ゲムシタビン内封リポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤 Z脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表 5に示す。表 5

* 65 :35=65.22 :34.78 (試験例 6)

<薬剤担体の血中滞留性 >

実施例 5および比較例 5で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封リポソームをマウス

(BALB/c、雌， 5週齢、日本クレア社）に、塩酸ゲムシ夕ビン量として 3 mg/k g (ゲムシタビン量として 2.63mg/kg) を尾静脈注射した。注射後、 1、 6、 24時間後に採血し、遠心分離（3， 000 r pm, 15分、 1 0°C) し、血漿を採取した。

各血漿中の薬剤担体に含まれるゲムシ夕ビン濃度を、高速液体クロマトダラフィ一法 (K.B. Freeman et.al. J. Chromatogr. B 665 (1995) 171-181 に準拠。なおここにある記載の引用により本明細書に記載されているものとする）にて測定した（以下、ゲムシ夕ビン濃度は、血漿中の薬剤担体に含まれるゲムシ夕ビン濃度である）。

結果を図 6に示す。

表 5に示す J 質組成のリポソームを尾静脈注射した際の血漿中のゲムシ夕ビン濃度は投与後 1、 6時間においては、 Cho i比率が低下するに従つて低下することが確認された。

Ch.o I比率が 0mo 1 %、 12mo 1 %のリボソームは、注射後 1時間において、血漿中のゲムシ夕ビン濃度が低く、速やかに血中より消失していることがわかった。

Ch 01比率が 22mo 1 %〜42mo 1 %のリボソームは、投与後 24時間の血漿中の塩酸ゲムシ夕ビン濃度に顕著な差は認められなかつた。 (実施例 6)

くローダミン DHP Eを含むカチオン化脂質を含む混合脂質の調製 >

3, 5-ジペン夕デシロキシベンズアミジン; ¾塩 (TRX-20) 0.05 g、水素添加大豆レシチン（HSPC) 0.55 g、およびコレステロール（Cho 1 ) 0.08 g、ローダミンジへキサデ力ノィルフォスファチジルエタノ一ルァミン（Rhodamine DHPE) 2.5mgを、 60°Cで加温した t-ブ夕ノール（関東化学） 25mlに溶解させた後氷冷し、凍結乾燥することで、表 6に示す組成の混合脂質（カチオン化脂質を含む）を調製した。

<PEG-PE量の異なる塩酸ゲムシ夕ビン内封リポゾームの調製 >

上記で得られた混合脂質（カチオン化脂質を含む）を用い、リボソームに加える PEG- PE (表面修飾剤）の生食溶液（36.74mgZml) 量を、総脂質量の 0.75mo l %、 1. Omo 1 %, 1.5mo 1 %に相当する 0.60、 0.

81、 1.22mlとした以外は、実施例 1と同様にして、塩酸ゲムシ夕ビン内封リボソームを調製した。

上記で調製した塩酸ゲムシ夕ビン内封りポソームについて求めた総脂質組成、脂質成分比、薬剤濃度、総脂質、薬剤ノ脂質比および秤量値、さらに以下のように測定した粒子径を一覧にして表 6に示す。表 6

(試験例 7)

実施例 6で調製したリボソームをマウス（BALBZc、雌， 5週齢、日本チヤ一ルス）に塩酸ゲムシ夕ビン量として 3 mgZkgを尾静脈注射した。注射後、 1、 6、 24時間後に採血し、遠心分離（3， 000 r pm, 15分、 1 0°C) し、血漿を採取した。各血漿中のゲムシ夕ビン濃度を、高速液体クロマトグラフィ一法（試験例 6と同様）にて測定した。結果を図 7に示す。

その結果、表 6に示すような Ch o 1比率 24mo 1 %の脂質組成で、 PE G-PE導入比率の異なるリポソ一ムを尾静脈注射した際の血漿中のゲムシ夕ビン濃度は、投与後 24時間では、 PEG- PE導入比率の違いにより血漿中のゲムシタビン濃度に顕著な差は認められなかったが、投与後 1、 6時間において、 P E G- P E導入比率が高いほど高値であった。

すなわち C ho 1比率 24mo 1 %の薬剤担体であっても、 PEG- PE導入比率が高いと、血中の薬剤担体に含まれる塩酸ゲムシ夕ビン濃度が高値を示し、血中滞留性が向上したことを示す。このことから、 C h o 1比率が本発明範囲であっても、 PEG-PE導入比率を上げることが望ましい。以上のことから、上記の実施例の範囲において、放出率と血中滞留性について下記表に示すように次のことが明らかとなった。コレステロール類の含有比率が低くなるに従い、塩酸ゲムシ夕ビンの薬剤担体からの放出を抑えることができるが、一方で、血中滞留性が低下する。また、コレステロール類の含有比率が高くなるに従い、塩酸ゲムシ夕ビンの薬剤担体の血中滞留性は向上するが、一方で、塩酸ゲムシタビンの薬剤担体からの放出を抑えることが困難となる。コレステロール類の含有比率が低い場合でも P E G-P E導入比率を上げることで血中滞留性は向上する。

表 7 実施例の範囲における

コレステロール類の低い高い

含有比率放出率好適血中滞留性好適

産業上の利用可能性本発明の薬剤担体は、本発明の範囲内の特定量でコレステロール類を含むリン脂質類からなる膜で形成される担体に、塩酸ゲムシ夕ビンを封入することにより、塩酸ゲムシ夕ビンの薬剤担体からの放出率を抑えることができる安定なゲムシ夕ビン製剤を提供することが可能となった。すなわちゲムシ夕ビンの放出速度を抑制することができ、長期にわたってゲムシ夕ビンの局所濃度を維持し、その薬効を発揮することができる

Claims

請求の範囲

1 . 膜で形成される担体であって、前記膜を構成する脂質成分として、リン脂質類とともに、コレステロール類を 0〜 3 5 m o 1 %未満の比率で含む担体に、ゲムシ夕ビンおよび Zまたはその塩を封入してなる薬剤担体。

2. 前記コレステロール類の比率が 1 3〜3 5 m o 1 %未満である請求項 1に記載の薬剤担体。

3. 前記コレステロール類がコレステロールおよび Zまたはコレスタノ一ルである請求項 1または 2に記載の薬剤担体。

4. 前記担体がリポソームである請求項 1ないし 3のいずれかに記載の薬剤担体。

5 . 前記膜が、前記リン脂質類およびコレステロール類以外の脂質類、および表面修飾剤からなる群から選ばれる少なくとも一つの構成成分をさらに含有する請求項 1ないし 4のいずれかに記載の薬剤担体。

6. 前記表面修飾剤が、ポリエチレングリコール誘導体および Zまたは荷電物質である請求項 5に記載の薬剤担体。

7. 前記薬剤担体が、安定化剤および化防止剤からなる群から選ばれる少なくとも一つをさらに含有する請求項 1ないし 6のいずれかに記載の薬剤担体。

8. 請求項 1ないし 7のいずれかに記載の薬剤担体を含有する医薬組成物。