WO2005016965A1 - Modulatoren der kaliumkanäle twik-1, task-1, girk1, sk2 oder pcn1 zur behandlung von arrhythmien, koronarer herzkrankheiten oder bluthochdruck - Google Patents

Modulatoren der kaliumkanäle twik-1, task-1, girk1, sk2 oder pcn1 zur behandlung von arrhythmien, koronarer herzkrankheiten oder bluthochdruck Download PDF

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WO2005016965A1
WO2005016965A1 PCT/EP2004/007364 EP2004007364W WO2005016965A1 WO 2005016965 A1 WO2005016965 A1 WO 2005016965A1 EP 2004007364 W EP2004007364 W EP 2004007364W WO 2005016965 A1 WO2005016965 A1 WO 2005016965A1
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WO
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modulators
arrhythmias
task
twik
coronary heart
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PCT/EP2004/007364
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Peter Ellinghaus
Klaus Münter
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Bayer Healthcare Ag
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to the use of potassium channel modulators for the manufacture of a medicament for the treatment of and / or preventive heart disease as well as high blood pressure or a combination of the diseases mentioned.
  • the cells of the sinus node in the right atrium of the heart have the function of a physiological pacemaker, since electrical excitation originates there at regular intervals.
  • a change in membrane potential which is determined by the concentration of different ions on both sides of a cell membrane, is responsible for the excitation conduction (Na + , K + ⁇ md Ca 2+ ).
  • These ions pass through the cell membrane through ion-selective channels that consist of several subunits and together form a pore.
  • the heart muscle cell runs through an action potential, which is composed of phases 0-3 and in which all three types of ion channels mentioned above are involved.
  • the action begins with a rapid depolarization (phase 0), in which primarily Na + channels are involved, followed by a transient, incomplete repolarization (phase 1) into the long-lasting one
  • Phase 2 Plateau phase (phase 2) passes and in which mainly Ca 2+ channels are involved.
  • Phase 3 represents repolarization and is therefore responsible for restoring sleep.
  • the KN outflow required for repolarization is mediated through potassium channels.
  • the membrane is protected from a further depolarizing stimulus, it is refractory (1).
  • Arrhythmias either lead to disturbances in the formation of arousal, the conduction of the arousal or a combination of both. This can be caused by ischemia, inflammatory diseases of the heart muscle, but also intoxications or vegetative influences. Substances and processes that affect arousal formation or transmission are used therapeutically to treat arrhythmias. Substances that repolarize
  • Delaying the K + current and thereby lengthening the action potential duration and refractory period belong to the so-called class HI antiarrhythmics, of which A iodarone and Sotalol are currently approved in Germany (1).
  • Sotalol in addition to blocking various K + channels (e.g. HERG), also has antagonistic properties for beta-adrenergic receptors, while amiodarone, in addition to HERG, also blocks the L-type Ca 2+ channel and Na + channel (1), ( 2).
  • K + channels e.g. HERG
  • amiodarone in addition to HERG, also blocks the L-type Ca 2+ channel and Na + channel (1), ( 2).
  • the class ÜI potassium channel blockers have a considerable pro-arrhythmic potential, which is attributed to the simultaneous influence on the potassium channels in the ventricle and limits the clinical use.
  • the identification of potassium channels, which are preferably expressed in the atrium, as possible antiarrhythmic targets is of particular importance, since this could reduce the side effects, which can even lead to fatal rabbit fibrillation (3).
  • potassium channel blockers such as sotalol and amiodarone
  • anti-arrhythmic effects of potassium channel openers e.g. B. for the ATP-dependent potassium channel (4).
  • genes were identified using Affymetrix microarray technology, which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle (see FIG. 1).
  • the differential expression of selected genes was verified using real-time PCR (TaqMan). It was shown that in all 6 patients examined the potassium channels TWIK-1 (5), TASK-1 (6), GIRKl (7), SK2 (8) and PCNl (9) were expressed much more strongly in the atrium than in the ventricle ( see Fig. 3).
  • the present invention therefore relates to the use of modulators of the aforementioned
  • Potassium channels for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of the abovementioned diseases are provided.
  • Potassium channel modulators in the sense of the present disclosure are substances which extend or shorten the opening time of the said potassium channels.
  • modulators are all substances that change the biological
  • modulators are nucleic acids including “locked nucleic acids”, “peptide nucleic acids” and “Spiegelmere”, proteins including antibodies and low molecular weight substances, very particularly preferred modulators are low molecular weight substances.
  • the invention relates to the use of modulators of the potassium channels TWIK-1, TASK-1,
  • GIRKl GIRKl
  • SK2 or PCNl for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiac arrhythmias (arrhythmias), coronary heart diseases or high blood pressure.
  • the invention relates to the use of modulators of the potassium channels TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 or PCNl with an IC 50 of ⁇ 1 ⁇ M, particularly preferably of ⁇ 100 nM for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of
  • Rhythm disorders arrhythmias
  • coronary heart disease or high blood pressure.
  • Another object of the invention is a method for screening test compounds for the identification of modulators of the potassium channels TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 or PCNl, which are suitable for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of cardiac arrhythmias (arrhythmias), coronary artery disease or high blood pressure.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition containing one or more modulators of the potassium channels TWK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 or PCNl for the treatment and / or prophylaxis of arrhythmias (arrhythmias), coronary heart diseases or high blood pressure.
  • the subject of the invention is also the use of modulators of the potassium channels TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 or PCNl for the regulation of the activity of the corresponding
  • Potassium channels in a living being including humans, for the treatment and / or prophylaxis of heart rhythm disorders (arrhythmias), coronary heart disease or high blood pressure.
  • the invention also relates to modulators of the potassium channels TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 or PCNl for the treatment and / or prophylaxis of cardiac arrhythmias (arrhythmias), coronary
  • modulators of gene products which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle, for the manufacture of a medicament for the treatment of arrhythmias, coronary heart diseases, high blood pressure and the consequences of atherosclerosis.
  • modulators of gene products which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle, for the manufacture of a medicament for the treatment of arrhythmias, coronary heart diseases, high blood pressure and the consequences of atherosclerosis.
  • Enhanced expression in the ventricle may also be preferred (e.g. for the endothelin A receptor), the term differential gene expression is used here.
  • Another object of the invention is a method for screening test compounds for the identification of modulators of gene products which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle, which are suitable for the
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition, containing a modulator or modulators of gene products which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle, for treatment and / or
  • Prophylaxis of arrhythmias, coronary artery disease or high blood pressure furthermore relates to the use of modulators of gene products which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle for regulating the activity of the corresponding gene products in a living being, including humans, for the treatment and / or prophylaxis of cardiac arrhythmias (arrhythmias). , coronary artery disease or high blood pressure.
  • the invention also relates to modulators of gene products which are differentially expressed in the human heart between the left atrium and left ventricle, for the treatment and / or prophylaxis of arrhythmias (arrhythmias), coronary heart diseases or high blood pressure.
  • Substances that have a modulating effect on the activity of the channels mentioned can be identified using the assay described below (screening).
  • the anti-arrhythmic effect is tested in vivo using the animal experiment described below.
  • Figure 1 Tabularly listed genes that were found to be differentially expressed between the atrium and ventricle in all 6 patients examined.
  • Figure 2 The Genbank Accession numbers of the genes verified by TaqMan-PCR and the primer / probe sequences used for this are listed in a table.
  • FIG. 3 The relative mRNA expression of the potassium channels TWIK-1, TASK-1 is shown.
  • FIG. 4 The relative protein expression of the potassium channel TASK-1 in human hearts is shown as the mean of all 6 patients, (left atrium [black] and left ventricle [white]. Examples
  • Example 1 Identification of differentially expressed genes between human ventricle and atrium
  • RNA from this was isolated after homogenization of the tissues using RNaesy columns (from Qiagen) according to the instructions.
  • the description of each 10 ⁇ g total RNA in cDNA, its subsequent linear amplification and the hybridization of the biotinylated cRNA on human HG-U133A arrays was carried out according to the “Affymetrix User Guide” using Superscript-II (Gibco) and the “ High yield cRNA labeling kits (from Enzo).
  • the HG-U133A array basically allows the simultaneous mR A analysis of approx. 22,600 human genes.
  • the arrays were evaluated using the software MAS 5.0 (Affymetrix) and Gene Spring 5.0 (Silicon Genetics). 1 summarizes the genes which were differentially expressed between the atrium and the ventricle in all 6 patients examined. The quotient of the normalized expression from the atrium and ventricle is given, in each case as
  • the differential expression of the potassium channels TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 and PCNl found by means of an array between the atrium and ventricle is verified by quantifying the mRNA in a real-time polymerase chain reaction (10).
  • the total RNA is isolated from the human myocardial samples as described above and 1 ⁇ g of each is reacted with 1 unit DNase I (Gibco) for 15 min at room temperature to remove contaminations of genomic DNA.
  • the DNase I is activated by adding 1 ⁇ l EDTA (25 inM) and then heating to 65 ° C. (10 min).
  • the cDNA synthesis is then carried out in the same reaction mixture in accordance with the instructions for the "SUPERSCRIPT- ⁇ RT cDNA synthesis kit" (from Gibco) and the reaction volume is diluted with distilled water
  • PCR For the PCR, 7.5 ⁇ l of the mixture of primer and probe and 12.5 ⁇ l of TaqMan reaction solution [Universal Master Mix (from Applied Biosytems]) are added to 5 ⁇ l of the diluted cDNA solution, and the final concentration of the primers is 300 nM in each case that of the probe 150 nM.
  • the sequences of the primers and the Geribank accession numbers of the genes analyzed are given in FIG.
  • Suitable primer and probe sequences were identified with the program Primer Express 5.0 (Applied Biosystems), the PCR is carried out on an ABI Prism SDS-7700 device (Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions.
  • the so-called Ct value is recorded, which is obtained for the gene in question in the tissue examined. This corresponds to the cycle in which the fluorescence intensity of the released probe is approx. 10 standard deviations above the background signal. The lower the Ct value, the earlier the reproduction begins, ie the more mRNA is contained in the original sample.
  • the expression of a so-called “household gene” is also analyzed in all examined tissues. This should be expressed approximately equally strongly in all tissues.
  • a uniform beta was used for the atrium and ventricles
  • the dCt value is calculated for each gene and each tissue for the graphical representation of the relative m-RNA expression
  • the dCt value is the difference between the Ct value of the examined potassium channel and the Ct value of the household gene
  • the protein expression was analyzed using a commercially available antibody (from Santa Cruz). For this, small pieces of tissue (approx. 50 mg) were homogenized in 1 X PBS (with 1% Triton) and after centrifugation and concentration determination
  • Potassium channel modulators are identified in a cellular assay in which CHO cells recombinantly express the respective ion channel and using the potential-sensitive dye Dye B from the "FLEPR membrane potential assay kit" (Molecular Probes).
  • a depolarization of the cells by a chemical Substance leads to an increased absorption of the dye "Dye B” and thus to an increased intracellular fluorescence intensity.
  • Hyperpolarization of the cell by a chemical substance leads to a decrease in the dye concentration in the cell and thus also to a decrease in the fluorescence intensity, since the quantum yield of Dye B in aqueous solution is lower.
  • Confluent cells are used for the measurement and, after removal of the medium, are loaded with the dye Dye B in accordance with the instructions of the kit manufacturer (Molecular Probes) at room temperature.
  • the fluorescence measurement is also carried out at room temperature in a fluobox (from Tecan) with an excitation wavelength of 520 nm and an absorption wavelength of 575 nm, as described for example in (11).
  • Example 3 Testing the in vivo effects of potassium channel modulators
  • the potassium channel modulators can be converted in a known manner into the customary formulations, such as tablets, dragées, pills, granules, aerosols, syrups, emulsions, suspensions and solutions, using inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients or solvents.
  • the therapeutically active compound should in each case be present in a concentration of 0.5 to 90% by weight of the total mixture, i.e. in amounts sufficient to achieve the dosage range indicated.
  • the formulations are prepared, for example, by stretching the active ingredients with solvents and / or carriers, optionally using emulsifiers and / or dispersants, e.g. if water is used as the diluent, organic solvents can optionally be used as auxiliary solvents.
  • the application is carried out in the usual way, preferably orally, transdermally, intravenously or parenterally, in particular orally or intravenously. However, it can also be done by inhalation through the mouth or nose, for example with the aid of a spray, or topically via the skin.
  • a K (ATP) Channel opener inhibited myocardial reperfusion action potential shortening and arrhythmias.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRK1 SK2 und PCN1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronaren Herzkrankheiten, sowie Bluthochdruck.

Description

MODULATOREN DER KALIUMKANÄLE T IK-1 , TASK-1 , GIRKl , SK2 ODER PCNl ZUR BEHANDLUNG VON ARRHYTHMIEN, KORONARER HERZKRANKHEITEN ODER BLUTHOCHDRUCK Die Erfindung betrifft die Verwendung von Kaliumkanal-Modulatoren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen, koronaren Herzkrankheiten sowie Bluthochdruck oder einer Kombination der genannten Erkrankungen.
Die Zellen des Sinusknotens im rechten Vorhof des Herzens haben die Funktion eines physiologischen Schrittmachers, da dort in regelmäßigen Intervallen eine elektrische Erregung ihren Ursprung hat. Verantwortlich für die Erregungsleitung ist eine Membranpotentialänderung, die durch die Konzentration verschiedener Ionen auf beiden Seiten einer Zellmembran bestimmt wird (Na+, K+ιmd Ca2+). Diese Ionen passieren die Zellmembran durch ionenselektive Kanäle, die aus mehreren Untereinheiten bestehen und zusammen eine Pore bilden. Während einer Herzaktion (Systole) durchläuft die Herzmuskelzelle ein -Aktionspotential, das sich aus den Phasen 0-3 zusammensetzt und an dem alle drei o. g. Typen von Ionenkanälen beteiligt sind. Die Aktion beginnt mit einer raschen Depolarisation (Phase 0), an der vor allem Na+-Kanäle beteiligt sind, gefolgt von einer transienten, unvollständigen Repolarisation (Phase 1) die in die lang anhaltende
Plateauphase (Phase 2) übergeht und an der vor allem Ca2+-Kanäle beteiligt sind. Die Phase 3 repräsentiert die Repolarisation und ist damit für die Wiederherstellung des Ruhezustandes verantwortlich. Der zur Repolarisation notwendige KNAusstrom wird durch Kaliumkanäle vermittelt. Während des gesamten Aktionspotentials ist die Membran vor einem weiteren depolarisierenden Reiz geschützt, sie ist refraktär (1).
Bei Arrhythmien kommt es entweder zu Störungen der Erregungsbildung, der Erregungsleitung oder einer Kombination aus beiden. Ursache hierfür können Ischämien, entzündliche Erkrankungen des Herzmuskels aber auch Intoxikationen oder vegetative Einflüsse sein. Substanzen und Verfahren, die die Erregungsbildung oder Weiterleitung beeinflussen, werden therapeutisch zur Behandlung von Arrhythmien eingesetzt. Substanzen, die den repolarisienden
K+-Strom verzögern und dadurch Aktionspotentialdauer und Refraktärzeit verlängern, gehören zu den sog. Klasse-HI-Antiarrhythmika von denen zur Zeit in Deutschland A iodaron und Sotalol zugelassen sind (1).
Beide Substanzen .sind .allerdings, keine selektiven.. ahumkanalblockeπ So zeigt . Sotalol neben- einer Blockade verschiedener K+-Kanäle (z. B. HERG) auch antagonistische Eigenschaften für beta-adrenerge Rezeptoren während Amiodaron neben HERG auch den L-Typ Ca2+-Kanal und Na+-Kanäie blockiert (1), (2). Ebenso wie die anderen Klassen von Antiarrhytmika besitzen auch die Klasse-ÜI Kaliumkanalblocker ein beträchtliches pro-arrhythmisches Potential, welches auf die gleichzeitige Beeinflussung der Kaliumkanäle im Ventrikel zurückgeführt wird und den klinischen Einsatz limitiert. Insofern kommt der Identifizierung von bevorzugt im Vorhof exprimierten Kaliumkanälen als möglichen Antiarrhythmika-targets ein besondere Bedeutung zu, da hierdurch die Nebenwirkungen, die bis zu tödlichem Kan-j-nerflimmern reichen, gesenkt werden könnten (3).
Neben Kaliumkanalblockem wie Sotalol und Amiodaron sind auch anti-arrhythmische Wirkungen von Kaliumkanalöffnern z. B. für den ATP-abhängigen Kaliumkanal beschrieben (4).
In der vorliegenden Arbeit wurden mittels Affymetrix-Micro-Array-Technologie Gene identifiziert,die im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, (s. Fig. 1). Die Verifizierung der differentiellen Expression ausgewählter Gene erfolgte mittels Real-time PCR (TaqMan). Dabei zeigte sich, das bei allen 6 untersuchten Patienten die Kaliumkanäle TWIK-1 (5), TASK-1 (6), GIRKl (7), SK2 (8) und PCNl (9) deutlich stärker im Vorhof als im Ventrikel exprimiert werden (s. Fig. 3).
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von Modulatoren der zuvor genannten
Kaliumkanäle zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prophylaxe der oben genannten Krankheiten.
Kaliumkanalmodulatoren im Sinne der vorliegenden Offenbarung sind Substanzen welche die Öffnungsdauer der genannten Kaliumkanäle verlängern oder verkürzen.
Modulatoren im Sinne der Erfindung sind alle Substanzen, die eine Veränderung der biologischen
Aktivität der Kanäle bewirken. Besonders bevorzugte Modulatoren sind Nukleinsäuren inklusive „locked nucleic acids", „peptide nucleic acids" und „Spiegelmere", Proteine inklusive Antikörper und niedermolekulare Substanzen, ganz besonders bevorzugte Modulatoren sind niedermolekulare Substanzen.
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1,
GIRKl, SK2 oder PCNl zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
Desweiteren betrifft die Erfindung die Verwendung von Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl mit einem IC50 von < 1 μM, besonders bevorzugt von < 100 nM zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von
Her-srhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck. Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist eine Methode zum Screenen von Testverbindungen zur Identifizierung von Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl, welche geeignet sind für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck. Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Modulator oder mehrere Modulatoren der Kaliumkanäle TWK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
Erfindungsgegenstand ist des weiteren die Verwendung von Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl für die Regulation der Aktivität der entsprechenden
Kaliumkanäle in einem Lebewesen einschließlich des Menschen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Her2rhvthmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzl-rankheiten oder Bluthochdruck.
Die Erfindung betrifft auch Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer
Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
Erfindungsgemäß ist ebenfalls die Verwendung von Modulatoren von Genprodukten, welche im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Arrhythmien, koronaren Herzkrankheiten, Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose. Da in Abhängigkeit von der Funktion des
Genproduktes durchaus auch eine verstärkte Expression im Ventrikel bevorzugt sein kann (z. B. für den Endothelin A-Rezeptor), wird hier der Begriff differentielle Genexpression verwendet.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist eine Methode zum Screenen von Testverbindungen zur Identifizierung von Modulatoren von Genprodukten, welche im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, die geeignet sind für die
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
Gegenstand, der Erfindung ist ebenfalls, eine .pharmazeutische Zusammensetzung,, enthaltend -einen Modulator oder mehrere Modulatoren von Genprodukten, welche im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, zur Behandlung und/oder
Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck. Erfindungsgegenstand ist des weiteren die Verwendung von Modulatoren von Genprodukten, welche im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, für die Regulation der Aktivität der entsprechenden Genprodukte in einem Lebewesen einschließlich des Menschen zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
Die Erfindung betrifft auch Modulatoren von Genprodukten, welche im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
Substanzen, die eine modulierende Wirkung auf die Aktivität der genannten Kanäle haben, können mit dem unten beschriebenen Assay identifiziert werden (Screening).
Die Testung der anti-arrhythmischen Wirkung in vivo erfolgt mit dem unten • beschriebenen Tierversuch.
Beschreibung der Figuren
Figur 1: Tabellarisch aufgelistet sind Gene, die bei allen 6 untersuchten Patienten übereinstimmend differentiell exprimiert zwischen Vorhof und Ventrikel gefunden wurden.
Figur 2: Tabellarisch aufgelistet sind die Genbank Accession-Nummern der mittels TaqMan-PCR verifizierten Gene sowie die dafür verwendeten Primer/Sonden-Sequenzen.
Figur 3: Dargestellt ist die relative mRNA-Expression der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1,
GIRKl SK2 und PCNl in humanen Herzen (linker Vorhof [schwarz] und linker Ventrikel [weiss].
Figur 4: Dargestellt ist die relative Proteinexpression des Kaluiumkanals TASK-1 in humanen Herzen als Mittelwert aus allen 6 Patienten, (linker Vorhof [schwarz] und linker Ventrikel [weiss]. Beispiele
Beispiel 1: Identifizierung differentiell exprimierter Gene zwischen humanem Ventrikel und Vorhof
Kleine Stücke (ca. 0,5 g) vom linken Ventrikel bzw. vom linken Vorhof explantierter Herzen wurden mit Einverständnis der Spender vom Herzzentrum Halle (Prof. Morawietz) erhalten. Die Gesamt-RNA hieraus wurde nach Homogenisierung der Gewebe mittels RNaesy-Säulen (Fa. Qiagen) gemäß der Anleitung isoliert. Die Umschreibung von jeweils 10 μg Gesamt-RNA in cDNA, deren anschließende lineare Amplifikation sowie die Hybridisierung der biotinylierten cRNA auf humanen HG-U133A Arrays erfolgte gemäß dem „Affymetrix User Guide" unter Verwendung von Superscript-II (Fa. Gibco) und des „High Yield cRNA labeling Kits (Fa. Enzo).
Der HG-U133A Array erlaubt prinzipiell die simultane mR A-Analyse von ca. 22.600 humanen Genen. Die Auswertung der Arrays erfolgte mit der Software MAS 5.0 (Fa. Affymetrix) und Gene Spring 5.0 (Fa. Silicon Genetics). In Fig. 1 sind die Gene zusammengefasst, die in allen 6 untersuchten Patienten zwischen Vorhof und Ventrikel differentiell exprimiert wurden'. Angegeben ist der Quotient der normierten Expression aus Vorhof und Ventrikel, und zwar jeweils als
Mittelwert aus allen 6 Probanden.
Die mittels Array zwischen Vorhof und Ventrikel gefundene differentielle Expression der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 und PCNl wird durch die Quantifizierung der mRNA in einer Echtzeit-Polymerasekettenreaktion verifiziert (10). Hierzu wird die Gesamt-RNA wie oben beschrieben aus den humanen Myokardproben isoliert und je 1 μg davon zur Entfernung von Kontaminationen genomischer DNA mit 1 Einheit DNase I (Fa. Gibco) für 15 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Die iaktivierung der DNase I erfolgt durch Zugabe von 1 μl EDTA (25 inM) und nachfolgendes Erhitzen auf 65°C (10 min). -Anschließend wird im selben Reaktionsansatz die cDNA-Synthese gemäß der Anleitung zum „SUPERSCRIPT-π RT cDNA synthesis kit" (Fa. Gibco) durchgeführt und das Reaktionsvolumen mit destilliertem Wasser auf
200 μl aufgefüllt.
Für die PCR wird zu je 5 μl der verdünnten cDNA-Lösung 7,5 μl Gemisch von Primer und Sonde sowie 12,5 μl TaqMan-Reaktionslösung [Universal Master Mix (Fa. Applied Biosytems] gegeben. Die Endkonzentration der Primer ist jeweils 300 nM, die der Sonde 150 nM. Die Sequenzen der Primer sowie die Geribank Accession-Nummern der analysierten Gene sind in Fig. 2 angegeben.
Die Identifizierung geeigneter Primer- und Sondensequenzen erfolgte mit dem Programm Primer Express 5.0 (Fa. Applied Biosystems), die PCR erfolgt auf einem ABI-Prism-SDS-7700-Gerät (Fa. Applied Biosystems) gemäß der Anleitung des Herstellers. Aufgezeichnet wird bei der Real-time PCR der sog. Ct-Wert, der für das betreffende Gen im untersuchten Gewebe erhalten wird. Dieser entspricht dem Zyklus, in dem die Fluoreszenzintensität der freigesetzten Sonde ca. 10 Standardabweichungen über dem Hintergrundsignal liegt. Je niedriger der Ct-Wert, umso -früher beginnt also die Vervielfältigung, d. h. je mehr mRNA ist in der ursprünglichen Probe enthalten. Zum Ausgleich eventueller Schwankungen bei der cDNA-Synthese wird in allen untersuchten Ge- weben auch die Expression eines sog. „Haushaltsgenes" analysiert. Dieses sollte in allen Geweben ungefähr gleich stark exprimiert werden. Für die Normierung der Kaliumkanalexpressionen wurde für Vorhof und Ventrikel einheitlich ß-Actin verwendet. Für die graphische Darstellung der relativen m-RNA-Expression wird für jedes Gen und jedes Gewebe der dCt-Wert berechnet. Der dCt-Wert ist die Differenz zwischen dem Ct-Wert des untersuchten Kaliumkanals und dem Ct- Wert des Haushaltsgens im jeweiligen Gewebe. Aus diesem Wert wird nach folgender Formel die relative Expression rE berechnet: rE = 2 (20"dct) Diese ist in Fig. 3 als dimensionslose Zahl angegeben.
Für den Kaliumkanal TASK-1 wurde unter Verwendung eines käuflichen -Antikörpers (Fa. Santa Cruz) die Protein-Expression analysiert. Hierzu wurden kleine Gewebestücke (ca. 50 mg) in 1 X PBS (mit 1 % Triton) homogenisiert und nach Zentrifugation und Konzentrationsbestimmung
(BCA-Tet, Fa. Pierce) ein Western Blot durchgeführt (10 % Nupage-Gel). Die Detektion erfolgte mittels des ECL-Systems (Fa. Amersham) unter Verwendung eines HRP-konjugierten Anti-goat IgG-Antikörpers. Der belichtete Film wurde in einem Bioimager (Fa. Fuji) densitrometrisch ausgewertet. Das Ergebnis in Fig. 4 als dimensionslose Zahl angegeben.
Beispiel 2: Identifizierung von Kaliumkanalmodulatoren
Die Identifizierung von Kaliumkanalmodulatoren erfolgt in einem zellulären Assay bei dem CHO- Zellen den jeweiligen Ionenkanal rekombinant exprimieren und unter Verwendung des potentialsensitiven Farbstoffs Dye B aus dem „FLEPR membrane potential assay kit" (Fa. Molecular Probes). Eine Depolarisation der Zellen durch eine chemische Substanz führt zu einer vermehrten Aufnahme des Farbstoffs „Dye B" und dadurch zu einer erhöhten intrazellulären Fluoreszenzintensität. Eine Hyperpolarisation der Zelle durch eine chemische Substanz führt dagegen zu einer Abnahme der Farbstoffkonzentration in der Zelle und damit auch zu einer Abnahme der Fluoreszenzintensität, da die Quantenausbeute von Dye B in wässriger Lösung geringer ist. Zur Messung werden konfluente Zellen verwendet, die nach Entfernen des Mediums entsprechend den Vorschriften des Kit-Herstellers (Molecular Probes) bei Raumtemperatur mit dem Farbstoff Dye B beladen werden. Die Fluoreszenzmessung erfolgt ebenfalls bei Raumtemperatur in einer Fluobox (Fa. Tecan) bei einer Anregungswellenlänge von 520 nm und einer Absorptionswellenlänge von 575 nm, wie zum Beispiel beschrieben in (11). Beispiel 3; Testung der in vivo Wirkung von Kaliumkanalmodulatoren
Der Einfluss der Kaliumkanalmodulatoren auf die Herzfrequenz wird an narkotisierten Ratten untersucht. Hierzu werden männliche Wistarratten (250-300g) mit 10mg/kg Thiobutabarbital i. p. (Inactin, Byk Gulden) narkotisiert und anschließend getötet. Nach Thoraxeröffnung wird das Herz freigelegt, der rechte Vorhof isoliert und unter einer lg- Vorspannung in einer 30°C warmen Krebs-Henseleit-Lösung (in einem 10 ml Organbad) aufbewahrt. Diese Lösung wird mit Carbogen (95% 02, 5% C02) bei pH 7.2-7.4 begast. Die Vorhöfe schlagen spontan und nach Aufzeichnung einer Kontrollperiode (Parameter: Frequenz) werden die Testsubstanzen in einer Dosisreihe appliziert. Pro Dosis wird die Veränderung der Frequenz im Vergleich zu Placebo-behandelten Kontrollen ausgewertet.
Beispiel 4: Kaliumkanalmodulator-Formulierungen
Die Kaliumkanalmodulatoren können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von 0,5 bis 90 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein, d.h. in Mengen, die ausreichend sind, um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Strecken der Wirkstoffe mit Lösungsmitteln und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z.B. im Fall der Benutzung von Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden können.
Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise oral, transdermal, intravenös oder parenteral, insbesondere oral oder intravenös. Sie kann aber auch durch Inhalation über Mund oder Nase, beispielsweise mit Hilfe eines Sprays erfolgen, oder topisch über die Haut.
Im -Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwas 0,001 bis 10 mg/kg, bei oraler Anwendung vorzugsweise etwa 0,005 bis 3 mg/kg Körpergewicht zur Erzielen wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikationsweges, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw.
Intervall, zu welchen die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.
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Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Modulatoren oder eines Modulators der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK- 1, GIRKl, SK2 oder PCNl zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
2. Eine Methode zum Screenen von Testverbindungen zur Identifizierung von Modulatoren der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl, welche geeignet sind für die Herstellung eines -Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
3. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Modulator oder mehrere Modulatoren der Kaliumkanäle TWTK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
4. Modulator der Kaliumkanäle TWIK-1, TASK-1, GIRKl, SK2 oder PCNl zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronarer Herzkrankheiten oder Bluthochdruck.
5. Verwendung von Modulatoren von Genprodukten, welche im humanen Herz differentiell zwischen linkem Vorhof und linkem Ventrikel exprimiert werden, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Herzrhythmusstörungen (Arrhythmien), koronaren Herzkrankheiten, oder Bluthochdruck.
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