WO2005012532A1 - Sistema para la producción de proteínas diméricas basado en el sistema de transporte de hemolisina de escherichia coli - Google Patents

Sistema para la producción de proteínas diméricas basado en el sistema de transporte de hemolisina de escherichia coli Download PDF

Info

Publication number
WO2005012532A1
WO2005012532A1 PCT/ES2004/070053 ES2004070053W WO2005012532A1 WO 2005012532 A1 WO2005012532 A1 WO 2005012532A1 ES 2004070053 W ES2004070053 W ES 2004070053W WO 2005012532 A1 WO2005012532 A1 WO 2005012532A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
peptide
coli
sequence
Prior art date
Application number
PCT/ES2004/070053
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Victor De Lorenzo Prieto
Luis Angel FERNÁNDEZ HERRERO
Original Assignee
Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior De Investigaciones Científicas filed Critical Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Priority to US10/566,827 priority Critical patent/US20080280346A1/en
Priority to EP04742091A priority patent/EP1655371A1/en
Priority to CA002534299A priority patent/CA2534299A1/en
Publication of WO2005012532A1 publication Critical patent/WO2005012532A1/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/245—Escherichia (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/73—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing coiled-coiled motif (leucine zippers)

Definitions

  • This invention relates to the production of dimeric recombinant proteins through the use of a protein expression system based on the hemolysin transport system of Escherichia coli.
  • fusion proteins that comprise recombinant bi-or multifunctional antibody fragments (minibodies). These fusion proteins have some advantages and can be used for therapeutic or diagnostic purposes. For this reason, various antibody fragment expression systems have been developed. Some of these expression systems are based on the use of Escherichia coli. Different antibody fragments are usually selected and produced in E. coli after cloning of fragments of the variable (V) and constant (C) regions of immunoglobulins (Ig) into filamentous phage or phagemid vectors [Hoogenboom, HR 1997. Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibody Trends in Biotechnology.
  • V variable
  • C constant regions of immunoglobulins
  • Antibodies for targeted gene therapy extracellular gene targeting and intracellular expression Adv Drug Deliv Rev. 31: 153-170; Yokota, T., D. ⁇ . Milenic, M. Whitlo, and J. Schlo 1992. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms Cancer Res. 52: 3402-8].
  • Antibody fragments based on a single Ig domain have also been produced in E. coli [Nuttall, SD, RA Irving, and PJ Hudson 2000.
  • V HH domains have demonstrated superior stability and solubility and lower immunogenicity [Cortez-Retamozo, V., M. Lauwereys, G. Hassanzadeh Gh, M. Gobert, K. Conrath, S Muyldermans, P. De Baetselier, and H. Revets 2002. Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels Int J Cancer. 98: 456-62; Tauttall, SD, RA Irving, and PJ Hudson 2000. Immunoglobulin NH domains and beyond: design and selection of single-domain binding and targeting reagents Curr Pharm Biotechnol.
  • This secretion system is independent of the cellular sec genes and consists of two internal membrane (IM) components, HlyB and HlyD, and the outer membrane (OM) pore, TolC, which are assembled in a large protein complex with a internal hydrophilic canal [Gentschev, L, G. Dietrich, and W. Goebel 2002. The E. coli alpha-hemolysin secretion system and its use in vaccine development Trends Microbiol. 10: 39-45; Koronakis, V., C. Andersen, and C. Hughes 2001. Channel-tunnels Curr Opin Struct Biol. 11: 403-7; Koronakis, V., A. Sharff, E. Koronakis, B.
  • the signal recognized by the Hly secretion machinery is located at the C terminal end of HlyA. It has been shown that scFv-HlyA hybrids, which contain a scFv molecule that lacks the N-SP bound to the last HlyA of approximately 23 kDa, are secreted in a functional manner and oxidized by the Hly transporter [Fernández, LA, and V. De Lorenzo 2001. Formation of disulphide bonds during secretion of proteins through the periplasmic-independent type I pathway Mol Microbiol. 40: 332-46; Fernández, LA, I. Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000.
  • dimerization is a property that is often desired to be engineered in proteins when binding activity is involved (for example, in protein--DN or antigen-antibody interactions), since it can enhance its affinity functional (avidity), or create bispecific molecules [Baxevanis, AD, and CR Vinson 1993. Interactions of coiled coils in transcription factors: where is the specificity? Curr Opin Genet Dev. 3: 278-85; Busch, SJ, and P. Sassonc-Corsi 1990.
  • the invention provides a solution to the existing need based on the development of a DNA construct comprising (i) a nucleotide sequence encoding a product of interest; (ii) a nucleotide sequence encoding a dimerization domain; and (iii) a nucleotide sequence encoding Escherichia coli ⁇ -hemolysin (HlyA) or for a fragment of said protein comprising the recognition signal of the secretion mechanism of the E. coli hemolysin transporter system (Hly). .
  • one aspect of this invention relates to a DNA construct comprising (i) a nucleotide sequence encoding a product of interest; (ii) a nucleotide sequence encoding a dimerization domain; and (iii) a nucleotide sequence encoding Escherichia coli ⁇ -hemolysin (HlyA) or for a fragment of said protein comprising the signal of recognition of the secretion mechanism of the hemolysin (Hly) transport system of E. coli.
  • the invention relates to an expression cassette comprising said DNA construct operatively linked to an expression control sequence.
  • the invention relates to a bacterium comprising at least one DNA construct or at least one expression cassette.
  • the invention relates to a method for producing a product of interest, in the form of a dimeric fusion protein, which comprises growing said bacterium under conditions that allow the production and excretion to the culture medium of said product of interest in form of a dimeric fusion protein.
  • this relates to a method of producing a heterodimeric fusion protein comprising two products of interest.
  • the invention relates to a dimeric fusion protein obtainable by expression of at least one nucleic acid sequence contained in at least one ⁇ DN construct.
  • Figure 1 illustrates the secretion of the C-HlyA polypeptide containing the ZIP domain.
  • Figure 1A shows a schematic representation of the structure of the EHlyA and ZEHlyA polypeptides containing the 23 kDa MyA secretion signal) of the E. coli Hly transporter labeled with the epitope E. The mass of said polypeptides (in kDa) , deduced from its amino acid sequence, is shown on the right.
  • FIG. 1 is a schematic representation of the C-HlyA (monomeric) polypeptide labeled with the E epitope and the C- polypeptide
  • HlyA (dimeric) marked with the epitope E and containing the ZIP domain (Ig hinge, leucine zipper, 6xhis mark).
  • Figure 1C shows the result of the immunoblotting developed with a POD-labeled anti-E monoclonal antibody of secreted (S) and cellular (C) proteins produced after 4 h induction with 0.3 mM IPTG of cultures of E. coli HB2151 cells, grown at 37 ° C- containing plasmid pNDL9J (which codes for HlyB and HlyD) and one of the indicated plasmids, pEHlyA or pZEHlyA.
  • the lane-loaded proteins represent those found in approximately 5 ⁇ l of the culture supernatants (S) and those of E. coli (C) cells present in approximately 100 ⁇ l of the same cultures (OD 6 or approximately 2 nm ).
  • Figure 2 illustrates the cross-linking of C-HlyA polypeptides secreted with idyl disuccini glutarate (DSG).
  • EHlyA and ZEHlyA polypeptides were incubated with DSG, at the indicated concentrations, and subjected to denaturing SDS-PAGE and immunoblotting with POD-labeled anti-E monoclonal antibody (see Example 1, section on Materials and Methods, for more details).
  • ZEHlyA intersected with DSG forming a protein band in SDS-PAGE of approximately 66 kDa - about twice the size of its monomer.
  • Figure 3 shows the results of gel filtration chromatography of the monomeric and dimeric C-HlyA polypeptides.
  • Figure 3A is a graph depicting the elution volume of the EHly ⁇ (circle) and ZEHly ⁇ (triangle) polypeptides separated by gel filtration chromatography (see Example 1, section on Materials and Methods, for more details) together with protein patterns of known mass (squares).
  • the mass standards used were thyroglobulin (Mr 670,000), bovine gammablobulin (Mr 158,000), chicken ovalbumin (Mr 44,000) and equine myoglobin (Mr 17,000).
  • the presence of EHlyA or ZEHlyA in the eluted fractions was determined by immunoblotting with POD-labeled anti-E monoclonal antibody.
  • Figure 3B shows the result of the immunoblotting developed with a POD-labeled anti-E monoclonal antibody of the EHlyA and ZEHlyA polypeptides.
  • a schematic representation of EHlyA (monomeric) and ZEHlyA (dimeric) is shown at the top.
  • Figure 4 illustrates the secretion of monomeric N HH- HlyA V amy -HlyA) and dimeric (N ⁇ -ZHlyA) polypeptides.
  • Figure 4A is a schematic representation of the structure of the N ⁇ -HlyA and Y amy -Z ⁇ ⁇ A polypeptides containing the 23 kDa (hlyA) secretion signal of the E.
  • FIG. 4A is a schematic representation of the polypeptide (monomeric) labeled with the epitope E and of the polypeptide N ⁇ ff ⁇ ZHlyA (dimeric) labeled with the epitope E and containing the ZIP domain (Ig hinge, Leucine zipper, 6xhis brand).
  • Figure 4C shows the results of a Western blot where the secretion of protein hybrids having N HH and -EHlyA or -ZEHlyA domains is revealed. E.
  • coli HB2151 cells carrying one of the indicated plasmids (N ⁇ w ⁇ HlyA or pN ⁇ ⁇ ZHlyA) were induced with IPTG (see Example 1, section on Materials and Methods, for more details), at indicated temperature, and the presence of secreted polypeptides labeled with the epitope E in culture supernatants was determined by immunoblotting with POD-labeled anti-E monoclonal antibody. Full-length N ⁇ myHlyA and N ⁇ m ZHlyA polypeptides were detected in culture supernatants, along with some proteolytic fragments derived therefrom.
  • Figure 4D is a graph of the elution volume of the N ⁇ HlyA (circle) and VamyZ ⁇ lyA (triangle) polypeptides separated by gel filtration chromatography, together with protein patterns of known mass (square) and detected with immunoblotting with monoclonal antibody anti-E marked with POD.
  • the mass standards used were the same as those used in relation to Figure 3.
  • Figure 5 is a graph illustrating the binding activity of monomeric and dimeric N HH- HlyA polypeptides. The binding of ⁇ -amylase by polypeptides N omj Hly ⁇ and N am; , ZhlyA, at the indicated concentrations, was determined by ELISA (see Example 1, section on Materials and Methods, for more details).
  • Figure 9 shows the map of plasmid pN ⁇ v ,, ZhlyA.
  • the invention provides a DNA construct, hereinafter referred to as the DNA construct of the invention, comprising: a) a first nucleic acid sequence containing the nucleotide sequence encoding a product of interest ; b) a second nucleic acid sequence containing the nucleotide sequence encoding a dimerization domain; and c) a third nucleic acid sequence containing the nucleotide sequence encoding E.
  • HlyA coli ⁇ -hemolysin
  • Ffly transporter system E. coli
  • nucleotide sequence encoding a homologous gene or a nucleotide sequence encoding a variant, natural or artificial, of HlyA or a fragment thereof comprising the recognition signal of the mechanism of secretion of the Hly transport system from E. coli;
  • the first nucleic acid sequence contains the nucleotide sequence that codes for a product of interest (gene of interest).
  • the product of interest can be eukaryotic, prokaryotic, viral, etc.
  • Virtually any peptide or protein that can be expressed recombinantly can be used in the construction of DNA of the invention, for example, enzymes, enzyme inhibitors, hormones, molecules involved in cell adhesion and / or signaling, molecules involved in detection or mareaje, and molecules composed of domains, for example, immunoglobulins, etc.
  • said product of interest can be an immunogenic antigen such as a protein or an antigenic fragment thereof originating from a pathogen, for example, from a viral, bacterial, a parasite pathogen, etc., which can cause infections. in humans or animals; a therapeutic agent, for example, a tumor specific antigen, an antigen of an autoimmune disease, etc .; or a molecule immunoregulatory, for example, growth factors, cytokines, such as interleukins, interferons, etc.
  • a pathogen for example, from a viral, bacterial, a parasite pathogen, etc.
  • a therapeutic agent for example, a tumor specific antigen, an antigen of an autoimmune disease, etc .
  • a molecule immunoregulatory for example, growth factors, cytokines, such as interleukins, interferons, etc.
  • said product of interest is a mini-native or, defining recombinant mini-antibodies or antibodies as fragments derived from the antibodies constructed by recombinant DNA technology, and that despite their smaller size retain the antigen binding capacity since they maintain the variable domains of immunoglobulin, where the antigen binding areas reside.
  • the second nucleic acid sequence contains the nucleotide sequence that codes for a dimerization domain.
  • a dimerization domain is a peptide sequence that promotes dimerization in the proteins that contain it.
  • any dimerization domain can be used in the construction of DNA of the invention, for example, peptide propellers, containing at least one propeller, or a structure formed by a propeller, a turn and other propeller, etc., structures double coiled coil (coiled coil), and, in general, any peptide sequence that promotes dimerization in the proteins that contain it.
  • said dimerization domain comprises the leucine zipper of the yeast GCN4 transcription factor.
  • the third nucleic acid sequence comprises the nucleotide sequence encoding E. coli ⁇ -hemolysin (HlyA) or for a fragment of said protein comprising the recognition signal of the secretion mechanism of the Hly transport system of E.
  • E. coli or a nucleotide sequence that codes for a homologous gene, or a nucleotide sequence that codes for a natural or artificial variant of HlyA or a fragment thereof comprising the recognition signal of the system secretion mechanism Hly transporter of E. coli.
  • the recognition signal of the secretion mechanism of the E. coli Hly transport system appears to be comprised in the carboxyl terminal (C-terminal), specifically within the last 60 amino acids of HlyA.
  • the amino acid and nucleotide sequence of E. coli HlyA can be obtained from GeneBank, accession number M10133, where the amino acid nucleotide sequence of HlyB and HlyD can also be obtained.
  • said third nucleic acid sequence is constituted by the nucleotide sequence encoding the E. coli HlyA.
  • said third nucleic acid sequence comprises a fragment of the E. coli HlyA containing the recognition signal of the secretion mechanism of the E. coli Hly transport system, such as a nucleotide sequence encoding the last 60 amino acids of the H-C C-terminus of E. coli.
  • said third nucleic acid sequence is constituted by, or comprises, the nucleotide sequence encoding the last 60 amino acids of the H-C C-terminal end of E. coli.
  • said third nucleic acid sequence contains the nucleotide sequence identified as S ⁇ Q ID NO: 1 which codes for a peptide of approximately 23 kDa from the HlyA terminal carboxyl terminus of E. coli whose amino acid sequence is shown in S ⁇ Q ID NO: 2.
  • the dimerization domain does not fuse directly to the gene encoding the product of interest but it is advantageous to introduce a spacer (flexible) peptide between the end of the gene encoding the product of interest and the beginning of the dimerization domain.
  • the DNA construct of the invention may also contain, in addition, a fourth nucleic acid sequence encoding a spacer peptide located between said first and second nucleic acid sequences, wherein the 5 'end of said fourth nucleic acid sequence is attached to the 3 'end of said first nucleic acid sequence and the 3' end of said fourth nucleic acid sequence is linked to the 5 'end of said second nucleic acid sequence.
  • the coding sequence of the product of interest is linked to the dimerization domain by a spacer peptide.
  • said spacer peptide is a peptide with structural flexibility. Virtually any peptide with structural flexibility can be used.
  • said flexible peptide may contain repeats of amino acid residues, such as Gly-Gly-Gly-Ser, or any other suitable amino acid residue repeat, or the hinge region of an antibody.
  • said flexible spacer peptide comprises the hinge region of an antibody and the DNA construct of the invention contains the coding sequence for said flexible peptide.
  • said fourth nucleic acid sequence contains the nucleotide sequence identified as S ⁇ Q ID NO: 3 which codes for a 10 amino acid peptide comprising the hinge region of an antibody whose amino acid sequence is shown in the S ⁇ Q ID NO: 4.
  • the DNA construct of the invention may contain, if desired, a nucleic acid sequence encoding a peptide that can be used for isolation or purification purposes of the peptide or fusion protein. Therefore, in a particular embodiment, the DNA construct of the invention contains, if desired, a fifth nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used for isolation or purification purposes.
  • Virtually any peptide or peptide sequence that allows the isolation or purification of the fusion peptide or protein can be used, for example, a polyhistidine sequence, or a peptide sequence recognized by a monoclonal antibody and which can be used to purify the resulting fusion protein by immunoaffinity chromatography, for example, tag peptides such as c-myc, HA, E, FLAG, etc. [Using Antibodies: A laboratory manual. Ed Harlow and David La e (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press. New Cork Chapter: Tagging proteins. pp. 347-377] and, in general, any other sequence recognized by an antibody.
  • Said fifth nucleic acid sequence may be located at any position of the ⁇ DN construct of the invention except in the region corresponding to the C-terminal end of Hly ⁇ since, in that case, it would break the secretion signal.
  • said fifth nucleic acid sequence could be located between said second and third nucleic acid sequences, wherein the 5 'end of said fifth nucleic acid sequence is attached to the 3' end of said second nucleic acid sequence and the 3 'end of said fifth nucleic acid sequence is attached to the 5' end of said third nucleic acid sequence.
  • said fifth nucleic acid sequence could be located in the region corresponding to the N-terminal end of the resulting fusion protein or between the product of interest and the dimerization domain.
  • the DNA construct of the invention may also contain, if desired, a sixth nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used for recognition purposes.
  • a sixth nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used for recognition purposes.
  • Virtually any peptide or peptide sequence that allows recognition of the peptide or fusion protein can be used, for example, a peptide sequence recognized by a monoclonal antibody and which can serve to recognize the resulting illusion protein by immunodetection techniques, for example, tag peptides such as c-myc, HA, E, FLAG and, in general, any other sequence recognized by an antibody.
  • Said sixth nucleic acid sequence may be located at any position of the DNA construct of the invention except in the region corresponding to the C-terminal end of HlyA to prevent the secretion signal from breaking.
  • said sixth nucleic acid sequence could be located between said second and third nucleic acid sequences, wherein the 5 'end of said sixth nucleic acid sequence is attached to the 3' end of said second nucleic acid sequence and the 3 'end of said sixth nucleic acid sequence is attached to the 5' end of said third nucleic acid sequence.
  • said sixth nucleic acid sequence could be located in the region corresponding to the N-terminal end of the resulting fusion protein or between the product of interest and the dimerization domain.
  • Said fifth and sixth nucleic acid sequences may be separated from each other.
  • said fifth and sixth nucleic acid sequences may be linked together.
  • said sixth nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used for recognition purposes may be located between said third and fifth nucleic acid sequences, wherein the 5 'end of said sixth sequence of nucleic acid is attached to the 3 'end of said fifth nucleic acid sequence and the 3' end of said sixth nucleic acid sequence is attached to the 5 'end of said third nucleic acid sequence.
  • said sequences may be linked together in the reverse order, in which case, said sixth nucleic acid sequence encoding a peptide capable of being used for recognition purposes is located between said second and fifth nucleic acid sequences, in wherein the 3 'end of said sixth nucleic acid sequence is attached to the 5' end of said fifth nucleic acid sequence and the 5 'end of said sixth nucleic acid sequence is attached to the 3' end of said second nucleic acid sequence .
  • the DNA construct of the invention may further contain a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means in order to release the dimeric protein of interest once isolated. fusion protein.
  • the DNA construct of the invention may also include a seventh sequence of nucleic acid comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means.
  • a seventh sequence of nucleic acid comprising a nucleotide sequence that encodes an amino acid sequence that can be specifically cleaved by enzymatic or chemical means.
  • said seventh nucleic acid sequence comprises a nucleotide sequence encoding a protease recognition site, for example, an enterokinase, Arg-C endoprotease, Glu-C endoprotease, Lys-C endoprotease, Factor coagulation Xa and the like.
  • said seventh nucleic acid sequence comprises a nucleotide sequence encoding a site that can be specifically cleaved by a chemical reagent such as, for example, cyanogen bromide that cleaves methionine residues or any other appropriate chemical reagent.
  • Said seventh nucleic acid sequence is generally located next to the 3 'end of said second nucleic acid sequence, at any position between the second and third nucleic acid sequences, so that enzymatic or chemical means can be cleaved. dimer protein of interest.
  • the DNA construct of the invention can be obtained by using techniques widely known in the state of the art [Sambrook et to the., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989 Vol 1-3]. Said DNA construct of the invention may, operably linked, incorporate an expression regulatory sequence, thereby constituting an expression cassette.
  • the invention provides at least one expression cassette comprising at least one DNA construct of the invention operably linked to an expression control sequence.
  • Control sequences are sequences that control and regulate transcription and, where appropriate, the translation of the product of interest, and include promoter sequences (pT7, plac, pBAD, ptet, etc.), coding sequences for transcriptional regulators (jad, tetR, araC, etc.), ribosome binding sequences (RBS), and / or transcription terminator sequences (tlt2, etc.), etc.
  • said expression control sequence is functional in bacteria, in particular, in Gram-negative bacteria.
  • the DNA construct of the invention, or the expression cassette provided by this invention can be inserted into an appropriate vector.
  • the invention relates to a vector, such as an expression vector, comprising at least one ⁇ DN construct or at least one expression cassette.
  • a vector such as an expression vector
  • the vector where said DNA sequence is introduced can be a plasmid or a vector that, when introduced into a host cell, is integrated or not into the gene a of said cell.
  • the obtaining of said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art [Sambrok et al., 1989, cited supra].
  • said vector further comprises a marker or gene that codes for a motif or for a phenotype that allows the selection of the host cell transformed with said expression cassette.
  • the invention relates to a bacterium, in particular, a Gram negative bacterium, comprising at least one DNA construct of the invention or at least one expression cassette of the invention, or at least one vector of the invention. , hereinafter bacterium of the invention. Said bacterium must have the E.
  • coli hemolysin (Hly) export system for which, if it is not native, the bacterium must be provided by transforming it with a vector containing the HlyB and HlyD genes, for example , plasmid pVDL9J [Fernández, LA et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2000, 5024-5029].
  • plasmid pVDL9J plasmid pVDL9J
  • Virtually any Gram negative bacteria for example, E. coli, Salmonella tiphymurium, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc., can be transformed with the DNA construct of the invention or with the expression cassette of the invention.
  • the promoter, regulatory, marker and origins of replication signals must be optimized for each bacterial species.
  • said Gram negative bacteria is Escherichia coli.
  • the DNA construct of the invention can be used to produce products of interest. Therefore, in another aspect, the invention relates to a method for producing a product of interest, in the form of a dimeric fusion protein, which comprises growing a bacterium of the invention under conditions that allow the production and excretion to the culture medium of said product of interest in the form of a dimeric fusion protein.
  • said dimeric fusion protein comprises two products of interest.
  • a dimeric fusion protein would be obtained by expression of the nucleic acid sequences contained in at least one DNA construct of the invention, or at least one expression cassette of the invention, or at least one vector of the invention.
  • the conditions to optimize the culture of the bacterium of the invention will depend on the bacteria used.
  • the method of producing a product of interest provided by this invention further includes isolation and purification of said dimeric fusion protein.
  • the DNA construct of the invention further includes said previously defined seventh nucleic acid sequence comprising a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence capable of being specifically cleaved by enzymatic or chemical means in order to Release the product of interest.
  • said nucleotide sequence encodes a protease recognition site, for example, an enterokinase, Arg-C endoprotease, Glu-C endoprotease, Lys-C endoprotease, Coagulation Factor Xa and the like.
  • said nucleotide sequence encodes a site that can be specifically cleaved by a chemical reagent such as, for example, cyanogen bromide that cleaves methionine residues or any other appropriate chemical reagent.
  • the invention relates to a dimeric fusion protein obtainable by expression of at least one nucleic acid sequence contained in at least one DNA construct of the invention, in which each monomer comprises: (i) the sequence of amino acids of a product of interest; (ii) an amino acid sequence corresponding to a dimerization domain; and (iii) the amino acid sequence of the E. coli HlyA or a fragment of said protein comprising the recognition signal of the secretion mechanism of the E. coli hemolysin (Hly) transport system.
  • each dimeric fusion protein monomer of the invention comprises (i) a product of interest, for example, an enzyme, an enzyme inhibitor, a hormone, a molecule involved in cell adhesion and / or signaling and composed of domains, for example, an inoglobulin, an immunogenic antigen, such as a protein or an antigenic fragment thereof from a pathogen, for example, from a viral, bacterial, a parasite pathogen, etc., which may cause infections in humans or animals, a therapeutic agent, for example, a tumor specific antigen, an antigen of an autoimmune disease, etc., or an immunoregulatory molecule, for example, a growth factor, a cytokine, such like an interleukin, an interferon, etc .; in a particular embodiment, said product of interest is a mini-antibody capable of being used for therapeutic, diagnostic or research purposes; (ii) a dimerization domain, such as a peptide helix, a double coil wound structure (coiled coil), or,
  • said dimerization domain comprises the leucine zipper of the yeast GCN4 transcription factor; and (iii) the complete amino acid sequence of E. coli HlyA, or alternatively, an E. coli HlyA fragment comprising the recognition signal of the secretion mechanism of the E. coli Hly transport system.
  • Each dimeric fusion protein monomer of the invention may also contain, if desired, (a) a spacer peptide between the product of interest and the dimerization domain; advantageously, said spacer peptide is a structurally flexible peptide, for example, a peptide containing amino acid residue repeats, such as Gly-Gly-Gly-Ser, or any other suitable amino acid residue repeat, or the hinge region of an antibody; in a particular embodiment, said flexible spacer peptide comprises the hinge region of a antibody; and / or (b) a peptide to facilitate the isolation or purification of the peptide or fusion protein, for example, a polyhistidine sequence, or a peptide sequence recognized by a monoclonal antibody and which can serve to purify the resulting fusion protein by immunoafmity chromatography, for example, tag peptides such as c-myc, HA, E, FLAG, and, in general, any other sequence recognized by an antibody; and / or (c) a
  • the dimeric fusion protein production system provided by this invention is particularly useful for the production of proteins involved in a binding activity, for example, in protein-DNA or antigen-antibody interactions, since it can intensify its greediness.
  • the DNA constructs of the invention serve for the creation and expression of a library of dimeric proteins, for example of mini-antibodies.
  • a particular example of this embodiment would be to use the mini-antibody dimers thus produced in processes of selecting molecules with binding capacity to a particular antigen.
  • the dimeric protein production system serves for the production of heterodimers between two molecules with binding capacity for different antigens or different epitopes of the same antigen, preferably two mini-antibodies, or a mini-antibody and another type of molecule, as can be, but is not limited to, a toxin, an antitumor drug, an enzyme or molecules involved in marking or detection.
  • a particular example of this embodiment would be to use these dimers for tumor cell mapping or the transport of molecules with antitumor activity to the tumor.
  • the production of this type of heterodimers presents important applications in diagnosis and therapy.
  • An advantage of the system provided by this invention is that it allows the production of toxic proteins for a bacterial host.
  • EXAMPLE 1 Production of dimeric mini-antibodies with high affinity secreted by the hemolysin transport system (Hly) of E. coli
  • Hly hemolysin transport system
  • This example describes the secretion of dimeric mini-antibodies in supernatants of E. coli cultures using the hemolysin transport system (Hly)
  • dimerization can be achieved by genetic engineering in the transport system of the Hly.
  • an amphipathic ⁇ -helix that is, the leucine zipper domain of the yeast transcription factor GCN4
  • VHHlyA the resulting polypeptide
  • the vectors derived from ⁇ HlyA and 'ZEHIyA were then used for the secretion of the VHH domains of immunoglobulins obtained from camel antibodies.
  • the hybrids V HH -EHlyA and V HH- ZEHI A were secreted and found in the extracellular medium as monomers and dimers, respectively.
  • the Vmi-ZEHlyA dimeric molecules showed superior binding properties to their related antigen, with a 10-fold increase in their functional affinity (avidity). This procedure allows to easily obtain miniantibodies V HH monomeric and dimeric with high avidity from culture supernatants of E. coli, facilitating thus the selection and purification of high performance of V HH clones from large libraries.
  • Plasmid pZEHly ⁇ ( ⁇ p 1 ) was obtained by inserting into the single site I left pEHly ⁇ a fragment of ⁇ DN of 170 bp encoding the amplified ZIP domain by PCR and digested with Sal ⁇ .
  • the plasmid map pZEHlyA is shown in Figure 6.
  • Plasmid pZEHly ⁇ 2-SD (Ap 1 ) was obtained by inserting into the single S ⁇ I site of pEHly ⁇ 2-SD the 170 bp ⁇ DN fragment encoding ZIP obtained by digestion with San of pZEHlyA.
  • the plasmid pZEHly ⁇ 2-SD map is shown in Figure 7.
  • the orientation of the ZIPDN ZIP fragment that produced an internal insertion in the E-labeled C-HlyA domain of pZEHlyA and pZEHlyA2-SD after ⁇ DN sequencing was selected.
  • the approximately 0.3 kb DNA fragments encoding the VH H , Vamy YV to domains were amplified by PCR with Vent DNA polymerase, using as template 1 ng of the phagemid A100R3A2 (anti- ⁇ -amylase) or R3E5 ( tetanus vaccine), respectively, and as primers the oligonucleotides identified as SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO:
  • the amplified DNA products encoding V amy and V ⁇ t ⁇ contained the flanking restriction sites Ncol and Sfi ⁇ , which allowed their cloning at the same sites of pEHlyA2-SD and pZEHlyA2-SD, thus generating pV ⁇ HlyA, pV to HlyA, pN ⁇
  • the plasmid maps V ⁇ lyA and pV ⁇ J , ZhlyA are shown in Figures 8 and 9, respectively.
  • Phagemids A100R3A2 and R3E5 were provided by Dr. Hennie Hoogenboon (Dyax Co., USA). Both phagemids are derived from pCA ⁇ TAB6 (Cambridge Research Biochemicals) that contain the V HH domains of cloned camelids between the S ⁇ l and Not ⁇ sites.
  • Electrophoresis and immunoblotting of proteins were carried out on sodium dodecyl sulfate-po liacrylamide gels (SDS-PAGE) using 4% stacking and 10% separation gels (acrylamide: bisacrylamide 29: 1; Bio-Rad), using the system of Miniprotean® (Bio-Rad) electrophoresis and following the standard protocols [Ausubel, FM, R. Brent, RE guitarist, DD Moore, JG Seidman, JA Smith, and K. Struhl 1994. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, ew York; Fraile, S., F. Roncal, LA Fernandez, and V. de Lorenzo 2001.
  • the membrane was blocked in MTP buffer (3% w / v skim milk, 0.1% v / v tween 20 in PBS) and the E-labeled polypeptides were detected with peroxidase-labeled anti-E monoclonal antibody (0, 2 ⁇ g / ml in MTP buffer; Amersham Bioscience).
  • the bound antibody-POD conjugate was revealed by chemilumimscence, as already described [Fraile, S., F. Roncal, LA Fernandez, and V. de Lorenzo 2001.
  • the culture supernatants (approximately 0.2 ml) containing PBS IX were mixed with 2 mg of standard protein of known mass (dissolved in 60 ⁇ l of H 2 O) and passed through a Bio-Gel ⁇ resin of l, 5m (Bio-Rad) packed in a column 1 m long and 1.5 cm wide (Bio-Rad).
  • the gel filtration patterns (Bio-Rad) were thyroglobulin (PM 670,000), bovine gammobulbulin (PM 158,000), chicken ovalbumin (PM 44,000), equine myoglobin (PM 17,000) and vitamin B-12 ( PM 1J50).
  • the flow rate of the sample through the column was set at 0.2 ml / min using a peristaltic pump (Pl, Amersham Bioscience).
  • the vacuum volume of the column was calculated by elution of dextran blue 2000 (Amersham Bioscience). Elution of protein patterns through the column was monitored by UN light absorption (Uvicord S LT, Amersham Bioscience). He collected 1 ml fractions (RediFrac collector, Amersham Bioscience) and concentrated 10 times by precipitation with 10% trichloroacetic acid (TCA) and 10 ⁇ g bovine serum albumin (BSA, Roche) that acted as a transporter. The presence of E-labeled HlyA proteins in these fractions was detected by Western blotting using a POD-labeled anti-E monoclonal antibody (see above).
  • Enzyme-linked immunosorbent assays ELISA.
  • the antigens ( ⁇ -amylase or ovalbumin; Sigma) were adsorbed for 1 h at 37 ° C to 96-well microtiter immunoplates (Maxisorb, Nunc) at 200 ⁇ g / ml in PBS. The excess antigen was washed and the plates were blocked for 16 h at 4 ° C in MTP buffer (see above).
  • the mini-antibodies were diluted in MTP buffer, added to the wells at the concentrations indicated in each case and incubated for 1 h at room temperature. Next, unbound antibodies were removed by four washes of the wells with PBS containing 0.1% Tween 20 (v / v).
  • the POD-labeled anti-E monoclonal antibody conjugate (0.2 ⁇ g / ml in MTP buffer) was added to the wells and further incubated for 1 h at room temperature to detect the bound E-labeled mini-antibodies, after washing as before, Plaques were revealed using o-phenylenediamine (Sigma). The reaction was allowed to continue for 10 minutes in the dark, stopped with 0.6 N HCl and the OD was determined at 490nm of the wells (Benchmark microplate reader, Bio-Rad).
  • Miniantibodies use of amphipathic helices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli Biochemistry. 31: 1579-84] for insertion in C-HlyA.
  • the ZIP domain consists of an amphipathic helix that forms the leucine zipper of the GCN4 yeast transcription factor, flanked at its N-terminal end by a peptide hinge zone derived from the mouse IgG3, and at its C-terminal end by a marker of polyhistidine (6xhis).
  • a DNA fragment encoding the ZIP domain was inserted internally near the N-terminal end of the approximately 27 kDa E-labeled version of C-HlyA (EHlyA) present in the plasmid pEHlyA ( Figure 1A).
  • the resulting plasmid, pZEHlyA codes for a polypeptide of approximately 33 kDa (called ZEHlyA) containing the ZIP and C-HlyA domains labeled with E ( Figures 1A and IB).
  • the production of ZEHlyA and EHlyA, as a control without ZLP, was induced in cultures of wild-type TolC + cells of E.
  • ZEHlyA showed an apparent Mr of approximately 66 kDa on gel filtration chromatography, while EHlyA had an apparent Mr of approximately 32 kDa under the same conditions. It is important that a single peak be detected for each protein (Figure 3B), which indicates that both polypeptides were present as monomers (EHlyA) and dimers (ZEHlyA) stable in solution. Taken together, these results demonstrated that protein dimerization could be obtained by incorporating unfriendly helices into C-HlyA without interfering with its secretion by the Hly transporter.
  • pZEHlyAJ-SD a plasmid, called pZEHlyAJ-SD, was constructed to generate internal fusions between recombinant antibody fragments that lack the N-SP and ZEHlyA domain.
  • This plasmid is a derivative of pEHlyA2-SD [Fernández, LA, I. Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000.
  • camel V HH co antibodies or fusion pairs were due to their small size (approximately 15 kDa) and their low tendency to form protein aggregates [Muyldermans, S. 2001. Single domain camel antibodies: current status J Biotechnol. 74: 277-302; Plückthun, A., and P. Pack 1997. New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments Immunotechnology. 3: 83- 105], which could interfere with the dimerization analysis obtained by the ZIP domain (see Discussion). E.
  • coli HB2151 cells (pNDL9J) were transformed with a plasmid encoding the hybrid N HH- HlyA (N ⁇ ⁇ HlyA, pN ⁇ OT ⁇ ZHlyA, pN te HlyA or pN ttf ZHlyA) and induced 4 h by adding 0.3 mM PTG to liquid cultures grown in LB at 30 or 37 ° C.
  • the secreted polypeptides N ⁇ m? HlyA and N roj ZHlyA were subsequently detected in the supernatants of the corresponding cultures of E. coli by Western blotting with POD-labeled anti-monoc monoclonal antibody ( Figure 4C).
  • V HH camel antibodies can be produced by fusing them to the ⁇ HlyA or Z ⁇ HlyA moieties, respectively.
  • dimerization improved the functional binding properties of N ⁇ ZHly ⁇ .
  • the binding to the ⁇ -amylase of V a ⁇ m , A ⁇ yA monomeric and V ⁇ m , dimeric ZHlyA was compared by ELISA.
  • serial dilutions of E. coli culture supernatants containing identical amounts of V ⁇ mj , HlyA or V to ⁇ ZHlyA were incubated with ELISA plates coated with ⁇ -amylase or ovalbumin (as a control antigen).
  • DISCUSSION Dimerization is a property that is often desired to be engineered in proteins when binding activity is involved (for example, in protein-DNA or antigen-antibody interactions), since it can enhance its functional affinity (avidity).
  • This example illustrates the genetic engineering, for the first time, of the dimerization of the proteins secreted by the E. coli hemolysin transport system and that technology has been used to produce high avidity mini-antibodies derived from camel V antibodies.
  • HH - The results obtained demonstrate that the incorporation of an amphipathic autodimerization helix at the N-terminus of C-HlyA does not interfere with the secretion of Hly and allows the dimerization of the secreted polypeptide.
  • dimerization can intensify the avidity of the binding of the secreted polypeptide derived from C-HlyA.
  • it can also have other applications, such as the molecular association of various antigens and / or adjuvants produced by live bacterial strains, or the combination of various biological activities for the generation of bispecific molecules (for example, antigen binding and recruitment of the complement).
  • Highly avid dimeric scFvs have been produced in the periplasm of E. coli cells by inserting antipathic helices at their C-terminal end. Due to the tendency of some scFvs to form dimers and aggregates of high molecular weight proteins, smaller antibody fragments were used.
  • V HH camel antibodies have received a lot of attention due to their better solubility and their simpler structure, which facilitates their amplification and cloning. It is worth noting that the changes made do not diminish the affinity or specificity of the V HH camel antibodies, due to the presence of extremely variable complementarity determining regions (CDRs) that compensate for the loss of diversity caused by the absence of a VL domain Camel antibodies have also demonstrated extraordinary potential as enzyme inhibitors since their large CDRs can reach the active sites hidden in enzymes. In addition, the similarity between the VHH camel antibodies and the human VH3 family sequences is allowing the generation of libraries presented in phages of the camelized human V H domains and the humanized V H H camel antibodies.
  • CDRs complementarity determining regions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

El sistema comprende una construcción de ADN que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés; b) una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y c) una tercera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la α-hemolisina (HlyA) de Escherichia coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. Coli. De aplicación en la producción de proteínas recombinantes diméricas.

Description

TÍTULO
SISTEMA PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS DIMÉRICAS BASADO EN
EL SISTEMA DE TRANSPORTE DE HEMOLISINA DE Escherichia coli
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con la producción de proteínas recombinantes diméricas mediante el empleo de un sistema de expresión de proteínas basado en el sistema de transporte de hemolisina de Escherichia coli.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Desde hace algún tiempo se está investigando en la producción de proteínas de fusión que comprenden fragmentos de anticuerpos recombinantes bi- o multifuncionales (minianticuerpos). Estas proteínas de fusión presentan algunas ventajas y pueden ser utilizadas con fines terapéuticos o de diagnóstico. Por este motivo, se han ido desarrollando diversos sistemas de expresión de fragmentos de anticuerpos. Algunos de estos sistemas de expresión se basan en el empleo de Escherichia coli. Habitualmente se seleccionan diferentes fragmentos de anticuerpos y se producen en E. coli tras la clonación de fragmentos de las regiones variable (V) y constante (C) de inmunoglobulinas (Ig) en vectores de fagos filamentosos o fagémidos [Hoogenboom, H. R. 1997. Designing and optimizing library selection strategies for generating high- affínity antibodies Trends in Biotechnology. 15:62-70; Hoogenboom, H. R. 2002. Overview of antibody phage-display technology and its applications Methods Mol Biol. 178: 1-37; Winter, G., A. D. Griffiths, R. E. Ha kins, and H. R. Hoogenboom 1994. Ma ing antibodies by phage display technology Annual Rev. Immunol. 12:433-455]. Estos fragmentos reconstruyen el sitio de unión al antígeno del anticuerpo original que, en general, se ensambla mediante el contacto de los dominios V de las cadenas pesadas (H) y ligeras (L) [Ay, J., T. Kcitel, G. Kuttner, H. Wessner, C. Scholz, M. Hahn, and W. Hohne 2000. Crystal structure of a phage library-derived single-chain Fv fragment complexed with tur ey egg-white lysozyme at 2.0 A resolution J Mol Biol. 301:239-46]. Este es el caso de las moléculas Fab, que consisten en la asociación de dos polipéptidos que contienen los dominios VH-CHI y VL-CL y de las moléculas Fv (scFv) de cadena simple, en las que los dominios VH y VL se unen en un único polipéptido. Las moléculas de Fab y scFv tienen ventajas importantes, tales como niveles de expresión más elevados en E. coli y una mejor distribución y aclaramiento más rápido cuando se administran in vivo para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas [C rter, P., and A. M. Merchant 1997. Εngineering antibodies for imaging and therapy Current Opinión in Biotechnology. 8:449-454; Marasco, W. A., and S. Dana Jones 1998. Antibodies for targeted gene therapy: extracellular gene targeting and intracellular expression Adv Drug Deliv Rev. 31:153-170; Yokota, T., D. Ε. Milenic, M. Whitlo , and J. Schlo 1992. Rapid tumor penetration of a single-chain Fv and comparison with other immunoglobulin forms Cáncer Res. 52:3402-8]. También se han producido en E. coli fragmentos de anticuerpo basados en un único dominio de Ig [Nuttall, S. D., R. A. Irving, and P. J. Hudson 2000. Immunoglobulin VH domains and beyond: design and selection of single-domain binding and targeting reagents Curr Pharm Biotechnol. 1:253-63; Riechmann, L., and S. Muyldermans 1999. Single domain antibodies: comparison of camel NH and camelised human NH domains J Immunol Methods. 231:25-38; Sheriff, S., and K. L. Constantino 1996. Redefining the minimal antigen-binding fragment Νat Struct Biol. 3:733-6]. Este progreso se realizó gracias al hallazgo de que en las especies de camélidos (por ejemplo, llamas, camellos) una proporción de sus anticuerpos naturales carece de cadena ligera, construyendo, por tanto, su superficie de unión a antígenos con un único dominio N de la cadena pesada (VHH). Además de los beneficios de scFv y Fabs, los dominios VHH han demostrado una estabilidad y solubilidad superiores y una inmunogenicidad inferior [Cortez-Retamozo, V., M. Lauwereys, G. Hassanzadeh Gh, M. Gobert, K. Conrath, S. Muyldermans, P. De Baetselier, and H. Revets 2002. Efficient tumor targeting by single-domain antibody fragments of camels Int J Cáncer. 98:456-62; Νuttall, S. D., R. A. Irving, and P. J. Hudson 2000. Immunoglobulin NH domains and beyond: design and selection of single-domain binding and targeting reagents Curr Pharm Biotechnol. 1:253-63; Riechmann, L., and S. Muyldermans 1999. Single domain antibodies: comparison of camel NH and camelised human NH domains J Immunol Methods. 231:25-38]. Sin embargo, todos estos fragmentos de anticuerpo pierden la bivalencia de unión a antígenos (o multivalencia) mostrada por los anticuerpos completos. Su carácter monovalente se refleja por una disminución en la afinidad funcional (avidez) para sus antígenos correspondientes. Para solventar este problema, se obtuvieron por ingeniería genética cortos dominios de oligomerización (por ejemplo- hélices anfipáticas) en los extremos C terminales para producir minianticuerpos bivalentes y tetravalentes con avidez idéntica a los anticuerpos completos [Pack, P., M. Kujau, V. Schroeckh, U. Knupfer, R. Wenderoth, D. Riesenberg, and A. Plückthim
1993. Improved bivalent miniantibodies, with identical avidity as whole antibodies, produced by high cell density fermentation of Escherichia coli Biotechnology (N Y). 11:1271-7; Pack, P., K. MuIIer, R. Zahn, and A. Plückthun 1995. Tetravalent miniantibodies with high avidity assembling in Escherichia coli J Mol Biol. 246:28-34; Pack, P., and A. Plückthun 1992. Miniantibodies: use of a phipathic hélices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli Biochemistry. 31:1579-84; Plückthun, A., and P. Pack 1997. New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments Immunotechnology. 3:83-105; Rheinnecker, M., C. Hardt, L. L. Ilag, P. Kufer, R. Gruber, A. Hoess, A. Lupas, C. Rottenberger, A. Plückthun, and P. Pack 1996. Multivalent antibody fragments with high functional affinity for a tumor-associated carbohydrate antigen J Immunol. 157:2989-97]. En casi todos los casos, los fragmentos de anticuerpos monovalentes y multivalentes se han producido en el espacio periplásmico de E. coli fusionándoles un péptido señal en el extremo N terminal (N-SP) que es reconocido por la maquinaria celular de la rata de secreción general (Sec) [Plückthun, A., C. Krcbbcr, U. Rrcbbcr, U. Horn, U. Knüpfcr, R. Wenderoth, L. Nicba, K. Proba, and D. Riesenberg 1996. Producing antibodies in Escherichia coli: from PCR to fermentation, p. 203-252. In J. McCafferty, and H. R. Hoogenboom (eds), Antibody Engineering: A Practical Approach. LRL Press, Oxford]. Recientemente se ha descrito un método alternativo para la producción de scFvs funcionales en el medio extracelular de cultivos de E. coli que emplean el transportador de la hemolisina α (Hly) [Fernández, L. A., I. Sola, L. Enjuancs, and V. de Lorenzo 2000. Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernantants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system Appl Environ Microbiol. 66:5024-5029]. Este sistema de secreción es independiente de los genes sec celulares y consta de dos componentes de membrana interna (IM), HlyB y HlyD, y el poro de la membrana externa (OM), TolC, que se ensamblan en un gran complejo proteico con un canal hidrófilo interno [Gentschev, L, G. Dietrich, and W. Goebel 2002. The E. coli alpha-hemolysin secretion system and its use in vaccine development Trends Microbiol. 10:39-45; Koronakis, V., C. Andersen, and C. Hughes 2001. Channel-tunnels Curr Opin Struct Biol. 11:403-7; Koronakis, V., A. Sharff, E. Koronakis, B. Luisi, and C. Hughes 2000 . Crystal structure of the bacterial membrane protein TolC central to multidrug efflux and protein export Nature. 405:914-919; Thanabalu, T., E. Koronakis, C. Hughes, and V. Koronakis 1998. Substrate-induced assembly of a contiguous channel for protein export from E. coli: reversible bridging of an inner-membrane translocase to an outer membrane exit pore EMBO J. 17:6487-96]. El sustrato natural de este sistema, la toxina de la hemolisina oc (HlyA), se expulsa a través de este canal directamente desde el citoplasma hacia el medio extracelular sin un intermediario periplásmico y de una forma dependiente de ATP. La señal reconocida por la maquinaria de secreción de Hly se localiza en el extremo C terminal de HlyA. Se ha demostrado que los híbridos scFv-HlyA, que contienen una molécula de scFv que carece del N-SP unido al último HlyA de aproximadamente 23 kDa, se secretan de una forma funcional y oxidada por el transportador de Hly [Fernández, L. A., and V. De Lorenzo 2001. Formation of disulphide bonds during secretion of proteins through the periplasmic-independent type I pathway Mol Microbiol. 40:332-46; Fernández, L. A., I. Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000. Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernantants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system Λppl Environ Microbiol. 66:5024-5029]. Por otra parte, la dimerización es una propiedad que con frecuencia se desea conseguir por ingeniería genética en las proteínas cuando está implicada una actividad de unión (por ejemplo, en las interacciones proteína-ΛDN o antígeno-anticuerpo), puesto que puede intensificar su afinidad funcional (avidez), o crear moléculas biespecíficas [Baxevanis, A. D., and C. R. Vinson 1993. Interactions of coiled coils in transcription factors: where is the specificity? Curr Opin Genet Dev. 3:278-85; Busch, S. J., and P. Sassonc-Corsi 1990. Dimers, leucine zippers and DNΛ-binding domains Trends Genet. 6:36-40; Crothcrs, D. M., and H. Mctzgcr 1972. The influence of polyvalency on the binding properties of antibodies Immunochemistry. 9:341-357; Plückthun, A., and P. Pack 1997. New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments Immunotechnology. 3:83-105]. Un procedimiento para la producción de proteínas diméricas que comprenden dos proteínas de fusión monoméricas en una interacción no covalente ha sido descrito en la patente norteamericana US 5.910.573. Las proteínas diméricas así obtenidas se acumulan dentro de la célula en el espacio periplásmico, sin secretarse al medio extracelular. Esto conduce a una mayor toxicidad de su expresión para la bacteria E. coli, induciendo un menor rendimiento en los cultivos (peso seco de células por litro), y dificultando la posterior purificación del anticuerpo dimérico al tener que lisar (romper) las bacterias. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar sistemas alternativos para la producción de proteínas diméricas.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona una solución a la necesidad existente basada en el desarrollo de una construcción de ADN que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la α-hemolisina (HlyA) de Escherichia coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. coli. Mediante el empleo de dicho sistema de expresión y secreción de proteínas se obtienen proteínas diméricas en el medio. La eficacia de dicho sistema de secreción ha sido demostrada mediante la producción de minianticuerpos de alta avidez derivados de los anticuerpos de camello VHH (Ejemplo 1). El translocador de hemolisina de E. coli se había usado anteriormente para la secreción de polipéptidos heterólogos, especialmente toxinas y antígenos de patógenos, así como para la secreción de anticuerpos recombinantes scFv. Sin embargo, los resultados ahora obtenidos han puesto de manifiesto que la incorporación de una hélice anfipática de autodimerización en el extremo N terminal de C-HlyA no interfiere con la secreción de Hly y permite la dimerización del polipéptido secretado. Asimismo, la dimerizaciόn intensifica la avidez de la unión del polipéptido secretado derivado de C- HlyA. Además, también puede tener otras aplicaciones, como la asociación molecular de varios antígenos y/o adyuvantes producidos por cepas bacterianas vivas, o la combinación de diversas actividades biológicas para la generación de moléculas biespecíficas (por ejemplo, la unión a un antígeno y el reclutamiento del complemento). Por tanto, un aspecto de esta invención se relaciona con una construcción de ADN que comprende (i) una secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés; (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y (iii) una secuencia de nucleótidos que codifica para la α-hemolisina (HlyA) de Escherichia coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. coli. Εn otro aspecto, la invención se relaciona con un cassette de expresión que comprende dicha construcción de ADN operativamente unida a una secuencia de control de expresión. Εn otro aspecto, la invención se relaciona con una bacteria que comprende al menos una construcción de ADN o al menos un cassette de expresión. Εn otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un producto de interés, en forma de una proteína de fusión dimérica, que comprende crecer dicha bacteria bajo condiciones que permiten la producción y excreción al medio de cultivo de dicho producto de interés en forma de una proteína de fusión dimérica. Εn un aspecto preferido de la invención ésta se relaciona con un método para producir una proteína de fusión heterodimérica que comprende dos productos de interés. Εn otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión dimérica obtenible por expresión de al menos una secuencia de ácido nucleico contenida en al menos una construcción de ΛDN.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra la secreción del polipéptido C-HlyA que contiene el dominio ZIP. La Figura 1A muestra una representación esquemática de la estructura de los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA que contienen la señal de secreción de 23 kDa MyA) del transportador de Hly de E. coli marcado con el epítopo E. La masa de dichos polipéptidos (en kDa), deducida de su secuencia de aminoácidos, se muestra a la derecha.
Se indica la composición del dominio ZIP (bisagra de Ig, cremallera de leucina, marca de 6xhis). También se muestra la secuencia de aminoácidos de la región N terminal de ambos polipéptidos EHlyA y ZEHlyA. La Figura IB es una representación esquemática del polipéptido C-HlyA (monomérico) marcado con el epítopo E y del polipéptido C-
HlyA (dimérico) marcado con el epítopo E y que contiene el dominio ZIP (bisagra de Ig, cremallera de leucina, marca de 6xhis). La Figura 1C muestra el resultado de la inmuno- transferencia desarrollada con un anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD de las proteínas secretadas (S) y celulares (C) producidas tras la inducción de 4 h con IPTG 0,3 mM de cultivos de células de E. coli HB2151, crecidas a 37°C- que contienen el plásmido pNDL9J (que codifica para HlyB y HlyD) y uno de los plásmidos indicados, pEHlyA o pZEHlyA. Las proteínas cargadas por carril representan las encontradas en aproximadamente 5 μl de los sobrenadantes (S) del cultivo y las de las células de E. coli (C) presentes en aproximadamente 100 μl de los mismos cultivos (DO6oonm aproximadamente 2). La Figura 2 ilustra el entrecruzamiento de los polipéptidos C-HlyA secretados con glutarato de disuccini idilo (DSG). Los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA secretados (10 μg/ml en PBS aproximadamente) se incubaron con DSG, a las concentraciones indicadas, y se sometieron a SDS-PAGE desnaturalizante y a inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD (véase el Ejemplo 1, apartado relativo a los Materiales y Métodos, para más detalles). Tal como se muestra, ZEHlyA se entrecruzó con DSG formando una banda proteica en SDS-PAGE de aproximadamente 66 kDa- unas dos veces el tamaño de su monómero. La Figura 3 muestra los resultados de la cromatografía de filtración en gel de los polipéptidos de C-HlyA monoméricos y diméricos. La Figura 3A es un gráfico que representa el volumen de elución de los polipéptídos EHlyΛ (círculo) y ZEHlyΛ (triángulo) separados por cromatografía de filtración en gel (véase el Ejemplo 1, apartado relativo a los Materiales y Métodos, para más detalles) junto con patrones de proteínas de masa conocida (cuadrados). Los patrones de masa utilizados fueron la tiroglobulina (Mr 670.000), la gammablobulina bovina (Mr 158.000), la ovoalbúmina de pollo (Mr 44.000) y la mioglobina equina (Mr 17.000). La presencia de EHlyA o ZEHlyA en las fracciones eluídas se determinó por inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD. La Figura 3B muestra el resultado de la inmunotransferencia desarrollada con un anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD de los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA. Una representación esquemática de EHlyA (monomérico) y de ZEHlyA (dimérico) se muestra en la parte superior. La Figura 4 ilustra la secreción de polipéptidos NHH-HlyA monoméricos Vamy- HlyA) y diméricos (N^-ZHlyA). La Figura 4A es una representación esquemática de la estructura de los polipéptidos N^-HlyA y Yamy-Z \γA que contienen la señal de secreción de 23 kDa (hlyA) del transportador de Hly de E. coli marcado con el epítopo E. La masa de dichos polipéptidos (en kDa), deducida de su secuencia de aminoácidos, se muestra a la derecha. La Figura 4B es una representación esquemática del polipéptido (monomérico) marcado con el epítopo E y del polipéptido Nαffí ZHlyA (dimérico) marcado con el epítopo E y que contiene el dominio ZIP (bisagra de Ig, cremallera de leucina, marca de 6xhis). La Figura 4C muestra los resultados de un Western blot en donde se pone de manifiesto la secreción de híbridos proteicos que tienen dominios NHHy -EHlyA o -ZEHlyA. Las células de E. coli HB2151 (pNDL9J) que llevan uno de los plásmidos indicados ( NαwμHlyA o pNα^ZHlyA) se indujeron con IPTG (véase el Ejemplo 1, apartado relativo a los Materiales y Métodos, para más detalles), a la temperatura indicada, y la presencia de polipéptidos secretados marcados con el epítopo E en sobrenadantes de cultivos se determinó por inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD. Los polipéptidos NαmyHlyA y Nαm ZHlyA de longitud completa se detectaron en los sobrenadantes de cultivos, junto con algunos fragmentos proteolíticos derivados de ellos. La Figura 4D es un gráfico del volumen de elución de los polipéptidos N^HlyA (círculo) y VamyZΗlyA (triángulo) separados por cromatografía de filtración en gel, junto con patrones de proteínas de masa conocida (cuadrados) y detectados con inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD. Los patrones de masa utilizados fueron los mismos que los utilizados en relación con la Figura 3. La Figura 5 es una gráfica que ilustra la actividad de unión de los polipéptidos NHH-HlyA monoméricos y diméricos. La unión de la α-amilasa mediante los polipéptidos NomjHlyΛ y Nam;,ZhlyA, a las concentraciones indicadas, se determinó mediante ELISA (véase el Ejemplo 1, apartado relativo a los Materiales y Métodos, para más detalles). Los minianticuerpos marcados con el epítopo E unidos se detectaron con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD y lectura de la D.O. a 490 n . Como controles de la especificidad se emplearon N/αHlyΛ y N/toZhlyΛ. La unión previa a un antígeno control no relacionado (ovoalbúmina) se ha sustraído (DO490nm ≤ 0,05). Los datos presentados son la media de los triplicados de cada punto. Se realizaron dos experimentos adicionales independientes, que demostraron valores similares a los mostrados en la figura. La Figura 6 muestra el mapa del plásmido pZEHlyA. La Figura 7 muestra el mapa del plásmido pZEHlyA2-SD. La Figura 8 muestra el mapa del plásmido pNα,„ HlyA. La Figura 9 muestra el mapa del plásmido pNα,,vZhlyA. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención proporciona una construcción de ADN, en adelante construcción de ADN de la invención, que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés; b) una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y c) una tercera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la α-hemolisina (HlyA) de E. coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Ffly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli;
en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
La primera secuencia de ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés (gen de interés). El producto de interés puede ser eucarótico, procariótico, viral, etc. Prácticamente cualquier péptido o proteína susceptible de ser expresado de forma recombinante puede ser utilizado en la construcción de ADN de la invención, por ejemplo, enzimas, inhibidores enzimáticos, hormonas, moléculas implicadas en la adhesión y/o señalización celular, moléculas implicadas en detección o mareaje, y moléculas compuestas por dominios, por ejemplo, inmunoglobulinas, etc. A modo ilustrativo, dicho producto de interés puede ser un antígeno inmunogénico tal como una proteína o un fragmento antigénico de la misma procedente de un patógeno, por ejemplo, de un patógeno viral, bacteriano, de un parásito, etc., que puede causar infecciones en seres humanos o animales; un agente terapéutico, por ejemplo, un antígeno específico de tumor, un antígeno de una enfermedad auto -inmune, etc.; o una molécula inmunoreguladora, por ejemplo, factores de crecimiento, citoquinas, tales como interleuquinas, interferones, etc. En una realización particular, dicho producto de interés es un minianticue o, definiendo minianticuerpos o anticuerpos recombinantes como fragmentos derivados de los anticuerpos construidos por tecnología de ADN recombinante, y que pese a su menor tamaño conservan la capacidad de unión al antígeno ya que mantienen los dominios variables de inmunoglobulina, donde residen las zonas de unión a los antígenos. La segunda secuencia de ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización. Un dominio de dimerización es una secuencia peptídica que promueve la dimerización en las proteínas que lo contienen. Prácticamente cualquier dominio de dimerización puede ser utilizado en la construcción de ADN de la invención, por ejemplo, hélices peptídicas, que contienen, al menos, una hélice, o una estructura formada por una hélice, una vuelta y otra hélice, etc., estructuras de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil), y, en general, cualquier secuencia peptídica que promueva la dimerización en las proteínas que la contengan. En una realización particular, dicho dominio de dimerización comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción GCN4 de levadura. La tercera secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para la α-hemolisina (HlyA) de E. coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli. La señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli parece estar comprendida en el extremo carboxilo terminal (C-terminal), concretamente dentro de los últimos 60 aminoácidos de HlyA. La secuencia de aminoácidos y nucleótidos de la HlyA de E. coli puede obtenerse de GeneBank, número de acceso M10133, donde también puede obtenerse la secuencia de nucleótidos de aminoácidos de HlyB y HlyD. Εn una realización particular, dicha tercera secuencia de ácido nucleico está constituida por la secuencia de nucleótidos que codifica para la HlyA de E. coli. Εn otra realización particular, dicha tercera secuencia de ácido nucleico comprende un fragmento de la HlyA de E. coli que contiene la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli, tal como una secuencia de nucleótidos que codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo C- terminal de HlyA de E. coli. Εn este caso, dicha tercera secuencia de ácido nucleico está constituida por, o comprende, la secuencia de nucleótidos que codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo C-terminal de HlyA de E. coli. Εn una realización concreta de la invención, dicha tercera secuencia de ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos identificada como SΕQ ID NO: 1 que codifica para un péptido de aproximadamente 23 kDa del extremo carboxilo terminal de HlyA de E. coli cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SΕQ ID NO: 2. Εn general, el dominio de dimerización no se fusiona directamente al gen que codifica el producto de interés sino que es ventajoso introducir un péptido espaciador (flexible) entre el extremo del gen que codifica para el producto de interés y el comienzo del dominio de dimerización. Por tanto, si se desea, la construcción de ADN de la invención también puede contener, además, una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido espaciador situada entre dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha cuarta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha cuarta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico. De esta manera, la secuencia codificante del producto de interés está unida al dominio de dimerización mediante un péptido espaciador. Ventajosamente, dicho péptido espaciador es un péptido con flexibilidad estructural. Prácticamente, cualquier péptido con flexibilidad estructural puede ser utilizado. Λ modo ilustrativo, dicho péptido flexible puede contener repeticiones de restos de aminoácidos, tales como Gly-Gly-Gly- Ser, o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada, o bien la región bisagra de un anticuerpo. Εn una realización particular, dicho péptido espaciador flexible comprende la región bisagra de un anticuerpo y la construcción de ADN de la invención contiene la secuencia codificante para dicho péptido flexible. Εn una realización concreta de la invención, dicha cuarta secuencia de ácido nucleico contiene la secuencia de nucleótidos identificada como SΕQ ID NO: 3 que codifica para un péptido de 10 aminoácidos que comprende la región bisagra de un anticuerpo cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SΕQ ID NO: 4. Para facilitar el aislamiento y purificación del péptido o protema de fusión obtenida mediante la presente invención, la construcción de ADN de la invención puede contener, si se desea, una secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión. Por tanto, en una realización particular, la construcción de ADN de la invención contiene, si se desea, una quinta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación. Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia de polihistidina, o una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG, etc. [Using Antibodies: A laboratory manual. Ed Harlow and David La e (1999). Cold Spring Harbor Laboratory Press. New Cork. Capítulo: Tagging proteins. pp. 347-377] y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. Dicha quinta secuencia de ácido nucleico puede estar situada en cualquier posición de la construcción de ΛDN de la invención excepto en la región correspondiente al extremo C-terminal de HlyΛ ya que, en ese caso, rompería la señal de secreción. Λ modo ilustrativo, dicha quinta secuencia de ácido nucleico podría estar situada entre dichas segunda y tercera secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha quinta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3 ' de dicha quinta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, dicha quinta secuencia de ácido nucleico podría estar situada en la región correspondiente al extremo N-terminal de la proteína de fusión resultante o entre el producto de interés y el dominio de dimerización. Para facilitar el reconocimiento de la proteína o péptido de íusión obtenido, la construcción de ADN de la invención también puede contener, si se desea, una sexta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento. Prácticamente cualquier péptido o secuencia peptídica que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión puede ser utilizada, por ejemplo, una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de íusión resultante por técnicas de inmunodetección, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo. Dicha sexta secuencia de ácido nucleico puede estar situada en cualquier posición de la construcción de ADN de la invención excepto en la región correspondiente al extremo C-terminal de HlyA para evitar que se rompa la señal de secreción. A modo ilustrativo, dicha sexta secuencia de ácido nucleico podría estar situada entre dichas segunda y tercera secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, dicha sexta secuencia de ácido nuicleico podría estar situada en la región correspondiente al extremo N-terminal de la proteína de fusión resultante o entre el producto de interés y el dominio de dimerización. Dichas quinta y sexta secuencias de ácido nucleico pueden estar separadas entre sí. Alternativamente, en una realización particular, dichas quinta y sexta secuencias de ácido nucleico pueden estar unidas entre sí. En este caso, a modo ilustrativo, dicha sexta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento puede estar situada entre dichas tercera y quinta secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 5' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha quinta secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, dichas secuencias pueden estar unidas entre sí en el orden inverso, en cuyo caso, dicha sexta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento está situada entre dichas segunda y quinta secuencias de ácido nucleico, en donde el extremo 3' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha quinta secuencia de ácido nucleico y el extremo 5' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico. Si se desea, la construcción de ADN de la invención puede contener, además, una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos con el fin de liberar la proteína dimérica de interés una vez aislada la proteína de fusión. En este caso, la construcción de ADN de la invención puede incluir, además, una séptima secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos. Prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimático o químicos puede ser utilizada. En una realización particular, dicha séptima secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio de reconocimiento de una proteasa, por ejemplo, una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, Glu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa, Factor de coagulación Xa y similares . En otra realización particular, dicha séptima secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio susceptible de ser específicamente escindido por un reactivo químico tal como, por ejemplo, bromuro de cianógeno que escinde restos de metionina o cualquier otro reactivo químico apropiado. Dicha séptima secuencia de ácido nucleico se encuentra, generalmente, a continuación del extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico, en cualquier posición entre las secuencias segunda y tercera de ácido nucleico, de manera que por medios enzimáticos o químicos se pueda escindir la proteína dímera de interés. La construcción de ADN de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica [Sambrook et al., "Molecular cloning, a Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1989 Vol 1-3]. Dicha construcción de ADN de la invención puede incorporar, operativamente unida, una secuencia reguladora de la expresión, constituyendo de este modo un cassette de expresión. Por tanto, en otro aspecto, la invención proporciona al menos un cassette de expresión que comprende al menos una construcción de ADN de la invención operativamente unida a una secuencia de control de expresión. Las secuencias de control son secuencias que controlan y regulan la transcripción y, en su caso, la traducción del producto de interés, e incluyen secuencias promotoras (pT7, plac, pBAD, ptet, etc.), secuencias codificantes para reguladores transcripcionales (jad, tetR, araC, etc.), secuencias de unión a ribosomas (RBS), y/o secuencias terminadoras de transcripción (tlt2, etc.), etc. En una realización particular, dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias, en particular, en bacterias Gram negativas. La construcción de ADN de la invención, o el cassette de expresión proporcionado por esta invención, pueden ser insertados en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector, tal como un vector de expresión, que comprende al menos una construcción de ΛDN o al menos un cassette de expresión. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, el vector donde se introduce dicha secuencia de ADN puede ser un plásmido o un vector que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra o no en el geno a de dicha célula. La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia [Sambrok et al., 1989, citado supra]. Ventajosamente, dicho vector comprende, además, un marcador o gen que codifica para un motivo o para un fenotipo que permita la selección de la célula hospedadora transformada con dicho cassette de expresión. Ejemplos ilustrativos de dichos marcadores que podrían estar presentes en el cassette de expresión de la invención incluyen genes de resistencia a antibióticos, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, kanamicina, cloranfenicol, espectinomicina, etc., o genes de resistencia a compuestos tóxicos (telurito, mercurio, etc.). En otro aspecto, la invención se relaciona con una bacteria, en particular, una bacteria Gram negativa, que comprende al menos una construcción de ADN de la invención o al menos un cassette de expresión de la invención, o al menos un vector de la invención, en adelante bacteria de la invención. Dicha bacteria debe tener el sistema exportador de hemolisina (Hly) de E. coli para lo cual, si no lo tiene de forma nativa, se debe proporcionar dicho sistema a la bacteria transformándola con un vector que contenga los genes HlyB y HlyD, por ejemplo, el plásmido pVDL9J [Fernández, L.A. et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov. 2000, 5024-5029]. Prácticamente cualquier bacteria Gram negativa, por ejemplo, E. coli, Salmonella tiphymurium, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, etc., puede ser transformada con la construcción de ADN de la invención o con el cassette de expresión de la invención. Para ello, las señales promotoras, reguladoras, marcadoras y orígenes de replicación deben ser optimizados para cada especie bacteriana. En una realización particular, dicha bacteria Gram negativa es Escherichia coli. La construcción de ADN de la invención puede ser utilizada para producir productos de interés. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir un producto de interés, en forma de una proteína de fusión dimérica, que comprende crecer una bacteria de la invención bajo condiciones que permiten la producción y excreción al medio de cultivo de dicho producto de interés en forma de una proteína de fusión dimérica. En una realización particular de la invención dicha proteína de fusión dimérica comprende dos productos de interés. Por tanto, en un aspecto aún más preferido de la invención se obtendría una proteína de fusión dimérica por expresión de las secuencias de ácido nucleico contenidas en al menos una construcción de ADN de la invención, o al menos un cassette de expresión de la invención, o al menos un vector de la invención. Las condiciones para optimizar el cultivo de la bacteria de la mvención dependerán de la bacteria utilizada. Si se desea, el método para producir un producto de interés proporcionado por esta invención incluye, además, el aislamiento y purificación de dicha proteína de fusión dimérica. En este caso, la construcción de ADN de la invención incluye, además, dicha séptima secuencia de ácido nucleico previamente definida que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos con el fin de liberar el producto de interés. En una realización particular, dicha secuencia de nucleótidos codifica para un sitio de reconocimiento de una proteasa, por ejemplo, una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, Glu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa, Factor de coagulación Xa y similares. En otra realización particular, dicha secuencia de nucleótidos codifica para un sitio susceptible de ser específicamente escindido por un reactivo químico tal como, por ejemplo, bromuro de cianógeno que escinde restos de metionina o cualquier otro reactivo químico apropiado. En otro aspecto, la invención se relaciona con una proteína de fusión dimérica obtenible por expresión de al menos una secuencia de ácido nucleico contenida en al menos una construcción de ADN de la invención, en la que cada monómero comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de un producto de interés; (ii) una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de dimerización; y (iii) la secuencia de aminoácidos de la HlyA de E. coli o de un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. coli. De forma más concreta, cada monómero de la proteína de fusión dimérica de la invención comprende (i) un producto de interés, por ejemplo, una enzima, un inhibidor enzimático, una hormona, una molécula implicada en la adhesión y/o señalización celular y compuesta por dominios, por ejemplo, una in unoglobulina, un antígeno inmunogénico, tal como una proteína o un fragmento antigénico de la misma procedente de un patógeno, por ejemplo, de un patógeno viral, bacteriano, de un parásito, etc., que puede causar infecciones en seres humanos o animales, un agente terapéutico, por ejemplo, un antígeno específico de tumor, un antígeno de una enfermedad auto-inmune, etc., o una molécula inmunoreguladora, por ejemplo, un factor de crecimiento, una citoquina, tal como una interleuquina, un interferón, etc.; en una realización particular, dicho producto de interés es un minianticuerpo susceptible de ser utilizado con fines terapéuticos, de diagnóstico o de investigación; (ii) un dominio de dimerización, tal como una hélice peptídica, una estructura de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil), o, en general, cualquier secuencia peptídica que promueva la dimerización en las proteínas que la contengan. En una realización particular, dicho dominio de dimerización comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción GCN4 de levadura; y (iii) la secuencia completa de aminoácidos de HlyA de E. coli, o alternativamente, un fragmento de HlyA de E. coli que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli.
Cada monómero de la proteína de fusión dimérica de la invención también puede contener, si se desea, (a) un péptido espaciador entre el producto de interés y el dominio de dimerización; ventajosamente, dicho péptido espaciador es un péptido con flexibilidad estructural, por ejemplo, un péptido que contiene repeticiones de restos de aminoácidos, tales como Gly-Gly-Gly-Ser, o cualquier otra repetición de restos de aminoácidos adecuada, o bien la región bisagra de un anticuerpo; en una realización particular, dicho péptido espaciador flexible comprende la región bisagra de un anticuerpo; y/o (b) un péptido para facilitar el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia de polihistidina, o una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafmidad, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG, y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo; y/o (c) un péptido que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión, por ejemplo, una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante por técnicas de inmunodetección, por ejemplo, péptidos etiqueta tales como c-myc, HA, E, FLAG y, en general, cualquier otra secuencia reconocida por un anticuerpo; y/o (d) una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que constituye un sitio de reconocimiento de una proteasa, por ejemplo, una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, Glu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa, Factor de coagulación Xa y similares, o una secuencia de aminoácidos susceptible de ser específicamente escindida por un reactivo químico tal como, por ejemplo, bromuro de cianógeno y similares. El sistema de producción de proteínas de fusión diméricas proporcionado por esta invención es particularmente útil para la producción de proteínas implicadas en una actividad de unión, por ejemplo, en las interacciones proteína-ADN o antígeno- anticuerpo, puesto que puede intensificar su avidez. En otra realización aún más preferida de la invención, las construcciones de ADN de la invención sirven para la creación y expresión de una librería de proteínas diméricas, por ejemplo de minianticuerpos. Un ejemplo particular de esta realización sería utilizar los dímeros de minianticuerpos así producidos en procesos de selección de moléculas con capacidad de unión a un antígeno determinado. En otra realización de la invención, el sistema de producción de proteínas diméricas sirve para la producción de heterodímeros entre dos moléculas con capacidad de unión para antígenos diferentes o epítopos diferentes del mismo antígeno, preferentemente dos minianticuerpos, o un minianticuerpo y otro tipo de molécula, como puede ser, pero no se limita a, una toxina, una droga antitumoral, un enzima o moléculas implicadas en mareaje o detección. Así, un ejemplo particular de esta realización sería utilizar estos dímeros para el mareaje de células tumorales o el transporte de moléculas con actividad antitumoral al tumor. La producción de este tipo de heterodímeros presenta importantes aplicaciones en diagnóstico y terapia. Una ventaja del sistema proporcionado por esta invención radica en que permite producir proteínas tóxicas para un huésped bacteriano. Como es conocido, la expresión por métodos recombinantes de proteínas tóxicas para un huésped bacteriano es muy complicada o prácticamente imposible cuando dicha proteína tóxica expresada no es exportada desde la bacteria hacia el exterior. Con el método proporcionado por esta invención se puede expresar una proteína tóxica o previamente inexpresable, o expresada a bajos niveles, para producir la proteína deseada en cantidades utilizables. El siguiente ejemplo ilustra la invención sin que deba ser considerado como limitativo del alcance de la misma.
EJEMPLO 1 Producción de minianticuerpos diméricos con elevada afinidad secretados por el sistema de transporte de hemolisina (Hly) de E. coli En este ejemplo se describe la secreción de minianticuerpos diméricos en sobrenadantes de cultivos de E. coli que emplean el sistema de transporte de hemolisina (Hly). En primer lugar, se demostró que la dimerización puede conseguirse por ingeniería genética en el sistema de transporte de la Hly. Para ello se insertó una hélice α anfipática (es decir, el dominio de cremallera de leucina del factor de transcripción de levaduras GCN4) en el extremo N terminal de una versión marcada (E-tag) del dominio C terminal de 23 kDa de la hemolisina (EHlyΛ). Se comprobó que el polipéptido resultante (ZEHlyA) se secretaba eficazmente por las células de E. coli y se acumulaba en el medio de cultivo como un dímero estable. Después se utilizaron los vectores derivados de ΕHlyA y 'ZEHIyA para la secreción de los dominios VHH de inmunoglobulinas obtenidos de anticuerpos de camello. Se secretaron los híbridos VHH- EHlyA y VHH-ZEHI A y se encontraron en el medio extracelular como monómeros y dímeros, respectivamente. Cuando se compararon con sus homólogos monoméricos, las moléculas diméricas Vmi-ZEHlyA mostraron propiedades superiores de unión a su antígeno relacionado, con un aumento de 10 veces en su afinidad funcional (avidez). Este procedimiento permite obtener fácilmente minianticuerpos VHH monoméricos y diméricos con alta avidez a partir de los sobrenadantes de cultivos de E. coli, facilitando así la selección y la purificación de alto rendimiento de clones de VHH a partir de grandes librerías.
1. MATERIALES Y MÉTODOS Cepas bacterianas, crecimiento y condiciones de inducción. Las cepas de E. coli K-12 empleadas eran DH5αF' (supE44 Á(lacZYA-argF)\J169 Φ80(lacZAM15) hsdR17 recAl endAl gyrA96 thil relAl; Invitrogen) para la clonación y la propagación de los plásmidos y HB2151 (Δlac-pro, ara, naf, thi, YproAB lacfl lacZAM15) [Cárter, P., H. Bedouelle, and G. Winter 19 85. Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using MI 3 vectors. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443] para la expresión de proteínas. Las bacterias que contenían los plásmidos indicados en cada caso se hicieron crecer a 30°C en placas de agar LB [Miller, J. H. 1992. A short course in bacterial genetics: a laboratory manual and handbook for Escherichia coli and related bacteria. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York] que contenía glucosa al 2% (p/v) (para reprimir el promotor lac) y los antibióticos apropiados para la selección de plásmidos. Para la inducción de los híbridos HlyA, se inocularon colonias individuales en el medio LB líquido que contenía glucosa al 2% (p/v) y se hicieron crecer a 30°C o a 37°C hasta que a la densidad óptica a 600 nm (DO6oo nm) alcanzó un valor de 0,5 aproximadamente. En ese punto, las bacterias se recogieron por centrifugación, se resuspendieron a la misma densidad en LB que contenía isopropil-1-tio-β-D-galactósido (IPTG) 0,3 mM y se incubaron (a 30°C o a 37°C) con agitación (160 r.p.m.) durante un periodo de tiempo comprendido entre 4 y 16 h. Se recogieron los sobrenadantes del cultivo tras la eliminación de las células de E. coli por centrifugación (lO.OOOxg, 10 min) y se añadió 1/10 del volumen de tampón fosfato salino (PBS) 10X concentrado [PBS: Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 1,5 mM, KCl 3 mM, NaCl 137 mM, pH 7,0]. Los sobrenadantes del cultivo se emplearon directamente para realizar inmunoensayos o se almacenaron a -80°C hasta su utilización. Los antibióticos añadidos al medio de cultivo para la selección de plásmidos fueron la ampicilina (Ap; 150 μg/ml) y el cloranfenicol (Cm; 30 μg/ml).
Plásmidos y oligonucleótidos. Se emplearon métodos estándar para la manipulación y el aislamiento del ΛDN, la amplificación por PCR y la secuenciación del ΛDN [Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl 1994. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York; Sambrook, J., E. Fritsch, and T. Maniatis 1989. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Láboratory Press, New York]. Los oligonucleótidos se obtuvieron de Sigma Genosys (Reino Unido) o de Isogen Bioscience BV (Países Bajos). Los plásmidos pEHlyA (Ap*), ρEHlyA2-SD (Ap1) y pVDL9.3 (Cm ya han sido descritos [Fernández, L. A., and V. De Lorenzo 2001. Formation of disulphide bonds during secretion of proteins through the periplasmic-independent type I pathway Mol Microbiol. 40:332-46; Fernández, L. A., I. Sola, L. Enjuancs, and V. de Lorenzo 2000. Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernantants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system Appl Environ Microbiol. 66:5024-5029; Tzschaschel, B. D., C. A. Guzman, K. N. Timmis, and V. de Lorenzo 1996. An Escherichia coli hemolysin transport system-based vector for the export of polypeptides: Export of Shiga-like toxin IleB subunit by Salmonella typhimurium aro A. Nature Biotechnology. 14:765-769]. El plásmido pZEHlyΛ (Λp1) se obtuvo insertando en el sitio único Salí de pEHlyΛ un fragmento de ΛDN de 170 pb que codifica para el dominio ZIP amplificado por PCR y digerido con Salí. El mapa del plásmido pZEHlyA se muestra en la Figura 6. La amplificación por PCR del dominio ZIP se llevó a cabo con la ADN polimerasa Vent (New England Biolabs), usando como molde 1 ng de pCLZIP (Codon Genetic Systems, GmbH), y como cebadores los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, que incorporaban dos sitios San flanqueando el producto amplificado. El plásmido pZEHlyΛ2-SD (Ap1) se obtuvo insertando en el sitio único Sα I de pEHlyΛ2-SD el fragmento de ΛDN de 170 pb que codifica para ZIP obtenido por digestión con San de pZEHlyA. El mapa del plásmido pZEHlyΛ2-SD se muestra en la Figura 7. Se seleccionó la orientación del fragmento de ΛDN ZIP que producía una inserción interna en el dominio C-HlyA marcado con E de pZEHlyA y pZEHlyA2-SD tras la secuenciación del ΛDN. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 0,3 kb que codificaban para los dominios VHH, Vamy Y Vto se amplificaron por PCR con la ADN polimerasa Vent, usando como molde 1 ng de los fagémidos A100R3A2 (anti-α-amilasa) o R3E5 (vacuna antitetánica), respectivamente, y como cebadores los oligonucleótidos identificados como SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: Los productos amplificados de ADN que codifican para Vamy y Vítχ contenían los sitios de restricción flanqueantes Ncol y Sfií, lo que permitía su clonación en los mismos sitios de pEHlyA2-SD y pZEHlyA2-SD, generando así pV^HlyA, pVtoHlyA, pN^ZhlyA y pVtoZHlyA. Los mapas de los plásmidos V^^lyA y pVαβ¡J,ZhlyA se muestran en las Figuras 8 y 9, respectivamente. Los fagémidos A100R3A2 y R3E5 fueron proporcionados por el Dr. Hennie Hoogenboon (Dyax Co., EE. UU.). Ambos fagémidos son derivados de pCAΝTAB6 (Cambridge Research Biochemicals) que contienen los dominios VHH de camélidos clonados entre los sitios S ϊl y Notí.
Electroforesis e inmunotransferencia de proteínas. Se llevó a cabo la electroforesis en geles de dodecil sulfato sódico - po liacrilamida (SDS-PAGE) usando geles de apilamiento al 4% y de separación al 10% (acrilamida:bisacrilamida 29:1; Bio-Rad), utilizando el sistema de electroforesis Miniprotean® (Bio-Rad) y siguiendo los protocolos estándar [Ausubel, F. M., R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, and K. Struhl 1994. Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, ew York; Fraile, S., F. Roncal, L. A. Fernandez, and V. de Lorenzo 2001. Monitoring Intracellular Levéis of XylR in Pseudomonas putida with a Single-Chain Antibody Specific for Aromatic-Responsive Enhancer-Binding Proteins J Bacteriol. 183:5571-9]. Para la inmunotransferencia, las proteínas se transfirieron a una membrana de difloruro de polivinilideno (Immobilon-P, Millipore) usando un aparato de electroforesis por transferencia semiseca (Bio-Rad). La membrana se bloqueó en tampón MTP (leche desnatada al 3% p/v, Tween 20 al 0,1% v/v en PBS) y se detectaron los polipéptidos marcados con E con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con peroxidasa (0,2 μg/ml en tampón MTP; Amersham Bioscience). El conjugado anticuerpo-POD unido se reveló mediante quimiolumimscencia, tal como ya se ha descrito [Fraile, S., F. Roncal, L. A. Fernandez, and V. de Lorenzo 2001. Monitoring Intracellular Levéis of XylR in Pseudomonas putida with a Single-Chain Antibody Specific for Aromatic-Responsive Enhancer-Binding Proteins J Bacteriol. 183:5571-9]. La membrana se expuso a una película de rayos X (X-OMAT®, Kodak) o a ChemiDoc® (Bio-Rad) para la cuantificación por quimioluminiscencia (software Quantity-one®; Bio-Rad). Las concentraciones de los polipéptidos HlyA marcados con E secretados presentes en los sobrenadantes del cultivo de E. coli se determinaron por la intensidad de sus bandas de proteínas correspondientes en geles de SDS-poliacrilamida teñidos con plata [Ansorge, W. 1985. Fast and sensitive detection of protein and DNA bands by treatment with potassium permanganate J. Biochem. Biophys. Methods. 11:13-20] y mediante inmuno-transferencia usando anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD. Se usaron diluciones seriadas de scFvs marcados con E purificados, de concentración conocida, como patrones en estos experimentos.
Entrecruzamiento de proteínas. Antes de su incubación con el agente de entrecruzamiento bifuncional glutarato de disuccinimidilo (DSG, 7.7 Á spacer; Pierce), los polipéptidos de HlyA marcados con E presentes en los sobrenadantes de los cultivos se equilibraron en el mismo volumen de PBS por ultrafiltración a través de una membrana con punto de corte de 10 kDa (Microcon 10, Millipore) que eliminó los compuestos pequeños con grupos amino libres presentes en el medio de cultivo. El entrecruzamiento se llevó a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente añadiendo DBS 40 ó 130 μM a muestras de proteínas de 50 μl equilibradas en PBS. Tras esta incubación, el agente de entrecruzamiento se inactivo con Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) durante 15 minutos y se añadió un volumen de tampón de muestra SDS-PΛGE 2X concentrado [Fraile, S., F. Roncal, L. A. Fernandez, and V. de Lorenzo 2001. Monitoring Intracellular Levéis of XylR in Pseudomonas putida with a Single-Chain Antibody Specific for Aromatic-Responsive Enhancer-Binding Proteins J Bacteriol. 183:5571-9]. Tras hervir durante 5 minutos, se cargaron 10 μl para el SDS-PΛGE.
Cromatografía por exclusión de tamaño. Los sobrenadantes del cultivo (aproximadamente 0,2 mi) que contenían PBS IX se mezclaron con 2 mg de proteína patrón de masa conocida (disuelta en 60 μl de H2O) y se hicieron pasar a través de una resina Bio-Gel Λ de l,5m (Bio-Rad) empaquetada en una columna de 1 m de longitud y 1,5 cm de ancho (Bio-Rad). Los patrones de filtración del gel (Bio-Rad) fueron la tiroglobulina (PM 670.000), la gammáblobulina bovina (PM 158.000), la ovoalbúmina de pollo (PM 44.000), la mioglobina equina (PM 17.000) y la vitamina B-12 (PM 1J50). La velocidad de flujo de la muestra a través de la columna se fijó a 0,2 ml/min usando una bomba peristáltica (P-l, Amersham Bioscience). El volumen de vacío de la columna se calculó mediante la elución de azul de dextrano 2000 (Amersham Bioscience). La elución de los patrones de proteínas a través de la columna se monitorizó mediante absorción de luz UN (Uvicord S LT, Amersham Bioscience). Se recogieron fracciones de 1 mi (colector RediFrac, Amersham Bioscience) y se concentraron 10 veces mediante precipitación con ácido tricloroacético (TCA) al 10% (p/v) y 10 μg de albúmina sérica bovina (BSA, Roche) que actuaba como transportador. La presencia de proteínas HlyA marcadas con E en estas fracciones se detectó por Western blot utilizando un anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD (véase más arriba).
Ensayos de inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA). Los antígenos (α-amilasa u ovoalbúmina; Sigma) se adsorbieron durante 1 h a 37°C a inmunoplacas de microtitulación de 96 pocilios (Maxisorb, Nunc) a 200 μg/ml en PBS. Se lavó el exceso de antígeno y las placas se bloquearon durante 16 h a 4°C en tampón MTP (véase anteriormente). Los minianticuerpos se diluyeron en tampón MTP, se añadieron a los pocilios a las concentraciones indicadas en cada caso y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, los anticuerpos no unidos se eliminaron mediante cuatro lavados de los pocilios con PBS que contenía Tween 20 al 0,1% (v/v). El conjugado anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD (0,2 μg/ml en tampón MTP) se añadió a los pocilios y se incubó adicionalmente durante 1 h a temperatura ambiente para detectar los minianticuerpos unidos marcados con E. Tras lavar como antes, las placas se revelaron usando o-fenilenediamina (Sigma). Se dejó continuar la reacción durante 10 minutos en oscuridad, se paró con HCl 0,6 N y se determinó la DO a 490nm de los pocilios (lector de micro-placas Benchmark, Bio-Rad).
2. RESULTADOS Dimerización por ingeniería genética de la señal de secreción de HlyA. En primer lugar, se investigó si la dimerización de C-HlyA podría realizarse por ingeniería genética sin afectar a su secreción. Se seleccionó un corto dominio de unos 6 kDa aproximadamente, denominado ZLP, que se había utilizado para la dimerización de scFvs en el periplasma de E. coli [Kerschbaumer, R. J., S. Hirschl, A. Kaufmann, M. Ibl, R. Koenig, and G. Himmler 1997. Single-chain Fv fusión proteins suitable as coating and detecting reagents in a double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay Anal Biochem. 249:219-27; Pack, P., and A. Plückthun 1992. Miniantibodies: use of amphipathic hélices to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli Biochemistry. 31:1579-84] para su inserción en C-HlyA. El dominio ZIP consta de una hélice anfipática que forma la cremallera de leucina del factor de transcripción de levaduras GCN4, flanqueado en su extremo N terminal por una zona bisagra peptídica derivada de la IgG3 del ratón, y en su extremo C terminal por un marcador de polihistidina (6xhis). Se insertó un fragmento de ADN que codificaba para el dominio ZIP internamente cerca del extremo N terminal de la versión de aproximadamente 27 kDa marcada con E de C-HlyA (EHlyA) presente en el plásmido pEHlyA (Figura 1 A). El plásmido resultante, pZEHlyA, codifica para un polipéptido de aproximadamente 33 kDa (denominado ZEHlyA) que contiene los dominios ZIP y C- HlyA marcados con E (Figuras 1A y IB). La producción de ZEHlyA y EHlyA, como control sin ZLP, se indujo en cultivos de células TolC+ de tipo salvaje de E. coli (por ejemplo, la cepa HB2151) que llevaban pVDL9J, que codifica para HlyB y HlyD, y que alojaban pZEHlyA o pEHlyA, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1C, se encontraron ambos polipéptidos en niveles similares (aproximadamente 10 μg/ml) en los sobrenadantes de los cultivos de E. coli crecidos a 37°C tras la inducción de 4 h con IPTG 0,3 mM. Estas proteínas se detectaron en virtud del péptido marcado con E incorporado en sus secuencias con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD (Métodos). La secreción de ambos polipéptidos derivados de HlyA fue específica y dependiente de la expresión de los componentes HlyB y HlyD por E. coli (datos no mostrados) [Fernández, L. A., and V. De Lorenzo 2001. Formation of disulphide bonds during secretion of proteins through the periplasmic-independent type I pathway Mol Microbiol. 40:332-46]. Este resultado indicaba que la presencia del dominio de dimerización ZIP no tenía efecto en la eficacia de la exportación de la señal de C-HlyA. A continuación, se investigó el estado de oligomerización de los polipéptidos secretados. Se incubaron muestras de alícuotas que contenía los polipéptidos secretados EHlyA o ZEHlyA con el agente de entrecruzamiento bifuncional glutarato de disuccinimidilo (DSG) y luego se sometieron a SDS-PAGE desnaturalizante y a inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD (Métodos). En este experimento, sólo se entrecruzaron las muestras de ZEHlyA a baja concentración de DSG (40 μM) para formar una banda de proteínas con una masa molecular (Mr) aparente de aproximadamente 66 kDa (Figura 2, carril 5), lo que estaba de acuerdo con el tamaño esperado para un dímero de ZEHlyA. La concentración más elevada de DSG (130 μM) intensificó la intensidad de la banda correspondiente a ZEHlyA dimérico (Figura 2, carril 6) mientras que sólo te a una reactividad menor sobre EHlyA control (Figura. 2, carril 3). También se demostró la dimerización de ZEHlyA mediante cromatografía por exclusión de tamaño. Se separaron muestras de alícuotas de sobrenadantes de cultivos que contenían EHlyA o ZEHlyA secretados en una columna de filtración en gel, con un límite de exclusión de 1.500 kDa, junto con proteínas de masa conocida utilizadas como patrones (Métodos). Como se muestra en la Figura 3A, ZEHlyA mostró una Mr aparente de aproximadamente 66 kDa en la cromatografía de filtración en gel, mientras que EHlyA tuvo una Mr aparente de aproximadamente 32 kDa en las mismas condiciones. Es importante que se detectara un único pico para cada proteína (Figura 3B), lo que indica que ambos polipéptidos estaban presentes como monómeros (EHlyA) y dímeros (ZEHlyA) estables en disolución. Considerados juntos, estos resultados demostraron que podría obtenerse la dimerización de proteínas mediante la incorporación de hélices antipáticas en C-HlyA sin interferir con su secreción por el transportador de Hly.
Secreción de minianticuerpos diméricos por el sistema de la Hly de E. coli. A la vista de los resultados previamente obtenidos se procedió a estudiar si los fragmentos de anticuerpos diméricos podían secretarse mediante el sistema de la Hly. En primer lugar, se construyó un plásmido, denominado pZEHlyAJ-SD, para generar fusiones internas entre los fragmentos de anticuerpos recombinantes que carecen del dominio N-SP y ZEHlyA. Este plásmido es un derivado de pEHlyA2-SD [Fernández, L. A., I. Sola, L. Enjuanes, and V. de Lorenzo 2000. Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernantants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system Appl Environ Microbiol. 66:5024-5029] en el que se insertó un fragmento de ADN que codifica para el dominio ZIP en un único sitio Salí, entre la secuencia de poliunión y el dominio C-HlyA marcado con E (Métodos). Se seleccionaron dos anticuerpos de camello VHH, frente a α-amilasa (amy) o la vacuna antitetánica (ttx), para determinar su expresión como híbridos con los restos 'EHlyA y 'ZEHlyA (Figuras 4A y 4B). El empleo de anticuerpos de camello VHH co o pares de fusión se debió a su pequeño tamaño (aproximadamente 15 kDa) y a su baja tendencia a formar agregados de proteínas [Muyldermans, S. 2001. Single domain camel antibodies: current status J Biotechnol. 74:277-302; Plückthun, A., and P. Pack 1997. New protein engineering approaches to multivalent and bispecific antibody fragments Immunotechnology. 3:83- 105], lo que podría interferir con el análisis de la dimerización obtenida por el dominio ZIP (véase Discusión). Las células de E. coli HB2151 (pNDL9J) se transformaron con un plásmido que codificaba para el híbrido NHH-HlyA ( Nα^HlyA, pNαOT^ZHlyA, pNteHlyA o pNttfZHlyA) y se indujeron 4 h por la adición de PTG 0,3 mM a los cultivos líquidos crecidos en LB a 30 ó 37 °C. Los polipéptidos secretados Nαm?HlyA y NrojZHlyA se detectaron posteriormente en los sobrenadantes de los cultivos correspondientes de E. coli por Western blot con anticuerpo monoclonal anti-Ε marcado con POD (Figura 4C). Εn estas condiciones, la concentración final de N^H yA y Vαm^ZHlyA fue de aproximadamente 2 μg/ml a 37°C, y se redujo aproximadamente en 2 veces en los cultivos que crecieron a 30°C. Resultados similares se obtuvieron con NήrHlyA y V.ftZHlyA (datos no mostrados). Εl estado de oligomerización de los híbridos VHH-HIVA secretados se sometió a ensayo mediante cromatografía de filtración en gel (Figura 4D). Muestras de alícuotas de sobrenadantes de cultivos de E. coli que contenían Vαffi5,HlyA o Vomj,ZHlyA se cargaron en una columna de filtración en gel (límite de exclusión de 1.500 kDa), junto con proteínas de masa conocida. A partir de sus perfiles de elución puede deducirse (Figura 4D) que el híbrido Va/ííyHlyA tenía una Mr aparente de aproximadamente 40 kDa, lo que estaba completamente de acuerdo con la masa esperada para un monómero de este polipéptido. Por el contrario, Nα^ZHlyA mostró una Mr aparente de aproximadamente 95 kDa, que es aproximadamente el doble de la masa esperada de su monómero (es decir, 47 kDa). Hay que mencionar que la temperatura a la que se indujeron los cultivos de E. coli (30°C ó 37°C) no tuvo ninguna influencia en el comportamiento cromatográfico de estas muestras. Por lo tanto, la secreción de los anticuerpos de camello VHH monoméricos o diméricos pueden producirse fusionándolos a los restos ΕHlyA o ZΕHlyA, respectivamente. A continuación, se probó si la dimerización mejoraba las propiedades de unión funcional de N^ZHlyΛ. Para este fin, se comparó la unión a la α-amilasa de Va¡m,ΗíyA monomérico y de Vαm,ZHlyA dimérico mediante ELISA. En estos experimentos, se incubaron diluciones seriadas de sobrenadantes de cultivos de E. coli que contenían cantidades idénticas de Vαmj,HlyA o Va^ZHlyA con placas de ELISA recubiertas con α- amilasa u ovoalbúmina (como antígeno control). Tras el lavado, los minianticuerpos unidos se detectaron con el conjugado anticuerpo monoclonal anti-E marcado con POD y se realizó la lectura a la DO4 onm (Métodos). La unión específica de la α-amilasa se demostró incubando estas placas con VtoHlyA y VtoZHlyA. En la Figura 5 se muestra el resultado de un ELISA prototipo de estos experimentos. La unión previa a ovoalbúmina (en todos los casos la DO490nm ≤ 0,05) se ha sustraído de los valores presentados. Tal como se indica, la molécula YamyZΗlyA dimérica presentó una afinidad funcional mayor frente a la α-amilasa, que Vαmj,HlyΛ monomérica. No se observó unión a α-amilasa con los derivados control de Vto (Figura 5) ni con los polipéptidos EHlyA y ZEHlyA (datos no mostrados). En general, al menos se requirió una concentración diez veces mayor de Vα^HlyA monomérico para lograr señales de unión a la α-amilasa similares a las obtenidas con YamyZΗlyA. Además, en la concentración de saturación de ambos minianticuerpos (aproximadamente 0,5 μg/ml) la unión obtenida con
Figure imgf000029_0001
alcanzó un nivel meseta superior. Por tanto, la dimerización de VamyZΗ\yA induce un efecto de avidez sobre este minianticuerpo que se refleja en una mayor afinidad de unión funcional a su antígeno. 3. DISCUSIÓN La dimerización es una propiedad que con frecuencia se desea conseguir por ingeniería genética en las proteínas cuando está implicada una actividad de unión (por ejemplo, en las interacciones proteína-ADN o antígeno-anticuerpo), puesto que puede intensificar su afinidad funcional (avidez). Este ejemplo ilustra la obtención por ingeniería genética, por primera vez, de la dimerización de las proteínas secretadas por el sistema de transporte de hemolisina de E. coli y se ha empleado esa tecnología para producir minianticuerpos de alta avidez derivados de los anticuerpos de camello VHH- Los resultados obtenidos demuestran que la incorporación de una hélice anfipática de autodimerización en el extremo N terminal de C-HlyA no interfiere con la secreción de Hly y permite la dimerización del polipéptido secretado. Tal como se muestra, la dimerización puede intensificar la avidez de la unión del polipéptido secretado derivado de C-HlyA. Además, también puede tener otras aplicaciones, como la asociación molecular de varios antígenos y/o adyuvantes producidos por cepas bacterianas vivas, o la combinación de diversas actividades biológicas para la generación de moléculas biespecíficas (por ejemplo, la unión a un antígeno y el reclutamiento del complemento). scFvs diméricos de alta avidez se han producido en el periplasma de las células de E. coli insertando hélices antipáticas en su extremo C terminal. Debido a la tendencia de algunos scFvs a formar dímeros y agregados de proteínas de elevado peso molecular se utilizaron fragmentos más pequeños de anticuerpos. Los anticuerpos de camello VHH han recibido mucha atención debido a su mejor solubilidad y a su estructura más simple, lo que facilita su amplificación y clonaje. Merece la pena destacar que los cambios efectuados no disminuyen la afinidad ni la especificidad de los anticuerpos de camello VHH, debido a la presencia de regiones determinantes de la complementaridad (CDR) extremadamente variables que compensan la pérdida de diversidad provocada por la ausencia de un dominio VL. LOS anticuerpos de camello también han demostrado un potencial extraordinario como inhibidores enzimáticos puesto que sus grandes CDR pueden alcanzar los sitios activos escondidos en las enzimas. Además, la similitud entre los anticuerpos de camello VHH y las secuencias de la familia VH3 humana está permitiendo la generación de librerías presentadas en fagos de los dominios VH humanos camelizados y de los anticuerpos de camello VHH humanizados. Los beneficios expuestos anteriormente motivaron a los inventores a utilizar los dominios VHH para su secreción por el translocador de hemolisina de E. coli. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos de camello funcionales, tanto en la forma monomérica como en la dimérica, pueden recuperarse de los sobrenadantes del cultivo de E. coli a niveles similares a los obtenidos en su expresión periplásmica (aproximadamente 1 g/litro de cultivo a D.O.6oonm =1)- Además, la dimerización provocada por ZΕHlyA indujo un aumento de diez veces en la afinidad funcional de Yαmy. Este valor está dentro del intervalo esperado producido por el cambio de anticuerpos monovalentes a divalentes. En conclusión, estos datos demuestran que el sistema de secreción de Hly puede emplearse para la secreción de polipéptidos y minianticuerpos diméricos de alta avidez. La simplicidad de esta tecnología puede ser extremadamente útil para la selección de alto rendimiento de las librerías de anticuerpos.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una construcción de ADN que comprende: a) una primera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un producto de interés; b) una segunda secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio de dimerización; y c) una tercera secuencia de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica para la α-hemolisina (HlyA) de E. coli o para un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli, o una secuencia de nucleótidos que codifica para un gen homólogo, o una secuencia de nucleótidos que codifica para una variante, natural o artificial, de HlyA o de un fragmento de la misma que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli.
2.- Una construcción de ΛDN según la reivindicación 1, en donde el extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
3. Construcción de ADN según la reivindicación 1, en la que dicho producto de interés se selecciona entre enzimas, inhibidores enzimáticos, hormonas, moléculas implicadas en la adhesión y/o señalización celular, moléculas implicadas en detección o mareaje, moléculas compuestas por dominios, antígenos inmunogénicos, agentes terapéuticos, y moléculas inmunoreguladoras.
4. Construcción de ADN según la reivindicación 3, en la que dicho producto de interés se selecciona entie antígenos específicos de tumor, antígenos de enfermedades auto-inmune, factores de crecimiento, citoquinas, interleuquinas, interferones y minianticuerpos.
5. Construcción de ADN según la reivindicación 1, en la que dicho dominio de dimerización comprende una hélice peptídica o una estructura de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil).
6. Construcción de ADN según la reivindicación 5, en la que dicho dominio de dimerización comprende una cremallera de leucina.
7. Construcción de ADN según la reivindicación 5, en la que dicho dominio de dimerización comprende la cremallera de leucina del factor de transcripción -GCN4 de levadura.
8. Construcción de ADN según la reivindicación 1, en la que dicha tercera secuencia de ácido nucleico se selecciona entre: a) la secuencia de nucleótidos que codifica para la HlyA de E. coli; b) una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo C-terminal de HlyΛ de E. coli; c) una secuencia de ácido nucleico constituida por una secuencia de nucleótidos que codifica para los 60 últimos aminoácidos del extremo C- terminal de HlyA de E. coli; d) la secuencia de nucleótidos identificada como SΕQ ID NO: 1 ; y e) una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos identificada como SΕQ ID NO: 2.
9. Construcción de ADN según las reivindicaciones 1 y 2, que comprende, además, una cuarta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido espaciador situada entre dichas primera y segunda secuencias de ácido nucleico, en donde el extiemo 5' de dicha cuarta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha primera secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha cuarta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico.
10. Construcción de ADN según la reivindicación 9, en la que dicho péptido espaciador comprende repeticiones de restos de aminoácidos, preferentemente, repeticiones Gly-Gly-Gly-Ser.
11. Construcción de ADN según la reivindicación 9, en el que dicho péptido espaciador es una región bisagra de un anticuerpo.
12. Construcción de ADN según la reivindicación 1, que comprende, además, una quinta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación.
13. Construcción de ADN según la reivindicación 12, en la que dicho péptido susceptible de ser utilizado con fines de aislamiento o purificación comprende una secuencia de polihistidina o una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad.
14. Construcción de ADN según la reivindicación 12, en la que dicha quinta secuencia de ácido nucleico está situada entre dichas segunda y tercera secuencias de ácido nucleico ordenadas según la reivindicación 2, en donde el extremo 5' de dicha quinta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha quinta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
15. Construcción de ADN según la reivindicación 1, que comprende, además, una sexta secuencia de ácido nucleico que codifica para un péptido susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento.
16. Construcción de ADN según la reivindicación 15, en la que dicho péptido susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento comprende una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante por técnicas de inmunodetección.
17. Construcción de ADN según la reivindicación 15, en la que dicho péptido susceptible de ser utilizado con fines de reconocimiento comprende la secuencia del epítopo E.
18. Construcción de ADN según la reivindicación 15, en la que dicha sexta secuencia de ácido nucleico está situada entie dichas segunda y tercera secuencias de ácido nucleico ordenadas según la reivindicación 2, en donde el extremo 5' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 3' de dicha segunda secuencia de ácido nucleico y el extremo 3' de dicha sexta secuencia de ácido nucleico está unido al extremo 5' de dicha tercera secuencia de ácido nucleico.
19. Construcción de ADN según las reivindicaciones 12 ó 15, en la que dichas quinta y sexta secuencias de ácido nucleico están separadas entre sí.
20. Construcción de ΛDN según las reivindicaciones 12 ó 15, en la que dichas quinta y sexta secuencias de ácido nucleico están unidas entre sí.
21.- Construcción de ADN según la reivindicación 20, en la que dichas quinta y sexta secuencias de ácido nucleico están situadas entre las secuencias segunda y tercera ordenadas según la reivindicación 2.
22. Construcción de ADN según la reivindicación 1, que comprende, además, una séptima secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos.
23. Construcción de ADN según la reivindicación 22, en la que dicha séptima secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio de reconocimiento de una proteasa.
24. Construcción de ADN según la reivindicación 23, en la que dicha proteasa se selecciona entre una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, Glu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa y Factor de coagulación Xa.
25. Construcción de ADN según la reivindicación 22, en la que dicha séptima secuencia de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio susceptible de ser específicamente escindido por un reactivo químico.
26. Construcción de ADN según la reivindicación 25, en la que dicho reactivo químico es bromuro de cianógeno.
27. Construcción de ADN según la reivindicación 22, en la que dicha séptima secuencia de ácido nucleico se encuentra en cualquier posición entre las secuencias segunda y tercera de ácido nucleico ordenadas según la reivindicación 2.
28. Un cassette de expresión que comprende una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones anteriores operativamente unida a una secuencia de control de expresión.
29. Cassette de expresión según la reivindicación 28, en la que dicha secuencia de control de expresión comprende una secuencia promotora, una secuencia codificante para reguladores transcripcionales, una secuencia de unión a ribosomas (RBS) y/o una secuencia terminadora de transcripción.
30. Cassette de expresión según las reivindicaciones 28 y 29, en el que dicha secuencia de control de expresión es funcional en bacterias.
31. Vector que comprende al menos una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 o al menos un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30.
32. Vector según la reivindicación 31, que comprende, además, un marcador.
33. Vector según la reivindicación 32, en el que dicho marcador comprende un gen de resistencia a antibióticos o un gen de resistencia a compuestos tóxicos.
34. Una bacteria Gram negativa que comprende una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, o un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30.
35. Una bacteria Gram negativa que comprende al menos una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27 o al menos un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o al menos un vector según las reivindicaciones 31 a 33.
36. Bacteria según la reivindicación 35, seleccionada entre Escherichia coli, Salmonella tiphymurium, Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas putida.
37. Una proteína de fusión dimérica obtenible por expresión de la secuencias de ácido nucleico contenida en una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27.
38. Una proteína de fusión dimérica obtenible por expresión de la secuencias de ácido nucleico contenidas en al menos una construcción de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, o al menos un cassette de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30 o al menos un vector según las reivindicaciones 31 a 33.
39. Protema de fusión dimérica según las reivindicaciones 37 y 38, en la que cada monómero comprende: (i) la secuencia de aminoácidos de un producto de interés, (ii) una secuencia de aminoácidos correspondiente a un dominio de dimerización; y (iii) la secuencia de aminoácidos de la α-hemolisina (HlyA) de Escherichia coli o de un fragmento de dicha proteína que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de hemolisina (Hly) de E. coli;
40. Proteína de fusión según la reivindicación 40, en la que cada monómero comprende: (i) un producto de interés seleccionado entre una enzima, un inhibidor enzimático, una hormona, una molécula implicada en la adhesión y/o señalización celular, moléculas implicadas en detección o mareaje, moléculas compuestas por dominios, un antígeno inmunogénico, un agente terapéutico, una molécula inmunoreguladora; (ii) un dominio de dimerización, seleccionado entre una hélice peptídica y una estructura de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil); y (iii) la secuencia completa de aminoácidos de HlyA de E. coli, o un fragmento de HlyA de E. coli que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli.
41. Proteína de fusión según la reivindicación 41, en la que cada monómero comprende: (i) un producto de interés seleccionado entre un antígeno específico de tumor, un antígeno de enfermedades autoinmunes, un factor de crecimiento, una citoquina, una interleuquina, un interferón, y un minianticuerpo; (ii) un dominio de dimerización, seleccionado entre una hélice peptídica y una estructura de doble arrollamiento helicolidal (coiled coil); y (iii) la secuencia completa de aminoácidos de HlyA de E. coli, o un fragmento de HlyA de E. coli que comprende la señal de reconocimiento del mecanismo de secreción del sistema transportador de Hly de E. coli.
42. Proteína de fusión según las reivindicaciones 37 a 41, en la que cada monómero comprende además (a) un péptido espaciador entre el producto de interés y el dominio de dimerización; y/o (b) un péptido para facilitar el aislamiento o purificación del péptido o proteína de fusión; y/o (c) un péptido que permita el reconocimiento del péptido o proteína de fusión; y/o (d) una secuencia de aminoácidos susceptible de ser escindida específicamente por medios enzimáticos o químicos.
43. Proteína de fusión según la reivindicación 42, en la que cada monómero
HOJA DΕ SUSTITUCIÓN REGLA 26 comprende, (a) un péptido que contiene repeticiones de Gly-Gly-Gly-Ser o la región bisagra de un anticuerpo; y/o (b) una secuencia de polihistidina o una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para purificar la proteína de fusión resultante por cromatografía de inmunoafinidad; y/o (c) una secuencia peptídica reconocida por un anticuerpo monoclonal y que puede servir para reconocer la proteína de fusión resultante por técnicas de inmunodetección; y/o (d) una secuencia de aminoácidos que constituye un sitio de reconocimiento de una enteroquinasa, Arg-C endoproteasa, Glu-C endoproteasa, Lys-C endoproteasa o Factor de coagulación Xa o una secuencia de aminoácidos susceptible de ser específicamente escindida por un reactivo químico.
44. Un método para producir un producto de interés, en forma de una protema de fusión dimérica según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 43, que comprende crecer una bacteria según la reivindicaciones 34 a 36 bajo condiciones que permiten la producción y excreción al medio de cultivo de dicho producto de interés en forma de una proteína de fusión dimérica.
45. Un método según la reivindicación 44 para producir una proteína de fusión dimérica que comprende dos productos de interés.
46. Método según la reivindicaciones 44 y 45, que comprende, además, el aislamiento y purificación de dicha proteína de fusión dimérica.
47. Uso de una construcción de ADN según las reivindicaciones 1 a 27 para la creación de una librería de proteínas diméricas.
48. Uso de la librería de la reivindicación anterior para la selección de moléculas con capacidad de unión a un antígeno determinado.
49. Protema de fusión dimérica según las reivindicaciones 37 a 43 para uso en terapia.
50. Proteína de fusión dimérica según las reivindicaciones 37 a 43 para uso en diagnóstico in vitro o in vivo.
PCT/ES2004/070053 2003-07-31 2004-07-19 Sistema para la producción de proteínas diméricas basado en el sistema de transporte de hemolisina de escherichia coli WO2005012532A1 (es)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10/566,827 US20080280346A1 (en) 2003-07-31 2004-07-19 System For the Production of Dimeric Proteins Based on the Transport System of Hemolysin of Escherichia Coli
EP04742091A EP1655371A1 (en) 2003-07-31 2004-07-19 System for the production of dimeric proteins based on the transport system of hemolysin of escherichia coli
CA002534299A CA2534299A1 (en) 2003-07-31 2004-07-19 System for producing dimeric proteins based on the escherichia coli hemolysin transport system

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ESP200301830 2003-07-31
ES200301830A ES2296423B1 (es) 2003-07-31 2003-07-31 Construccion de adn para la produccion de proteinas de fusion dimericas y sus aplicaciones.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005012532A1 true WO2005012532A1 (es) 2005-02-10

Family

ID=34112523

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2004/070053 WO2005012532A1 (es) 2003-07-31 2004-07-19 Sistema para la producción de proteínas diméricas basado en el sistema de transporte de hemolisina de escherichia coli

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20080280346A1 (es)
EP (1) EP1655371A1 (es)
CA (1) CA2534299A1 (es)
ES (1) ES2296423B1 (es)
WO (1) WO2005012532A1 (es)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101965362A (zh) * 2008-03-05 2011-02-02 埃博灵克斯股份有限公司 新型抗原结合二聚体-复合物及其制备方法和应用
EP2670779B1 (en) * 2011-02-01 2017-08-02 Bac Ip B.V. Antigen-binding protein directed against epitope in the ch1 domain of human igg antibodies
JP2014530009A (ja) * 2011-09-29 2014-11-17 エーピーオー‐ティー ビー．ヴイ． 異常細胞を標的とする多重特異性結合分子
CA2860914A1 (en) 2012-01-13 2013-07-18 Apo-T B.V. Aberrant cell-restricted immunoglobulins provided with a toxic moiety
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
CN113238053B (zh) * 2021-04-30 2022-05-13 四川大学华西医院 一种用于检测stat3二聚化的质粒

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006953A1 (en) * 1986-05-15 1987-11-19 Ian Barry Holland Process for the production of a polypeptide

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1987006953A1 (en) * 1986-05-15 1987-11-19 Ian Barry Holland Process for the production of a polypeptide

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FERNANDEZ L.A. ET AL.: "Specific secretion of active single-chain Fv antibodies into the supernatants of Escherichia coli cultures by use of the hemolysin system", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, vol. 66, no. 11, November 2000 (2000-11-01), pages 5024 - 5029, XP002371602 *
FRAILE S. ET AL.: "Secretion of proteins with dimerization capacity by the haemolysin type I transport system of Escherichia coli", MOLECULAR MICROBIOLOGY, vol. 53, no. 4, August 2004 (2004-08-01), pages 1109 - 1121, XP003000853 *
PACK P. ET AL.: "Miniantibodies: use of amphipatic helice to produce functional, flexibly linked dimeric FV fragments with high avidity in Escherichia coli", BIOCHEMISTRY, vol. 31, no. 6, 18 February 1992 (1992-02-18), pages 4579 - 1584, XP002026334 *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2296423A1 (es) 2008-04-16
US20080280346A1 (en) 2008-11-13
CA2534299A1 (en) 2005-02-10
ES2296423B1 (es) 2009-03-16
EP1655371A1 (en) 2006-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2335136T3 (es) Expresion fagica mediante translocacion cotraduccional de polipeptidos de fusion.
ES2306794T3 (es) Moleculas de autoensamblaje.
Lai et al. The T-pilus of Agrobacterium tumefaciens
EP0654085B1 (en) Monomeric and dimeric antibody-fragment fusion proteins
de Gier et al. Assembly of a cytoplasmic membrane protein in Escherichia coli is dependent on the signal recognition particle
ES2536509T3 (es) OB-fold usado como estructura para diseño por ingeniería de nuevos agentes de unión específicos
Facey et al. Biogenesis of bacterial inner-membrane proteins
ES2661404T3 (es) Métodos para la expresión de péptidos y proteínas
ES2268376T3 (es) Etiqueta proteica que comprende un dominio de biotinilacion y procedimiento para aumentar la solubilidad y determinar el estado de plegamiento.
ES2296423B1 (es) Construccion de adn para la produccion de proteinas de fusion dimericas y sus aplicaciones.
Jacob‐Dubuisson et al. Amino‐terminal maturation of the Bordetella pertussis filamentous haemagglutinin
Canali et al. A high-performance thioredoxin-based scaffold for peptide immunogen construction: proof-of-concept testing with a human papillomavirus epitope
CN103497253A (zh) 一种针对h2a.z变体的纳米抗体、其编码序列及应用
CN111269324B (zh) 高斯荧光素酶和地高辛单链抗体的融合蛋白及其应用
CN107365732A (zh) 一种抗TNF‑α纳米抗体及其基因工程表达
AR044603A1 (es) Proteinas quimericas aisladas de lumazina sintetasa modificada para la presentacion multiple de moleculas y sus aplicaciones
Chung et al. Export of recombinant proteins in Escherichia coli using ABC transporter with an attached lipase ABC transporter recognition domain (LARD)
ES2612545T3 (es) Sistema de expresión del operón melibiosa
Ye et al. High-level expression and characterization of an anti-VEGF165 single-chain variable fragment (scFv) by small ubiquitin-related modifier fusion in Escherichia coli
JP2011178691A (ja) カテニン結合プローブとその用途
ES2792350T3 (es) Secuencia señal secretora de organismos eucariotas para la expresión recombinante en organismos procariotas
ES2674983T3 (es) Método para la separación de proteínas que contienen un dominio que se une a albúmina
Martsev et al. Antiferritin single‐chain antibody: a functional protein with incomplete folding?
ES2301262B1 (es) Generacion de adhesion especifica en bacterias gram negativas mediante el anclaje de monodominos de inmunoglobulinas en su superficie con autotransportadores.
CN106928358A (zh) 一种CD105纳米抗体Nb168

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2534299

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004742091

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10566827

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004742091

Country of ref document: EP

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)