WO2005002623A1 - サルコイドーシスの治療薬と治療方法 - Google Patents

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WO2005002623A1
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sarcoidosis
antibiotics
cells
pulmonary
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Kouji Matsushima
Tetsu Nishiwaki
Hiroyuki Yoneyama
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Definitions

  • the present invention relates to a remedy for sarcoidosis containing an antibiotic targeting Propionibacterium acnes as an active ingredient, and a sarcoidosis treatment for administering such a therapeutic agent to a sarcoidosis patient.
  • a remedy for sarcoidosis containing an antibiotic targeting Propionibacterium acnes as an active ingredient and a sarcoidosis treatment for administering such a therapeutic agent to a sarcoidosis patient.
  • a sarcoidosis treatment for administering such a therapeutic agent to a sarcoidosis patient.
  • Sarcoidosis is one of the most well-known, systemic granulomatosis cases, but despite many intensive studies, its etiology has not been elucidated for more than 100 years (eg, Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997).
  • the lungs are the most commonly affected organs, and pulmonary granulomatous inflammation, if left untreated, disrupts gas exchange and often leads to irreversible fibrosis with a poor prognosis.
  • the occurrence of long-term respiratory disorders with continued lung inflammation or fibrosis is very common in the general population.
  • tuberculosis the most common mycobacterial infection
  • tuberculosis the most common mycobacterial infection
  • PCR polymerase chain reaction
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic drug for sarcoidosis, which is one of systemic granulomatosis, and a method for treating sarcoidosis.
  • Pulmonary and hepatic granulomas were formed by intravenous transfer of P. acnes-sensitized CD4 + T cells to normal mice.
  • mice with P. acnes extra-pulmonary showed a distribution predominantly below the pleura and bronchi around perivascular bundles. Th1 type granulomas were formed.
  • serum calcium and ACE levels increased in a dose-dependent manner, and the CD4 / 8 ratio of BAL (bronchoalveolar lavage) lymphocytes was positively correlated with serum calcium levels.
  • Extrapulmonary lesions also showed abnormal accumulation of hepatic granuloma * CD4-positive T cells in the red pulp.
  • the present invention provides (1) a therapeutic agent for sarcoidosis, which comprises an antibiotic targeting Propionibacterium acnes as an active ingredient; and (2) a therapeutic agent for sarcoidosis;
  • a therapeutic agent for sarcoidosis selected from penicillin antibiotics, cephalosporin antibiotics, macrolide antibiotics, lincomycin antibiotics, and tetracycline antibiotics
  • the present invention provides (4) a method for treating sarcoidosis, which comprises administering an antibiotic targeting Propionibacterium acnes to a patient with sarcoidosis;
  • Antibiotics targeting Propionibacterium acnes are penicillin antibiotics, cephalosporin antibiotics, macrolide antibiotics, lincomycin antibiotics, and tetracysteine antibiotics.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of an experiment showing the presence of P. acnes in the alveoli of healthy mouse lungs.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of an immune response to P. acnes in normal peripheral LNs.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of adoptive transfer of P.acnes-sensitized helper T cells.
  • a, b H & E staining shows granulomas in lung (a) and liver (b) of mice injected with P. acnes-sensitized CD4-positive cells on day 1-4.
  • mice injected with naive CD4 positive cells corresponding to c, da and b, respectively, are shown.
  • Scale 100 m.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of repeated immunization with P. acnes.
  • a H & E staining showed multiple pulmonary granulomas mainly in the peripheral (upper panel) and peribronchial vessels (lower panel) of the lungs of the three immunized mice.
  • Scale bar 100 mB. Bronchi; L, lymphatics; V, pulmonary vessels.
  • CD4-positive T cells (brown) at the periphery of granuloma, F4 / 80-positive (b) and CD11c-positive (c) cells at the center of the granuloma (both blue).
  • Scale bar 100 m. dTh1 / 2 site force-in expression in pulmonary granulomas.
  • Granuloma CD4-positive cells (green) that expressed IFN-a but did not express IL-14 (all red).
  • CD4-positive IFN-a positive cells (yellow) were around the layer of CD4-positive cells. e to i BA L number and cell composition, serum calcium levels, and ACE activity.
  • FIG. 5 is a photograph showing the effect of the P. acnes colony on the granuloma formation.
  • FIG. 6 is a photograph showing the therapeutic effect of sarcoidosis by administration of the antibiotic of the present invention.
  • FIG. 4 shows the results of examining the ratio of the number of CD4-positive cells in BAL (bronchoalveolar lavage) for CAM).
  • the results of examining the number of CD4-positive cells in the BAL for the short-term administration groups are shown.
  • FIG. 8 is a photograph showing PCR data showing that indigenous P. acnes in the lung was reduced by antibiotic administration.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of examining whether non-specific immunosuppressive phenomena have occurred due to administration of antibiotics.
  • the therapeutic agent for sarcoidosis of the present invention is not particularly limited as long as the active ingredient and the therapeutic agent are antibiotics targeting P. acnes, and the method for treating sarcoidosis of the present invention is not particularly limited.
  • the method of treatment in which an antibiotic targeting P.acnes is administered to patients with sarcoidosis, and sarcoidosis is defined as sarcoidosis, Beck's sarcoma, Beniet'Beck Schaumann It refers to a granulomatous disease involving multiple organs, also called disease or lupus vasculature.
  • the antibiotics targeting P.acnes may be any chemicals having an antibacterial activity against P.acnes, such as amoxicillin (Amoxicillin, AMPC), and amoxicillin club.
  • Lanic acid Amoxicillin / Clavulanate, AMP C / C VA
  • Aspoxycillin Aspoxicillin, AS PC
  • Benzylpenicillin Benzy lpeni ci 11 in, PCG
  • Ampicillin ABPC
  • cefditoren Pivoxil CDTR-P1; cefetametipoxyl (Cefetamet pivoxil hydrochor ide, C EMT— P 1), cefdinir (Cefdinir, CFDN), cefixime (Cefixime, CFIX), cefcapene pivoxil (cefcapene pivoxil, CFPN-PI), cefpodoxime proxetil (cefpodoxime proxetil) , C PDX—PR) and other cefem antibiotics, faropenem sodium (Faropenem, FRPM), imidenem / cilastatin (Imipenem / Cilastatin, IPM / CS), meropenem (Meropenem, ME PM), Panipenem Z
  • Lactam antibiotics such as (Panipenem / Betamipron, PAPM / BP), ceptazidime (Ceftazidime, CAZ), cephalotin (Cefalotin, CET), cefazolin (Cefazolin, CEZ), cefotiam (Cefotianu CTM), cefotaxime (Cefotaxime) CTX), Sef Operazon
  • tetracycline antibiotics such as doxycycline (Doxycyc 1 ine, DOXY), quinolone (Quinolone), chloramphenicol (chloramphenicol CP), rifamycin (rifamycin, RFM), sulfonamide (SA) drugs, antibacterial antibiotics such as cotrimoxazole, oxazol idinone, roxithromycin (Roxithromycin, RXM), pancomycin (Vancomyc in, VCM), etc.
  • Substances and synthetic antibacterial agents such as sparfloxacin (SPFX), ciprofloxacin (Ciprofloxacin, CPFX), lepofloxacin (Levof loxacin, LVFX), tosfloxacin (Tosufloxacin, TF LX), and fleroxacin (Fleroxacin, FLRX)
  • SPFX sparfloxacin
  • CPFX ciprofloxacin
  • CPFX ciprofloxacin
  • LVFX lepofloxacin
  • tosfloxacin Tosufloxacin, TF LX
  • fleroxacin FlRX
  • clindamycin minocycline hydrochloride
  • ampicillin and clarithromycin
  • the therapeutic agent for sarcoidosis of the present invention can be used also as a preventive agent for sarcoidosis, and uses an antibiotic targeting P. acnes as an active ingredient as a therapeutic agent for pharmaceuticals
  • various preparations such as pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, solubilizers, solubilizers, isotonic agents, etc.
  • Ingredients can be added.
  • These therapeutic agents can be administered orally or parenterally.For example, they can be administered orally in the form of powder, granules, tablets, capsules, syrups, suspensions, etc. Alternatively, in the form of a solution, emulsion, suspension or the like, it can be administered parenterally in the form of an injection, or it can be administered in the form of a spray, for example, intranasally or through the respiratory tract.
  • pharmacologically acceptable carriers include various conventional organic or inorganic carrier materials, such as lactose, starch and other excipients for tablets, talc, magnesium stearate. And other binders such as hydroxypropylcellulose and polyvinylpyrrolidone, disintegrants such as propyloxymethylcellulose, and the like. Glycol,
  • Solubilizing agents such as propylene dalicol, suspending agents such as stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, and lecithin; isotonic agents such as glycerin and D-mannitol; phosphates, acetates, citrates, etc. Buffering agents and the like. If necessary, pharmaceutical additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents and sweeteners can be added.
  • water-soluble solvents such as distilled water and physiological saline
  • solubilizers such as sodium salicylate
  • isotonic agents such as sodium chloride, glycerin, D-mannitol
  • human Stabilizers such as serum albumin
  • preservatives such as methylparaben
  • local anesthetics such as benzyl alcohol
  • the dose of the therapeutic agent for sarcoidosis of the present invention can be appropriately selected depending on the type of disease, weight and age of the patient, dosage form, symptoms, and the like.For example, when administered to an adult, it is an active ingredient.
  • Antibiotics targeted to P. acnes and their pharmaceutically acceptable salts are usually about 0.001 to 500 mg, preferably in a single dose, preferably:! 550 mg, and it is desirable to administer this amount once to three times a day.
  • Parenteral administration of the therapeutic agent for sarcoidosis of the present invention includes, for example, intravenous administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, intrathecal administration, transmucosal administration, and airway administration. However, intravenous administration, subcutaneous administration and trans-airway administration are preferred.
  • P. acnes-positive staining images in which (round granules) aggregated were observed. They were all phagocytosed by lung cells, most of which were adjacent to the alveoli (Fig. La, b). Double immunostaining revealed that P. acnes-positive cells were not known as dendritic cells, such as CD11c ( Figure Id) or DEC205 ( Figure le), but were known macrophage markers. It was found to express a certain F4 / 80 (Fig. Lc) (Blood. 95, 138-146, 2000, J. Immunol. 166, 2071-2079, 2001). In addition, RT_PCR analysis of normal lungs from which the upper respiratory tract was removed revealed the presence of the P. acnes-genome (Figure 1f), supporting the immunostaining results.
  • P. acnes resides on the skin or mucosal surfaces of the oral cavity and intestine (Manual of Clinical Microbiology. 587-602, 1995).
  • RT-PCR RT-PCR primers
  • lymphocytes in the regional lymph nodes of the lung were found to be in the groin, liver, and kidney. Like lymph node cells, they were found to proliferate specifically in response to P. acnes (Fig. 2b).
  • the present inventors next examined whether P. acnes-sensitized T cells were intravenously transferred to form granulomas also in normal lungs and normal liver.
  • the present inventors obtained P. acnes-sensitized CD4-positive T cells from the associated lymph node of the footpad to which P. acnes was repeatedly immunized, and obtained them into the tail vein of normal mice. Injected. Two weeks after transplantation of 2 ⁇ 10 6 T cells, the present inventors observed changes in granuloma as an aggregate of epithelioid cells and monocytes in the lung and liver (FIGS. 3 a, b). ). On the other hand, adoptive transfer of naive T cells did not produce such results in control experiments (Fig. 3c, d).
  • the present inventors have continuously induced transcircular supply of P. acnes-sensitized T cells to the lungs of normal mice by repeated immunization via the footbed. Characteristic granulomas formed mainly in the subpleural and peribronchovascular areas of the lungs of mice treated in this way (FIG. 4a). Immunohistochemical analysis revealed that granuloma consisted of nucleus progenitor cells and peripheral CD4 + T cells (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6, 671 -679, 2002) (Fig.
  • FIG. 8 shows the results of a study on PCR using PBS as a control to determine whether antibiotics reduce P. acnes resident in mouse lung. As a result, it was found that P. acnes was reduced when MINO and CLDM were used. In addition, P. acne did not decrease so much when GM was used compared to when MI NO or CL DM was used, but this was because GM was originally less sensitive to P. acnes. This is consistent with the BAL results shown in Figure 7.
  • FIG. 9 shows the results of an examination as to whether MI NO and CL DM improve the size of ear swelling and the value of the kidney. As a result, no remarkable difference was observed from PBS which is the control. This indicated that the improvement of granulomatous lesions was brought about by the antibacterial effects of pure antibiotics.
  • P. acnes is distributed on the skin and mucosal surfaces of healthy subjects and causes acne vulgaris (Semin. Cutan. Med. Surg. 20, 139-143, 2001). (J. Exp. Med. 193, 35-49, 2001, J. Exp. Med. 195, 1257-1266, 2002), making P. acnes a likely candidate for pathogenic bacteria . Indeed, earlier reports have emphasized the relationship between P. acnes and sarcoidosis (Lancet. 354, 120-123, 1999; J. Clin. Microbiol. 0, 198-204, 2002). As described above, the present inventors identified P. acnes in normal mouse alveolar cells by immunostaining (FIG. 1). a, b). These P.
  • acnes-containing cells are: Consistent with macrophage's known finding that it expresses F4Z80 instead of 0110 and not 0205, phagocytoses antigens in the lungs, and transmits antigen information to dendritic cells. (Fig. 1c-e) (Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162, S151-S156, 2000, Immunology. 81, 343-351, 1994). Subsequent to the presence of antigen-presenting cells (AP Cs) that phagocytize P. acnes in healthy lungs, the present inventors followed the existence of an immune response to P. acnes in the lung regional lymph nodes of normal mice. Was examined. Indeed, lymphocytes from normal pulmonary lymph nodes show P. acnes-specific proliferation (Figure 2b), which indicates that when these cells are in a steady state, they are already P. It suggests that an immune response to acnes has been established.
  • AP Cs antigen-presenting cells
  • mice show pulmonary granulomas characteristic of lymphoid areas (Scientific Foundations, Vol. 1, 2395-2409, 1997), such as the subpleural, pleural, and perivascular areas ( Figure 4a). ), Typical granuloma (Scientific Foundations, Vol. 2, 2395-2409, 1997) (Fig. 4b, c) and expression of Th1 cytokines were observed (Fig. 4d). These characteristics are very similar to those of pulmonary sarcoidosis (N. Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997; Curr. Opin. Pulm. Med. 8, 435-440, 2002; Diagnosis of Disease of the CHEST
  • acnes not only plays a pivotal role in pulmonary granuloma formation through extrapulmonary P. acnes sensitization, but also as an antibacterial substance as a treatment for pulmonary sarcoidosis. Also suggests the possibility of clinical usefulness of eradication therapy with steroids.
  • acnes is also present in the lungs of healthy individuals, in humans with a unique genetic background, as reported for patients with sarcoidosis, (N Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997, Lancet. 361, 1111-1118, 2003, J. Immunol. 167, 6756-6764, 2001), in extrapulmonary areas such as acne vulgaris. Pulmonary lesions may also occur following excessive sensitization of P. acnes. Therefore, eradication of this pathogen should be considered prior to conventional immunosuppressive treatment of sarcoidosis. We suggest that this new view of pulmonary sarcoidosis deserves further study and provides a basis for new therapeutic strategies.
  • mice 5-7 week-old female C57BLZ6J mice were obtained from CLEA Japan (Shizuoka, Japan) or SLC Japan (Tokyo, Japan) and used for molecular prophylaxis, graduate School of Medicine, Tokyo University. They were placed under specific pathogen-free (SPF) conditions in an animal facility in a medical school. All animal experiments were performed according to the guidelines of the University of Tokyo.
  • SPF pathogen-free
  • anti-mouse monoclonal antibodies were used.
  • CD 4 (clone; RM4-5), Piotinylated IFN-A (XMG 1.2), Piotinylated IL-14 (BVD 6-24G2)-all from BD PharMingen (Riki Reformia, San Diego) I, Piotinylated F 4/8 0 (C I: A3—l), CD llc (N4 18) —all manufactured by Serotec (U.S.A., Oxford), DEC—205 (NLD C-145; BMA Biomedical, Augst, Switzerland) ), And mouse mAb against P. acnes for lipotic acid recognition of the plasma membrane (J. Exp. Med. 193, 35-49, 2001).
  • alkaline phosphatase-labeled anti-rat IgG antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvania
  • alfa lipophorase anti-hamster IgG antibody Cederlane, Ontario , Canada
  • avidin Naichirei, Tokyo, Japan
  • peroxidase-labeled anti-rat Ig antibody BioSource, Camarillo, California
  • peroxidase-labeled anti-mouse Ig antibody DAKO
  • RNA sample 1 g was collected from lungs and lung, liver, skin, and regional lymph node samples from TPF from SPF mice using Trisol (Invitrogen, Groningen, the Netherlands) as directed by the manufacturer. Isolated. The RNA sample was then reverse transcribed into cDNA and amplified. U. Exp. Med. 193, 35-49, 2001, J. Clin. Invest. 102, 1933-1941, 1998). The PCR product of 16 s ribosomal RNA of P. acnes was electrophoresed on a 2.5% agarose gel. Bands visualized by bromide thidium staining were the expected size of each mRNA product. An oligonucleotide primer of P.
  • lymph node cells 105 cells Z1901 / ⁇
  • peribronchial, axillary, inguinal, liver, and tongue of a mouse are usually used as antigens (P. acnes and OVA; 10 zg / culture solution 1).
  • 0_i1) was used to stimulate at 37 ° C for 72 hours.
  • the cell proliferation was measured using a Premix WST-1 cell proliferation measurement system (Yukara Bio Inc., Shiga, Japan) according to the manufacturer's instructions.
  • P. acnes-sensitized CD4-positive T cells were isolated from the groin of normal mice and mice immunized three times. Immunization was carried out using 400 g of heat-killed P. acnes (AT CC 118,88, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia) and Freund's complete adjuvant (Difco, Detroit, Michigan). It was performed by subcutaneous injection into the footpad at two week intervals.
  • CD4-positive cells 2 4 positive cells were isolated using the MACS system (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany) according to the manufacturer's instructions. The purity of the CD4-positive cell population was greater than 94%, as confirmed by immunostaining flow cytometry.
  • the isolated CD4-positive cells (2 ⁇ 10 6 cells / PBS 200 ⁇ 1) were injected into the tail vein of normal mice, and two weeks later, the lungs were analyzed histologically.
  • BAL cells were transformed with 2% FCS (Sigma, St. Louis, Missouri) and
  • BAL leukocytes Collected by 5 injections of 0.8 ml of sterile PBS containing 2 mM EDTA. The total number of BAL leukocytes was calculated with a hemocytometer.
  • rat anti-mouse CD16 / CD32 (clone; 2.4G2)
  • mAb c Pre-incubation to block R-mediated binding, followed by both FITC-conjugated anti-CD4 (H129.19) mAb and PE-conjugated anti-CD8 (manufactured by BD PharMingen).
  • Serum calcium levels were measured with a Fuji DRI-CHEM 5500V (Fuji Medical System, Tokyo, Japan) and angiotensin converting enzyme (ACE) activity was measured using ACE color (Fuji Medical System, Tokyo, Japan). ) was measured according to the manufacturer's instructions.
  • Minocycline hydrochloride (MIN ⁇ ) (Wyeth Ledele, Tokyo, Japan) and clindamycin (CL DM) (Pharmacia, Tokyo, Japan) were used.
  • MIN ⁇ Minocycline hydrochloride
  • CL DM clindamycin
  • ABPC ampicillin
  • CEZ cefazolin sodium
  • GM genomycin sulfate
  • FOM fosfomycin
  • CAM clarithromycin
  • a therapeutic drug for sarcoidosis which is one of systemic granulomatosis, and a method for treating sarcoidosis can be provided.

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Abstract

　全身性肉芽腫症の一つであるサルコイドーシスの治療薬や、サルコイドーシスの治療方法を提供するものである。塩酸ミノサイクリン、クリンダマイシン等のプロピオニバクテリウム・アクネス（Propionibacterium acnes）を標的とした抗生物質を有効成分とするサルコイドーシスの治療薬を調製する。また、このサルコイドーシスの治療薬をサルコイドーシス患者に投与してサルコイドーシスを治療する。

Description

明 細 書 サルコィ ド一シスの治療薬と治療方法 技術分野
本発明は、 プロピオニバクテリゥム . ァクネス （Propionibacterium acnes)を標的とした抗生物質を有効成分とするサルコィ ド一シスの治療 薬や、 かかる治療薬をサルコィ ドーシス患者に投与するサルコィ ドーシ スの治療方法に関する。 背景技術
サルコイ ドーシスは、 最も良く知られた、 全身性肉芽腫症の一つであ るが、 多くの集中的な研究にも関わらず、 その病因は 1 0 0年以上も解 明されていない （例えば、 Ν· Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997 参 照）。 肺は、 最も一般的に影響をうける臓器であり、 肺肉芽腫性炎症は処 置されないまま放置されると、 ガス交換が妨害され、 しばしば回復不能 な線維化に陥り、 予後不良である。 継 した肺の炎症又は線維症を伴う 長期的な呼吸障害の発生は、 一般の人々に非常に多く見られる。 肺は常 に病原体を含む風媒性物質にさらされており、 多くの研究者が原因とな りうる伝播性病原体、 及びその肺肉芽腫形成機序への関与を特定すべく 研究を続けている （例えば、 Clin. Exp. Allergy. 31, 543-554, 2001, Curr. Opin. Pulm. Med. 8, 435-440, 2002参照）。
臨床的及び免疫病理学的類似点のため、 最も一般的なマイコバクテリ ァの感染症である結核がサルコィ ド一シスに関与しているかもしれない と考えられている。 しかしながら、 バクテリア培養システム及び組織学 的手法、並びにポリメラ一ゼ連鎖反応法（P CR)の利用にも関わらず、 ヒト結核菌 （Mycobacterium tuberculosis) 及びサルコイ ドーシスの関 係については議論中である （例えば、 非特許文献 Am. J. Respir. Crit. Care Med. 156， 1000-1003, 1997, Hum. Pathol. 28, 796-800, 1997, Thorax. 51, 530-533, 1996参照）。 Propionibacter ium acnes (P. acnes) は、 皮膚又は粘膜表面に常在する嫌気性胞子非形成型グラム陽性桿菌で あるが （例えば、 Manual of Clinical Microbiology, 587-602, 1995参 照）、近年、サルコィ ドーシスの原因抗原の有力候補であることが示唆さ れている （例えば、 Lancet. 361， 1111-1118, 2003 参照）。 定量的 P C Rを使ったいくつかの研究により、 サルコィ ドーシス患者の縦隔又は表 在性リンパ節 （L N s ) における P. acnesゲノムのレベルは、 対象者の それに比べて顕著に高いということが明らかになり、 このことは患者体 内において P. acnes による 「内因性感染」 がある可能性を示唆している (例えば、 Lancet. 354, 120-123, 1999, J. Clin. Microbiaol. 40, 198-204, 2002, J. Pathol. 198, 541-547, 2002参照）。
肺肉芽腫形成の誘因となる過程では、 風媒性又は血液由来の抗原が肺 に定着し、マクロファージ（貪食細胞）又は樹状細胞（D C s ) (例えば、 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 26, 671-679, 2002参照） のような抗 原提示細胞 （AP C s ) が、 貪食やその後の抗原提示のためにそれらの 抗原を集積して取り囲むと考えられている （例えば、 The Lung. Vol. 1. 2395- 2409， 1997参照）。 この見解に基づいて、 肺肉芽腫のいくつかの動 物モデル、 特にマウスの住血吸虫症モデルにおいて、 抗原を肺に留める ための抗原塞栓術を用いた方法が提案されている（例えば、 Am. J. Pathol. 158, 1503-1515, 2001 , J. Immunol. 166, 3423-3439, 2001 参照）。 し かしながら、 肺間質における長期的な抗原の堆積は実地肺臨床には不適 合であり、 又、 血液由来抗原の播種が肺肉芽腫の全症例の原因になると は考えにくい。 本発明の課題は、 全身性肉芽腫症の一つであるサルコィ ド一シスの治 療薬ゃサルコィ ドーシスの治療方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究し、以下（ 1 )〜（ 7 ) の知見を得て、 本発明を完成するに至った。
( 1 ) 抗 P. acnesモノクローナル抗体を用いた健常マウス肺の免疫染色 により、 無菌とされてきた正常下気道肺に主にマクロファージに貪食さ れている P. acnesが存在することがわかった。
( 2 ) P. acnes の 1 6 s リポゾ一マル RN Aのプライマーを用いた RT 一 P C Rにより、健常下気道肺に P. acnesが検出され、 （ 1 ) をサポート する結果となった。
( 3) 正常肺所属リンパ節についても （2) と同様に P. acnesが検出さ れた。 また、 リンパ球増殖アツセィにより P. acnes特異的な免疫反応も 認められた。
(4) 正常マウスに対する P. acnes感作 C D 4陽性 T細胞の経静脈的移 入実験により、 肺 ·肝肉芽腫が形成された。
( 5) 上記 （4) の応用モデルとしてマウスに P. acnesの肺外 (足床) 反復免疫 （4 0 0 /i g ' 週間隔） を行ったところ、 胸膜直下 ·気管支 血管周囲束優位に分布する T h 1型の肉芽腫が形成された。 これらのマ ウスは抗原投与量依存的に血清カルシウム · AC Eレベルが上昇し、 B AL (気管支肺胞洗浄） リンパ球の CD 4/ 8比は血清カルシウム値に 正の相関をもっていた。 また、 肺外病変として、 肝肉芽腫 * CD 4陽性 T細胞の赤脾髄への異常集積もみられた。 これらの結果は肺サルコィ ド —シスの免疫組織学的特徴に酷似するものであった。
(6) 上述のサルコイ ドーシス様肺肉芽腫形成において、 健常肺に常在 する P. acnesが重要であることを示すために、 反復免疫の開始一週間前 に P. acnes生菌を前投与し、 肉芽腫形成の増幅の有無をみた。 すると、 投与菌量依存的に肉芽腫形成が増幅し BAL細胞数も増加した。
(7) 上記 （6) と同様の目的で、 P. acnes に対する抗菌操作が肺肉芽 腫形成にあたえる影響をみた。 P. acnes に対して抗菌作用の分かってい る塩酸ミノサイクリン ' クリンダマイシンの投与群では P B S投与群に 比し、 B AL総細胞 · C D 4陽性細胞数が減少しており、 肉芽腫形成も 抑制されていた。 発明の開示
すなわち本発明は、 （ 1 ) プロピオ二パクテリ ゥム · ァクネス (Propionibacterium acnes) を標的とした抗生物質を有効成分とするこ とを特徴とするサルコィ ドーシスの治療薬や、 （ 2)プロピオニバクテリ ゥム · ァクネス （Propionibacterium acnes) を標的とした抗生物質が、 ペニシリン系抗生物質、 セファロスポリン系抗生物質、 マクロライ ド系 抗生物質、 リンコマイシン系抗生物質、 テトラサイクリン系抗生物質か ら選ばれる 1種又は 2種以上の抗生物質であることを特徴とする （ 1 ) 記載のサルコィ ドーシスの治療薬や、 （3) プロピオ二パクテリゥム 'ァ クネス （Propionibacterium acnes) を標的とした抗生物質が、 塩酸ミノ サイクリン、 クリンダマイシン、 アンピシリン又はクラリスロマイシン であることを特徴とする （ 1 ) 又は （ 2) 記載のサルコイ ドーシスの治 療薬に関する。
また本発明は、 （ 4 ) プロ ピオ二パクテ リ ゥム · ァク ネス (Propionibacterium acnes) を標的とした抗生物質をサルコィ ドーシス 患者に投与することを特徴とするサルコィ ドーシスの治療方法や、 （ 5) プロピオニバクテリゥム · ァクネス （Propionibacterium acnes) を標的 とした抗生物質が、 ペニシリン系抗生物質、 セファロスポリン系抗生物 質、 マクロライ ド系抗生物質、 リンコマイシン系抗生物質、 テトラサイ W 200
クリン系抗生物質から選ばれる 1種又は 2種以上の抗生物質であること を特徴とする （4) 記載のサルコィ ドーシスの治療方法や、 （6) プロピ ォニバクテリウム ·ァクネス （Propionibacterium acnes) を標的とした 抗生物質が、 塩酸ミノサイクリン、 クリンダマイシン、 アンピシリン又 はクラリスロマイシンである.ことを特徴とする （4) 又は （ 5) 記載の サルコィ ドーシスの治療方法に関する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 健常マウス肺の肺胞における P. acnesの存在を示す実験の 結果を示す写真である。
a , b 正常マウス肺の肺胞における P. acnesの免疫染色 （茶色）。 拡大 率を大きくした P. acnes含有細胞。 スケールバー； 5 ΓΠ (a)、 2 0 m (b)。
c〜 e P. acnes (茶色）及び F 4/ 8 0 (青） の二重染色（ c )、 P. acnes (茶色） 及び CD 1 1 c (青） の二重染色 （d)、 P. acnes (茶色） 及び D E C 2 0 5 (青）の二重染色（ e )。 F 4Z 8 0提示細胞のみが P. acnes を貪食する。 スケールバ一、 2 0 xm。
f 健常マウスの下気道肺.における P. acnes の検出。 P. acnes 生菌から 抽出した全 RN Aを陽性コントロ一ルとして使用し、 正常な末梢血単核 細胞を陰性コントロールとして使用した。 示されているデータは 3回以 上の独立した実験の代表例からとったものである。 n= 5。 マウスに #
1 - 5の番号をふつた。
第 2図は、 正常末梢 LN s内の P. acnesに対する免疫応答の結果を示 す写真である。
a 正常末梢 L N sの P. acnes の 1 6 s リポゾ一マル R N Aの検出。 P. acnes 生菌から抽出した全 R N Aを陽性コントロールとして使用した c 示されているデ一夕は 3回以上の独立した実験の代表例からとったもの である。
b P.acnes 及びコントロール抗原に反応する白血球増殖アツセィ。 白 いバ一、 刺激受けず；黒いバー、 P. acnes剌激受けた；ストライプバー、 〇VA—刺激受けた。 示されているデータは 3回以上の独立した実験の 代表例からとった。 n= 7。 データは平均値土平均値標準誤差。 *、 Pく 0. 0 5 ; **、 Pく 0. 0 1、 剌激受けていないグループ及び OVA—剌 激受けたグループの両ダループに対して。
第 3図は、 P.acnes 感作ヘルパー T細胞の養子移植の結果を示す写真 である。
a, b H&E染色は P. acnes感作 C D 4陽性細胞を第 1 4日目に注射 されたマウスの肺 （ a) 及び肝臓 （b) の肉芽腫を示している。
c , d a及び bに対応する、 未感作 CD 4陽性細胞を注射されたマウ スの肺 （c ) 及び肝臓 （d) をそれぞれ示す。 スケ一ルバ一、 1 0 0 m。
第 4図は、 P. acnes反復免疫付与の結果を示す写真である。
a H&E染色が、 3回免疫付与されたマウスの肺の主に末梢 （上パネ ル） 及び気管支周囲血管により （下パネル） における多数の肺肉芽腫を 示した。 スケールバー、 1 0 0 mB。 気管支； L、 リンパ管； V、 肺 血管。
b, c 肺肉芽腫の細胞構成。肉芽腫の末梢の CD 4陽性 T細胞（茶色）、 肉芽腫中央の F 4/ 8 0陽性 （b) 及び CD 1 1 c陽性 （ c ) 細胞 （両 方青色）。 スケールバー、 1 0 0 m。 d 肺肉芽腫における T h 1 / 2 サイ ト力イン発現。 I FN—ァを発現し、 I L一 4 (いずれも赤色） は 発現しなかった肉芽腫 CD 4陽性細胞（緑色）。 CD 4陽性 I FN—ァ陽 性細胞 （黄色） は、 CD 4陽性細胞の層の周辺であった。 e〜 i BA L数及び細胞構成、 血清カルシウムレベル、 及び AC E活性。 全 BAL 細胞 （ e) 及び BAL内リンパ球数 （ f ) は、 免疫付与の頻度が上がる と上昇し、 CD 4ノ 8比 （g) 及び血清カルシウムレベル （h) は、 二 回免疫付与されたグループにおいて最大で、 2回以上の免疫付与を受け たグループの血清 A C E活性 （ i ) は増加した。 n= 5. データは平均 値土平均値標準誤差 （hを除く）。 示されているデータは 3回以上の独立 した実験の代表例からとった。 j ， k 高頻度の免疫付与が、 多数の肝 臓肉芽腫 （ j ) 及び赤脾髄における CD 4陽性 T細胞 （矢印） の異常な 集積 （k) を誘発した。 試料は免疫付与が 9回行われたマウスから入手 した。 スケールバーはそれぞれ、 1 0 0、 5 0 m。 R P, 赤脾髄； W P， 白脾髄。
第 5図は、 肉芽腫形成に対する P. acnesコロニ一常在量の影響を示す 写真である。
a P. acnes による免疫付与を 3回行ったマウスの B A L細胞総数。 n = 5。 デ一夕は平均値土平均値標準誤差。 示されているデータは 3回以 上の独立した実験の代表例からとった。
b H&E染色による組織学的所見。 スケールパー、 1 0 0 m。
第 6図は、 本発明の抗生物質投与によるサルコィ ドーシスの治療効果 を示す写真である。
a , b P. acnes による免疫付与を 3回行ったマウスの全 B A L細胞 ( a)、 CD 4陽性 T細胞 （b)。 n = 4〜 6。 データは平均値土平均値 標準誤差。 *、 Pく 0. 0 5 ; **、 Pく 0. 0 1 (各 P B S処置グループに 対して）。示されているデータは 3回以上の独立した実験の代表例からと つた。
c H&E染色による組織学的所見。 スケールパー、 1 0 0 /m。
第 7図は、 P. acnes の肺外免疫を 3 回受けるマウスに対し、 ベニシリ ン系：アンピシリン （AB P C)、 セフエム系：セファゾリンナ卜リウム (C E Z)、 アミノ配糖体系 ： 硫酸ゲンタマイシン （GM)、 ホスホマイ シン系：ホスホマイシン （F OM)、 マクロライ ド系：クラリスロマイシ ン （CAM) についての BAL (気管支肺胞洗浄） 中の CD 4陽性細胞 数比を調べた結果を示す図である。 また、 MINO short、 CLDM short とし て短期間投与群 （肉芽腫誘導モデルマウスの処置後一ヶ月後 （最終免疫 時） より抗生物質投与） についての BAL中 C D 4陽性細胞数を調べた 結果を示す図である。
第 8図は、 抗生物質投与によって肺内の常在 P. acnesが減少している ことを示す P C Rデ一タを示す写真である。
第 9図は、 抗生物質投与により非特異的な免疫抑制現象が起こってい るかどうかを調べた結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明のサルコイ ドーシスの治療薬としては、 P. acnes を標的とした 抗生物質を有効成分と治療薬であれば特に制限されるものではなく、 ま た、 本発明のサルコイ ドーシスの治療方法としては、 P.acnes を標的と した抗生物質をサルコィ ドーシス患者に投与する治療方法であれば特に 制限されるものではなく、ここでサルコィ ドーシスとは、サルコィ ド症、 ベック類肉腫、 ベニエー 'ベック · シャウマン病、 血管類狼瘡などとも 呼ばれる多臓器にわたる肉芽腫性疾患をいう。
上記 P.acnes を標的とした抗生物質としては、 P.acnes に対して抗 菌活性を有する化学物質であればどのような物質でもよく、 ァモキシシ リ ン （Amoxicillin、 AM P C )、 ァモキシシリ ン · クラブラン酸 (Amoxicillin/Clavulanate, AMP C/C VA), ァスポキシシリン (Aspoxicillin, AS P C)、 ベンジルペニシリン （Benzy lpeni c i 11 in、 P C G)、 アンピシリ ン （Ampicillin、 A B P C ) , バカンピシリ ン
(Bacampicillin, BAP C)、 シクラシリン （Ciclacillin、 AC P C)、 ピぺラシリン（Piperacillin、 P I P C)等のぺニシリン系抗生物質や、 セフジトレンピポキシル （Cefditoren Pivoxil、 CDTR— P 1 )、 セフ ェタメ トピポキシル （Cefetamet pivoxil hydrochor ide、 C EMT— P 1 )、 セフジニル （Cefdinir、 C F D N), セフィキシム （Cefixime、 C F I X)、セフカペンピポキシル（cefcapene pivoxil、 C F P N— P I )、 セフポドキシムプロキセチル (cefpodoxime proxetil、 C PDX— P R) 等のセフエム系抗生物質や、 ファロぺネムナトリウム （Faropenem、 F R P M)、 イミぺネム · シラスタチン （Imipenem/Cilastatin、 I PM/C S)、 メロぺネム （Meropenem、 ME PM)、 パニぺネム Zベタミプロン
(Panipenem/Betamipron, PAPM/B P) 等のひラクタム系抗生物質 や、セプタジダイム (Ceftazidime, C A Z )、セファロチン（Cefalotin、 C E T)、 セファゾリン（Cefazolin、 C E Z )、セフォチアム（Cefotianu C TM)、 セフオタキシム (Cefotaxime, C T X )、 セフオペラゾン
(Cefoperazone. C P Z)、 セフチゾキシム (Cef t i zoxime, C Z X)、 セ フメノキシム（Cefmenoxime、 CMX)、セフピロム（Cefpirome、 C P R)、 セフエピム (Cefepime, C F PM)、 セフォゾプラン (Cefozopran, C Z 〇 P ) 等のセフ ァ ロスポ リ ン系抗生物質や、 ク リ ンダマイ シン (Clindamycin, C LDM)、 リンコマイシン （Lincomycin、 L CM)、 ェ リ ス ロ マイ シ ン （ Erythromycin、 E M ) 、 ク ラ リ ス ロ マイ シン
(Clarithromycin, CAM), ロキタマイシン （Roki tamycin、 R KM) 等のマクロライ ド · リ ンコマイシン系抗生物質や、 ミ ノサイク リ ン
(Minocycline, M I NO), ドキシサイクリン （Doxycyc 1 ine、 DOXY) 等のテトラサイクリン系抗生物質や、 キノロン （Quinolone)、 クロラム フエニコール （chloramphenicol C P)、 リファマイシン (rifamycin, RFM)、 スルホンアミ ド （sulfonamide, S A) 薬、 コ トリモキサゾ一ル (cotrimoxazole)、 ォキサゾリジノン （oxazol idinone) 等や、 ロキシス ロマイシン （Roxithromycin, RXM)、 パンコマイシン （Vancomyc in、 V CM) 等の抗菌性抗生物質や、 スパルフロキサシン （Sparfloxacin、 S P F X)、 シプロフロキサシン （Ciprofloxacin, C P F X)、 レポフロ キサシン（Levof loxacin、 L V F X) トスフロキサシン （Tosufloxacin、 TF LX)、 フレロキサシン (Fleroxacin、 F L R X) 等の合成抗菌剤を 挙げることができるが、 これらの中でもクリンダマイシン、 ミノサイク リン （塩酸ミノサイクリン）、 アンピシリン、 クラリスロマイシンが好ま しい。
本発明のサルコィ ド一シスの治療薬は、 サルコィ ド一シスの予防薬と しても用いることができ、 有効成分である P. acnes を標的とした抗生物 質を医薬用の治療剤として用いる場合は、 薬学的に許容される通常の担 体、 結合剤、 安定化剤、 賦形剤、 希釈剤、 pH緩衝剤、 崩壊剤、 可溶化 剤、 溶解補助剤、 等張剤などの各種調剤用配合成分を添加することがで きる。 これら治療剤は、 経口的又は非経口的に投与することができ、 例 えば粉末、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤、 シロップ剤、 懸濁液等の剤型で経 口的に投与することができ、 あるいは、 例えば溶液、 乳剤、 懸濁液等の 剤型にしたものを注射の型で非経口投与することができる他、 スプレー 剤の型で鼻孔内投与及び経気道投与することもできる。
経口的に投与する製剤の場合、 薬理学的に許容される担体としては、 慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられ、例えば錠剤には乳糖、 デンプン等の賦形剤、 タルク、 ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ポリビニルピロリ ドン等の結合剤、 力 ルポキシメチルセルロース等の崩壊剤等を配合することができ、 懸濁液 製剤には生理的食塩水アルコール等の溶剤、 ポリエチレングリコール、
0 プロピレンダリコール等の溶解補助剤、 ステアリルトリエタノールアミ ン、 ラウリル硫酸ナトリウム、 レシチン等の懸濁化剤、 グリセリン、 D 一マンニトール等の等張化剤、 リン酸塩、 酢酸塩、 クェン酸塩等の緩衝 剤などを配合することができる。また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、 着色剤、 甘味剤などの製剤添加物を配合することもできる。 非経口的に 投与する製剤の場合、 蒸留水、 生理的食塩水等の水溶性溶剤、 サリチル 酸ナトリウム等の溶解補助剤、 塩化ナトリウム、 グリセリン、 D—マン 二トール等の等張化剤、 ヒト血清アルブミン等の安定化剤、 メチルパラ ベン等の保存剤、 ベンジルアルコール等の局麻剤を配合することができ る。
また、 本発明のサルコイ ドーシスの治療薬の投与量は、 疾病の種類、 患者の体重や年齢、 投与形態、 症状等により適宜選定することができる が、 例えば成人に投与する場合、 有効成分である P . acnesを標的とした 抗生物質およびそれらの薬学的に許容される塩を通常 1回量として約 0 . 0 0 1〜 5 0 0 m g、 好ましくは：！〜 5 0 m gであり、 この量を 1 日 1 回〜 3回投与するのが望ましい。 本発明のサルコィ ドーシスの治療薬を 非経口的に投与するには、 たとえば、 静脈内投与、 皮下投与、 筋肉内投 与、 骨髄腔内投与、 経粘膜投与及び経気道投与などを挙げることができ るが、 静脈内投与や皮下投与及び経気道投与が好ましい。
(実施例 1 )
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明の技術 的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
(結果）
[健常マウス肺の肺胞における P . acnesの存在]
P. acnes に対する既存の免疫反応があるのならば、 健常肺において P. acnes を検出することが可能なはずである。 従って本発明者らは、 健 常な C 5 7 B LZ 6マウスから採取された新鮮凍結肺切片上で、 P. acnes の存在について免疫組織化学的な検討を行った。 2〜 5の円形顆粒
(round granules) が集合する P. acnes陽性染色像を観察した。 これら は全て、 肺細胞により貪食され、 その肺細胞の大半は肺胞に隣接してい た （図 l a, b)。 二重免疫染色により、 P. acnes陽性細胞が、 CD 1 1 c (図 I d) 又は D E C 2 0 5 (図 l e ) といった樹状細胞マ一力一で はなく、 既知のマクロファージマ一カーである F 4/ 8 0 (図 l c ) を 発現することが明らかになった（Blood. 95, 138-146， 2000、 J. Immunol. 166， 2071-2079, 2001)。 さらに、 上部気道を除去した、 正常な肺の RT _ P C R分析により、 P. acnes—ゲノムの存在が明らかになり（図 1 f )、 免疫染色の結果をサポートする結果となった。
[定常状態の局所リンパ節におけるリンパ球の P. acnesに対する特異的 免疫応答]
末梢 AP C sは、 定常状態においても、 提示のために抗原を所属リン パ節に輸送する （Nature. 392， 245-252, 1998、 J. Immunol. 167, 6756-6764, 2001)、 また、 P. acnes は、 皮膚又は口腔及ぴ腸の粘膜表面 に常在する (Manual of Clinical Microbiology. 587-602， 1995)。 正常 肺リンパ節における P. acnes特異的免疫反応をテストするため、 本発明 者らは先ず、 RT— P C Rにより、 他のリンパ節と同様に正常肺リンパ 節にも P. acnesゲノムが存在することを証明した（図 2 a)。本発明者ら はその後、 これら LN sにおいて、 P. acnes に対して特異的な免疫反応 が確立されているかをテストし、肺所属リンパ節のリンパ球が、鼠径部、 肝臓、 及び塍臓のリンパ節細胞と同様に、 P. acnes に反応して特異的に 増殖することを見出した （図 2 b)。
[肺及び肝臓の肉芽腫は、 未処置マウスへの P. acnes感作 T細胞の経静 脈的養子移植により、 誘発される]
2 本発明者らは次に、 P. acnes 感作 T細胞を経静脈的に移入すると、 正 常肺及び正常肝にも肉芽腫が形成されるかどうかを検定した。 本発明者 らは、 P. acnesの免疫付与が繰返し行われた足床 （footpad) の所属リン パ節から、 P. acnes 感作 C D 4陽性 T細胞を入手し、 正常なマウスの尾 静脈に注射した。 2 X 1 06の T細胞移植の 2週間後、 本発明者らは、 肺 及び肝臓の類上皮細胞及び単核細胞の集合体としての肉芽腫の変化を観 察した （図 3 a, b)。 一方対照実験において未感作 T細胞の養子移植は そのような結果を生み出さなかった （図 3 c， d)。
[P. acnes の反復免疫付与により、 肺サルコイ ドーシスに酷似する肺 肉芽腫が誘発される]
上記移植モデルの応用モデルとして、 本発明者らは足床経由の反復免 疫付与により、正常マウス肺に経循環的な P. acnes感作 T細胞の供給を、 継続的に誘導した。 特徴的な肉芽腫が、 主にこのように処置されたマウ スの肺の胸膜下、 及び気管支血管周囲 （peribronchovascular) 領域に形 成された （図 4 a)。 免疫組織化学的な分析により、 肉芽腫は、 中核原提 示細胞、 及び周辺部の C D 4陽性 T細胞から成ることが明らかになつた (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6, 671-679, 2002) (図 4 b, c )0 さらに、 これら CD 4陽性 T細胞は、 I L一 4ではなく、 I FN—ァを 発現したことから、 肉芽腫は Th l型 （図 4 d) であることが示唆され ている。 本発明者らは BAL細胞の数を数えることにより、 肉芽腫の病 変の程度を予測することができた。 BAL液中の全白血球及びリンパ球 の合計数の増加は、 投与回数に伴って増加したが （図 4 e， f )、 二回注 射されたグループの中では、 CD 4ノ 8細胞の比が最も大きかった （図 4 g)0
この実験的モデルで得られた結果は、 サルコイ ドーシス患者の特徴と 合致したため、 本発明者らは血清カルシウムレベル及び AC E (アンギ 転換酵素） 活性を評価することにより、 それらの血清学的類 似性を検証した （N. Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997、 Lancet. 361, 1111-1118, 2003、 Diagnosis of Disease of the CHEST Vol. 1, 1533-1583, 1999)。血清カルシウムは 2回注射されたグループで最も増加し（図 4 h). AC E活性は抗原投与量依存的に増加した （図 4 i )。サルコィ ドーシス において、 しばしば病変がみられる肝臓及び脾臓の免疫組織化学的分析 により、 頻繁に免疫付与されていたマウスにおいて、 肝臓に多数の肉芽 腫 （図 4 j ) 及び、 脾臓の赤脾髄に CD 4陽性 T細胞の異常な蓄積が見 られた。
[健常肺的常在 P. acnesが増加すると肺肉芽腫形成が増進される] 正常な肺に常在する P. acnesが肺肉芽腫をもたらすのであれば、 その 数量が病変の程度に影響するはずである。 この仮説を検証するために、 本発明者らは、 免疫付与の前の健常マウス肺に P. acnes生菌を前投与し た。気管内単独投与により肉芽腫が誘発される可能性を排除するために、 本発明者らは、 実験の初期段階及び最終段階のいずれにおいてもコント ロールの肺に肉芽腫が存在していないことを確認した。 3回の免疫付与 の後に回収された B AL内の白血球の総数は前投与された P. acnesの数 量依存的に増加し （図 5 a)、 肉芽腫病変の組織学的検討の結果はこの所 見と一致した （図 5 b)。
[抗生物質治療はマウスサルコィ ドーシス肺の肉芽腫病変を軽減する] 常在する P. acnesの重要性をさらに評価するために、 本発明者らは、 抗菌性物質である塩酸ミノサイクリン （M I NO) 及びクリンダマイシ ン （C LDM) を用いて健常肺に常在する P. acnesの数を免疫付与に先 立って減らした （J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 15, 51-55, 2001、 Semin. Cutan. Med. Surg. 20, 139-143, 2001)。 3回目の免疫付与から 2週間後、 M I NO _及び C L DM—処置マウスには、 BAL白血球総
4 数の大幅な減少が見られた（図 6 a)； これら 2グループの CD 4陽性 B AL細胞数はそれぞれ、 5 3. 5 %及び 4 2. 1 %減少した （図 6 b)。 組織学的検証により、 肉芽腫の病変の減少も明らかになった （図 6 c )。
また、 上記塩酸ミノサイクリン及びクリンダマイシンと同様に、 ベニ シリン系：アンピシリン （ A B P C )、 セフエム系：セファゾリンナトリ ゥム （C E Z)、 アミノ配糖体系 ：硫酸ゲンタマイシン （GM)、 ホスホ マイシン系：ホスホマイシン （F OM；)、 マクロライ ド系： クラリスロマ イシン （CAM) についての BAL (気管支肺胞洗浄） 中の CD 4陽性 細胞数比を調べた。 また、 M I NO short, C L DM short として短期 間投与群 （肉芽腫誘導モデルマウスの処置後一ヶ月後 （最終免疫時） よ り抗生物質投与） についても調べた。 結果を図 7に示す。 図 7は、 コン トロール（P B S)群を 1 0 0とした％表示で示されている。その結果、 前述の M I N〇 （ 5 3. 5 %改善）、 C L DM ( 4 2. 1 %改善） に加え、 AB P C (46. 1 %改善）、 CAM (48. 3 %改善）、 C LDM short ( 7 4. 3 %改善） 投与群において、 BAL白血球総数の大幅な減少が 見られた。 GMでは効果が見られなかったが、 これは GMが元来 P. acnes に対して低感受性であることと合致する。
[抗生物質投与により肺内常在の P. acnesゲノムは減少する]
抗生物質によりマウス肺内常在の P. acnesが減少するかについて、 P B Sをコントロールとする P C Rで調べた結果を図 8に示す。その結果、 M I NO及び C L DMを用いた場合に P. acnesが減少することがわかつ た。 また、 GMを用いた場合、 M I NOや C L DMを用いた場合と比較 して、 P. acneはそれほど減少しなかったが、 これは G Mが元来 P. acnes に対して低感受性であることと合致するものであり、 図 7に示す B AL の結果と呼応している。
[肉芽腫病変の改善は抗生物質の抗菌作用によりもたらされる]
5 サルコィ ドーシスに対して抗生物質としての機能を有する M I NO と MO NOとが、 非特異的な免疫抑制現象を引き起こしているかにつき 調べた。 M I NO及び C L DMが耳腫脹の大きさや塍臓値を改善するか にっき調べた結果を図 9に示す。 その結果、 コント口一ルである P B S と顕著な差はみられなかった。 このことから、 肉芽腫病変の改善が、 純 粋な抗生物質の抗菌作用によりもたらされたことがわかった。
(実施例 2)
(考察）
生物は常に異種抗原にさらされているが、 肺の下気道は不可侵の無菌 空間であり、 病原体の肺への侵入が肺の疾患を引き起こすと考えられて きた。 この前提に基づき、 肺疾患の動物モデルは、 気管、 鼻腔、 又は抗 原塞栓肺血管を経由した抗原の強制的投与に立脚していた （Am. J. Pathol. 158, 1503-1515, 2001、 J. Immunol. 166， 3423-3439, 2001、 Nature. 392, 245-252, 1998、 Immunology. 108, 352-364, 2003)。 しか しながら、 臨床医は病原菌への明らかな曝露のない原因不明の肺疾患、 特に間質性肺疾患にしばしば直面している。 従って本発明者らは、 ある 一定の条件下で病原体となりうる生物が健常肺に常在するのかもしれな いと推測した。
P. acnes が健常者の皮膚及び粘膜表面に分布し、 尋常性ざ瘡 （acne vulgaris) の病原となり （Semin. Cutan. Med. Surg. 20, 139-143, 2001) また実験モデルにおいて肉芽腫形成 （j. Exp. Med. 193, 35-49， 2001、 J. Exp. Med. 195, 1257-1266, 2002)を顕著に誘導することから、 P. acnes は病原菌の有力候補と見られている。 実際、 先行の報告は、 P. acnes と サルコィ ドーシスの関係を強調している （Lancet. 354, 120-123, 1999、 J. Clin. Microbiol. 0, 198-204, 2002)。 上述のように、 本発明者ら は免疫染色により正常なマウスの肺胞細胞の P. acnesを同定した （図 1 a， b)。 これら P. acnes含有細胞は、 。0 1 1 0又ほ0 £じ 2 0 5では なく F 4Z 8 0を発現しており、 肺において抗原を貪食し、 抗原情報を 樹状細胞へ伝播するというマクロファージの既知の知見と一致している (図 1 c〜e ) (Am. J. Respir. Crit. Care Med. 162, S151-S156, 2000、 Immunology. 81， 343-351, 1994)。 健常肺に、 P. acnes を貪食している 抗原提示細胞 （AP C s ) が存在するという引き続いて、 本発明者らは 正常なマウスの肺所属リンパ節における P. acnesに対する免疫反応の存 在を調べた。 確かに、 正常な肺リンパ節のリンパ球は P. acnes特異的な 増殖を示しており （図 2 b)、 このことは、 これらの細胞が定常状態にお いて既に肺由来の A P Cにより P. acnesに対する免疫応答を確立してい ることを示唆している。
本発明者らは次に、 P. acnes 感作 Tリンパ球が、 人工的な抗原定着化 (antigen-anchoring) がなくても肺の炎症を引き起こすと仮定した。 P. acnes 感作 C D 4陽性 T細胞の未処置マウスへの養子移植は、 肺及び 肝の肉芽腫変化をもたらした （図 3 a；)。 このことは P. acnesに感作した 肺外リンパ節の CD 4陽性 T細胞は、 経循環的に正常な肺に流入するこ とによって肉芽腫形成を誘導し得ることを示している。 従って本発明者 らは、 正常マウスに、 継続的な P. acnes肺外感作をすることで P. acnes 感作 T細胞が継続的に供給され、 慢性的な肺肉芽腫形成が起こると仮定 した。 これらのマウスには、 胸膜下、 胸膜、 及び血管周囲領域などのリ ンパに富む領域 (Scientific Foundations, Vol. 1, 2395-2409, 1997) に特徴的な肺肉芽腫が見られ （図 4 a)、 典型的な肉芽腫 （Scientific Foundations, Vol. 2, 2395-2409, 1997) (図 4 b， c ) 及び T h 1サイ トカインの発現が見られた （図 4 d)。 これらの特徴は肺サルコィ ドーシ スの特徴と酷似している （N. Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997、 Curr. Opin. Pulm.Med. 8， 435-440, 2002、 Diagnosis of Disease of the CHEST
7 Vol. 1， 1533-1583, 1999)。 また、 モデルマウスでは B A L内 C D Z C D 8細胞比の増加 （図 4 g) に加えて、 A C E活性の増加 （図 4 i ) 及 びカルシウムレベルの上昇 （図 4 h) が認められた。 これらの所見は、 サルコィ ド一シス患者の血清カルシウムレベル及び B A L CD 4ZC D 8比の正の相関を示した先行研究と一致している （Am. J. Med. 110, 687-693, 2001)。 さらに、 本発明者らは、 サルコイ ドーシスにおいて頻 繁に影響を受けている肝臓と脾臓について、 このモデルマウスにおいて も同様の肺外病変を見出した （図 4 j , k ) (N. Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997、 Lancet. 361, 1111-1118, 2003、 Diagnosis of Disease of the CHEST Vol. 1, 1533-1583, 1999)。 以上より、 P. acnes反復免疫 付与モデルには、サルコィ ドーシス患者との著しい類似性が認められた。
P. acnes 感作 T細胞の経循環的な肺内への流入は肉芽腫の形成を誘発 しうるので （図 3 a)、 P. acnesを貪食している肺 A P Cと肺リンパ節内 T細胞の相互作用は肉芽腫の発生に不可欠であると考えた。 この点を確 認するために、 健常肺内に常在する P. acnesの総量の変化が肺肉芽腫形 成に影響を与えるか否かを調べた。 予想通り、 抗菌性物質治療により P. acnes を減少させると、 肺の肉芽腫病変が減少したのに対して、 P. acnesの肺内前投与は、 肺の病変を悪化させた （図 6 a， b)。 これら の結果は、 常在している P. acnesが、 肺外 P. acnes感作により肺肉芽腫 形成に極めて重要な役割を果たしているばかりでなく、 肺サルコイ ド一 シス治療としての抗菌性物質による除菌療法の臨床的有用性の可能性も 示唆している。
サルコィ ドーシスの原因は現在に至るまで不明とされている。 主に皮 質ステロイ ドによる免疫抑制療法が、 この疾患に対して 5 0年以上も用 いられてきたが、 慢性的な肺サルコィ ドーシスに対するステロイ ド治療 の長期的な効果については、 未だに議論中であ り （Lancet. 361, 1111-1118, 2003)、 治療後の再発率の高さがしばしば臨床的問題となつ ている （Chest. Ill, 623-631, 1997)。 本実施例においては、 肺サルコ ィ ドーシスと著しく類似している新規のマウス肺肉芽腫モデルを作製し た。 本発明者らが提示したように、 もし P. acnesが健常者肺にも存在す るのであれば、 サルコイ ドーシス患者について報告されているような、 独特の遺伝的背景をもつ人間においては （N. Engl. J. Med. 336, 1224-1234, 1997、 Lancet. 361, 1111-1118, 2003、 J. Immunol. 167, 6756-6764, 2001)、 尋常性ざ瘡のような肺外の領域においても P. acnes の過剰な感作に引き続いて、 肺の病変がおきる可能性がある。 従って、 この病原体の根絶は、 サルコイ ドーシスの従来の免疫抑制治療に先駆け て考慮されるべきである。 本発明者らはこの新しい肺サルコィ ドーシス の見解が更なる研究に値し、 新規の治療戦略の基礎を提供することを提 言する。
(実施例 3)
(材料と方法)
[マウス]
5〜 7週齢の雌の C 5 7 B L Z 6 Jマウスを、 日本クレア社 （日本、 静岡県） 又は日本エスエルシー社 （日本、 東京都） から入手し、 東京大 学医学系研究科分子予防医学教室の動物用施設内で、特定病原体除去（S P F) 条件下においた。 全ての動物実験は、 東京大学の指針に従って行 つた。
[免疫染色]
以下の抗—マウスモノクローナル抗体 （mAb s ) を使用した。
CD 4 (クローン； RM4— 5)、ピオチン化 I FN—ァ（XMG 1. 2)、 ピオチン化 I L一 4 (BVD 6 - 2 4 G 2) —以上全て BD PharMingen 社製 (力リフォルニァ、 サンディエゴ） 一、 ピオチン化 F 4/8 0 (C I : A 3— l )、 CD l l c (N4 1 8) —以上いずれも Serotec社製（ィ ギリス、 オックスフォード） 一、 D E C— 2 0 5 (NLD C- 1 4 5 ； BMA Biomedical 社製 Augst, Switzerland), 及び原形質膜のリポティコ 酸認識用の P. acnesに対するマウス mA b (J. Exp. Med. 193, 35-49, 2001)。
2次抗体として、 アルカリフォスファターゼ標識化抗ラット I g G抗 体 ( Jackson ImmunoResearch Laboratories 土 製 、 West Grove, Pennsylvania)、アル力リフォスファ夕一ゼ標識化抗ハムスター I g G抗 体 （Cederlane 社製、 Ontario, Canada) 又はアビジン （ニチレイ社製、 東京、 日本）、及びペルォキシダーゼ標識化抗ラッ ト I g抗体（BioSource 社製、 Camarillo, California), 又はペルォキシダ一ゼ標識化抗マウス I g抗体 （DAKO社製、 Carpinteria, California) を使用した。
一重及び二重の免疫染色を間接的免疫アル力リフォスフォ夕一ゼ及び 免疫ペルォキシダーゼ法により行った U. Exp. Med. 183, 1865-1878, 1996)。二重免疫染色については、 ァセトン固定化 6 m新鮮凍結組織切 片を抗 C D 4抗体に続いて、 Alexa Fluor 488 抗ラッ ト I g抗体 (Molecular Probes社製、 Eugene, Oregon) を用いてインキュベートし た。 次いで、 ピオチン化 I FN—ァ又はピオチン化 I L一 4を用いてィ ンキュペートし、 さらに、 A l e X a 5 9 4一結合アビジン （Molecular Probes社製） を用いてインキュベートし、 蛍光顕微鏡観察により観察し た （Clin. Immunol. 97, 33-42, 2000)。
[R T - P C R]
1 gの全 RN Aサンプルを肺、 並びに S P Fマウスの肺、 肝臓、 皮 膚及び滕臓の所属リンパ節試料から、 トライゾル （Invitrogen 社製、 Groningen, the Netherlands) を用いて、 製造者の指示通りに単離した。 その後 RNAサンプルを c DNAへ逆転写し、 増幅した U. Exp. Med. 193， 35-49, 2001、 J. Clin. Invest. 102, 1933-1941, 1998)。 P. acnes の 1 6 s リボソーム RNAの P C R産物を、 2. 5 %のァガロースゲル 上で電気泳動した。 臭化工チジゥム染色により可視化されたバンドは各 mR N A産物の予想されたサイズであった。 P. acnes のオリゴヌクレオ チドプライマ一を文献 （J. Clin. Microbiol. 40, 198-204, 2002) 記載 に準じて設計した： forward, 5' -GCGTGAGTGACGGTAATGGGTA-3' (配列番号 1 ) ； reverse^ 5' -TTCCGACGCGATCAACCA-3' (配列番号 2 )。 実験中の P. acnes のコンタミネーシヨンは、 ノ ツファーコントロールでチェック した。 内部標準としての GAP DHのプライマーは、 文献 U. Exp. Med. 193, 35-49, 2001) 記載のものを用いた。 P C R条件は： 9 5 °Cで 5分 間加温した後、 9 5 °Cで 3 0秒、 5 8 °Cで 6 0秒、 7 2 °Cで 6 0秒のサ イクルを 4 0サイクル繰返し、 最後に 7 2 °Cで 1 0分間加温した。
[抗原特異的増殖アツセィ] '
インビト口での細胞増殖アツセィを、 文献 U. Exp. Med. 193, 35-49, 2001)記載の方法に準じて行った。すなわち、通常マウスの気管支周囲、 腋窩、 鼠径、 肝臓、 滕臓のリンパ節細胞 （ 1 05 細胞 Z 1 9 0 1 /ゥ エル） を、 抗原 （P. acnes 及び OVA ； 1 0 z g/培養液 1 0 _i 1 ) を 用いて 3 7 °Cで 7 2時間刺激した。 インキュベーション後、 細胞増殖を P r e m i x W S T— 1細胞増殖測定システム （夕カラバイオ社製、 滋賀、 日本） を用いて、 製造者の指示通りに測定した。
[P. acnes感作ヘルパー T細胞の養子移植]
P. acnes 感作 CD 4陽性 T細胞を、 正常マウス及び 3回免疫付与され たマウスの鼠径部より単離した。 免疫付与は、 熱死滅処理した 4 0 0 gの P. acnes (AT C C 1 1 8 2 8、 American Type Culture Collection 製、 Manassas, Virginia) とフロイント完全アジュバント （Difco社製、 Detroit, Michigan) を、 2週間隔で足床に皮下注射して実施した。 CD
2 4陽性細胞を、 MAC Sシステム （Miltenyi Biotech 社製、 Bergisch Gladbach, Germany) を用いて製造者の指示通りに単離した。 C D 4陽性 細胞集団の純度は 94 %以上で、 免疫染色流動細胞計測法によって確認 された通りであった。 単離された CD 4陽性細胞 （2 X 1 06 細胞/ P B S 2 0 0 ^ 1 ) を、 正常マウスの尾静脈に注射し、 二週間後に肺を組 織学的に分析した。
[気管支肺胞洗浄 （BAL) 細胞のフローサイ トメトリー分析]
BAL細胞を 2 %のF C S (Sigma社製、 St. Louis、 Missouri) 及び
2 mMの E D T Aを含有する無菌 P B S 0. 8m l を 5回注射するこ とにより収集した。 BAL白血球総数は血球計数器により計算した。 B
AL細胞を、 EPICS Elite ins ument (Beckman Coul ter社製、 Miami、 Frolida)で分析する前、ラッ ト抗マウス CD 1 6 /CD 3 2 (クローン； 2. 4 G 2 ) mAbを用いて、 F c Rを介する結合をブロックするため にプレインキュベ一トし、 その後、 いずれも BD PharMingen社製の F I T C結合抗 C D 4 (H 1 2 9. 1 9 ) m A b及び P E結合抗 C D 8 ひ （ 5
3— 6. 7 ) mAbを用いて 4 °Cで 2 5分間インキュベートした。
[血清学的分析]
血清カルシウムレベルを、 Fuj i DRI- CHEM 5500V (Fuj i Medical System 社製、 東京、 日本） により測定し、 アンジォテンシン変換酵素 （AC E) 活性を ACE color (Fuji Medical System社製、 東京、 日本） により製造 者の指示どおりに測定した。
[抗生物質治療]
塩酸ミノサイクリン （M I N〇） (Wyeth Ledele 社製、 東京、 日本） 及びクリンダマイシン (C L DM) (Pharmacia社製、 東京、 日本） を使 用した。 第一日目に 1 3 3 gの M I N〇、 及び 1. 6mgの C LDM を気管内投与 （i. t.) する。 その後、 同用量の各抗生物質を免疫付与前 の一週間、 毎日腹腔内に投与 （i.p.) したあと、 腹腔内注射を週に 3回 行う。 実験の間、 マウスには上記と同量の各抗生物質を含有した水を与 えた。 同様に、 アンピシリン （AB P C)、 セファゾリンナトリウム (C E Z))、 硫酸ゲン夕マイシン （GM)、 ホスホマイシン （F OM)、 クラ リスロマイシン （CAM) を使用し、 これら抗生物質の一回投与量も同 じく、 成人常用最大量を体重換算して設定した。
[統計分析]
二つの要素、 すなわち、 要因の分散分析 （ANQVA) 及び Fisher's protected least significant di f f ereneceを用いて、 差異を評価した。 0. 0 5未満の P値（P. valueく 0.05)は統計的に有意であると判断した。 産業上の利用可能性
本発明によると、 全身性肉芽腫症の一つであるサルコィ ド一シスの治 療薬ゃサルコィ ドーシスの治療方法を提供することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. プロピオ二パクテリゥム ·ァクネス （Propionibacterium acnes) を 標的とした抗生物質を有効成分とすることを特徴とするサルコィ ドーシ スの治療藥。
2. プロピオ二パクテリゥム · ァクネス （Propionibacterium acnes) を 標的とした抗生物質が、ベニシリン系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、 マクロライ ド系抗生物質、 リンコマイシン系抗生物質、 テトラサイクリン系抗生 物質から選ばれる 1種又は 2種以上の抗生物質であることを特徴とする請求項 1記載のサルコイ ドーシスの治療薬。
3. プロピオ二パクテリゥム ·ァクネス （Propionibacterium acnes) を 標的とした抗生物質が、 塩酸ミノサイクリン、 クリンダマイシン、 アン ピシリン又はクラリスロマイシンであることを特徴とする請求項 1又は 2記載のサルコィ ドーシスの治療薬。
4. プロピオ二バクテリウム ·ァクネス （Propionibacterium acnes) を 標的とした抗生物質をサルコィドーシス患者に投与することを特徴とす るサルコィ ドーシスの治療方法。
5. プロピオ二バクテリウム ·ァクネス （Propionibacterium acnes) を 標的とした抗生物質が、 ペニシリン系抗生物質、 セファロスポリン系抗 生物質、 マクロライ ド系抗生物質、 リンコマイシン系抗生物質、 テトラ サイクリン系抗生物質から選ばれる 1種又は 2種以上の抗生物質である ことを特徴とする請求項 4記載のサルコィ ドーシスの治療方法。
6. プロピオ二バクテリウム ·ァクネス （Propionibacterium acnes) を 標的とした抗生物質が、 塩酸ミノサイクリン、 クリンダマイシン、 アン ピシリン又はクラリスロマイシンであることを特徴とする請求項 4又は 5記載のサルコィ ドーシスの治療方法。
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