WO2004113560A1 - In vivo-testsystem zum nachweis von hiv-proteaseaktivität - Google Patents

In vivo-testsystem zum nachweis von hiv-proteaseaktivität Download PDF

Info

Publication number
WO2004113560A1
WO2004113560A1 PCT/EP2004/006827 EP2004006827W WO2004113560A1 WO 2004113560 A1 WO2004113560 A1 WO 2004113560A1 EP 2004006827 W EP2004006827 W EP 2004006827W WO 2004113560 A1 WO2004113560 A1 WO 2004113560A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protease
nucleic acid
containing composition
cell
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/EP2004/006827
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jochen Bodem
Hans-Georg KRÄUSSLICH
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Heidelberg
Original Assignee
Universitaet Heidelberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Heidelberg filed Critical Universitaet Heidelberg
Publication of WO2004113560A1 publication Critical patent/WO2004113560A1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4746—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used p53
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
    • C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a 7n vtvo test system based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) for the detection of protease activity, in particular HIV protease activity, and for the selection of effective HIV protease inhibitors.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • HIV human immunodeficiency virus
  • retrovirus a so-called retrovirus.
  • HIV-lp three retroviral enzymes, reverse transcriptase, integrase and protease (HIV-lp) are crucial both for the life cycle of HIV and as target molecules for the development of drugs.
  • the primary function of HIV-lp, an aspartyl protease, is the proteolytic cleavage of the viral polypeptides p55 / Gag (group-specific antigen; structural proteins) and pl60 / Pol (reverse transcriptase, integrase and RNase H).
  • HIV-lp protease activity protease activity
  • the problem of the present invention is therefore to provide a compound or a test system, by means of which the activity of the HIV protease or any other protease can preferably be measured quickly and easily, and by means of which potential protease inhibitors can be tested for their effectiveness can.
  • Test systems and compounds are known from the prior art, in which the detection of protease activity is based, for example, on the measurement of a changed fluorescence. Lindsten et al. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, Vol.
  • MCS8 45, pages 2616-2622 describes a chimeric nucleic acid construct consisting of the region coding for an inactive precursor of the HIV-lp protease and the region coding for the so-called “green fluorescent protein” (GFP).
  • GFP green fluorescent protein
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the excitation energy from the donor is now transferred via fluorescence transferred to the acceptor, which can be up to 90 angstroms away Transferred energy leads to electronic excitation of the acceptor, whereby the fluorescence of the donor is "quenched". If the acceptor releases its excitation energy in the form of fluorescent light, the compound begins to fluoresce after the FRET.
  • the efficiency of the energy transfer depends on the size of the overlap of the emission spectrum of the donor with the absorption spectrum of the acceptor, the relative orientation of the donor and acceptor transition dipoles and the distance between donor and acceptor. It follows from the latter that an experimentally induced spatial separation between donor and acceptor leads to a reduced emitted fluorescence of the acceptor compared to the initial situation.
  • An example of an experimental use of this physical principle is described in WO-A 02/090987.
  • the invention discloses a two-part probe, consisting of a target molecule binding site which is linked to a first fluorescent polypeptide, a binding molecule which is linked to a second fluorescent polypeptide, and a so-called flexible linker which connects the first and the second fluorescent polypeptide connects together.
  • the binding of a test substance can be examined. If a test substance binds successfully, the binding molecule of the probe is displaced from the binding site, so that the distance between the first and second fluorescent polypeptide (donor and acceptor) increases, which causes a change in fluorescence.
  • the disclosed invention is apparently not suitable for measuring protease activity, even if the linker would represent a protease interface. In this case, efficient separation of the fluorophores would not be guaranteed, since the two parts of the probe would still be connected to one another via the binding site and the binding molecule and proteases are small.
  • Cummings et al. have used the FRET principle for the development of an in vitro test system for HIV protease.
  • a substrate for the HIV protease is provided at one end with a biotin group and at the other end with a phosphotyrosine residue.
  • An FRET is generated by binding an antibody directed against phosphotyrosine, to which europium cryptate (donor fluorophore) is coupled, and by simultaneously binding streptavidin, to which XL665 (acceptor fluorophore) is coupled, to the biotin group.
  • the fluorophores are separated from one another, so that the fluorescence signal decreases. Disadvantages of this method are the fact that it can only be used in vitro and consequently is not suitable for uptake and tolerance studies and that the fluorescence also depends on the binding behavior of a fluorophore support to its corresponding interaction partner on the substrate.
  • EP-A 0 428 000 describes a fluorogenic protease substrate for the HIV and AMV protease (Avian Myeloblastosis Virus), in which the donor and acceptor fluorophores are each coupled directly to one end of the substrate.
  • the present invention relates to a protein-containing composition
  • a protein-containing composition comprising
  • the inventors have recognized that if protease activity is present, a fluorophore is separated by cutting the interface, so that FRET can no longer take place.
  • B is the donor and B 'is the acceptor or whether B' is the donor and B is the acceptor. Accordingly, it is also irrelevant whether the activity of the protease separates the donor or the acceptor, since the presence of both fluorophores is necessary for successful energy transfer.
  • the interface is placed on the fusion protein containing the acceptor, so that the acceptor is separated off.
  • the fluorescence signal decreases in proportion to the protease activity, provided the emitted fluorescence of the acceptor is measured.
  • the fluorescence signal increases when the emitted fluorescence of the donor, which is no longer transferable due to the lack of an acceptor, is measured.
  • a decrease in the fluorescence signal proportional to the protease activity is measured.
  • the interface can be an interface for any protease known to the person skilled in the art. This includes all acidic, neutral and alkaline proteases, which belong to the groups of serine, cysteine, aspartate or metal proteases. A comprehensive list of proteases (also known as peptidases), the activity of which can be tested or detected using the present invention, is on the ExPASy website (Expert Protein Analysis System) at http://ca.expasy.org/cgi-bin / enzyme-search- to find ful? peptidase. Furthermore, the present invention includes interfaces for both animal, plant, bacterial and viral proteases.
  • the interface is an interface for a viral protease. It is particularly favorable for the present invention if the interface is the interface for the HJV protease.
  • Suitable donors or acceptors (B or B ') for the present invention are all fluorophores known to the person skilled in the art which have the properties described above. It may depend on the protease to be examined which donor / acceptor pair is best suited for carrying out the invention. When choosing a donor / acceptor pair which is favorable for the present invention, care must also be taken to ensure that the protease to be examined does not have an intrinsic chromophore (color support) which could serve as a donor or acceptor.
  • aromatic molecular components such as Tryptophan, pyrimidine bases, albumin, reduced nicotine adenine nucleotides, oxidized flavin mononucleotides,
  • Suitable donor / acceptor pairs can be, for example: phycoerythrin / cyan-5, FITC (fluorescein isothiocyanate) / cyan-3, fluorescein / hexafluorescein, Lucifer-Yello w / DNP (2,4-dinitrophenyl), EDANS / DABCYL, coumarin / DABCYL , Europium cryptate / XL665, BFP / GFP, CFP / YFP or GFP / Rhodamine, as well as further different combinations of the named or other fluorophores known to the person skilled in the art.
  • BFP, GFP, CFP and YFP are the common abbreviations for Blue, Green, Cyan and Yellow Fluorescent Protein.
  • the donor / acceptor pairs BFP / GFP and CFP / YFP are preferred, particularly preferably BFP / GFP.
  • the acceptor B or B ' is a non-fluorescent dye. This can be used to minimize background fluorescence, for example, which is based on direct excitation of the acceptor that is not via the donor. Examples of this are the so-called QSY-7 dyes (Molecular Probes), which are generally used in combination with green or orange fluorescent donors such as fluorescein, Oregon Green, Alexa Fluor, BODIPY FL or tetramethylrhodamine.
  • QSY-7 dyes Molecular Probes
  • Any suitable light source such as e.g. a tungsten lamp, xenon lamp, mercury-argon lamp, deuterium arc lamp, halogen lamp
  • Lasers or an LED (light-emitting diodes) light source are used.
  • the measurement is carried out using common detectors, for example a photomultiplier tube, photodiodes (Diode row), silicon detector or charge couple device detectors.
  • common detectors for example a photomultiplier tube, photodiodes (Diode row), silicon detector or charge couple device detectors.
  • various interference filters known to those skilled in the art, e.g. bandpass filters, edge filters, conversion filters, heat reflection filters, UV blocking filters, UV mirrors, cold light mirrors, achromatic beam splitters, dichroic mirrors, color splitters, fluorescence excitation and blocking filters can be used.
  • the donor B or B ' is a so-called bioluminescent donor, which does not have to be excited by absorbed light energy.
  • this procedure known to those skilled in the art under the name biolominescence resonance energy transfer (BRET), is comparable to FRET.
  • the bioluminescent donor is usually the luciferase of the pansy Renilla reniformis, which oxidizes its substrate coelenterazine to coelenteramide in the presence of oxygen, generating light energy, which in turn is based on the fluorescent acceptor, e.g. GFP or YFP.
  • Coelenterazine is cell permeable, so this method can also be used in vivo.
  • Suitable interaction partners A or A 'for the present invention are all molecules which are customary for the person skilled in the art for such purposes and which naturally interact with one another. This can be, for example, antigen / antibody pairs, or the binding and activator domain of a selected protein, e.g. Lex A / B42 or GAL4 binding domain / VP16. Other examples include Myo-D / Id, EVH-1 / Act-A, and Biotin / (Strept-) Avidin. In a particularly preferred embodiment, the interaction partners are the so-called large T antigen of the SV40 virus and the proto-oncogene p53.
  • the mutual binding of the interaction partners A and A 'to one another can take place as a main or secondary valence bond.
  • the main valence bonds include covalent (atomic) bonds, ionic and metallic bonds as well as transitions between them.
  • Side valence bonds (Van der Waals bonds) include electrostatic interactions such as dipole-dipole or dipole-quadrupole interactions and indirect interactions due to mutual polarization of the charge distribution.
  • An example of a secondary valence bond is the formation of a hydrogen bond.
  • the proteinaceous composition of the present invention can be prepared by any method available to those skilled in the art. Chemical peptide synthesis processes and genetic engineering processes are particularly conceivable. To make the The protein-containing composition according to the invention by means of genetic engineering methods requires the provision of the nucleic acid coding for the protein-containing composition.
  • the present invention accordingly relates to a nucleic acid or nucleic acid-containing composition which codes for the protein-containing composition of the present invention.
  • nucleic acid or nucleic acid-containing composition according to the invention accordingly consists of
  • a second nucleic acid coding for a second fusion protein containing an interaction domain A 'and a fluorophore B' characterized in that the regions A and A 'encoded by the nucleic acid bind to each other, and that between those of the nucleic acid coded areas A and B or between A 'and B' the coding area for a protease interface is inserted.
  • renilla luciferase, BFP, GFP, CFP and YFP are preferably chosen as fluorophores, since low-molecular-weight, fluorescent compounds such as e.g. DNP can only be attached to the finished protein after transcription and translation.
  • the nucleic acid according to the invention is preferably used to express the protein encoded by it in cells which can be transfected simultaneously or subsequently with a nucleic acid encoding a protease, in particular HIV protease. All cells in which protease activity is to be verified or inhibited can be considered as cells.
  • the present invention can be carried out in T cells.
  • nucleic acid according to the invention locates in the nucleus after transfection of the target cells, but the fluorophore separated from the protease after transcription and translation in
  • Cytoplasm is detected. Due to the spatial separation of the fluorophore in one Another cell compartment guarantees a change in fluorescence after successful cleavage by a protease.
  • nucleic acid Numerous methods are available to the person skilled in the art for introducing the nucleic acid according to the invention into the host or target cell (transformation or transfection), depending on the host cell selected.
  • the simplest method for gene transfer is the injection of "naked" nucleic acids into a target tissue / target cells.
  • a more efficient method is the manipulation of a single cell by so-called microinjection of the nucleic acid into the cell nucleus.
  • reagents and methods, as well as any combinations thereof which are selected from the group consisting of calcium chloride, rubidium chloride, lithium chloride, calcium phosphate, DEAE dextran, cationic lipids, biolistic particle bombardment ("gene gun” method), heat shock transformation and electroporation.
  • nucleic acid or composition containing nucleic acid according to the invention is inserted in a so-called expression vector.
  • the present invention therefore also relates to a recombinant DNA and an expression vector which contain the nucleic acid according to the invention.
  • the expression vector is a eukaryotic, in particular human, bacterial or a retroviral vector, plasmid, bacteriophage or other vectors customary in genetic engineering, e.g. Liposomes that are suitable for the expression of proteins or peptides.
  • the nucleic acid sequence in the vector according to the invention can be operatively linked to regulatory elements which ensure transcription and synthesis of a translatable mRNA in pro- and / or eukaryotic cells.
  • regulatory elements are promoters, enhancers or transcription termination signals, but can also be introns or similar elements, such as elements which enable or contribute to the stability and multiplication of the vector, the selection and / or the integration into the host genome.
  • the invention also includes a method of making a recombinant
  • the process includes the following steps: (a) Insertion a vector according to the invention, which contains the nucleic acid according to the invention, into a suitable host cell by means of suitable methods, where the host cell can be pro- or eukaryotic, (b) culturing the transfected host cell and (c) isolating the recombinant protein from the host cell or from the culture medium ,
  • the proteins isolated according to step (c) can be further purified for other purposes.
  • the person skilled in the art knows numerous methods for this, e.g. Salt fractionation, size exclusion chromatography, ion exchange chromatography, reverse phase chromatography, affinity chromatography and the like.
  • nucleic acid according to the invention By introducing the nucleic acid according to the invention into the target cells, so-called stable cell lines can be generated by selecting a suitable selection marker known to the person skilled in the art, i.e. the nucleic acid according to the invention remains in the genome of the target cell for permanent expression (stable against transient enter transfection).
  • a suitable selection marker known to the person skilled in the art, i.e. the nucleic acid according to the invention remains in the genome of the target cell for permanent expression (stable against transient enter transfection).
  • the opposite of the present invention is therefore also a host cell or a cell line which is transfected with the nucleic acid according to the invention.
  • the present invention relates to a method for the detection of protease activity in a target cell, the method comprising the following steps:
  • step (d) Measurement of the fluorescence of the cell lysates from step (c) of the target cells from step (a) and from step (b) and comparison of the fluorescence values obtained. If the fluorescence of the target cells from (a) is similar to the fluorescence of the target cells from (b), it can be assumed that the target cells from (a) contain the protease we are looking for.
  • the method according to the invention is therefore suitable for diagnostic purposes, in particular if it is intended to be used to detect viral or bacterial proteases or, in general, proteases foreign to the organism.
  • a fluorescence comparable to the positive control could therefore indicate a virus infection or other type of contamination of the affected cell.
  • the protease to be detected using the method according to the invention is the HIV protease.
  • a diagnostic kit could thus contain a nucleic acid according to the invention, a nucleic acid coding for a protease, transfection reagents, cells already transfected as controls, and buffers and enzymes suitable for carrying out the method.
  • the present invention relates to a method for identifying protease inhibitors, the method comprising the following steps:
  • step (d) Measurement of the fluorescence of the cell lysates from step (c) of the target cells from step (a) and from step (b) and comparison of the fluorescence values obtained.
  • Identification of a protease activator is suitable.
  • the above method is preferably used to identify inhibitors of HIV protease.
  • a certain nucleic acid sequence which codes for a possible protease interface can be inserted between the nucleic acid sequence coding for the interaction partner A or A 'and for the fluorophore B or B' using standard cloning methods known to the person skilled in the art.
  • the present invention accordingly relates to a method for detecting a protease interface, the method comprising the following steps:
  • step (d) Measurement of the fluorescence of the cell lysates from step (c) of the target cells from step (a) and from step (b) and comparison of the fluorescence values obtained.
  • FIGURE 1 Constructs according to the invention
  • the drawing shows a schematic representation of a protein-containing composition according to the invention.
  • A is an example in the construction shown
  • SV40 Large T Antigen A 'is exemplary ⁇ 53, B is exemplary GFP and B' is exemplary BFP.
  • the scissors or C marks the interface for a protease.
  • the wavelength of the absorbed and emitted light energy is in
  • FIG. B shows the structure of a nucleic acid according to the invention (top) and the structure of a nucleic acid coding for a protease (bottom).
  • P stands for "promoter”
  • A stands for any interaction partner
  • C stands for "cleavage site”
  • B stands for fluorophore
  • E stands for HcRED or DSRed2 (BD Biosciences)
  • IRES stands for
  • Internal ribosomal entry site (restart of translation initiation) and F denotes any protease.
  • FIGURE 2 Measurement of protease activity as a function of protease inhibitors
  • FRET (380/508 nm) was transfected into lysates of cells transfected with pGFP-C-LT and pBFP-p53 and either without (lane 1) or with a nucleic acid encoding an HIV protease (lanes 2- 6) are measured. Increasing concentrations of saquinavir (lanes 3-6) were added two hours after the transfection.
  • FIGURE 3 Influence of HIV protease on FRET
  • the nucleic acids according to the invention are either introduced into HIV wild-type infected cells or into cells which have been introduced with an HIV mutant which has a mutation in the catalytic center of the protease (HIV delta-PR, HIV ⁇ PR).
  • HIV- ⁇ PR HIV with mutation of the cat. Center of protease
  • FIGURE 4 The cleavage of GFP-C-LT is specific for the HIV protease
  • GFP detection with anti-GFP antibody in the lysate from transfected 293 T cells with GFP-C-LT (lane 1), GFP-C-LT plus HIV delta-PR (HTV ⁇ PR) (lane 2) and GFP-C -LT plus HIV (wild type).
  • FIGURE 5 Modification of the protease expression system
  • FIGURE 6 Investigation of nelfinavir resistance with wild type and protease mutant 101, 90M
  • the GFP fluorescence decrease by protease cleavage is given.
  • the clones are shown without protease in the first column and the clones without NFV in the last.
  • the 10L, 90M mutant shows resistance at higher NFV concentrations (column 5-2), since the protease still shows activity here.
  • 293 -T cells were co-transfected with the corresponding vectors and the cell lysates prepared from the transfected cells were measured one day after the transfection in a fluorometer (380/507 nm).
  • the vectors pGFP-LT and pGFP-C-LT differ by an HIV protease interface clipped between GFP and LT. If this is cut by the HIV protease, no FRET takes place.
  • the control experiment is pGFP-C-LT without HIV protease and pGFP-LT without interface with HIV protease. A FRET was detected in both cases.
  • subviral HIV clones for the expression of the HIV protease in the cells which contain the nucleic acid according to the invention, subviral HIV clones (security level I) and a construct which DsRed2 or Far-Red expressed under the control of the CMV-LE. promoter (eg pCMV-DsRed-Express from BD Biosciences).
  • promoter eg pCMV-DsRed-Express from BD Biosciences
  • IRES internal ribosomal entry site
  • IRES internal ribosomal entry site
  • HTV-I protease were cloned, so that the protease is expressed about 20 times lower than DsRed. This allows low protease expression and internal transfection control.
  • FRET (380/508 nm) was transfected into lysates of cells transfected with pGFP-C-LT and pBFP- ⁇ 53 and either without (FIGURE 2, lane 1) or with a nucleic acid encoding an HJV protease ( FIGURE 2, tracks 2-6) are measured.
  • Increasing concentrations of saquinavir (FIGURE 2, lanes 3-6) were added two hours after the transfection. The decrease in fluorescence due to the active HIV protease and successful removal of the fluorophore is prevented with increasing saquinavir concentration, i.e. the protease is successfully inactivated by the inhibitor, so that one of the two fluorophores is not separated and FRET can still take place.
  • EXAMPLE 3 The change in FRET and the cleavage of the fluorophore is based specifically on HIV protease activity
  • the nucleic acids according to the invention are either in HIV-wild-type infected cells or in cells which have an HIV mutant which has a mutation in the catalytic center which has protease (HIV delta-PR, HIV ⁇ PR). Since a reduction in emissions can only be observed in the wild-type HIV clone, but not in the mutant HiV clone, it becomes clear that only the HIV protease and not another HIV protein reduces the FRET, ie the reaction is specific ( FIGURE 3).
  • the GFP detection with anti-GFP antibody in the lysate from transfected 293 T cells with GFP-C-LT (FIGURE 4, lane 1), GFP-C-LT plus HTV delta-PR (HIV ⁇ PR) (FIGURE 4, Lane 2) and GFP-C-LT plus HIV (wild type) shows that GFP is only cleaved in the presence of wild type HIV, which expresses the functional protease.
  • the experiment shows that only HIV-PR and no other HIV component reduces FRET.
  • the HC red protease vector was modified such that it has two overhanging dTTP nucleotides at an open cloning site. Since Taq polymerases add an overhanging dATP to the amplificate, the PCR products can be cloned directly (without restriction digest) into the expression vector using this system (see FIG. 5).
  • the PR mutations L10I and L90M produce medium resistance to nelfinavir.
  • the question in this experiment was: can this difference be measured with the system according to the invention.
  • cells were transfected with the FRET vectors and HIV Wt or HIV-PR-101, 90M.
  • the medium was changed 6 h after the transfection and NFV was added in a falling concentration.
  • FRET was measured 24 hours after transfection (see Figure 6).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Offenbart ist eine proteinhaltige Zusammensetzung, umfassend ein erstes Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A und ein Fluorophor und ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor B', dadurch gekennzeichnet, dass A und A' aneinander binden können, und dass zwischen A und B oder zwischen A' und B' die Schnittstelle für eine Protease eingefügt ist. Ausserdem offenbart die Erfindung die für die proteinhaltige Zusammensetzung kodierende Nukleinsäure, ein Verfahren zum Nachweis von Proteaseaktivität sowie ein Verfahren zur Identifizierung von Proteaseinhibitoren.

Description

In vivo-Testsystem zum Nachweis von HlV-Proteaseaktivität
Die vorliegende Erfindung betrifft ein auf Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) basierendes 7n-vtvo-Testsystem zum Nachweis einer Proteaseaktivität, insbesondere HIV- Proteaseaktivität, und zur Selektion wirksamer HlV-Proteaseinhibitoren.
Mit einer geschätzten Anzahl von 40 Millionen erkrankten Personen weltweit, 4,1 Millionen Neuinfektionen und etwa 2,5 Millionen Todesfällen pro Jahr breitet sich das erworbene Immundefizienz-Syndrom (AIDS) nach wie vor immer weiter aus. AIDS wird durch das humane Immundefizienzvirus (HIV), ein so genanntes Retrovirus, verursacht. Drei retrovirale Enzyme, reverse Transkriptase, Integrase und Protease (HIV-lp) sind sowohl für den Lebenszyklus von HIV als auch als Zielmoleküle für die Entwicklung von Arzneimittel entscheidend. Die vornehmliche Funktion von HIV-lp, einer Aspartyl- Protease, besteht in der proteolytischen Spaltung der viralen Polypeptide p55/Gag (gruppenspezifisches Antigen; Strukturproteine) und pl60/Pol (reverse Transkriptase, Integrase und RNase H). Die Spaltung dieser essentiellen HIV-Enzyme bzw. Proteine durch HIV-lp ist wichtig für ihre Reifung und ihre Funktion und ist somit für die Lebensfähigkeit von HIV verantwortlich. Zahlreiche antivirale Medikamente, die in der AIDS-Therapie eingesetzt werden, basieren auf einer Hemmung der HIV-lp- Proteaseaktivität (Proteaseinhibitoren). Jedoch treten aufgrund der raschen Anpassung des Virus durch Mutationen bei Therapie mit bestimmten Wirkstoffen schon nach wenigen Wochen resistente Virusvarianten auf, so dass die Behandlung von AIDS-Patienten auch in entwickelten Ländern nach wie vor sehr schwierig ist.
Das Problem der vorliegenden Erfindung besteht somit in der Bereitstellung einer Verbindung oder eines Testsystems, mit dessen Hilfe bevorzugt in vivo die Aktivität der HlV-Protease oder jeder anderen Protease schnell und einfach gemessen werden kann, und mit dessen Hilfe potentielle Proteaseinhibitoren auf ihre Wirksamkeit getestet werden können.
Aus dem Stand der Technik sind Testsysteme und Verbindungen bekannt, bei denen der Nachweis einer Proteaseaktivität beispielsweise auf der Messung einer geänderten Fluoreszenz beruht. Lindsten et al. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2001, Vol.
äi»MGS8 45, Seiten 2616-2622) beschreibt ein chimäres Nukleinsäurekonstrukt, bestehend aus dem für eine inaktive Vorstufe der HlV-lp-Protease kodierenden Bereich und dem für das so genannte „Green Fluorescent Protein" (GFP) kodierenden Bereich. Nach Einbringen und Expression in einer Zielzelle werden die beiden fusionierten Anteile des Konstrukts durch die autokatalytische Aktivität der HIV-lp gespalten, so dass sich die Wirkung der Protease entfaltet, was anhand der GFP-basierenden Fluoreszenz bestimmt werden kann. Mit diesem System lässt sich die Aktivität der Protease jedoch nicht direkt nachweisen, sondern nur ihr toxischer Effekt auf die betroffene Zelle, da die Protease zytotoxisch ist und die grün fluoreszierenden Zellen absterben.
Seit Beginn der neunziger Jahre hat sich eine Fluoreszenz-basierende Nachweismethode etabliert, die dem Fachmann unter der Bezeichnung „Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer" (FRET) bekannt ist. Mit der FRET-Methode werden üblicherweise Distanzen zwischen Molekülen gemessen. Entweder wird die Distanz zweier fluoreszierender Verbindungen (Fluorophore) voneinander auf einem einzigen Konstrukt, das heißt der Abstand zwischen. den Enden bestimmt, oder man ermittelt die Distanz zweier Fluorophore auf zwei verschiedenen Molekülen. In einem typischen FRET-Experiment werden die interessierenden Moleküle mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren verknüpft. Ein Fluorophor wird als „Donor", das andere als „Akzeptor" bezeichnet. Die Lichtabsorption des Donors (z.B. 350 nm) erfolgt bei kürzerer Wellenlänge als die des Akzeptors (z.B. 450 nm). Beim FRET wird nun die Anregungsenergie vom Donor über Fluoreszenz auf den Akzeptor übertragen, der bis zu 90 Angström entfernt sein kann. Die übertragene Energie führt zur elektronischen Anregung des Akzeptors, wobei die Fluoreszenz des Donors „gelöscht" wird. Gibt der Akzeptor seine Anregungsenergie in Form von Fluoreszenzlicht ab, so beginnt die Verbindung nach dem FRET zu fluoreszieren.
Die Effizienz des Energietransfers hängt von der Größe der Überlappung des Emissionsspektrums des Donors mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptors, der relativen Orientierung der Donor- und Akzeptor-Übergangsdipole und dem Abstand zwischen Donor und Akzeptor ab. Aus dem letztgenannten ergibt sich, dass eine experimentell herbei geführte, räumliche Trennung zwischen Donor und Akzeptor zu einer im Vergleich zur Ausgangssituation verringerten emittierten Fluoreszenz des Akzeptors fuhrt. Ein Beispiel für eine experimentelle Ausnutzung dieses physikalischen Prinzips ist in WO-A 02/090987 beschrieben. Die Erfindung offenbart eine zweiteilige Sonde, bestehend aus einer Zielmolekülbindungsstelle, welche mit einem ersten fluoreszierenden Polypeptid verknüpft ist, einem Bindungsmolekül, welches mit einem zweiten fluoreszierenden Polypeptid verknüpft ist, und einem so genannten flexiblen Linker, der das erste und das zweite fluoreszierende Polypeptid miteinander verbindet. Mit Hilfe dieser Sonde lässt sich die Bindung einer Testsubstanz untersuchen. Bei erfolgreicher Bindung einer Testsubstanz wird das Bindungsmolekül der Sonde von der Bindungsstelle verdrängt, so dass sich der Abstand zwischen dem ersten und zweiten fluoreszierenden Polypeptid (Donor und Akzeptor) vergrößert, was eine Fluoreszenzänderung hervorruft. Die offenbarte Erfindung eignet sich jedoch offenbar nicht zur Messung einer Proteaseaktivität, auch wenn der Linker eine Proteaseschnittstelle darstellen würde. Denn in diesem Fall wäre eine effiziente Trennung der Fluorophore nicht gewährleistet, da die beiden Teile der Sonde noch über die Bindungsstelle und das Bindungsmolekül miteinander verbunden wären und Proteasen klein sind.
Cummings et al. (Analytical Biochemistry, 1999, Vol. 269, Seiten 79-93) haben sich das FRET-Prinzip für die Entwicklung eines In-vitro-Testsystems für HlV-Protease zunutze gemacht. Bei diesem System ist ein Substrat für die HlV-Protease an einem Ende mit einer Biotingruppe und am anderen Ende mit einem Phosphotyrosinrest versehen. Die Erzeugung eines FRET erfolgt durch Bindung eines gegen Phosphotyrosin gerichteten Antikörper, an welchem Europium-Cryptat (Donor-Fluorophor) gekoppelt ist, und durch gleichzeitige Bindung von Streptavidin, an welches XL665 (Akzeptor-Fluorophor) gekoppelt ist, an die Biotingruppe. Bei erfolgreicher Spaltung des Substrats mittels einer exogen zugegebenen HlV-Protease werden die Fluorphore voneinander getrennt, so dass das Fluoreszenzsignal abnimmt. Nachteil dieser Methode ist die Tatsache, dass sie nur in vitro angewendet werden kann und infolgedessen sich nicht für Aufnahme- und Verträglichkeitsstudien eignet und dass die Fluoreszenz auch vom Bindungsverhalten eines Fluorophor-Trägers zu seinem entsprechenden Interaktionspartner an dem Substrat abhängt.
In ähnlicher Weise beschreibt EP-A 0 428 000 ein fluorogenes Proteasesubstrat für die HIV- und AMV-Protease (Avian Myeloblastosis Virus), bei welchem Donor- und Akzeptorfluorophor jeweils direkt an ein Ende des Substrats gekoppelt sind. In diesem System wird die emittierte Fluoreszenz des Donors (z.B. EDANS) gemessen, wobei die Fluoreszenz bei intaktem Substrat durch die Anwesenheit des „löschenden" Akzeptors (z.B. DABCYL) niedrig ist und erst nach erfolgreicher Spaltung des Substrats durch eine Protease und infolgedessen Abtrennung des Akzeptors ansteigt. Auch diese Verbindungen eignen sich nur für einen In-vitro-Nachweis von (HIV-) Proteasen. Das gleiche Prinzip für ein Proteasesubstrat, nämlich die Anhefrung eines Donors bzw. Akzeptors an je einem Ende einer proteolytischen Schnittstelle ist in US 6,291,201 beschrieben. Mit der vorliegenden Erfindung kann das zugrunde liegende Problem unter Vermeidung der vorstehend genannten Nachteile gelöst werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine proteinhaltige Zusammensetzung, umfassend
(a) ein erstes Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A und ein Fluorophor B und
(b) ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor B', dadurch gekennzeichnet, dass A und A' aneinander binden können, und dass zwischen A und B oder zwischen A' und B' die Schnittstelle für eine Protease eingefügt ist.
Die Erfinder haben erkannt, dass bei vorhandener Proteaseaktivität durch Schnitt der Schnittstelle ein Fluorophor abgetrennt wird, so dass kein FRET mehr erfolgen kann. Für die Wirkungsweise der Zusammensetzung ist es gegebenenfalls unerheblich, ob B der Donor und B' der Akzeptor oder ob B' der Donor und B der Akzeptor ist. Demnach ist es außerdem unerheblich, ob durch die Aktivität der Protease der Donor oder der Akzeptor abgetrennt wird, da für einen erfolgreichen Energietransfer die Anwesenheit beider Fluorophore erforderlich ist. Bevorzugt für die vorliegende Erfindung ist es allerdings, wenn die Schnittstelle auf dem den Akzeptor enthaltenden Fusionsprotein platziert ist, so dass der Akzeptor abgetrennt wird.
Wird durch entsprechende Platzierung der Schnittstelle der Akzeptor abgetrennt, nimmt das Fluoreszenzsignal proportional zur Proteaseaktivität ab, sofern die emittierte Fluoreszenz des Akzeptors gemessen wird. Das Fluoreszenzsignal nimmt hingegen zu, wenn die emittierte, aber infolge des fehlenden Akzeptors nicht mehr übertragbare Fluoreszenz des Donors gemessen wird. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform wird eine zur Proteaseaktivität proportionale Abnahme des Fluoreszenzsignals gemessen.
Die Schnittstelle kann eine Schnittstelle für jede dem Fachmann bekannte Protease sein. Dazu zählen alle sauren, neutralen und alkalischen Proteasen, welche zu den Gruppen der Serin-, Cystein-, Aspartat- oder Metallproteasen gehören. Eine umfangreiche Liste von Proteasen (auch bekannt als Peptidasen), deren Aktivität mittels der vorliegenden Erfindung getestet oder nachgewiesen werden kann, ist auf der ExPASy-Internetseite (Expert Protein Analysis System) unter http://ca.expasy.org/cgi-bin/enzyme-search- ful?peptidase zu finden. Des Weiteren umfasst die vorliegende Erfindung Schnittstellen für sowohl tierische, pflanzliche, bakterielle als auch virale Proteasen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Schnittstelle um eine Schnittstelle für eine virale Protease. Besonders günstig für die vorliegende Erfindung ist es, wenn die Schnittstelle die Schnittstelle für die HJV-Protease ist.
Als Donor oder Akzeptor (B oder B') eignen sich für die vorliegende Erfindung alle dem Fachmann bekannten Fluorophore, welche die zuvor beschriebenen Eigenschaften aufweisen. Dabei hängt es gegebenenfalls von der zu untersuchenden Protease ab, welches Donor/ Akzeptor-Paar sich zur Durchführung der Erfindung am besten eignet. Bei der Wahl eines für die vorliegende Erfindung günstigen Donor/ Akzeptor-Paares ist außerdem darauf zu achten, dass die zu untersuchende Protease kein intrinsisches Chromophor (Farbträger) besitzt, welches als Donor oder Akzeptor dienen könnte. Dazu gehören, unter anderem, aromatische Molekülbestandteile wie z.B. Tryptophan, Pyrimidinbasen, Albumin, reduzierte Nicotin-Adenin-Nukleotide, oxidierte Flavin-Mononukleotide,
Pyridoxalphosphat, Häm-Gruppe, Retinalgruppe im Rhodopsin. Geeignete Donor/Akzeptor-Paare können beispielsweise sein: Phycoerythrin/Cyan-5, FITC (Fluoreszeinisothiocyanat)/Cyan-3 , Fluoreszein/Hexafluoreszein, Lucifer- Yello w/DNP (2,4-Dinitrophenyl), EDANS/DABCYL, Coumarin/DABCYL, Europiumkryptat/XL665, BFP/GFP, CFP/YFP oder GFP/Rhodamin, sowie weitere unterschiedliche Kombinationen der genannten oder anderer, dem Fachmann bekannten Fluorophore. BFP, GFP, CFP und YFP sind die gebräuchlichen Abkürzungen für Blue, Green, Cyan und Yellow Fluorescent Protein. Bevorzugt sind die Donor/Akzeptor-Paare BFP/GFP und CFP/YFP, besonders bevorzugt BFP/GFP.
Es ist auch möglich, dass der Akzeptor B oder B' ein nicht-fluoreszierender Farbstoff ist. Damit lässt sich beispielsweise Hintergrundfluoreszenz, die auf einer direkten, nicht über den Donor erfolgten Anregung des Akzeptors basiert, minimieren. Beispiele hierfür sind die so genannten QSY-7-Farbstoffe (Molecular Probes), die im Allgemeinen in Kombination mit grün- oder orange-fluoreszierenden Donoren wie Fluoreszein, Oregon Green, Alexa Fluor, BODIPY FL oder Tetramethylrhodamin eingesetzt werden.
Zur Anregung des Donors kann jede geeignete Lichtquelle, wie z.B. eine Wolframlampe, Xenonlampe, Quecksilber-Argon-Lampe, Deuteriumbogenlampe, Halogenlampe, ein
Laser oder eine LED (Licht-Emittierende Dioden)-Lichtquelle dienen. Die Messung erfolgt mittels gebräuchlicher Detektoren, beispielsweise eine Photomultiplierröhre, Photodioden (Diodenzeile), Siliziumdetektor oder Charge-Couple-Device-Detektoren. Zur Erzielung optimaler Wellenlängen können verschiedene, dem Fachmann bekannte Interferenzfilter, z.B. Bandpassfilter, Kantenfilter, Konversionsfilter, Wärmereflexionsfilter, UV-Sperrfilter, UV-Spiegel, Kaltlichtspiegel, achromatische Strahlteiler, dichroitische Spiegel, Farbteiler, Fluoreszenz- Anregungs- und Sperrfilter zum Einsatz kommen.
In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Donor B oder B' um einen so genannten biolumineszenten Donor, der nicht durch absorbierte Lichtenergie angeregt werden muss. Prinzipiell ist diese Vorgehensweise, die der Fachmann unter der Bezeichnung Biolomineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) kennt, mit FRET vergleichbar. Der biolumineszente Donor ist dabei üblicherweise die Luciferase des Seestiefmütterchens Renilla reniformis, welche in Anwesenheit von Sauerstoff ihr Substrat Coelenterazin zu Coelenteramid oxidiert, wobei Lichtenergie entsteht, die wiederum auf den fluoreszierenden Akzeptor, z.B. GFP oder YFP, übertragen wird. Coelenterazin ist zellpermeabel, so dass diese Methode auch in vivo angewendet werden kann.
Als Interaktionspartner A oder A' eignen sich für die vorliegende Erfindung alle dem Fachmann für solche Zwecke gebräuchlichen Moleküle, die natürlicherweise miteinander interagieren. Es kann sich hierbei beispielsweise um Antigen/Antikörper-Paare handeln, oder um die Bindungs- und Aktivatordomäne eines ausgewählten Proteins, z.B. Lex- A/B42 oder GAL4-Bindedomäne/VP16. Andere Beispiele umfassen Myo-D/Id, EVH- 1/Act-A, und Biotin/(Strept-)Avidin. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Interaktionspartnern um das so genannte Large-T-Antigen des SV40-Virus und da Proto-Onkogen p53.
Die gegenseitige Bindung der Interaktionspartner A und A' aneinander kann als Hauptoder Nebenvalenzbindung stattfinden. Als Hauptvalenzbindungen kommen unter anderem kovalente (Atombindungen), ionische und metallische Bindungen sowie Übergänge dazwischen in Frage. Als Nebenvalenzbindungen (Van der Waals-Bindungen) kommen elektrostatische Wechselwirkungen wie Dipol-Dipol- oder Dipol-Quadrupol- Wechselwirkungen und indirekte Wechselwirkungen infolge gegenseitiger Polarisation der Ladungsverteilung in Frage. Ein Beispiel für eine Nebenvalenzbindung stellt die Ausbildung einer Wasserstoffbrückenbindung dar.
Die proteinhaltige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann nach jedem dem Fachmann zugänglichen Verfahren hergestellt werden. Denkbar sind vor allem chemische Peptidsyntheseverfahren sowie gentechnologische Verfahren. Zur Herstellung der erfindungsgemäßen, proteinhaltigen Zusammensetzung mittels gentechnologischer Verfahren ist die Bereitstellung der für die proteinhaltige Zusammensetzung kodierenden Nukleinsäure erforderlich.
In einer weiteren Ausführungsform richtet sich die vorliegende Erfindung demnach auf eine Nukleinsäure bzw. nukleinsäurehaltige Zusammensetzung, die für die proteinhaltige Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kodiert.
Die erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. nukleinsäurehaltige Zusammensetzung besteht demnach aus
(a) einer ersten Nukleinsäure, die für ein erstes Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A und ein Fluorophor B, kodiert und
(b) einer zweiten Nukleinsäure, die für ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor B', kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Nukleinsäure kodierten Bereiche A und A' aneinander binden, und dass zwischen den von der Nukleinsäure kodierten Bereichen A und B oder zwischen A' und B' der kodierende Bereich für eine Proteaseschnittstelle eingefügt ist.
Als Fluorophore werden in diesem Fall vorzugsweise Renilla-Luciferase, BFP, GFP, CFP und YFP gewählt, da niedermolekulare, fluoreszierende Verbindungen wie z.B. DNP nur nachträglich nach Transkription und Translation am fertigen Protein angebracht werden können.
Vorzugsweise wird die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Expression des von ihr kodierten Proteins in Zellen eingesetzt, die gleichzeitig oder anschließend mit einer für eine Protease, insbesondere HlV-Protease, kodierenden Nukleinsäure transfiziert werden können. Als Zellen in Frage kommen alle Zellen, in denen eine Proteaseaktivität verifiziert oder inhibierte werden soll. Beispielhaft kann die vorliegende Erfindung in T-Zellen ausgeführt werden.
Als besonderen Vorteil der vorliegenden Erfindung kann auch gesehen werden, dass die erfindungsgemäße Nukleinsäure nach Transfektion der Zielzellen im Kern lokalisiert, das von der Protease abgetrennte Fluorophor nach Transkription und Translation jedoch im
Cytoplasma nachgewiesen wird. Durch die räumliche Abtrennung des Fluorophors in ein anderes Zellkompartiment ist eine Änderung der Fluoreszenz nach erfolgreicher Spaltung durch eine Protease gewährleistet.
Zum Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Wirts- bzw. Zielzelle (Transformation oder Transfektion) stehen dem Fachmann zahlreiche Verfahren - abhängig von der gewählten Wirtszelle - zur Verfügung. Die einfachste Methode für den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe/Zielzellen. Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen Zelle durch so genannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den Zellkern. Besonders günstig ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, sowie beliebige Kombinationen davon, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Kalziumchlorid, Rubidiumchlorid, Lithiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, katiönische Lipide, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation und Elektroporation.
Für die Expression und das Einbringen der Nukleinsäure in die Zielzelle ist es von Vorteil, wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. nukleinsäurehaltige Zusammensetzung in einem so genannten Expressionsvektor inseriert ist. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch eine rekombinante DNA und einen Expressionsvektor, welche die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform handelt es sich bei dem Expressionsvektor um einen eukaryontischen, insbesondere menschlichen, bakteriellen oder einen retroviralen Vektor, Plasmid, Bacteriophagen oder um andere in der Gentechnik übliche Vektoren, z.B. Liposomen, die zur Expression von Proteinen bzw. Peptiden geeignet sind. Falls gewünscht oder erforderlich, kann die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektor mit regulatorischen Elementen, die Transkription und Synthese einer translatierbaren mRNA in pro- und/oder eukaryontischen Zellen gewährleisten, operativ verbunden sein. Derartige regulatorische Elemente sind Promotoren, Enhancer oder Transkriptionsterminationssignale, können aber auch Introns oder ähnliche Elemente sein, wie Elemente, welche die Stabilität und Vermehrung des Vektors, die Selektion und/oder die Integration in das Wirtsgenom ermöglichen oder dazu beitragen.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
Proteins, eines Fragments oder Derivats davon, das von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert wird. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (a) Einbringen eines erfindungsgemäßen Vektors, der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält, in eine geeignete Wirtszelle mittels geeigneter Methoden, wobei die Wirtszelle pro- oder eukaryontisch sein kann, (b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle und (c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kultuπnedium.
Falls gewünscht oder erforderlich können die gemäß Schritt (c) isolierten Proteine für andere Zwecke weiter aufgereinigt werden. Der Fachmann kennt hierfür zahlreiche Methoden, wie z.B. Salzfraktionierung, Größenausschlusschromatografie, Ionenaustauschchromatografie, Reverse-Phase-Chromatografie, Affinitätschomatografϊe und ähnliches.
Durch das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in die Zielzellen können durch Auswahl eines geeigneten, dem Fachmann bekannten, Selektionsmarkers sogenannte stabile Zelllinien generiert werden, d.h. die erfϊndungsgemäße Nukleinsäure bleibt im Genom der Zielzelle zur dauerhaften Expression vorhanden (stabile gegenüber transi enter Transfektion). Gegensand der vorliegenden Erfindung ist demzufolge auch eine Wirtszelle bzw. eine Zelllinie, welche mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfiziert ist.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer Proteaseaktivität in einer Zielzelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für einen für die Schnittstelle der nachzuweisenden Protease enthält,
(b) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die Schnittstelle der nachzuweisenden Protease enthält, und Transfektion der selben Zielzelle mit einer für die nachzuweisende Protease kodierenden Nukleinsäure als Positivkontrolle,
(c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a) und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b) und
(d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte. Verhält sich die Fluoreszenz der Zielzellen aus (a) ähnlich wie die Fluoreszenz der Zielzellen aus (b), ist davon auszugehen, dass die Zielzellen aus (a) die gesuchte Protease enthalten. Damit ist das erfindungsgemäße Verfahren für diagnostische Zwecke geeignet, insbesondere, wenn damit virale oder bakterielle Proteasen bzw. im allgemeinen organismusfremde Proteasen nachgewiesen werden sollen. Eine mit der Positivkontrolle vergleichbare Fluoreszenz könnte demnach auf eine Virusinfektion oder andere Art von Kontamination der betroffenen Zelle hindeuten. In einer besonderen Ausführungsform ist die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren nachzuweisende Protease die HlV-Protease. Ein diagnostisches Kit könnte somit eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, eine für eine Protease kodierende Nukleinsäure, Transfektionsreagenzien, bereits transfizierte Zellen als Kontrollen, sowie für die Durchführung des Verfahrens geeignete Puffer und Enzyme enthalten.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Proteaseinhibitoren, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die Schnittstelle der zu inhibierenden Protease enthält, und Transfektion der selben Zielzelle mit einer für die zu inhibierende Protease kodierenden Nukleinsäure,
(b) Zugabe einer Testsubstanz zu einer Teilpopulation der transfizierten Zielzellen aus
(a),
(c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a) und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b) und
(d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte.
Sollte die mit der Testsubstanz behandelte Teilpopulation der transfizierten Zielzellen eine im Vergleich zur unbehandelten Teilpopulation veränderte Fluoreszenz aufweisen, könnte dies auf eine erfolgreiche Inhibition der betreffenden Protease hindeuten. In entsprechender Weise ist es auch denkbar, dass das erfindungsgemäße Verfahren zur
Identifizierung eines Proteaseaktivators geeignet ist. Bevorzugt wird das vorstehende Verfahren zur Identifizierung von Inhibitoren der HlV-Protease eingesetzt. Darüber hinaus ist es möglich, unter Einsatz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. des davon kodierten Polypeptids zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz eine Proteaseschnittstelle darstellt. Zu diesem Zweck kann man zwischen die für den Interaktionspartner A oder A' und für das Fluorophor B oder B' kodierende Nukleinsäuresequenz mittels dem Fachmann bekannter, gängiger Klonierungsmethoden eine bestimmte Nukleinsäuresequenz einfügen, die für eine etwaige Proteaseschnittstelle kodiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge ein Verfahren zum Nachweis einer Proteaseschnittstelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die nachzuweisende Schnittstelle einer bekannten Protease enthält, und Transfektion der selben Zielzelle mit einer für die bekannte Protease kodierenden Nukleinsäure,
(b) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die bekannte Schnittstelle einer bekannten Protease enthält, und Transfektion der selben Zielzelle mit einer für die bekannte Protease kodierenden Nukleinsäure,
(c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a) und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b) und
(d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte.
Der Fachmann weiß, wie man die vorstehend beschriebenen Verfahren (Nachweis einer Proteaseaktivität, Identifizierung von Proteaseinhibitoren und Nachweis einer Proteaseschnittestelle) auch in vitro durchführen kann, indem nämlich statt der nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung die erfindungsgemäße, proteinhaltige Zusammensetzung eingesetzt wird. Diese kann direkt im Reagenzgefaß in einem geeigneten Puffer mit einer nachzuweisenden Protease, und gegebenenfalls einem entsprechenden Inhibitor, in Kontakt gebracht werden. Der Nachweis einer veränderten Fluoreszenz aufgrund vorhandener oder inhibierter Proteaseaktivität erfolgt entsprechend. BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG:
FIGUR 1: Erfindungsgemäße Konstrukte
(A)
Die Zeichnung zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen, proteinhaltigen Zusammensetzung. In der abgebildeten Konstruktion ist A beispielhaft
SV40-Large-T-Antigen (LT), A' ist beispielhaft ρ53, B ist beispielhaft GFP und B' ist beispielhaft BFP. Die Schere bzw. C (für „cleavage site") kennzeichnet die Schnittstelle für eine Protease. Die Wellenlänge der absorbierten und emittierten Lichtenergie ist in
Nanometer (nm) angegeben.
(B)
In (B) ist der Aufbau einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure (oben), sowie der der Aufbau einer für eine Protease kodierenden Nukleinsäure (unten) dargestellt. P steht für „Promotor", A steht für einen beliebigen Interaktionspartner, C steht für „cleavage site", B steht für Fluorophor, E steht für HcRED oder DSRed2 (BD Biosciences), IRES steht für
„internal ribosomal entry site" (Neustart der Translationsinitiation) und F bezeichnet eine beliebige Protease.
FIGUR 2: Messung der Proteaseaktivität in Abhängigkeit von Proteaseinhibitoren
FRET (380/508 nm) wurde in Lysaten von Zellen, die mit pGFP-C-LT und pBFP-p53 transfiziert worden waren, und entweder ohne (Spur 1) oder mit einer für eine HIV- Protease kodierenden Nukleinsäure transfiziert (Spuren 2-6) sind, gemessen. Zwei Stunden nach der Transfektion wurden ansteigende Konzentrationen Saquinavir (Spuren 3-6) zugegeben.
FIGUR 3: Einfluss der HlV-Protease auf den FRET
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind entweder in HlV-Wildtyp-infizierte Zellen oder in Zellen, die mit einer HIV-Mutante, welche eine Mutation im katalytischen Zentrum der Protease aufweist (HIV delta-PR, HIVΔPR), eingebracht.
Konstrukte Fluoreszenz (380/507 nm)* :
GFP-c-LT 1 GFP-C-LT+BFP-P53 4,8
GFP-C-LT+BFP-P53+ HIV 1,5
GFP-C-LT+BFP-P53+ HIV-ΔPR 4,4 HIV: HIV Klon
HIV- ΔPR : HIV mit Mutation des kat. Zentrum der Protease
* Werte sind normalisiert auf GFP
FIGUR 4: Die Spaltung von GFP-C-LT ist spezifisch für die HlV-Protease
GFP -Nachweis mit anti-GFP -Antikörper im Lysat aus transfizierten 293 -T-Zellen mit GFP-C-LT (Spur 1), GFP-C-LT plus HIV delta-PR (HTVΔPR) (Spur 2) und GFP-C-LT plus HIV (Wildtyp).
FIGUR 5: Modifikation des Protease-Expressionssystems
FIGUR 6: Untersuchung der Nelfinavir Resistenz mit Wildtyp und Protease Mutante 101, 90M
Angegeben ist die GFP-Fluoreszenzabnahme durch Proteasespaltung. In der ersten Spalte sind die Klone ohne Protease aufgetragen und in der letzten die Klone ohne NFV. Es zeigt sich bei der 10L, 90M Mutante eine Resistenz bei höheren NFV Konzentrationen (Spalte 5-2), da die Protease hier noch Aktivität zeigt.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert:
BEISPIEL 1:
293 -T-Zellen wurden mit den entsprechenden Vektoren ko-transfiziert und die aus den transfizierten Zellen hergestellten Zelllysate einen Tag nach der Transfektion im Fluorometer (380/507 nm) gemessen. Die Vektoren pGFP-LT und pGFP-C-LT unterscheiden sich durch eine zwischen GFP und LT Monierte HlV-Proteaseschnittstelle. Wird diese von der HlV-Protease geschnitten, findet kein FRET mehr statt. Das Kontrollexperiment ist pGFP-C-LT ohne HlV-Protease und pGFP-LT ohne Schnittstelle mit HlV-Protease. In beiden Fällen wurde ein FRET nachgewiesen. Zur Expression der HlV-Protease in den Zellen, die die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten wurden subvirale HIV-Klone (Sicherheitsstufe I) und ein Konstrukt, welches DsRed2 oder Far-Red unter der Kontrolle des CMV-LE.-Promotors exprimiert (z.B. pCMV-DsRed-Express von BD Biosciences). Am 3 '-Ende von DsRed wurde eine Interne Ribosomale Eintritts-Stelle (Translationsinitiation; IRES) (z.B. pIRES2-DsRed2 BD Biosciences) und die HTV-I- Protease kloniert, so dass die Protease etwa zwanzigfach niedriger als DsRed exprimiert wird. Dies erlaubt eine niedrige Proteaseexpression und eine interne Transfektionskontrolle.
Ergebnis-Tabelle:
Figure imgf000015_0001
BEISPIEL 2: Wirkung eines HlV-Proteaseinhibitors
FRET (380/508 nm) wurde in Lysaten von Zellen, die mit pGFP-C-LT und pBFP-ρ53 transfiziert worden waren, und entweder ohne (FIGUR 2, Spur 1) oder mit einer für eine HJV-Protease kodierenden Nukleinsäure transfiziert (FIGUR 2, Spuren 2-6) sind, gemessen. Zwei Stunden nach der Transfektion wurden ansteigende Konzentrationen Saquinavir (FIGUR 2, Spuren 3-6) zugegeben. Die Abnahme der Fluoreszenz aufgrund der aktiven HlV-Protease und erfolgreicher Abtrennung des Fluorophors wird mit steigernder Saquinavirkonzentration verhindert, d.h. die Protease wird durch den Inhibitor erfolgreich inaktiviert, so dass eines der beiden Fluorphore nicht abgetrennt wird und ein FRET nach wie vor erfolgen kann.
BEISPIEL 3: Die Veränderung des FRET und die Abspaltung des Fluorophors beruht spezifisch auf HlV-Proteaseaktivität
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind entweder in HlV-Wildtyp-infizierte Zellen oder in Zellen, die mit einer HIV-Mutante, welche eine Mutation im katalytischen Zentrum der Protease aufweist (HIV delta-PR, HIVΔPR), eingebracht. Da nur im Wildtyp-HIV- Klon, aber nicht im mutanten HiV-Klon eine Verringerung der Emission beobachtet werden kann, wird deutlich, dass nur die HlV-Protease und nicht ein anderes HIV-Protein den FRET vermindert, d.h. die Reaktion ist spezifisch (FIGUR 3). Der GFP -Nachweis mit anti-GFP-Antikörper im Lysat aus transfizierten 293 -T-Zellen mit GFP-C-LT (FIGUR 4, Spur 1), GFP-C-LT plus HTV delta-PR (HIVΔPR) (FIGUR 4, Spur 2) und GFP-C-LT plus HIV (Wildtyp) verdeutlicht, dass nur in Gegenwart von HIV- Wildtyp, der die funktioneile Protease exprimiert, GFP abgespalten wird. Das Experiment zeigt, dass nur die HIV-PR und kein anderer HIV-Bestandteil den FRET vermindert.
BEISPIEL 4: Modifikation des Protease-Expressionssvstems
Um eine einfach Klonierbarkeit der Protease zu erreichen, wurde der HC-Red-Protease- Vektor so modifiziert, dass er an einer offenen Klonierungsstelle zwei überhängende dTTP-Nukleotide besitzt. Da Taq-Polymerasen dem Amplifikat ein überhängendes dATP anfügen können mit diesem System die PCR-Produkte direkt (ohne Restriktionsverdau) in den Expressions vektor kloniert werden (siehe Figur 5).
BEISPIEL 5: Untersuchung der Nelfinavir Resistenz mit Wildtvp und Protease Mutante 101. 90M
Die PR-Mutationen L10I und L90M erzeugen eine mittlere Resistenz gegen Nelfinavir. Die Fragestellung in diesem Versuch lautete: Kann dieser Unterschied mit dem erfindungsgemäßen System gemessen werden. Dazu wurden Zellen mit den FRET- Vektoren und HIV Wt oder HIV-PR- 101, 90M transfiziert. Das Medium wurde 6 h nach der Transfektion gewechselt und NFV in fallender Konz. zugegeben. FRET wurde 24 h nach der Transfektion gemessen (siehe Figur 6).

Claims

Patentansprüche
1. Proteinhaltige Zusammensetzung, umfassend
(a) ein erstes Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomane A und ein Fluorophor B und
(b) ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor B', dadurch gekennzeichnet, dass A und A' aneinander binden können, und dass zwischen A und B oder zwischen A' und B' die Schnittstelle für eine Protease eingefügt ist.
2. Proteinhaltige Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Schnittstelle die Schnittstelle für eine virale Protease ist.
3. Proteinhaltige Zusammensetzung gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die virale Protease die HlV-Protease ist.
4. Proteinhaltige Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Fluorophore B und B' entweder BFP in Kombination mit
GFP oder CFP in Kombination mit YFP sind.
5. Proteinhaltige Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktionsdomänen A und A' SV40-Large-T-Antigen in Kombination mit p53 sind.
6. Nukleinsäurehaltige Zusammensetzung, umfassend
(a) eine erste Nukleinsäure, die für ein erstes Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A und ein Fluorophor B, kodiert und
(b) eine zweite Nukleinsäure, die für ein zweites Fusionsprotein, enthaltend eine Interaktionsdomäne A' und ein Fluorophor B', kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass die von der Nukleinsäure kodierten Bereiche A und A' aneinander binden können, und dass zwischen den von der Nukleinsäure kodierten Bereichen A und B oder zwischen A' und B' der kodierende Bereich für eine
Proteaseschnittstelle eingefügt ist.
7. Nukleinsäurehaltige Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der kodierende Bereich für die Schnittstelle der HlV-Protease kodiert.
8. Expressionsvektor, der eine nukleinsäurehaltige Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 enthält.
9. Wirtszelle, die einen Expressionsvektor gemäß Anspruch 8 enthält.
10. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Proteins, das von der nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 6 oder 7 kodiert wird, umfassend die Schritte
(a) Einbringen eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 8. in eine pro- oder eukaryontische Wirtszelle,
(b) Kultivierung der transfizierten Wirtszelle, und
(c) Isolierung des rekombinanten Proteins aus der Wirtszelle oder aus dem Kulturmedium.
11. Verfahren zum Nachweis einer Proteaseaktivität, umfassend die folgenden Schritte (a) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer nukleinsäurehaltigen
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, welche den kodierenden Bereich für die Schnittstelle der nachzuweisenden Protease enthält,
(b) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, welche den kodierenden Bereich für die Sclinittstelle der nachzuweisenden Protease enthält, und Transfektion der selben
Zielzelle mit einer für die nachzuweisende Protease kodierenden Nukleinsäure als Positivkontrolle,
(c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a) und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b) und
(d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Protease eine HlV-Protease ist.
13. Diagnostisches Kit zum Nachweis einer Protease, enthaltend eine nukleinsäurehaltige Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, eine für eine Protease kodierende Nukleinsäure, ein Transfektionsreagenz und gegebenenfalls Puffer und Enzyme.
14. Verfahren zur Identifizierung von Proteaseinhibitoren, umfassend die folgenden Schritte
(a) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung gemäß Anspruch 6 oder 7, welche den kodierenden Bereich für die Sclinittstelle der zu inhibierenden Protease enthält, und Transfektion der selben
Zielzelle mit einer für die zu inhibierende Protease kodierenden Nukleinsäure,
(b) Zugabe einer Testsubstanz zu einer Teilpopulation der transfizierten Zielzellen aus
(a),
(c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a) und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b), und
(d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der Zielzellen aus Schritt (a) und aus Schritt (b) und Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte.
15. Verfahren zum Nachweis einer Proteaseschnittstelle, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
(a) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die nachzuweisende Schnittstelle einer bekannten Protease enthält, und Transfektion der selben Zielzelle mit einer für die bekannte Protease kodierenden Nukleinsäure,
(b) Transfektion mindestens einer Zielzelle mit einer erfindungsgemäßen, nukleinsäurehaltigen Zusammensetzung, welche den kodierenden Bereich für A/A', für B/B' und für die bekannte Schnittstelle einer bekannten Protease enthält, und Transfektion der selben Zielzelle mit einer für die bekannte Protease kodierenden Nukleinsäure,
(c) Herstellung eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (a) und eines Zelllysats aus den Zielzellen aus (b) und (d) Messung der Fluoreszenz der Zelllysate aus Schritt (c) der Zielzellen aus Schritt
(a) und aus Schritt (b) und Vergleich der erhaltenen Fluoreszenzwerte.
16. Verfahren zum Nachweis einer Proteaseaktivität, umfassend das Inkontaktbringen einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus Anspruch 1 mit einer nachzuweisenden Protease und Messung der Fluoreszenz.
17. Verfahren zur Identifizierung von Proteaseinhibitoren, umfassend das Inkontaktbringen einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus Anspruch 1 mit einer zu inhibierenden Protease und mit einer Testsubstanz und Messung der Fluoreszenz.
18. Verfahren zum Nachweis einer Proteaseschnittstelle, umfassend das Inkontaktbringen einer proteinhaltigen Zusammensetzung aus Anspruch 1 mit einer bekannten Protease und Messung der Fluoreszenz.
PCT/EP2004/006827 2003-06-25 2004-06-24 In vivo-testsystem zum nachweis von hiv-proteaseaktivität Ceased WO2004113560A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10328775.2 2003-06-25
DE2003128775 DE10328775B4 (de) 2003-06-25 2003-06-25 In vivo-Testsystem zum Nachweis von HIV-Proteaseaktivität

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004113560A1 true WO2004113560A1 (de) 2004-12-29

Family

ID=33521034

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2004/006827 Ceased WO2004113560A1 (de) 2003-06-25 2004-06-24 In vivo-testsystem zum nachweis von hiv-proteaseaktivität

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE10328775B4 (de)
WO (1) WO2004113560A1 (de)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117088988A (zh) * 2023-10-20 2023-11-21 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种融合蛋白、质粒及其在hiv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0877805B1 (de) * 1996-01-31 2002-06-05 The Regents of The University of California Tandem-fluoreszenzproteinkonstrukte
WO2002090987A2 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 Isis Innovation Limited Universal fluorescent sensors

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020110834A1 (en) * 1994-11-04 2002-08-15 Benkovic Stephen J. Fluorescent assay for proteolysis

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0877805B1 (de) * 1996-01-31 2002-06-05 The Regents of The University of California Tandem-fluoreszenzproteinkonstrukte
WO2002090987A2 (en) * 2001-05-10 2002-11-14 Isis Innovation Limited Universal fluorescent sensors

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Alpha-Gal quantitative assay kit. A quantitative kit to assay the strength of protein interactions in two-hybrid analysis", CLONTECHNIQUES, October 1999 (1999-10-01), XP002302302 *
HAZEBROUCK S ET AL: "Local and spatial factors determining HIV-1 protease substrate recognition.", THE BIOCHEMICAL JOURNAL. 1 SEP 2001, vol. 358, no. Pt 2, 1 September 2001 (2001-09-01), pages 505 - 510, XP002302303, ISSN: 0264-6021 *
MAHAJAN N P ET AL: "BCL-2 AND BAX INTERACTIONS IN MITOCHONDRIA PROBED WITH GREEN FLUORESCENT PROTEIN AND FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER", NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, vol. 16, June 1998 (1998-06-01), pages 547 - 552, XP000876894, ISSN: 1087-0156 *
MITRA R D ET AL: "Fluorescence resonance energy transfer between blue-emitting and red-shifted excitation derivatives of the green fluorescent protein", GENE, ELSEVIER BIOMEDICAL PRESS. AMSTERDAM, NL, vol. 173, no. 1, 1996, pages 13 - 17, XP004042847, ISSN: 0378-1119 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117088988A (zh) * 2023-10-20 2023-11-21 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种融合蛋白、质粒及其在hiv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用
CN117088988B (zh) * 2023-10-20 2024-02-06 浙江迪福润丝生物科技有限公司 一种融合蛋白、质粒及其在hiv蛋白酶抑制剂筛选及药效评价中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
DE10328775B4 (de) 2007-01-04
DE10328775A1 (de) 2005-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69033855T2 (de) Modifizierte biolumineszierende proteine und deren verwendung
DE69713059T2 (de) Tandem-fluoreszenzproteinkonstrukte
DE69521219T2 (de) Modifizierte grün fluorszierende proteine
DE60026603T2 (de) Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer(BRET)-System mit großer spektraler Auflösung zwischen der Donator- und der Akzeptoremissionswellenlänge sowie dessen Verwendun
Daniels et al. Expression of multiple transgenes from a single construct using viral 2A peptides in Drosophila
US7094888B2 (en) Hybrid molecules and their use for optically detecting changes in cellular microenvironments
DE69321580T2 (de) Car-rezeptoren und verwandte moleküle und entsprechende methoden
EP1537142B1 (de) Akap18 delta, eine neue spleissvariante eines proteinkinase a-ankerproteins und verwendung dieser
EP1381624B1 (de) Spezifischer nachweis von proteolytischen enzymen mittels eines hybrid-proteins
Gage et al. The virally encoded fungal toxin KP4 specifically blocks L-type voltage-gated calcium channels
DE60307061T2 (de) Verfahren zum nachweis von liganden des leptinrezeptors
DE10328775B4 (de) In vivo-Testsystem zum Nachweis von HIV-Proteaseaktivität
EP1664102B1 (de) Isoliertes photoprotein mtclytin, sowie dessen verwendung
DE60316718T2 (de) Lösliche notch basierte substrate für gamma secretase, methoden, zusammensetzungen und verwendungen davon
WO2004092211A1 (de) Nicht fluoreszierende, durch proteolyse zur fluoreszenz aktivierbare reporterproteine und ihre verwendung zur detektion protease-abhängiger ereignisse
DE69803193T2 (de) Verfahren zum Screenen von Interaktionen zwischen Transkriptionsfaktoren und Koaktivatoren
EP1572732A1 (de) Isoliertes fluoreszierendes protein aus clytia gregaria cgfp, sowie dessen verwendung
DE102015115640B4 (de) Verfahren zum Nachweis von Liganden vermittels Biosensoren
DE69922372T2 (de) Polypeptide aus creb-binding-protein und verwandtem protein p300 für die verwendung bei der transkriptionsregulation
DE10306085A1 (de) Neue Spleißvariante eines Proteinkinase A-Ankerproteins und Verwendung dieser
WO1998003676A1 (de) Verfahren zum nachweis für effektoren intra- und/oder interzellulärer protein-protein-wechselwirkungen
DE60308182T2 (de) Verfahren zum nachweis von allosteren effektoren eines rezeptors
DE19715683C2 (de) Neue Reportervektoren für One-Hybrid und Two-Hybrid Systeme
DE102006026586A1 (de) Fluoreszierende Proteine wfCGFP, sowie deren Verwendung
DE102021005748A1 (de) Replikasekettenreaktion (RCR) und ihre Verwendung in der Diagnose und Behandlung von viralen Erkrankungen

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
122 Ep: pct application non-entry in european phase