WO2004113539A2 - Procede de production d’une proteine recombinante d’interet et proteine produite - Google Patents

Procede de production d’une proteine recombinante d’interet et proteine produite Download PDF

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WO2004113539A2
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integrin
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alpha
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Bernard Mouillac
Tuhnadri Sen
Jean-Louis Baneres
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Inserm
Centre National De La Recherche Scientifique-Cnrs
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    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Definitions

  • the subject of the invention is a new process for producing protein of interest, in large quantity, which can be directly used for structural analyzes.
  • the invention also relates to the recombinant protein obtained.
  • the receptors coupled to G proteins constitute a super-family of membrane proteins characterized by 7 transmembrane domains (TM I to VII) which play a primordial role in intercellular communication and the reception of sensory signals [1].
  • RCPGs constitute the most important structural and functional family of membrane receptors. They represent in particular a significant part of the human genome known to date (at least 700 receptors, 0.5% of the genome). Expressed on the surface of all cells in an organism (from yeast to humans), they are activated by a very wide variety of extracellular messages.
  • peptides peptides, hormones, lipids, odorous molecules, light, nucleotides, nucleosides, taste molecules, etc.
  • Their activation leads to an intracellular cascade of signals via G proteins and results in a large number of cellular responses (for example cell division or contraction, neurotransmission).
  • RCPGs are involved in each physiological function.
  • the importance of these receptors as well as the knowledge of their cellular localization designates them as ideal targets for therapy. And indeed, we can estimate that almost 50% of the drugs on the market act via GPCRs.
  • GPCRs Many pathologies are the consequence of mutations in GPCRs, and their clinical manifestations are well known, we can cite for example blindness, nephrogenic diabetes insipidus, hypo- or hyperthyroidism, precocious puberty, obesity [2].
  • GPCRs are very difficult for various reasons: the transmembrane nature of these proteins and their hydrophobic nature make them difficult to handle and generally lead to a loss of functionality and to denaturation after solubilization; - obtaining them in their entire primary sequence remains very difficult. Most of the time, they are expressed in truncated form [5].
  • the RCPGs represent in this area of the production in large quantity of a protein only one example of the difficulties which one meets when it is a question of obtaining a significant quantity of a protein of interest.
  • the object of the present invention is to provide a method for producing a large quantity of a protein of interest, in particular RCPGs.
  • recombinant proteins particularly membrane proteins, very particularly RCPGs, comprising at least one fragment of an alpha integrin and the protein of interest
  • This strategy makes it possible in particular to obtain a production of said proteins in large quantities in microorganisms, particularly in bacteria.
  • the recombinant proteins of the invention are produced in bacteria, they accumulate in the inclusion bodies of the bacterial cytoplasm. It is then necessary to renaturate the proteins of interest in order to obtain them in active form in an amount compatible with a direct analysis of their structure, for example by X-ray crystallography or by nuclear magnetic resonance (NMR).
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • the process of the invention can also allow the production of non-truncated proteins, particularly when applied to GPCRs.
  • Integrins form a family of structurally and functionally linked receptors that participate in cell-cell and cell-extracellular matrix interactions. All integrins are in the form of heterodimers of alpha and beta subunits, linked non-covalently. Based on their primary sequence, all alpha integrins have an N-terminal region made up of seven repeated amino acid sequences (repeat I to VII), each comprising approximately 60 amino acids. Some alpha subunits include an insertion domain (domain-I) of approximately 200 amino acids, located between repetitions II and III.
  • the homologies between repetitions I and VII essentially comprise consensus sequences FG and GAP, corresponding to the phenylalanine, glycyl-glycyl, alanyl, prolyl sequences, hence their name "FG-GAP repeat”.
  • the alpha subunit of integrins (also called integrin alpha (integrin ⁇ ) in the text) has never been used for the production of recombinant proteins of interest in cells other than cells of mammals and this in an amount directly compatible with a structural analysis of the protein of interest, which requires an amount of said protein which can range up to several milligrams.
  • the present invention aims to meet this requirement.
  • the primary object of the invention is the use of at least one fragment of an alpha integrin in the construction of at least one recombinant protein of interest.
  • the invention also relates to the use of at least one fragment of an alpha integrin for the production of at least one recombinant protein of interest.
  • recombinant protein or “recombinant protein of interest” refers to the recombinant protein produced according to the invention.
  • This recombinant protein can in particular comprise the chain of several (at least two) proteins of interest, fused, optionally separated by spacer sequences and / or cleavage sequences.
  • protein of interest refers to the peptide sequence corresponding to a protein of interest that one wants to produce (or that one has produced).
  • a "recombinant protein” consists of one or more "protein of interest” possibly separated by spacer sequences and / or cleavage sequences.
  • fragment of an alpha integrin is meant both the complete amino acid sequence of the alpha integrin used and a partial sequence.
  • the sequence of the integrin alpha used can be native or mutated.
  • the sequence used is a sequence comprising the N-terminal end of the alpha integrin used, even more preferably a sequence corresponding to the N-terminal end of the alpha integrin used.
  • the fragment of the alpha integrin used comprises at least the FG-GAP modules IV to VII and a portion of the FG-GAP III module of the alpha integrin used.
  • the fragment of the alpha integrin used can be a fragment of any known alpha integrin. Particular mention will be made of the integrins al, ⁇ 2, ⁇ 3, ⁇ 4, 5, 6, al, ⁇ , ⁇ 9, iO, garlic, ⁇ D, ⁇ E, ⁇ L, ⁇ M, ⁇ X, ⁇ llb or even ⁇ v.
  • a fragment of 287 amino acids is used, corresponding to the part of the N-terminal end of the alpha 5 integrin which extends between positions 231 and 517, depending on the numbering taking into account the presence of the signal peptide. If the signal peptide is not taken into account, the fragment which can be used in the invention extends from positions 190 (residue G) to 476 (residue G) of the alpha5 integrin.
  • the fragments which can be used according to the invention are the fragments homologous to the fragments defined above.
  • the fragment which can be used according to the invention corresponds to the part of the N-terminal end of the ⁇ V integrin which extends from positions 211
  • the fragment which can be used in the invention extends from positions 181 (residue G) to 465
  • the fragment usable according to the invention corresponds to the part of the N-terminal end of integrin ⁇ llb which extends from positions 224 (residue G) to 508 (residue Q), according to the numbering account for the presence of the signal peptide. If the signal peptide is not taken into account, the fragment which can be used in the invention extends from positions 193 (residue G) to 477 (residue Q) of the ⁇ 11b integrin.
  • the fragment of the alpha integrin used comprises at least one amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 1 (fragment of the human integrin ⁇ £), SEQ ID No. 2 (fragment of human integrin V) and SEQ ID No. 3 (fragment of human ⁇ 11b integrin), from the sequence list provided in the appendix.
  • the fragment of the alpha integrin used comprises at least one amino acid sequence coded by one of the nucleotide sequences, chosen from the sequences SEQ ID No. 4 (fragment of 1 ' human integrin ⁇ 5), SEQ ID N ° 5 (fragment of human integrin V) and SEQ ID N ° 6 (fragment of human integrin ⁇ llb), from the sequence list provided in the appendix.
  • the fragment of the alpha integrin is used in the construction of several (at least two) proteins of recombinant interest.
  • the recombinant proteins will be fused during translation. This may prove necessary in the case of a protein of interest for which the construction according to the invention does not allow its direct production (refractory protein). It is then necessary to couple in tandem the sequence of said refractory protein to a recombinant protein of interest which the constructs according to the invention make it possible to produce.
  • the construction according to the invention will comprise at least one DNA fragment coding for at least one fragment of an alpha integrin, then at least one DNA coding for at least one first recombinant protein. of interest and at least one DNA encoding at least one second recombinant protein of interest.
  • the DNA encoding the second protein of interest will be inserted into the phase construction downstream of the DNA sequence encoding the first protein of interest.
  • the integrin alpha fragment is located in the recombinant protein of interest prepared according to the invention, upstream of the sequence of the protein of interest (or sequences of the proteins of interest) that the 'We aim to produce, that is to say on the N-terminal side of the recombinant protein of interest (or recombinant proteins of interest) that we seek to construct and / or produce.
  • the subject of the invention is also a recombinant protein characterized in that it comprises, fused, at least one fragment of an alpha integrin as defined above and at least one protein of interest.
  • the protein (s) of interest, part (s) of the recombinant protein of the invention can be any protein that it is desired to produce, particularly a membrane protein, very particularly a receptor coupled to proteins G (RCPGs).
  • vasopressin and oxytocin receptors Via, V2, OTR
  • BLT1, BLT2, CysLTl, CysLT2 leukotriene receptors
  • BLT1 leukotriene receptors
  • BLT2 CysLTl
  • CysLT2 adrenergic receptors
  • Beta 3 canabinoid receptors
  • CB1 canabinoid receptors
  • CCR5 chemokine receptors
  • ATI receptor for angiotensin II the bradykinin B2 receptor.
  • the recombinant protein of the invention can also comprise any amino acid sequence which makes it possible to purify it in an easy manner.
  • the recombinant protein can comprise a sequence of 6 histidine residues (tag 6xHIS).
  • This 6xHIS tag can be incorporated into the protein sequence for purification on a column of Ni-NTA (Nickel-nitrilotriacetic acid) agarose.
  • this sequence is at the C-terminal end of the recombinant protein of the invention.
  • the 6xHIS tag is preferably located downstream of the last of the proteins of interest which it is sought to produce.
  • sequence encoding the recombinant protein may further comprise at least one sequence encoding at least one endoprotease cleavage site.
  • the sequence coding for the last integrin residues can be mutated to constitute a cleavage site for an endoprotease (factor Xa, thrombin), which will allow, after expression and purification of the recombinant protein, to separate the protein of interest from its fusion partner.
  • the residue L (position 285) can be modified by mutation into a residue I, the residues E and G (positions 286 and 287) being preserved.
  • An additional R residue can be introduced by mutagenesis.
  • the sequence thus constituted (IEGR) corresponds to the cleavage site by factor Xa which cuts the protein after the residue R.
  • the cleavage site for factor Xa can be transformed into a cleavage site at the thrombin.
  • the residues I, E, and G can be replaced by residues L, V and P.
  • the residue R is kept in order to obtain the LVPR sequence.
  • the integrin fragment was incorporated into the 3 '' side vector by a BamHI site (ggatcc sequence)
  • the ggatcc sequence coding for two residues G and S is therefore obtained just after LVPR.
  • the LVPRGS chain constitutes the thrombin cleavage site, which cuts the protein after the residue R.
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its end C-Terminal, the alpha integrin fragment comprising the endoprotease cleavage site, the protein (s) of interest and the tag 6xHIS.
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, the fragment of alpha integrin comprising the site of cleavage by factor Xa, the protein (s) ( s) of interest and the 6xHIS tag.
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, the fragment of alpha integrin comprising the site of cleavage by the thrombin, the protein (s) of interest and the 6xHIS tag.
  • the recombinant protein according to the invention comprises more than one protein of interest fused together, that said proteins of interest can be separated after their synthesis, for example before purification.
  • the recombinant protein may be necessary to make the cleavage of the recombinant protein even more efficient.
  • a sequence encoding a peptide sequence serving as a spacer arm preferably located upstream of the site of cleavage by an endoprotease.
  • the recombinant protein further comprises a peptide sequence serving as a spacer arm, preferably located upstream of the site of cleavage by an endoprotease.
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, the fragment of alpha integrin comprising a spacer arm and the site of cleavage by an endoprotease. , the protein (s) of interest and the 6xHIS tag.
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, the fragment of alpha integrin comprising a spacer arm, the site of cleavage by the factor Xa, the protein (s) of interest and the 6xHIS tag.
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, the alpha integrin fragment comprising a spacer arm, the site of cleavage by thrombin, the (or the) protein (s) of interest and the 6xHIS tag.
  • sequence coding for a peptide sequence serving as a spacer arm can be any sequence known to those skilled in the art allowing sufficient spacing of the site of cleavage by an endoprotease and the protein (s) of interest for the cleavage of the recombinant protein to be effective.
  • sequence coding for a peptide sequence serving as a spacer arm is the following sequence SEQ ID No. 7:
  • the recombinant protein of the invention comprises, from its N-terminal end to its C-terminal end, the fragment of alpha integrin comprising a spacer arm and the site of cleavage by an endoprotease, the protein (s) of interest, separated by one or more endoprotease cleavage sites (for example factor Xa or thrombin) and the tag 6xHIS.
  • Another subject of the invention is the use of at least one fragment of a nucleotide sequence coding for at least one fragment of an alpha integrin as defined above, in the construction of a sequence nucleotides encoding a recombinant protein of interest, as defined above.
  • the subject of the invention is also the use of at least one fragment of a nucleotide sequence coding for at least one fragment of an alpha integrin as defined above, for the production of a recombinant protein of interest such as defined above.
  • the subject of the invention is also a nucleotide sequence coding for a recombinant protein of interest comprising at least one fragment of a nucleotide sequence coding for at least one fragment of an alpha integrin, as defined above, and a nucleotide sequence coding for at least one protein of interest, as defined above.
  • the nucleotide sequence coding for at least one fragment of an alpha integrin usable according to the invention or included in the nucleotide sequence coding for a recombinant protein of interest according to the invention can be chosen from the nucleotide sequences SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5 and SEQ ID No. 6, from the sequence list provided in the appendix.
  • the subject of the invention is also a vector comprising a nucleotide sequence coding for a recombinant protein of interest, as defined above, comprising at least one fragment of a nucleotide sequence coding for at least one fragment of an alpha integrin and a nucleotide sequence encoding at least one protein of interest.
  • the vector can be a eukaryotic vector such as a plasmid or a virus.
  • the vector can also be any prokaryotic vector such as a plasmid or a phage.
  • the vector is an expression vector, that is to say capable of allowing the transcription and the translation of the sequence into nucleotides which it contains.
  • the vectors of the pET family sold by the company Novagen or those of the pGEX family sold by the company AmershamBiosciences are examples of expression vectors.
  • the invention also relates to a cell into which a nucleotide sequence coding for a recombinant protein of interest, as defined above, has been introduced.
  • the sequence was introduced in the form of a vector as defined above.
  • cell By cell is meant here both a eukaryotic cell and a prokaryotic cell, particularly a bacterium.
  • Any bacterium capable of allowing the expression of a protein from a nucleotide sequence can be used according to the invention.
  • the subject of the invention is also a method for producing at least one protein of interest, characterized in that in a first step, a nucleotide sequence coding for a recombinant protein of interest as defined above is introduced into a cell. , and that in a second step, the cell is placed in conditions sufficient to allow the expression of the recombinant protein of interest.
  • the method of the invention can also comprise an additional step during which the recombinant protein of interest can be cut by the action of an endoprotease (factor Xa, thrombin, for example), at the site created in the last residues integrin to separate the protein of interest from its fusion partner.
  • an endoprotease factor Xa, thrombin, for example
  • the method of the invention may also include an additional step during which the protein recombinant of interest, or the protein (s) of interest separated from its fusion partner (s), can be purified.
  • the nucleotide sequence coding for a recombinant protein of interest can be introduced into the cell by any known method.
  • any known method it is possible to cite for prokaryotic cells, thermal shock or electroporation.
  • electroporation the calcium phosphate precipitate method, the use of cationic polymers such as DEAE-dextran or any method using cationic liposomes or activated dendrimers.
  • Retroviruses can also be used to transfer genes, as can techniques using microprojectiles to deliver DNA to target cells.
  • any sufficient condition allowing the expression of the recombinant protein of interest known to those skilled in the art, can be used according to the method of the invention.
  • any method of purification of the protein (s), known to those skilled in the art, can be used according to the method of the invention.
  • the recombinant protein of interest comprises the tag 6xHIS
  • purification on a Nickel-nitrilotriacetic acid agarose (Ni-NTA) column represents a particularly satisfactory purification method within the framework of the process of the invention.
  • Ni-NTA Nickel-nitrilotriacetic acid agarose
  • Figure 1 shows a construction corresponding to a vector according to the invention.
  • FIG. 2 represents the production of the integrin fusion protein ⁇ 5-vasopressin receptor V2 according to the method of the invention (left column: molecular weights of proteins in the marker sample; arrow: position of the recombinant protein integrin ⁇ 5 - V2 receptor for vasopressin, NI: proteins from an uninduced sample, 2h, 3h and 4h: proteins from an induced sample after 2h, 3h and 4h of induction).
  • FIG. 3 represents the recombinant integrin protein ⁇ 5-V2 receptor for vasopressin of FIG. 2 after purification and migration on an electrophoresis gel.
  • left column molecular weights of proteins in the marker sample;
  • arrow position of the recombinant protein integrin ⁇ 5-vasopressin receptor V2
  • FIG. 4 represents the result of the purification of the recombinant fusion protein integrin ⁇ 5-V2 receptor-CXCR4 receptor ( ⁇ 5-V2-CXCR4) by affinity chromatography
  • FT sample not retained on the resin : wash fraction containing 15 mM imidazole
  • E100 purified fusion eluted in buffer containing 100 mM imidazole
  • the arrow indicates the position of the fusion protein ⁇ 5-V2-CXCR4.
  • Example 1 Construction of a vector allowing the expression in bacteria of a recombinant protein of interest:
  • a complementary DNA coding for the protein of interest which it is desired to express is positioned in the vector pET21a (+) (sold by the company Novagen) in phase with a DNA fragment complementary to the integrin ⁇ 5, by the use of appropriate restriction sites.
  • the fragment of the ⁇ 5 integrin is delimited by the NdeI and BamHI sites.
  • the Ndel site has the advantage of incorporating an ATG codon which is the codon initiating translation. This initiator codon codes for a methionine (M).
  • M methionine
  • the ATG of the NdeI site is positioned upstream of its nucleotide sequence.
  • the ATG will code for an M1 and the G of the integrin will be residue 2.
  • the fragment of 287 residues will be coupled to methionine 1 and therefore a fusion partner of 288 residues is obtained: M1-G288.
  • the vector directly provides the sequence coding for the tag 6xHIS which will be located at the C-terminal end of the recombinant protein of interest.
  • An EcoRI site is located in the vector on the side of the N-terminal end of the tag site.
  • Example 2 Expression of the human vasopressin V2 receptor: Construction of the vector:
  • Step 1 Preparation of the complementary DNA of the human vasopressin V2 receptor:
  • oligo sense (allows the incorporation of the BamHI site): 5 'ATG GGT CGC GGA TCC ATG CTC ATG GCG TCC ACC ACT TCC 3' oligo antisense (allows the incorporation of the EcoRI site) : 5 'CGA CGG AAT TCT GCG ATG AAG TGT CCT TGG CCA G 3'.
  • the PCR reaction is carried out in 50 microliters of a reaction mixture comprising:
  • amplified fragment is checked on 1% agarose gel.
  • Step 2 Purification of the amplified fragment (amplified PCR V2 fragment): The area of the agarose gel where the amplified DNA fragment is viewed is cut out and 1 ⁇ DNc is purified using the Qiaquick gel extraction purification kit kit
  • Step 3 Cutting of the PCR V2 fragment amplified by the BamHI and EcoRI enzymes:
  • the two enzymes are inactivated by heating to 80 ° C. for 20 minutes.
  • the PCR V2 fragment is then purified from a 1% agarose gel according to the protocol described above.
  • Step 3 Subcloning of the PCR V2 Fragment Amplified in the BamHI and EcoRI Sites of the Vector pET21a of Example 1:
  • the ligation is carried out by incubation at room temperature (20-25 ° C) for 4 hours in a medium comprising: PCR fragment V2 BamHI / EcoRI (100 to 200 ng) 8 ⁇ l vector pET21a (30 ng) cut with BamHI / EcoRI 3 .mu.l
  • the ligation product, integrin-human V2 vasopressin receptor fusion protein, is then used for a transformation of Rosetta bacteria (DE3) in order to carry out the receptor expression tests.
  • the vector obtained previously is then introduced into a Rosetta strain bacterium (DE3) by the thermal shock technique by following the transformation protocol recommended by the supplier, in this case Novagen.
  • the incubation medium is then spread on petri dishes containing LB agar medium + ampicillin at 100 micrograms / ml.
  • the dishes are incubated at 37 ° C for 16 hours.
  • the bacteria of a colony are then cultivated at 37 ° C. in 10 ml of LB medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin (or its analogous to carbenicillin), and the cell suspension is stirred at 300 revolutions / minute.
  • Samples are taken 2, 3 or 4 hours after induction. For this, 1 ml of bacterial suspension, with an optical density of 0.6, is taken from each culture. The sample is centrifuged for 2 minutes at 12,000 rpm. The supernatant is removed and the pellet is resuspended in 60 ⁇ l of lysis buffer (25 mM Tris, pH 8.3, 185 mM glycine, 0.1% SDS).
  • lysis buffer 25 mM Tris, pH 8.3, 185 mM glycine, 0.1% SDS.
  • SDS deposition buffer (10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 25 mM Tris-HCl, pH 6.5, 8% SDS, bromophenol blue (some grains)
  • 10 ⁇ l of l 'lysed sample total protein extracts
  • 10 ⁇ l of l 'lysed sample total protein extracts
  • they are stained with Coomassie blue according to the usual techniques.
  • Figure 2 shows the results obtained. Induced samples are compared to controls not induced (NI) but having been cultured for an equivalent time. It is obvious that the fusion protein ⁇ 5-receptor V2, which has an apparent molecular weight around 65 kDa, constitutes one of the majority proteins of the bacterium, which is a condition required for a purification of the receptor in an amount compatible with analyzes of its structure via crystallography or NMR approaches.
  • Example 2 The result obtained in Example 2 was reproduced with the same efficiency, for other RCPGs, such as the ⁇ 3-adrenergic receptor, the BLT2, Cys-LTl and Cys-LT2 receptors of the leukotrienes LTB4, LTD4 and LTC, the cannabinoid type 1 receptor, the vasopressin receptor Via and the oxytocin receptor.
  • other RCPGs such as the ⁇ 3-adrenergic receptor, the BLT2, Cys-LTl and Cys-LT2 receptors of the leukotrienes LTB4, LTD4 and LTC, the cannabinoid type 1 receptor, the vasopressin receptor Via and the oxytocin receptor.
  • Example 4 Purification of the fusion protein integrin fragment ⁇ 5-vasopressin V2 receptor obtained in Example 2:
  • a colony isolated on LB agar + Ampicillin (100 ⁇ g / ml) is pricked and cultured in 10 ml of LB + carbenicillin culture medium (100 ⁇ g / ml).
  • the culture is carried out at 37 ° C., with stirring at 300 rpm.
  • the optical density of the culture reaches 0.6, the culture is stopped and stored in the refrigerator (this sample is called preculture).
  • 100 ml of LB culture medium + carbenicillin (100 ⁇ g / ml) are seeded with 2 ml of preculture and left at 37 ° C., at 300 rpm until the density culture optics reached 0.6.
  • 0.1 mM IPTG are then added to the culture in order to induce the expression of recombinant protein.
  • the culture is continued for approximately 3 hours, until an optical density of 2.4 is obtained (stimulation factor of 4).
  • the culture is then centrifuged at 4000 revolutions per minute for 5 minutes.
  • the supernatant is removed and the residue can be directly lysed or stored at -80 ° C.
  • the pellet is taken up by homogenization with a pipette in 6 ml of 20 mM Tris-HCl, pH 8.00 + protease inhibitors (leupeptin 5 ⁇ g / ml; benzamidine 10 ⁇ g / ml and PMSF 10 ⁇ g / ml) .
  • protease inhibitors leupeptin 5 ⁇ g / ml; benzamidine 10 ⁇ g / ml and PMSF 10 ⁇ g / ml
  • the bacteria are lysed by sonication using a Branson conical microprobe (duty cycle 50%, output control 5, frequency 1 burst per second for 30 seconds, then rest 30 seconds; this cycle is repeated 5 times).
  • the tube is kept in ice during sonication.
  • the medium is then centrifuged for 30 minutes at 15,000 rpm at 4 ° C. The supernatant is retained for control over one gel electrophoresis.
  • the pellet contains the protein of interest since it is accumulated in inclusion bodies.
  • the pellet is taken up by homogenization with a pipette in 5 ml of 20 mM Tris-HCl, pH 8.00. The lysis and centrifugation steps are repeated once.
  • the supernatants of the centrifugations are kept for control on an electrophoresis gel.
  • the pellet is taken up by homogenization with a pipette in 5 ml of Tris-HCl, pH 8.00, 1M urea. A magnetic bar is placed in the sample and the latter is stirred gently for 1 h 30 min. The tube is kept in ice during this step which corresponds to washing the inclusion bodies and makes it possible to eliminate membrane or cytoplasmic proteins associated with the inclusion bodies but which are considered to be contaminating with respect to the recombinant protein.
  • the whole is then centrifuged at 15,000 revolutions per minute for 30 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant is kept for control on an electrophoresis gel.
  • the pellet is taken up by homogenization with a pipette in 5 ml of 20 mM Tris-HCl, pH 8.00, 6M urea, 0.2% SDS. A magnetic bar is placed in the sample and the latter is stirred gently for 3 hours in ice.
  • the protein of interest (the integrin fragment protein ⁇ 5-vasopressin V2 receptor) is then completely denatured.
  • the whole is then centrifuged at 15,000 revolutions per minute for 30 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant contains the protein of interest and constitutes the sample which will be brought into contact with the Ni-NTA resin (Nickel-nitriloacetic acid) in order to purify the alpha5-V2 fusion by affinity chromatography.
  • Ni-NTA resin Nickel-nitriloacetic acid
  • 3 ml of Superflow agarose Ni-NTA resin (Qiagen, ref 30430) are balanced in 20 mM Tris-HCl, pH 8.00, 6M urea, 0.2% SDS, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole. A sufficient amount of NaCl and imidazole is added to the sample containing the protein of interest to obtain a final concentration of 150 mM NaCl and 5 mM imidazole. The sample and the resin are brought into contact and incubated at 4 ° C. for 16 hours and with gentle shaking. The sample / resin mixture is placed in a plastic column. After decantation, the "flowthrough" fraction is recovered at a low flow rate, for checking on electrophoresis gel.
  • the resin is then washed with 3 x 9 ml of a 20 mM Tris-HCl solution, pH 8.00, 6M urea, 0.2% SDS, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole, to remove all the proteins not retained. specifically on Nickel groups.
  • the washing eluates are kept for control on an electrophoresis gel.
  • the protein of interest is then detached from the resin by passing 3 ml of a 20 mM Tris-HCl solution pH 8.00, 6M urea, 0.2% SDS, 150 mM NaCl, 100 mM imidazole. An aliquot of the purified protein is stored for control on gel electrophoresis 1.
  • 10 ⁇ l of the medium containing the purified protein are mixed with 10 ⁇ l of SDS deposition buffer and the whole is deposited on an electrophoresis gel.
  • 10 ⁇ l of purified sample contain 5 to 10 ⁇ g of protein, ie in 3 ml of eluate, 1.5 to 3 mg of recombinant protein.
  • FIG. 3 shows the purified protein deposited on an electrophoresis gel.
  • the purified sample is dialyzed against a 20 mM Tris-HCl solution, pH 8.00, 6M urea, 150 mM NaCl to remove the SDS and imidazole.
  • the sample is placed in a Pierce dialysis cassette (M CO membrane of 10,000) and the dialysis is carried out in a beaker containing one liter of the buffer. Dialysis is carried out at 4 ° C for at least 24 hours.
  • the sample is recovered and the quantity of protein of interest obtained is measured by absorption measurement (excitation at 280 nM, absorption between 235 and 500 nM). In general, an OD of 1 to 1.5 is obtained, which is equivalent to a concentration of 0.5 to 1 mg / ml, which is equivalent to a concentration of the order of 10 ⁇ M.
  • the purified and denatured protein (because dissolved in 6M urea) is used for the renaturation tests.
  • Example 5 Construction of a vector allowing the simultaneous expression of two proteins of interest (here two RCPGs) in Escherichia coli and their purification.
  • a complementary DNA coding for a protein of interest in this case the human CXCR4 chemokine receptor, is inserted into the vector pET21a (+) - ⁇ 5V2 described previously in example 2.
  • This DNA must be in phase with that coding for the ⁇ 5V2 fusion and is positioned between the SacI and HindIII restriction sites for example.
  • the vector directly provides the sequence coding for the tag 6xHIS which will therefore be located at the C-terminal end of the CXCR4 receptor and will therefore allow its purification in a later step.
  • Step 1 Preparation of the DNA complementary to the human CXCR4 receptor.
  • Recognition sites for the restriction enzymes SacI and HindIII are added to either side of the sequence coding for the human CXCR4 receptor during a standard PCR reaction.
  • the complementary DNA of this receptor is amplified from the vector pET10 / D-TOPO (Invitrogen) in which it is subcloned and from two priming oligonucleotides making it possible to insert the restriction sites considered. Oligo sens (incorporation of the Sacl site): 5 'CGAGCTAAGGC GAGCTC A ATGGAAGGCATTAGCATTTATAC 3'
  • Oligo antisense incorporation of the HindIII site: 5 'CGACGGCCC AAGCTT GCTGCTATGAAAGCTGCTGCTTTC 3'
  • the PCR reaction is carried out in 50 microliters and is composed of: pET10 / D-TOPO 20 ng
  • the reaction parameters are: initial denaturation at 95 ° C for 2 minutes then 25 cycles: 95 ° C, 30 s; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1.5 min then final elongation at 72 ° C, 10 min.
  • the presence of the amplified fragment is verified on 1% agarose gel.
  • Step 2 purification of the amplified fragment
  • the area of the agarose gel in which the amplified DNA fragment is viewed is cut out and the cDNA is purified using the Qiaquick gel extraction purification kit.
  • Step 3 cutting of the CXCR4 PCR fragment amplified by Sacl and HindIII
  • the PCR fragment amplified and cut with SacI is purified from an agarose gel according to the protocol described in step 2.
  • the PCR fragment amplified and cut with SacI / HindIII is purified from an agarose gel according to the protocol described in step 2.
  • Step 4 subcloning of the amplified and cut SacI / HindIII PCR fragment CXCR4 in the vector pET21a (+) - ⁇ 5V2. This step is carried out by ligation at room temperature for 16H00.
  • the vector obtained which codes for a triple integrin-V2 receptor-CXCR4 receptor fusion protein is then used for a transformation of the Rosetta bacteria (DE3) in order to express this fusion and to purify it.
  • Step 5 transformation of Rosetta bacteria.
  • Step 6 expression of the ⁇ 5V2-CXCR4 fusion
  • the LB culture medium is replaced by Hyperbroth medium (Athena Enzyme Systems) and the optimum induction time is 4 hours .
  • Step 7 purification of the ⁇ 5V2-CXCR4 fusion. This step is illustrated in Figure 4.
  • Example 4 Following the protocol of Example 4 to the letter but during the washing step of the agarose Ni-NTA resin, a concentration of 15 mM of imidazole instead of 20 mM is used in the washing solution. The elution is carried out at 100 mM as in Example 4.
  • the spacer arm can also be inserted upstream of the thrombin cleavage site just after the site

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Abstract

L'invention est relative à un nouveau procédé de production de protéine d'intérêt, en grande quantité, directement utilisable pour des analyses structurales. L'invention concerne également la protéine recombinante obtenue, la séquence en nucléotides codant pour la protéine recombinante, des vecteurs contenant la séquence en nucléotides, des cellules contenant ladite séquence ou ledit vecteur.

Description

Procédé de production d'une protéine recombinante d'intérêt et protéine produite.
L'invention a pour objet un nouveau procédé de production de protéine d'intérêt, en grande quantité, directement utilisable pour des analyses structurales.
L'invention concerne également la protéine recombinante obtenue .
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent une super-famille de protéines membranaires caractérisées par 7 domaines transmembranaires (TM I à VII) qui jouent un rôle primordial dans la communication intercellulaire et la réception des signaux sensoriels [1] .
Avec plusieurs centaines de membres identifiés, les RCPGs constituent la famille structurale et fonctionnelle de récepteurs membranaires la plus importante. Ils représentent notamment une part significative du génome humain connu à ce jour (au moins 700 récepteurs, 0.5 % du génome) . Exprimés à la surface de toutes les cellules d'un organisme (de la levure à l'homme), ils sont activés par une très grande variété de messages extracellulaires
(peptides, hormones, lipides, molécules odorantes, lumière, nucléotides, nucléosides, molécules du goût, etc...). Leur activation entraîne une cascade intracellulaire de signaux par l'intermédiaire de protéines G et résulte en un grand nombre de réponses cellulaires (par exemple division ou contraction cellulaire, neurotransmission) .
De façon générale, les RCPGs sont impliqués dans chaque fonction physiologique. L'importance de ces récepteurs ainsi que la connaissance de leur localisation cellulaire les désigne comme des cibles idéales de la thérapeutique. Et effectivement, on peut estimer que près de 50% des médicaments sur le marché agissent via les RCPGs. Beaucoup de pathologies sont la conséquence de mutations des RCPGs, et leurs manifestations cliniques sont bien connues, on peut citer par exemple cécité, diabète insipide néphrogénique, hypo- ou hyperthyroïdisme, puberté précoce, obésité [2] .
La découverte que certains récepteurs des chémokines sont des cofacteurs de l'infection par le virus HIV renforce l'idée que les RCPGs sont impliqués dans une grande variété de situations pathologiques [3] . Ces considérations générales indiquent clairement la nécessité d'étudier l'architecture fonctionnelle de ces récepteurs, afin de mieux comprendre le processus de transduction du signal et la dynamique de leurs interactions avec diverses molécules (ligands ou partenaires intracellulaires) , ainsi que pour développer de nouveaux outils pharmacologiques et thérapeutiques. Cependant, l'étude de l'architecture fonctionnelle des RCPGs par les méthodes expérimentales « directes » (cristallographie aux rayons X, RMN, spectrométrie de masse) reste encore très limitée. Une seule structure tridimensionnelle (3D) est actuellement connue, celle de la rhodopsine de bœuf [4] , du fait du très fort niveau d'expression naturel de ce récepteur dans la rétine. La connaissance de leur architecture fonctionnelle est donc abordée actuellement par un faisceau de méthodes théoriques (modélisation), physico- chimiques (photomarquage, fluorescence) et biologiques (mutagénèse dirigée, pharmacologie moléculaire, knock-out, etc...).
Ces études représentent un enjeu industriel et socio- économique de première importance, compte tenu des applications thérapeutiques potentielles.
Cependant l'étude structurale et fonctionnelle des RCPGs est très difficile pour diverses raisons : la nature transmembranaire de ces protéines et leur caractère hydrophobe rendent leur manipulation délicate et conduisent en général à une perte de la fonctionnalité et à une dénaturation après solubilisation ; - les obtenir dans la totalité de leur séquence primaire reste très difficile. La plupart du temps, ils sont exprimés sous forme tronquée [5] . ils sont exprimés en quantité très faible (0.01% des protéines membranaires) ce qui constitue un blocage à leur purification en grande quantité ; leur poids moléculaire est élevé (supérieur à 40 kD) , et ils sont caractérisés par la présence de modifications post-traductionnelles (glycosylation, palmitoylation, phosphorylation) et de traits structuraux particuliers (ponts disulfure) ; ce sont des protéines multifonctionnelles possédant des domaines avec des rôles différents : liaison des ligands, activation des protéines G, sites allostériques, zones impliquées dans leur régulation / désensibilisation On comprend aisément que l'étape critique qui constitue actuellement un réel blocage est certainement celle de l'obtention des RCPGs en des quantités compatibles avec les approches de biologie structurale « directes » .
Jusqu'à présent, aucune stratégie de production en grande quantité, generalisable à tous les RCPGs, permettant en outre leur purification sous forme fonctionnelle d'une manière simple, n'a été mise au point. Ponctuellement, certains récepteurs ont été produits en quantité élevée
(mg/1 de culture) [6-8] , mais les méthodes mises en place ne s'appliquent pas à une majorité de RCPGs.
Les RCPGs ne représentent dans ce domaine de la production en grande quantité d'une protéine qu'un exemple des difficultés que l'on rencontre lorsqu'il s'agit d'obtenir une quantité importante d'une protéine d'intérêt. La présente invention a pour but de fournir un procédé de production en grande quantité d'une protéine d'intérêt, particulièrement des RCPGs.
Les inventeurs ont de manière surprenante, montré que la construction de protéines recombinantes, particulièrement de protéines membranaires, très particulièrement de RCPGs, comprenant au moins un fragment d'une intégrine alpha et la protéine d'intérêt, permet d'obtenir des protéines recombinantes pouvant être exprimées en grande quantité. Cette stratégie permet en particulier d'obtenir une production desdites protéine en grande quantité dans des microorganismes, particulièrement dans des bactéries . Lorsque les protéines recombinantes de l'invention sont produites dans des bactéries, elle s'accumulent dans les corps d'inclusion du cytoplasme bactérien. Il est alors nécessaire de renaturer les protéines d'intérêt pour les obtenir sous forme active en une quantité compatible avec une analyse directe de leur structure par exemple par cristallographie aux rayons X ou par résonance magnétique nucléaire (RMN) . Le procédé de l'invention peut permettre en outre la production de protéines non tronquées, particulièrement lorsqu'il est appliqué aux RCPGs.
Les integrines forment une famille de récepteurs liés structurellement et fonctionnellement qui participent aux interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire. Toutes les integrines se présentent sous forme d' hétérodimères de sous-unités alpha et bêta, liées de manière non covalente. Sur la base de leur séquence primaire, toutes les integrines alpha présentent une région N-terminale constituée de sept séquences en acides aminés répétées (répétition I à VII), chacune comprenant approximativement 60 acides aminés. Certaines sous-unités alpha incluent un domaine d'insertion (domaine-I) d'environ 200 acides aminés, situé entre les répétitions II et III. Les homologies entre les répétitions I et VII comprennent essentiellement des séquences consensus FG et GAP, correspondant aux enchaînements phenylalanine, glycyl- glycyl, alanyl, prolyl, d'où leur dénomination « répétition FG-GAP ».
A la connaissance des inventeurs, la sous-unité alpha des integrines (par ailleurs appelée intégrine alpha (intégrine α) dans le texte) n'a jamais été utilisée pour la production de protéines recombinantes d'intérêt dans des cellules autres que des cellules de mammifères et ce en quantité directement compatible avec une analyse structurale de la protéine d'intérêt, ce qui nécessite une quantité de ladite protéine pouvant aller jusqu'à plusieurs milligrammes.
La présente invention vise à satisfaire cette exigence .
Ainsi, l'invention a pour objet premier l'utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha dans la construction d'au moins une protéine recombinante d'intérêt. L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha pour la production d'au moins une protéine recombinante d'intérêt.
Dans le présent texte, l'expression "protéine recombinante" ou "protéine recombinante d'intérêt" se rapporte à la protéine recombinante produite selon l'invention. Cette protéine recombinante peut en particulier comprendre l'enchaînement de plusieurs (au moins deux) protéine d'intérêt, fusionnées, éventuellement séparées par des séquences espaceurs et/ou des séquences de clivage.
L'expression "protéine d'intérêt" se rapporte à la séquence peptidique correspondant à une protéine d'intérêt que l'on veut produire (ou que 1 ' on a produite) . Ainsi, l'on comprend qu'une "protéine recombinante" est constituée d'une ou plusieurs "protéine d'intérêt" éventuellement séparées par des séquences espaceurs et/ou des séquences de clivage. Par fragment d'une intégrine alpha, on entend aussi bien la séquence en acide aminé complète de l' intégrine alpha utilisée qu'une séquence partielle. La séquence de l' intégrine alpha utilisée peut être native ou mutée. Préférentiellement selon l'invention, la séquence utilisée est une séquence comprenant l'extrémité N-terminale de 1' intégrine alpha utilisée, encore plus préférentiellement une séquence correspondant à l'extrémité N-terminale de 1' intégrine alpha utilisée.
Selon un mode particulier de l'invention, le fragment de l' intégrine alpha utilisée comprend au moins les modules FG-GAP IV à VII et une portion du module FG-GAP III de 1' intégrine alpha utilisée.
Le fragment de l' intégrine alpha utilisée peut être un fragment de toute intégrine alpha connue. On citera particulièrement les integrines al, α2 , α3 , α4 , 5, 6, al , δ, α9, iO, ail, αD, αE, αL, αM, αX, αllb ou encore αv.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, on utilise un fragment de 287 acides aminés, correspondant à la partie de l'extrémité N-terminale de 1 ' intégrine alpha 5 qui s'étend entre les positions 231 et 517, selon la numérotation tenant compte de la présence du peptide signal. Si l'on ne tient pas compte du peptide signal, le fragment utilisable dans l'invention s'étend des positions 190 (résidu G) à 476 (résidu G) de 1 ' intégrine alpha5.
Lorsque l'on utilise d'autres integrines alpha, les fragments utilisables selon l'invention sont les fragments homologues aux fragments ci-dessus définis. Par exemple quand il s'agit de 1 ' intégrine αV, le fragment utilisable selon l'invention correspond à la partie de l'extrémité N- terminale de 1 ' intégrine αV qui s'étend des positions 211
(résidu G) à 495 (résidu G) selon la numérotation tenant compte de la présence du peptide signal. Si l'on ne tient pas compte du peptide signal, le fragment utilisable dans l'invention s'étend des positions 181 (résidu G) à 465
(résidu G) de 1 ' intégrine αV. Quand il s'agit de
1 ' intégrine αllb, le fragment utilisable selon l'invention correspond à la partie de l'extrémité N-terminale de 1 ' intégrine αllb qui s'étend des positions 224 (résidu G) à 508 (résidu Q) , selon la numérotation tenant compte de la présence du peptide signal. Si l'on ne tient pas compte du peptide signal, le fragment utilisable dans l'invention s'étend des positions 193 (résidu G) à 477 (résidu Q) de 1 ' intégrine αllb.
Selon un mode particulier de l'invention, le fragment de l' intégrine alpha utilisée comprend au moins une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID n°l (fragment de 1 ' intégrine θ£ humaine), SEQ ID n°2 (fragment de l' intégrine V humaine) et SEQ ID N°3 (fragment de l' intégrine αllb humaine), de la liste de séquence fournie en annexe .
Selon un autre mode particulier de l'invention, le fragment de l' intégrine alpha utilisé comprend au moins une séquence en acides aminés codée par l'une des séquences en nucléotides, choisie parmi les séquences SEQ ID N°4 (fragment de 1 ' intégrine α5 humaine), SEQ ID N°5 (fragment de l' intégrine V humaine) et SEQ ID N°6 (fragment de 1' intégrine αllb humaine), de la liste de séquence fournie en annexe .
Selon encore un autre mode de réalisation particulier de l'invention, il est possible que le fragment de 1' intégrine alpha soit utilisé dans la construction de plusieurs (au moins deux) protéines d'intérêt recombinantes. Dans ce cas, les protéines recombinantes seront fusionnées lors de la traduction. Cela peut s'avérer nécessaire dans le cas d'une protéine d'intérêt pour laquelle la construction selon l'invention ne permet pas sa production directe (protéine réfractaire) . Il est alors nécessaire de coupler en tandem la séquence de ladite protéine réfractaire à une protéine recombinante d'intérêt que les constructions selon 1 ' invention permettent de produire. Ainsi, selon cette forme particulière de réalisation de l'invention, la construction selon l'invention comprendra au moins un fragment d'ADN codant au moins un fragment d'une intégrine alpha, puis au moins un ADN codant au moins une première protéine recombinante d'intérêt et au moins un ADN codant au moins une seconde protéine recombinante d'intérêt. Selon ce mode de réalisation particulier de l'invention, 1 'ADN codant la seconde protéine d'intérêt sera inséré dans la construction en phase en aval de la séquence d'ADN codant la première protéine d'intérêt. Ce mode de réalisation particulier peut être combiné à l'un quelconque des modes de réalisations particuliers décrits précédemment.
Préférentiellement selon l'invention, le fragment d' intégrine alpha est situé dans la protéine recombinante d'intérêt préparée selon l'invention, en amont de la séquence de la protéine d'intérêt (ou des séquences des protéines d'intérêt) que l'on vise à produire, c'est-à-dire du côté N-terminal de la protéine recombinante d'intérêt (ou des protéines recombinantes d'intérêt) que l'on cherche à construire et/ou à produire.
L'invention a également pour objet une protéine recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend, fusionnés, au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que défini précédemment et au moins une protéine d'intérêt. La (ou les) protéine (s) d'intérêt, partie (s) de la protéine recombinante de l'invention, peut être toute protéine que l'on cherche à produire, particulièrement une protéine membranaire, très particulièrement un récepteur couplé aux protéines G (RCPGs). A titre d'exemple pour ces derniers, on peut citer les récepteurs de la vasopressine et de l'ocytocine (Via, V2 , OTR) , les récepteurs des leucotriènes (BLT1, BLT2 , CysLTl, CysLT2), les récepteurs adrénergiques (bêta 3) , les récepteurs canabinoides (CB1) , les récepteurs des chimiokines (CCR5, CXCR4) le récepteur ATI de 1 ' angiotensine II, le récepteur B2 de la bradykinine .
La protéine recombinante de l'invention (quel que soit le mode de réalisation de l'invention) peut en outre comprendre toute séquence en acides aminés qui permet de la purifier de manière aisée. Ainsi selon un mode particulier de l'invention, la protéine recombinante peut comprendre une séquence de 6 résidus histidine (tag 6xHIS) . Ce tag 6xHIS peut être incorporé dans la séquence de la protéine en vue de sa purification sur colonne de Ni-NTA (Nickel- nitrilotriacetic acid) agarose . Préférentiellement , cette séquence est à l'extrémité C-terminale de la protéine recombinante de l'invention. Lorsque la protéine recombinante selon l'invention est constituée d'au moins deux protéines fusionnées, le tag 6xHIS est préférentiellement situé en aval de la dernière des protéines d'intérêt que l'on cherche à produire.
La séquence codant la protéine recombinante peut en outre comprendre au moins une séquence codant au moins un site de clivage par une endoprotéase .
De manière avantageuse, la séquence codant pour les derniers résidus de l' intégrine peut être mutée pour constituer un site de clivage pour une endoprotéase (facteur Xa, thrombine) , qui permettra après expression et purification de la protéine recombinante, de séparer la protéine d'intérêt de son partenaire de fusion. Selon une forme de réalisation particulière de l'invention, le résidu L (position 285) peut être modifié par mutation en un résidu I, les résidus E et G (positions 286 et 287) étant conservés. Un résidu R supplémentaire peut être introduit par mutagenèse. L'enchaînement ainsi constitué (IEGR) correspond au site de clivage par le facteur Xa qui coupe la protéine après le résidu R. Sous une autre forme de réalisation, le site de clivage au facteur Xa peut être transformé en un site de clivage à la thrombine. Pour cela les résidus I, E, et G peuvent être remplacés par des résidus L, V et P. Le résidu R est conservé afin d'obtenir l'enchaînement LVPR. Comme le fragment intégrine a été incorporé dans le vecteur côté 3 '' par un site BamHl (séquence ggatcc) , on obtient donc la séquence ggatcc codant pour deux résidus G et S juste après LVPR. L'enchaînement LVPRGS constitue le site de clivage à la thrombine, qui coupe la protéine après le résidu R. On comprend donc que dans une forme plus élaborée, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant le site de clivage par une endoprotéase, la (ou les) protéine (s) d'intérêt et le tag 6xHIS.
Sous une forme particulière, la protéine reσombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant le site de clivage par le facteur Xa, la (ou les) protéine (s) d'intérêt et le tag 6xHIS.
Sous une autre forme particulière, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N- Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant le site de clivage par la thrombine, la (ou les) protéine (s) d'intérêt et le tag 6xHIS .
Il peut encore être nécessaire, lorsque la protéine recombinante selon l'invention comporte plus d'une protéine d'intérêt fusionnées entre-elles, que lesdites protéines d'intérêt puissent être séparées après leur synthèse, par exemple avant purification. Ainsi, il est possible d'insérer entre les différentes séquences d'ADN codant les différentes protéines d'intérêt, au moins une séquence d'ADN codant un site de clivage pour une endoprotéase. Il est possible que des sites de clivage pour des endonucléases différentes soient insérés dans une même protéine recombinante .
Il peut être nécessaire de rendre le clivage de la protéine recombinante encore plus efficace. A cet égard il est possible d'insérer dans la construction selon l'invention une séquence codant une séquence peptidique servant de bras espaceur, préférentiellement situé en amont du site de clivage par une endoprotéase. Ainsi selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la protéine recombinante comprend en outre une séquence peptidique servant de bras espaceur, préférentiellement situé en amont du site de clivage par une endoprotéase. Dès lors, dans une forme encore plus élaborée, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant un bras espaceur et le site de clivage par une endoprotéase, la (ou les) protéine (s) d'intérêt et le tag 6xHIS.
Sous une forme particulière, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N-Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant un bras espaceur, le site de clivage par le facteur Xa, la (ou les) protéine (s) d'intérêt et le tag 6xHIS.
Sous une autre forme particulière, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N- Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant un bras espaceur, le site de clivage par la thrombine, la (ou les) protéine (s) d'intérêt et le tag 6xHIS.
Selon l'invention, la séquence codant une séquence peptidique servant de bras espaceur peut être toute séquence connue de l'Homme du Métier permettant un espacement suffisant du site de clivage par une endoprotéase et de la (ou des) protéine (s) d'intérêt pour que le clivage de la protéine recombinante soit efficace. Préférentiellement, ladite séquence codant une séquence peptidique servant de bras espaceur est la séquence SEQ ID N°7 suivante :
5 ' GACCCGGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGT 3 ' codant la séquence peptidique SEQ ID N°8 suivante : DPGGGGGGGG .
Ainsi, dans une forme des plus élaborée, la protéine recombinante de l'invention comprend, de son extrémité N- Terminale à son extrémité C-Terminale, le fragment d' intégrine alpha comportant un bras espaceur et le site de clivage par une endoprotéase, la (ou les) protéine (s) d'intérêt, séparées par un (ou des) sites de clivage par une endoprotéase (par exemple le facteur Xa ou la thrombine) et le tag 6xHIS.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que défini précédemment, dans la construction d'une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que défini précédemment, pour la production d'une protéine recombinante d'intérêt telle que définie précédemment.
L'invention a en outre pour objet une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt comprenant au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha, tel que défini précédemment, et une séquence en nucléotides codant pour au moins une protéine d'intérêt, telle que définie précédemment. Préférentiellement, la séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha utilisable selon l'invention ou comprise dans la séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d' intérêt selon l'invention, peut être choisie parmi les séquences en nucléotides SEQ ID n°4, SEQ ID n°5 et SEQ ID N°6, de la liste de séquence fournie en annexe.
L'invention a encore pour objet un vecteur comprenant une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment, comprenant au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha et une séquence en nucléotides codant pour au moins une protéine d'intérêt. Le vecteur peut être un vecteur eucaryote tel qu'un plasmide ou un virus. Le vecteur peut aussi être tout vecteur procaryote tel qu'un plasmide ou un phage .
De préférence, le vecteur est un vecteur d'expression, c'est-à-dire capable de permettre la transcription et la traduction de la séquence en nucléotides qu'il contient. A titre d'exemple, il est possible de citer les vecteurs de la famille pET vendu par la société Novagen ou ceux de la famille pGEX vendus par la société AmershamBiosciences . L'invention a encore pour objet une cellule dans laquelle une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt, telle que définie précédemment, a été introduite. Selon un mode particulier de l'invention, la séquence a été introduite sous la forme d'un vecteur tel que défini précédemment.
Par cellule, on entend ici aussi bien une cellule eucaryote qu'une cellule procaryote, particulièrement une bactérie. Toute bactérie capable de permettre l'expression d'une protéine à partir d'une séquence en nucleotide peut être utilisée selon l'invention. A titre d'exemple, il est possible de citer toutes les bactéries qui dérivent de BL21, BL21 star, Rosetta, BLR, Origami, Tuner, Novablue, toute disponible commercialement.
L'invention a encore pour objet un procédé de production d'au moins une protéine d'intérêt, caractérisé en ce que dans une première étape on introduit dans une cellule une séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt telle que définie précédemment, et que dans une deuxième étape on place la cellule dans des conditions suffisantes pour permettre l'expression de la protéine recombinante d'intérêt.
Le procédé de l'invention peut en outre comprendre une étape supplémentaire au cours de laquelle la protéine recombinante d'intérêt peut être coupée par action d'une endoprotéase, (facteur Xa, thrombine, par exemple) , au site créé dans les derniers résidus de l' intégrine afin de séparer la protéine d'intérêt de son partenaire de fusion.
Le procédé de l'invention peut également comprendre une étape supplémentaire au cours de laquelle la protéine recombinante d'intérêt, ou la (ou les) protéines d'intérêt séparée (s) de son (de leurs) partenaire (s) de fusion, peut (peuvent) être purifiée (s).
Selon le procédé de l'invention, la séquence en nucléotides codant pour une protéine recombinante d'intérêt peut-être introduite dans la cellule par toute méthode connue. A titre d'exemple de méthodes utilisables, il est possible de citer pour les cellules procaryotes, le choc thermique ou 1 ' électroporation . Pour les cellules eucaryotes, on peut citer 1 ' électroporation, la méthode du précipité au phosphate de calcium, l'utilisation de polymères cationiques tels que le DEAE-dextran ou encore toute méthode utilisant des liposomes cationiques ou des dendrimères activés. On peut aussi utiliser des rétrovirus pour faire du transfert de gènes ainsi que les techniques utilisant des microprojectiles pour délivrer de 1 'ADN dans des cellules cibles.
De même, toute condition suffisante permettant l'expression de la protéine recombinante d'intérêt, connues de l'homme du métier, sont utilisables selon le procédé de 1' invention.
Enfin, toute méthode de purification de la (ou des) protéine(s), connue de l'homme du métier, peut être utilisée selon le procédé de l'invention. A titre d'exemple, on peut citer les méthodes de chromatographie d'affinité, de chromatographie d'échange d'ions, de chromatographie d'interaction hydrophobes ou encore de filtration sur tamis moléculaire.
Particulièrement, lorsque la protéine recombinante d'intérêt comprend le tag 6xHIS, la purification sur colonne Nickel-acide nitrilotriacétique agarose (Ni-NTA) représente une méthode de purification particulièrement satisfaisante dans le cadre du procédé de l'invention. Les techniques utilisables selon l'invention sont connues de l'homme du métier. Celui-ci peut se référer aux nombreux manuels disponibles et en particulier à "Molecular
Cloning, a laboratory manual . 2nd édition, Sambrook, Fritsch, Maniatis eds . , CSH laboratory press, (1989)".
Outre les dispositions qui précèdent, l'Invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l'Invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels :
La Figure 1 représente une construction correspondant à un vecteur selon l'invention.
La Figure 2 représente la production de la protéine de fusion intégrine α5-récepteur V2 de la vasopressine selon le procédé de l'invention (colonne de gauche : poids moléculaires des protéines de l'échantillon marqueur ; flèche : position de la protéine recombinante intégrine α5-récepteur V2 de la vasopressine, NI : protéines d'un échantillon non-induit, 2h, 3h et 4h : protéines d'un échantillon induit après 2h, 3h et 4h d'induction).
La Figure 3 représente la protéine recombinante intégrine α5-récepteur V2 de la vasopressine de la figure 2 après purification et migration sur gel d' électrophorèse . (colonne de gauche : poids moléculaires des protéines de l'échantillon marqueur ; flèche : position de la protéine recombinante intégrine α5-récepteur V2 de la vasopressine)
La Figure 4 représente le résultat de la purification de la protéine recombinante de fusion intégrineα5-récepteur V2-récepteur CXCR4 (α5-V2-CXCR4) par chromatographie d'affinité
S6M: surnageant de solubilisâtion en tampon 6M urée, déposé sur la résine Ni-NTA agarose
FT: échantillon non retenu sur la résine : fraction wash contenant 15 mM imidazole E100: fusion purifiée éluée en tampon contenant 100 mM imidazole
La flèche indique la position de la protéine de fusion α5-V2-CXCR4.
Les exemples suivants sont illustratifs de l'Invention et ne la limitent aucunement"
Exemple 1 : Construction d'un vecteur permettant l'expression dans les bactéries d'une protéine recombinante d'intérêt :
Un ADN complémentaire codant pour la protéine d'intérêt que l'on veut exprimer, est positionné, dans le vecteur pET21a (+) (vendu par la société Novagen) en phase avec un fragment d'ADN complémentaire de l' intégrine α5 , par l'utilisation de sites de restriction appropriés. Le fragment de 1 ' intégrine α5 est délimité par les sites Ndel et BamHI . Le site Ndel a l'avantage d'incorporer un codon ATG qui est le codon initiateur de la traduction. Ce codon initiateur code pour une méthionine (M) . Le site Ndel constitué par la séquence CATATG est donc intéressant pour sous-cloner un fragment d'ADN puisque la séquence cible se trouve directement en phase avec le codon ATG. Celui-ci constitue alors le résidu 1. En ce qui concerne 1 ' intégrine alpha5, l'ATG du site Ndel est positionné en amont de sa séquence nucléotidique . Dans ce cas, l'ATG codera pour une Ml et le G de 1 ' intégrine sera le résidu 2. Le fragment de 287 résidus sera couplé à la méthionine 1 et on obtient donc un partenaire de fusion de 288 résidus : M1-G288. Le vecteur fournit directement la séquence codant pour le tag 6xHIS qui sera localisé à l'extrémité C-terminale de la protéine recombinante d'intérêt. Un site EcoRI est localisé dans le vecteur du côté de l'extrémité N-terminale du site tag. Ainsi l'ADN complémentaire codant pour la protéine d'intérêt est inséré entre le site Bam HI marquant l'extrémité C-terminale du fragment d'ADN complémentaire de l' intégrine α5 et le site EcoRI situé du côté de l'extrémité N-terminale du tag 6xHIS. La figure 1 montre le schéma d'une telle construction .
Exemple 2 : Expression du récepteur V2 humain de la vasopressine : Construction du vecteur :
L'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine (Cotte et al., J. BIOL. Chem. 273, 29462- 29468, 1998) , est inséré entre les sites BamHI et EcoRI du vecteur obtenu à 1 ' exemple 1. Etape 1 : Préparation de 1 'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine :
Des sites de reconnaissances pour les enzymes de restriction BamHI et EcoRI sont ajoutés de part et d'autre de la séquence de 1 'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine. Cela est réalisé par la technique de PCR classique. L'ADN complémentaire du récepteur V2 humain de la vasopressine est amplifié à partir du vecteur pRK5-V2, (Cotte et al., J. BIOL. Chem. 273, 29462-29468, 1998), à l'aide de deux oligonucléotides amorces permettant d'insérer les sites de restriction recherchés : oligo sens (permet l'incorporation du site BamHI) : 5' ATG GGT CGC GGA TCC ATG CTC ATG GCG TCC ACC ACT TCC 3 ' oligo antisens (permet l'incorporation du site EcoRI) : 5 ' CGA CGG AAT TCT GCG ATG AAG TGT CCT TGG CCA G 3 ' .
La réaction de PCR est réalisée dans 50 microlitres d'un mélange réactionnel comprenant :
- pRK5-V2 20 ng
- oligo sens 100 ng - oligo antisens 100 ng
- Pfu Turbo polymerase (Stratagene) 2.5 U
- tampon Pfu 10X (Stratagene) 5 μl
- dNTP 80 μM final pour chacun des 4 selon les paramètres de cycle suivants :
- dénaturation initiale à 95 °C pendant 2 minutes puis
- 25 cycles :95°C, 30 secondes puis 55°C, 1 minute, 72°C, 1,5 minutes puis - élongation finale à 72°Cpendant 10 minutes.
La présence du fragment amplifié (fragment PCR V2 amplifié) est contrôlée sur gel agarose 1%.
Etape 2 : Purification du fragment amplifié (fragment PCR V2 amplifié) : La zone du gel d'agarose où l'on visualise le fragment d'ADN amplifié est découpée et 1 ΑDNc est purifié à l'aide du kit de purification Qiaquick gel extraction kit
(référence Qiagen 28706), en suivant strictement le protocole préconisé par le fournisseur. Etape 3 : Coupure du fragment PCR V2 amplifié par les enzymes BamHI et EcoRI :
Cela est réalisé en une seule étape à l'aide des enzymes vendues par New England Biolabs (NEB) par une incubation de 3 heures à 37°C, dans un volume final de 50 microlitres contenant :
- insert V2 (fragment amplifié) 100 à 200 ng 24 μl
- tampon EcoRI 10X NEB 5 μl
- sérum albumine bovine NEB 100X (10 mg/ml) 1 μl
- EcoRI ( 40 U ) 2 μl - BamHI ( 40 U ) 2 μl
- eau 16 μl
En fin de réaction, les deux enzymes sont inactivées par chauffage à 80°C. pendant 20 minutes. Le fragment PCR V2 est alors purifié à partir d'un gel d'agarose 1% selon le protocole décrit ci-dessus.
Etape 3 : sous-clonage du fragment PCR V2 amplifié dans les sites BamHI et EcoRI du vecteur pET21a de 1 ' exemple 1 :
La ligation est réalisée par incubation à température ambiante (20-25°C) pendant 4 heures dans un milieu comprenant : fragment PCR V2 BamHI / EcoRI (100 à 200 ng) 8 μl vecteur pET21a (30 ng) coupé par BamHI / EcoRI 3 μl
- tampon ligase 10X (NEB) 2.5 μl
- T4 DNA ligase (NEB) 2 μl - eau 9.5 μl .
Le produit de ligation, protéine de fusion intégrine- récepteur V2 humain de la vasopressine, est ensuite utilisé pour une transformation des bactéries Rosetta (DE3) afin de réaliser les tests d'expression du récepteur. Introduction du vecteur d'expression dans une bactérie et expression de la protéine d'intérêt : Transformation :
Le vecteur obtenu précédemment est ensuite introduit dans une bactérie de souche Rosetta (DE3) par la technique du choc thermique en suivant le protocole de transformation préconisé par le fournisseur, en l'occurrence Novagen.
20 μl de bactéries Rosetta (DE3) référence Novagen 70954-4 et 1 μl de pET21a- intégrine/V2 (quelques nanogrammes) sont incubés sur glace 30 minutes, puis maintenus à 42 °C pendant 30 secondes et de nouveau sur glace pendant 2 minutes pour réaliser un choc thermique.
80 μl de milieu SOC (voir composition dans Molecular Cloning, a laboratory manual . 2nd édition, Sambrook, Fritsch, Maniatis eds . CSH laboratory press, 1989) sont alors ajoutés, puis l'ensemble est incubé à 37°C pendant 1 heure sous agitation à 300 tours/minutes.
Le milieu d'incubation est alors étalé sur boîtes de pétri contenant du milieu LB agar + ampicilline à 100 microgrammes / ml. Les boîtes sont incubées à 37°C 16 heures. Les bactéries d'une colonie sont alors cultivées à 37°C dans 10 ml de milieu LB contenant 100 μg/ml d' ampicilline (ou de son analogue la carbenicilline) , et la suspension cellulaire est agitée à 300 tours/minutes. Expression de la protéine :
Lorsque la densité optique de la culture atteint 0.6 U, l'expression de la protéine recombinante est induite par addition d'IPTG 1 mM.
Des échantillons sont prélevés 2, 3 ou 4 heures après induction. Pour cela, 1 ml de suspension bactérienne, à densité optique de 0,6, est prélevé dans chaque culture. L'échantillon est centrifugé pendant 2 minutes à 12000 tours par minutes. Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 60 μl de tampon de lyse (25 mM Tris, pH8,3, 185 mM glycine, 0,1% SDS). 60 μl de tampon de dépôt au SDS (10% glycérol, 5% 2-mercaptoethanol, 25 mM Tris-HCl, pH 6,5, 8% SDS, bleu de bromophénol (quelques grains)) sont alors ajoutés et 10 μl de l'échantillon lysé (extraits protéiques totaux) sont alors déposés sur gel d ' acrylamide/bis-acrylamide 12% - SDS 0.1 %. Après migration des protéines, elles sont colorées au bleu de Coomassie selon les techniques habituelles.
La Figure 2 représente les résultats obtenus. Les échantillons induits sont comparés à des contrôles non induits (NI) mais ayant été cultivés pendant un temps équivalent. Il est évident que la protéine de fusion α5- récepteur V2 , qui présente un poids moléculaire apparent autour de 65 kDa, constitue une des protéines majoritaires de la bactérie, ce qui est une condition requise pour une purification du récepteur en quantité compatible avec des analyses de sa structure via des approches de cristallographie ou RMN.
1 ml de culture ainsi réalisée a permis d'obtenir environ 3 μg de récepteur de la vasopressine.
Exemple 3 : Expression d'autres récepteurs :
Le résultat obtenu à l'exemple 2 a été reproduit avec la même efficacité, pour d'autres RCPGs, tels que le récepteur β3-adrénergique, les récepteurs BLT2 , Cys-LTl et Cys-LT2 des leucotrienes LTB4 , LTD4 et LTC , le récepteur cannabinoïde de type 1, le récepteur Via de la vasopressine et le récepteur de l'ocytocine.
Exemple 4 : Purification de la protéine de fusion fragment d' intégrine α5- récepteur V2 de la vasopressine obtenu à l'exemple 2 :
La méthode utilisée est celle décrite par Porath J. et collaborateurs, (Métal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature 258, 598-599, 1975) L'exemple exposé ici est un essai qui a permis de purifier 3 g de protéine fusion à partir d'une culture bactérienne de 100 ml.
Une colonie isolée sur LB agar + Ampicilline (100 μg / ml) est piquée et cultivée dans 10 ml de milieu de culture LB + carbenicilline (100 μg / ml) . La culture est réalisée à 37°C, sous agitation à 300 tours par minute. Lorsque la densité optique de la culture atteint 0,6, la culture est arrêtée et conservée au réfrigérateur (cet échantillon est appelé préculture) . Le lendemain, dans un Erlenmeyer de 500 ml, 100 ml de milieu de culture LB + carbenicilline (100 μg / ml) sont ensemencés avec 2 ml de préculture et laissé 37°C, à 300 tours par minute jusqu'à ce que la densité optique de la culture ait atteint 0,6. 0,1 mM d'IPTG sont alors ajoutés à la culture afin d'induire l'expression de la protéine recombinante. La culture est poursuivie environ 3 heures, jusqu'à obtention d'un densité optique de 2,4 (facteur de stimulation de 4) .
La culture est alors centrifugée à 4000 tours par minute pendant 5 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot peut être lysé directement ou conservé à -80°C.
Pour la lyse, le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 6 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8,00 + inhibiteurs de protéases (leupeptine 5 μg / ml ; benzamidine 10 μg / ml et PMSF 10 μg / ml) . Ces trois inhibiteurs de protéases seront incorporés à tous les tampons utilisés par la suite.
Les bactéries sont lysées par sonication à l'aide d'une microsonde conique Branson (duty cycle 50%, output control 5, fréquence 1 burst par seconde pendant 30 secondes, puis repos 30 secondes ; ce cycle est répété 5 fois) . Le tube est conservé dans la glace pendant la sonication. Le milieu est alors centrifugé pendant 30 minutes à 15000 tours par minute à 4°C. Le surnageant est conservé pour contrôle sur gel d1 électrophorèse .
Le culot contient la protéine d'intérêt puisque celle- ci est accumulée en corps d'inclusion.
Le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 5 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8,00. Les étapes de lyse et de centrifugation sont répétées une fois.
Les surnageants des centrifugations sont conservés pour contrôle sur gel d' électrophorèse.
Le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 5 ml de Tris-HCl, pH 8,00, urée 1M. Un barreau aimanté est placé dans l'échantillon et celui-ci est agité doucement pendant lh30. Le tube est conservé dans la glace pendant cette étape qui correspond à un lavage des corps d'inclusion et permet d'éliminer des protéines membranaires ou cytoplasmiques associées aux corps d'inclusion mais qui sont considérées comme contaminantes par rapport à la protéine recombinante.
L'ensemble est alors centrifugé à 15000 tours par minute pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant est conservé pour contrôle sur gel d' électrophorèse.
Afin de solubiliser les corps d'inclusion et donc la protéine d'intérêt, le culot est repris par homogénéisation à la pipette dans 5 ml de Tris-HCl 20 mM, pH 8,00, urée 6M, SDS 0.2%. Un barreau aimanté est placé dans l'échantillon et celui-ci est agité doucement pendant 3 heures, dans la glace.
La protéine d'intérêt (la protéine de fusion fragment d' intégrine α5-récepteur V2 de la vasopressine) est alors complètement dénaturée .
L'ensemble est alors centrifugé à 15000 tours par minute pendant 30 minutes à 4°C. Le surnageant contient la protéine d'intérêt et constitue l'échantillon qui sera mis en contact avec la résine Ni-NTA (Nickel-nitriloacetic acid) afin de purifier la fusion alpha5-V2 par chromatographie d'affinité.
3 ml de résine Ni-NTA agarose Superflow (Qiagen, ref 30430) sont équilibrés dans du Tris-HCl 20 mM, pH 8,00, urée 6M, SDS 0,2%, NaCl 150 mM, imidazole 5 mM. On rajoute dans l'échantillon contenant la protéine d'intérêt une quantité suffisante de NaCl et d' imidazole pour obtenir une concentration finale de 150 mM de NaCl et de 5 mM d' imidazole. L'échantillon et la résine sont mis en contact et on laisse incuber à 4°C pendant 16 heures et sous agitation douce. Le mélange échantillon/résine est déposé dans une colonne plastique. On laisse Après la décantation, la fraction "flowthrough" est récupérée à un débit faible, pour contrôle sur gel d' électrophorèse. La résine est alors lavée avec 3 x 9 ml d'une solution de Tris-HCl 20 mM, pH 8,00, urée 6M, SDS 0,2%, NaCl 150 mM, imidazole 20 mM, pour éliminer toutes les protéines non retenues de façon spécifique sur les groupements Nickel. Les éluats de lavage sont conservés pour contrôle sur gel d ' électrophorèse .
La protéine d'intérêt est alors détachée de la résine par passage de 3 ml d'une solution de Tris-HCl 20 mM pH 8,00, urée 6M, SDS 0,2%, NaCl 150 mM, imidazole 100 mM. Un aliquot de la protéine purifiée est conservé pour contrôle sur gel d1 électrophorèse .
10 μl du milieu contenant la protéine purifiée sont mélangés à 10 μl de tampon de dépôt au SDS et l'ensemble est déposé sur un gel d' électrophorèse. 10 μl d'échantillon purifié contiennent de 5 à 10 μg de protéine soit dans 3 ml d'éluat, 1,5 à 3 mg de protéine recombinante .
La figure 3 montre la protéine purifiée déposée sur gel d' électrophorèse. L'échantillon purifié est dialyse contre une solution de Tris-HCl 20 mM, pH 8,00, urée 6M, NaCl 150 mM pour éliminer le SDS et l' imidazole. Pour cela, l'échantillon est placé dans une cassette de dialyse Pierce (membrane de M CO de 10000) et la dialyse se fait dans un Bêcher contenant un litre du tampon. La dialyse est effectuée à 4°C pendant au moins 24 heures.
L'échantillon est récupéré et la quantité de protéine d'intérêt obtenue est dosée par mesure d'absorption (excitation à 280 nM, absorption entre 235 et 500 nM) . En général, on obtient une D.O de 1 à 1.5, ce qui est équivalent à une concentration de 0.5 à 1 mg / ml , ce qui est équivalent à une concentration de l'ordre de 10 μM. La protéine purifiée et dénaturée (car solubilisée dans l'urée 6M) est utilisée pour les essais de renaturation.
Exemple 5 : construction d'un vecteur permettant l'expression simultanée de deux protéines d'intérêt (ici deux RCPGs) dans Escherichia coli et leur purification.
Un ADN complémentaire codant pour une protéine d'intérêt, en l'occurrence ici le récepteur CXCR4 humain des chimiokines, est inséré dans le vecteur pET21a (+) -α5V2 décrit auparavant dans l'exemple 2. Cet ADN doit être en phase avec celui codant pour la fusion α5V2 et est positionné entre les sites de restriction Sacl et HindIII par exemple. Le vecteur fournit directement la séquence codant pour le tag 6xHIS qui sera donc localisé à l'extrémité C-terminale du récepteur CXCR4 et permettra donc sa purification dans une étape ultérieure.
Dans l'exemple, une version optimisée
(« bactérialisée ») du CXCR4 est insérée dans le vecteur mais la version eucaryote naturelle de ce récepteur (Herzog H, Hort YJ, Shine J and Selbie LA. Molecular cloning, characterization and localization of the human homolog to the reported bovine NPY Y3 receptor : lack of NPY binding and activation. DNA Cell Biol . 12, 465-471, 1993) peut également être utilisée de la même façon. Etape 1 : Préparation de 1 'ADN complémentaire du récepteur CXCR4 humain.
Des sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction Sacl et HindIII sont ajoutés de part et d'autre de la séquence codant pour le récepteur CXCR4 humain au cours d'une réaction PCR classique. L'ADN complémentaire de ce récepteur est amplifié à partir du vecteur pETlOl/D-TOPO (Invitrogen) dans lequel il est sous-cloné et à partir de deux oligonucléotides amorces permettant d'insérer les sites de restriction considérés. Oligo sens (incorporation du site Sacl) : 5' CGAGCTAAGGC GAGCTC A ATGGAAGGCATTAGCATTTATAC 3'
Oligo antisens (incorporation du site HindIII) : 5' CGACGGCCC AAGCTT GCTGCTATGAAAGCTGCTGCTTTC 3' La réaction de PCR est réalisée dans 50 microlitres et est composée de : pETlOl/D-TOPO 20 ng
Oligo sens 100 ng
Oligo antisens 100 ng Pfu Turbo polymerase (Stratagene) 2.5 U
Tampon Pfu 10 X 5 μl dNTP 80 μM final pour chacun des 4 Les paramètres de la réaction sont : dénaturation initiale à 95°C pendant 2 minutes puis 25 cycles : 95°C, 30 s ; 55°C, 1 min ; 72°C, 1.5 min puis élongation finale à 72°C, 10 min.
La présence du fragment amplifié est vérifiée sur gel d'agarose 1%.
Etape 2 : purification du fragment amplifié
La zone du gel d'agarose dans laquelle on visualise le fragment d'ADN amplifié est découpée et l'ADNc est purifié à l'aide du kit de purification Qiaquick gel extraction
(Qiagen référence 28706) en suivant strictement le protocole préconisé par le fournisseur.
Etape 3 : coupure du fragment PCR CXCR4 amplifié par Sacl et HindIII
Cela est réalisé en deux réactions successives à l'aide d'enzymes de restriction vendues par NEB Biolabs au cours d'incubation à 37°C. lëe réaction pendant 3h: fragment PCR 500 ng tampon NEB 1 10X 5 μl sérum albumine bovine (BSA) 1 μl Sacl 40 U
Eau qsp 50 μl
Le fragment PCR amplifié et coupé par Sacl est purifié à partir d'un gel agarose selon le protocole décrit à l'étape 2.
2ême réaction pendant 3h : fragment PCR récupéré de la réaction précédente tampon NEB 2 10X 5 μl
BSA 1 μl
HindIII 40 U
Eau qsp 50 μl
Le fragment PCR amplifié et coupé par Sacl / HindIII est purifié à partir d'un gel d'agarose selon le protocole décrit à l'étape 2.
Etape 4 : sous-clonage du fragment PCR CXCR4 amplifié et coupé Sacl / HindIII dans le vecteur pET21a (+) -α5V2. Cette étape est réalisée par ligation à température ambiante pendant 16H00.
Fragment PCR coupé 200 ng
Vecteur pET21a (+) -α5V2 coupé par les mêmes enzymes 50 ng Tampon ligase 10X (NEB) 2.5 μl
T4 DNA ligase (NEB) 2 μl
Eau qsp 25 μl
Le vecteur obtenu qui code pour une triple protéine de fusion intégrine-récepteur V2-récepteur CXCR4 , est ensuite utilisé pour une transformation des bactéries Rosetta (DE3) dans le but d'exprimer cette fusion et de la purifier.
Etape 5 : transformation des bactéries Rosetta. Suivre à la lettre le protocole décrit dans l'exemple 2.
Etape 6 : expression de la fusion α5V2-CXCR4 Suivre à la lettre le protocole décrit dans l'exemple 2 mais le milieu de culture LB est remplacé par du milieu Hyperbroth (Athena Enzyme Systems) et le temps optimum d'induction est de 4 heures.
Etape 7 : purification de la fusion α5V2-CXCR4. Cette étape est illustrée par la figure 4.
Suivre à la lettre le protocole de l'exemple 4 mais lors de l'étape de lavage de la résine Ni-NTA agarose, une concentration de 15 mM d' imidazole au lieu de 20 mM est utilisée dans la solution de lavage. L'élution est réalisée à 100 mM comme dans l'exemple 4.
Le bras espaceur peut également être inséré en amont du site de clivage à la thrombine juste après le site
EcoRI .
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Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'au moins un fragment d'une intégrine alpha pour la production dans une cellule, à l'exception d'une cellule de mammifères, d'au moins une protéine recombinante d' intérêt .
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la cellule est une cellule procaryote, particulièrement une bactérie.
3 )ϋtilisation selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha est une séquence en acides aminés complète de l' intégrine alpha ou une séquence partielle;
4 )Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha est une séquence comprenant l'extrémité N-terminale de l' intégrine alpha utilisée.
5 )Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que l' intégrine alpha est native ou mutée.
6 )Ut i l isat ion selon l ' une quel conque des revendications 1 à 5 , caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha comprend au moins les modules FG-GAP IV à VII et une portion du module FG-GAP III de l ' intégrine alpha utilisée .
7 )Ut i l i s at ion se l on l ' une que l conque de s revendications 1 à 6 , caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha provient d' une intégrine alpha choisie parmi les integrines i, α2, α3 , α4, α5, α6, α7, α8 , α9, αlO, αll, αD, αE, αL, αM, αX, αllb, ou encore αV.
8) Utilisation selon la revendication 7, caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha provient d'une intégrine alpha choisie parmi les integrines α5 , αV ou αllb.
9) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le fragment de 1 ' intégrine alpha 5 s'étend entre les positions 231 et 517 (en tenant compte de la présence du peptide signal) ou des positions 190 à 476 (en ne tenant pas compte de la présence du peptide signal) .
10 ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le f agment de 1 ' intégrine αV s'étend entre les positions 211 et 495 (en tenant compte de la présence du peptide signal) ou des positions 181 à 465 (en ne tenant pas compte de la présence du peptide signal) .
11 ) Utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce que le fragment de 1 ' intégrine αllb s'étend entre les positions 224 et 508 (en tenant compte de la présence du peptide signal) ou des positions 193 à
12 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha comprend au moins une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID n°l, SEQ ID n°2 et SEQ ID N°3 de la liste de séquence fournie en annexe.
13 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha comprend au moins une séquence en acides aminés codée par l'une des séquences en nucléotides choisie parmi les séquences SEQ ID n°4, SEQ ID n°5 et SEQ ID N°6, de la liste de séquence fournie en annexe.
14) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisée en ce que le fragment d' intégrine alpha est situé dans la (ou les) protéine (s) recombinante (s) d'intérêt préparée (s) selon l'invention, en amont de la (ou des) séquence (s) de la (ou des) protéine (s) d'intérêt que l'on vise à produire.
15 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que la (ou les) protéine (s) recombinante (s) comprend (comprennent) au moins un site de clivage par une endoprotéase.
16 ) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que la (ou les) protéine (s) recombinante (s) comprend (comprennent) au moins un bras espaceur.
17 ) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que le bras espaceur est constitué par la séquence peptidique SEQ ID N°8 de la liste de séquence fournie en annexe.
18 ) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que la protéine recombinante comprend au moins un bras espaceur codé par la séquence en acide nucléique SEQ ID N°7 de la liste de séquence fournie en annexe .
19) Protéine recombinante caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14 et au moins une protéine membranaire d'intérêt.
20) Protéine recombinante selon la revendication 19 caractérisée en ce que la protéine d' intérêt est un récepteur couplé aux protéines G.
21) Protéine recombinante selon la revendication 20, caractérisée en ce que le un récepteur couplé aux protéines G est choisi parmi les récepteurs de la vasopressine et de l'ocytocine (Via, V2, OTR) , les récepteurs des leucotrienes (BLT1, BLT2, CysLTl, CysLT2) , les récepteurs adrénergiques (béta 3) , les récepteurs canabinoïdes (CB1) , les récepteurs des chimiokines (CCR5, CXCR4 ) le récepteur ATI de 1 ' angiotensine II, le récepteur B2 de la bradykinine.
22) Protéine recombinante selon l'une quelconque des revendications 19 à 21, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence de 6 résidus histidine (tag 6xHIS) .
23) Protéine recombinante selon la revendication 22, caractérisée en ce que la séquence de 6 résidus histidine est à l'extrémité C-terminale de la protéine.
24) Utilisation d'au moins un fragment d'une séquence en nucléotides codant pour au moins un fragment d'une intégrine alpha tel que décrit dans l'une quelconque des revendications 1 à 14 , dans la construction d'une séquence en nucléotides codant pour au moins une protéine recombinante d'intérêt telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 19 à 23. 25) Séquence en nucléotides codant pour au moins une protéine recombinante d'intérêt telle que décrite dans l'une quelconque des revendications 19 à 23.
26) Vecteur comprenant une séquence en nucléotides telle que décrite à la revendication 25.
27) Cellule, à l'exception d'une cellule de mammifères, dans laquelle une séquence en nucléotides telle que décrite à la revendication 25 ou un vecteur tel que décrit à la revendication 26 a été introduit.
28) Procédé de production d'au moins une protéine d'intérêt, caractérisé en ce que dans une première étape on introduit dans une cellule, à l'exception d'une cellule de mammifères, une séquence en nucléotides codant pour au moins une protéine recombinante d'intérêt, telle que décrite à la revendication 25, et que dans une deuxième étape on place la cellule dans des conditions permettant l'expression de la (ou des) protéine (s) recombinante (s) d' intérêt.
29) Procédé selon la revendication 28, caractérisé en ce qu' il comporte en outre une étape supplémentaire au cours de laquelle la (ou les) protéine (s) recombinante (s) d'intérêt est (sont) coupée (s) par action d'une endoprotéase .
30) Procédé selon l'une quelconque des revendications 28 ou 29, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape supplémentaire au cours de laquelle la (ou les) protéine (s) recombinante (s) d'intérêt ou la (ou les) protéine(s) d'intérêt séparée(s) de son (leurs) partenaire (s) de fusion, est (sont) purifiée (s).
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