WO2004106541A1

WO2004106541A1 - 歯周病マーカー

Info

Publication number: WO2004106541A1
Application number: PCT/JP2004/007867
Authority: WO
Inventors: Kenji Yamamoto
Original assignee: Kyushu Tlo Company, Limited
Priority date: 2003-05-30
Filing date: 2004-05-31
Publication date: 2004-12-09
Also published as: JPWO2004106541A1

Abstract

【課題】歯周病を検出して、歯周病ならびに全身疾患を診断することができる歯周病マーカーを提供すること。【解決手段】歯周病マーカーは、ジンジバリス菌が産生するシステインプロテアーゼからなる。システインプロテアーゼは、アルギニン残基のC末端側にペプチド結合切断特異性を有するArgージンジパインと、リジン残基のC末端側にペプチド結合切断特異性を有するLysージンジパインとからなるジンジパインである。

Description

明細書歯周病マーカー技術分野

この発明は、歯周病マーカーに関するものである。更に詳細には、この発明は、歯周病マーカー、それを用いた歯周病検出方法ならびに診断方法および歯周病検出用キットに関するものである。背景技術

歯周病は、成人における歯牙喪失の主因であり、成人の罹患率が 4 0 %以上にも達する、いわば国民病のひとつである。かっては、歯周病は、加齢とともに起こる生理現象のひとつと考えられ、高齢における歯牙喪失は不可避なことと理解されていた。歯牙喪失は、口腔機能の低下を招くばかりではなく、各種神経機能に異常をもたらすことや、歯周病が全身疾患 (冠状動脈性心疾患、低体重児出産，早産、糖尿病、心内膜炎、細胞性肺炎など）のリスクファクタ一であることなどが明らかにされ、歯周病の克服が Q O L (quality of life)の向上を実現するために必須の課題と考えられるようになってきた。

歯周病は、歯肉縁下プラーク中の細菌によって惹起される感染症であることは周知の事実であり、歯周病の治療や予防の第一の目的は、歯周病原性細菌のコントロールにあると考えられている。そのために、歯周病を早期にかつ確実に診断することが、本疾患に対する的確な治療と予防に向けた新たな方法論を確立するうえで極めて重要である。

これまで歯周病のスクリーニングでは歯周ポケットを測定することが標準とされてきたが、この方法は、費用、労力、再現などに問題があり、一度に多数の人をスクリーユングすることができないという欠点がある。

そこで、歯周病を早期に診断する方法として、 U 液を検査することが提唱されてきた。唾液は、血液とは異なり、ほぼ無侵襲でかつ簡便に試料採取が可能であり、その上、唾液には、歯肉溝滲出液、細菌性プラークなど、歯周組織の状況把握に有用な種々のマーカーが含まれていることから、歯周病診断や治療効果の判断に使用できる材料と考えられてきている。

唾液を歯周病診断の材料として使用する方法として、唾液サンプルに 0—ダルコ- ダーゼに対する基質を添加して、その基質上の /3—ダルコニダーゼの反応生成物を測定することによつて唾液中の β一ダルコ二ダーゼ濃度を測定する方法が提案されている（ァメリカ特許第 6 0 6 3 5 8 8号)。しかしながら、この方法は、歯周病を早期にかつ確実に診断する方法として診断などに実際に使用するためには、精度、再現性等改良すべき点があるといわざるを得ない。

ところで、近年における遺伝子解析技術の急速な進展に伴い、歯周病の主要な原因菌と考えられているグラム陰性嫌気性細菌 Porphyromonas gingival is (以下、「ジンジバリス菌」という）の産生産物であるタンパク質や、その細胞表面タンパク質などについても遺伝子研究が精力的に進められてきた。

その結果、ジンジバリス菌由来の酵素が、コラーゲンを主体とする歯周組織に対し直接的な分解能を有すると共に、好中球などの炎症性細胞に対して障害活性を有することが見出された（日本国特許公開第平 7 _ 1 3 5 9 7 3号公報)。この酵素は、既知のジンジバリス菌由来の 5 0 k D aシスティンプロテアーゼ（Chen, Z. , et al. , J. Biol. Chem. 267 : 18896-18901， 1992) と至適 p Hやインヒビターに対する感受个生などの酵素学的性質は類似しているが、基質特異性や熱安定性などの性質においては相違していると報告されている。

また、ァメリカ特許第 6 5 1 1 6 6 6号明細書には、アルギニン特異性ならびにリジン特異性チオールェンドぺプチダーゼのアミノ酸配列の僅かな断片部分からなる 9 個のタンパク質断片を有するタンパク質複合体を、ジンジバリス菌に対する免疫応答を誘導するために使用することが記載されている。

他方、本発明者らは、ジンジパインが、他のプロテア一ゼとはアミノ酸配列においてほとんど類似性を示さない独自のファミリー（C 2 5 )を構成する酵素群であって、触媒活' 1生として強力なトリプシン様活性を有していること、またそのべプチド結合切断特異性から、アルギニン残基の C末端側に特異的な A r _g —ジンジパイン (以下、「R g p」という）とリジン残基の C末端側に特異的な L y s—ジンジパイン (以下、「K g p j という）に分けることができることを報告している（山本健二他：プロテオリシス一蛋白質分解の分子機構とバイオロジー (鈴木紘ー ·木南英紀 ·田中啓二編)、蛋白質核酸酵素増刊、 pp. 2425-2431,共立出版（I⁹⁹⁷)； Yamamoto, K.， et al.： in Proteases： New Perspectives (Turk. V. ed.ノ, pp. 175— 184， Birkhauser Verlag, Base丄 (1999) ；山本健二：細胞工学、 19, 295-301 (2000) ； Kadowaki, T. , et al.： J. Biochem. , 128, 153-159 (2000) )。更に、本発明者らは、これらの酵素がいずれも、大部分が膜結合型酵素として存在し、一部が分泌型として菌体外へ分泌され、それらの生理ならびに病理作用を発現していることを確認している。

しかしながら、かかるジンジパインならびにその 1部が歯周病マーカーとして作用することができるという記載は一切ない。

さらに、歯周病を早期にかつ確実に診断する方法が今まで確立されていないのが現況である。

そこで、本発明者らは、歯周病の早期かつ確実な診断手段を見出すべく、歯周病の主要な原因菌と考えられているジンジバリス菌について研究を進めてきた結果、ジンジバリス菌が産生する 2種類のシスティンプロテアーゼ (以下、「ジンジパイン」 (gingipain)ともいう） ίΚ 歯周病を早期にかつ確実に、その上簡便に検出することができるマーカーとして利用できることを見出して、この発明を完成した。

したがって、この発明は、ジンジバリス菌が産生するシスティンプロテアーゼ（ジンジパイン）を歯周病の検出のために使用することからなる歯周病マーカーを提供することを目的としている。

この発明の別の目的は、上記ジンジパインを歯周病検出のマーカーとして使用することからなる歯周病検出方法を提供することである。

この発明はさらに、ジンジパインを歯周病検出マーカーとして唾液を使用して歯周病を診断する歯周病診断方法を提供することを目的としている。

この'発明はさらに、ジンジパインを歯周病検出マーカーとして利用して歯周病を簡便に診断することができる歯周病診断キットを提供することを目的としている。発明の開示

上記目的を達成するために、この発明は、ジンジバリス菌が産生するジンジパインからなる歯周病検出用マーカーを提供する。また、この発明は、上記ジンジパインを歯周病検出用マーカーとして使用することからなるジンジパインの使用方法と、上記ジンジパインを歯周病マーカーとして使用して歯周病を検出する歯周病検出方法を提供する。

この発明の好ましい態様として、上記ジンジパインが、アルギニン残基の C末端側にぺプチド結合切断特異性を有する Arg_ジンジパイン（R g p )と、リジン残基の C 末端側にぺプチド結合切断特異性を有する Lys—ジンジパイン（K g p )と力ら構成されている。

この発明はまた、上記ジンジパインを歯周病検出マーカーとして利用して歯周病を診断することからなる歯周病診断方法を提供する。

この発明はさらに、上記ジンジパインを歯周病検出マーカーとして利用して歯周病を簡便に診断することができる歯周病診断キットを提供する。図面の簡単な説明

図 1は、抗体を用いたウェスタンプロット法による K g pと R g pとの測定結果を示す図である。

図 2は、抗 K g p · R g p抗体を用いたウェスタンブロット法による歯周病患者の唾液中の K g pと R g pとの測定結果を示す図である。

図 3は、抗 K g p · R g p抗体を用いたウェスタンプロット法による I型糖尿病患者の唾液中の K g pと R g Pとの測定結果を示す図である。

図 4は。抗 K g p · R g p抗体を用いたウェスタンプロット法による I型糖尿病患者の唾液中の K g pと R g pとの測定結果を示す図である。発明を実施するための最良の形態

この発明は、ジンジバリス菌が産生するシスティンプロテアーゼ (ジンジパイン) を歯周病検出用マーカーとして使用することを特徴としている。

この発明において歯周病検出用マーカーとして使用するジンジパインは、他のプロテア一ゼとはアミノ酸配列においてほとんど類似性を示さない独自のフアミリー（C 2 5 )を構成する酵素群であって、触媒活性として強力なトリプシン様活性を有している。ジンジパインは、そのペプチド結合切断特異性から、アルギニン残基の C末端側に特異的な A r g _ジンジパイン（以下、「R g p」という）とリジン残基の C末端側に特異的な L y s—ジンジパイン（以下、「K g p」という）に分けることができる（山本健二他：プロテオリシスー蛋白質分解の分子機構とバイオロジー（鈴木紘ー ·木南英紀 '田中啓二編）、蛋白質核酸酵素増刊、 PP. 2425-2431、共立出版（19Θ7)； Yamamoto, K. , et al.： in Proteases : New Perspectives (Turk. ！. ed.ノ, pp. 175-18¾, Birkhauser Verlag, Basel (1999)；山本健二：細胞工学、 19, 295-301 (2000) ； Kadowaki, T.， et al.： J. Biochem. , 128, 153 - 159 (2000) )。両酵素とも、大部分が膜結合型酵素として存在し、一部が分泌型として菌体外へ分泌され、それらの生理ならびに病理作用を発現している。

以下に、ジンジパインの構造特性について説明する。

R _g ρをコードする遺伝子はジンジバリス菌染色体上に 2つ（以下、「r g p A」（配列表配列番号 1 ) (Pavloff et al.： J. Biol. Chem. 270, 1007-1010 (1995) ) と、「 r g p B」（配列表配列番号 2 ) (Nakayama : Microbiol. Immunol. , 41, 185-196 (1997) ) という）存在する。 r g p A遺伝子は、プロテアーゼドメインのほかに、 N末端側にシグナルぺプチドとプロべプチド、 C末端側に付着因子ドメインをもっている。付着因子ドメインはさらに赤血球凝集素活性やへモグロビン結合活性をもつ、いくつかのサブドメインからなっている（図 1 a )。シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸に富む 2 4個のアミノ酸からなっており、生合成後の遺伝子産物の内膜への挿入に重要であると考えられる。また、それに続く 2 0 3個のアミノ酸からなるプロペプチドは、酸性ァミノ酸より塩基性ァミノ酸に富み、輸送過程の酵素分子の高次構造の保持に寄与していると考えられる。付着因子ドメインは、極性アミノ酸が非対称の分布を示し、全体としては酸性を示している。この付着因子ドメインは、外膜蛋白質の膜貫通領域に特徴的な両親媒性 (amphipatic)のストランド構造を有しており、これによつて外膜に移送，挿入されるものと考えられる（非特許文献 7 )。また、付着因子ドメィンの機能的重要性を示すものとして、このドメインに赤血球凝集素やへモグロビン結合を担う重要なサブドメインが存在している（Okamoto, K. , et al.： Arch. Biochem. Biophys. , 316, 917—925 (1995) ; Pavloff, N. , et al.： J. Biol. Chem. , 270, 1007-1010 (1995) )。これらサブドメインは付着因子ドメインが外膜への輸送過程でプロセシングを受け、いったん解離した後、プロテアーゼドメインに再会合する形で複合体を形成し、プロテアーゼ活性と共役した形でそれぞれの機能を発揮するものと考えられている。

r g p A遺伝子産物の一部は細胞外へ、残りの大部分は外膜に局在する。細胞外へ分泌される酵素は主としてプロテアーゼドメインのみからなっているが、例外的に HG66株では付着因子ドメインをもつ高分子型酵素が主成分として存在する（Pike, R. , et al.： J. Biol. Chem. , 269, 406-411 (1994) )。膜結合型酵素には、プレブロぺプチドが除去された後、プロテアーゼドメインと付着因子ドメインのサブドメインが非共有的に結合した高分子複合体として存在するものと、プロテアーゼドメインのみからなるものが存在する。さらに、 R g pは糖鎖の修飾 (Curtis, M. A. , et al.： Infect. Immun. , 67, 3816-3823 (1999) ) やリポ多糖の付加（Rangarajan, M. , et al.： Mol. Microbiol. , 23, 855-865 (1997) ) を受けることが指摘されており、これらの糖の種類や修飾の程度によってもさまざまなアイソザィムが存在すると考えられている。第二遺伝子の r g p B遺伝子は r g p A遺伝子の付着因子ドメィンの大部分を欠失していることを除けば、本質的には r g p A遺伝子と同一である（プレブ口ペプチドおよびプロテアーゼドメインの同一性はアミノ酸配列でそれぞれ 7 6 %および 9 3 %) (Nakayama, K.： Mol. Microbiol. , 1, 185-196 (1997) )。このように、 R g pをコ一ドする遺伝子が同一染色体に 2つ存在することは、本酵素が本菌にとつてきわめて重要な因子であることを示すとともに、本菌が外界や宿主との関係で常に多様ィ匕（進化）していることを示唆している。

一方、 K g pは単一の遗伝子（k g p )によってコードされており、その遺伝子産物は R g p A の遗伝子産物と同様にシグナルペプチド、プロペプチド、プロテアーゼドメイン、および付着因子ドメインからなっている（図 1 a ) (Okamoto, Κ·， et al.： J. Biochem.， 120, 398 - 406 (1996)； Barcocy-Ganagher, G. A.， et al.： J. Bacteriol. , 178, 2734-2741 (1996) ; Pavloff, N. , et al.： J. Biol. Chem. , 272， 1593 - 1600)。菌株の違いから K g pをコードする遺伝子も R g pと同様に数種類報告されているが、それらはきわめてよく似たアミノ酸配列を示すことから、異なる株での同一遺伝子と考えられ、現在では K g pという名で統一して扱われている。 K g pと R g pのプレプロぺプチドおよびプロテアーゼドメインには相同性はほとんど認められないが、付着因子ドメイン間には高い相同性が認められる（図 2 )。このことは、これらの遺伝子間に recombinational rearrangementが起こっている可能性を強く示唆する。 K g p も R g pと同様に一部は細胞外へ、残りの大部分は外膜に輸送され、細胞外のものはプロテアーゼドメインのみからなり、膜結合型のものは主としてプロテアーゼドメインと付着因子ドメインに由来するサブドメインの複合体として存在している（図 lb) (山本健二他蛋白質核酸酵素、 Vol. 46， No. 11， pp. 1781-1427 (2001) )。

R g pおよび K g pの触媒ドメィンには、ァミノ酸配列上ほぼ同位置に活性発現に必須の His211/Cys244 2連子（diad)が存在する。 r g p Bの X線結晶構造解析の結果は、本酵素が触媒ドメインと免疫グロプリンスーパーフアミリードメインをもつ単一のポリぺプチドであることを示しており、触媒ドメインはさらに αヘリックスに挟まれた 4個と 6個の |3シート構造をもつ 2つのサブドメインからなっていることを明らかにしている（非特許文献 1 8 )。この 2つのサブドメインはカスパーゼー 1のサプドメイン ρ20と plOによく似たトポロジーをもっている。すなわち、両者は同じ位置に活性ァミノ酸残基の Cysと Hisをもち、類似の基質認識サブサイトと S1ボケットを有している。これらの結果は、ジンジパインフアミリー（fami ly C25)がカスパーゼファミリー（family C11)と共通の祖先から進化したということを支持している。 X線結晶構造解析の結果は、本発明者らが 2次構造解析から得た結果 (図 3)ともよく符合する。

(Eichinger, A.， et al. ： EMBO J.， 18, 5453-5462 (1999)

この発明に係る歯周病検出方法は、生物学的試料中のジンジパイン活性を測定することによって歯周病を検出することからなっている。

この発明に使用することができる生物学的試料としては、例えば、 «；肉溝滲出液（G C F )、唾液、血清などが挙げられる。これらの試料のうち、歯肉溝滲出液（G C F ) の試料としては、ろ紙などを歯肉溝に挿入してその滲出液を採取し、 P B Sなどの溶媒中に浸漬 '溶出させて調製したものを使用するのがよい。唾液、血清などの試料としては、遠心分離をして不溶性沈殿物を除去して調製したものを使用するのがよレ、。この発明に係る歯周病検出方法においては、このようにして調製した生物学的試料について、例えば、 E I A法、酵素学的測定法、ウェスタンプロット法などの酵素活性測定法によって、そのジンジパイン活性を測定するのがよい。この発明に使用することができる測定方法それ自体は、いずれもこの発明が属する技術分野で慣用されている方法である。

この発明において、 E I A法によるジンジパイン活性測定方法は、例えば、生物学的試料を特異抗体と反応させて得られた抗原抗体複合物を除去した後の残存活性を、抗体無添カ卩の試料中の活性から差し引いた活性を R g p活性あるいは K g p活性として測定する。

この発明において、酵素学的測定法によるジンジパイン活性測定方法は、例えば、生物学的試料を特異合成基質と反応させて、得られた遊離蛍光基質成分を蛍光光度計で測定することによって R g p活性あるいは K g p活性を測定することからなっている。

この発明に使用することができる酵素学的測定法に使用する特異合成基質としては、ジンジパイン活性測定に適用することができる合成基質であればいずれも使用することができる。例えば、 R g pに対する特異合成基質としては、例えば、 Z— P h e _ A r g -MC A ( Z =ベンジルォキシカルボニル； MC A = 4—メチルクマリノレー 7 —アミド）、 B o c— P h e— S e r— A r g -MC A ( B o c = t —ブチルォキシカルボニル）、 N— a—ベンゾィル—D L—アルギニン— b—ナフチルアミド（BA PNA)などが挙げられる。また、 Kg pに対する特異合成基質としては、たとえば、 B o c-Va l -L e u-Ly s -MCA, Z— H i s— G l u_Ly s -MCA, N— p—トシルー G l y— P r o— Ly s— p—二トロアニリド（pNA) などが挙げられる。

この発明において、ウェスタンプロット法によるジンジパイン活性測定方法は、例えば、生物学的試料を SDS— PAGEにて測定することによって行なうことができる。使用できる 1次抗体としては、例えば、抗 R g p - Kg p抗体を使用することができ、 2次抗体としては、例えば、 HRP標識抗ゥサギ抗体を使用することができる。また、 1次抗体としては、上記の他に、 Kg p単独に反応する抗体、 Rg p単独に反応する抗体なども使用することができる。

この発明において 1次抗体として使用することができる Kg p単独に反応する抗体としては、例えば、 K g p酵素活性型分子の N末端から 1 6アミノ酸に相当する合成ぺプチドを抗原として、ゥサギに免役して得られたポリクローナル抗体などを使用することができる。

R g p単独に反応する抗体としては、例えば、 R g p酵素前駆体分子に相当する D NAを大腸菌に高発現させ精製したものを抗原として、ゥサギに免役して得られたポリクローナル抗体などを使用することができる。

なお、抗原とする組換え型 R g pは、アミノ酸にして翻訳開始の Me t (1) 〜A r g (71 9) を N末端と C末端の両方に H i sタグが付くように、ベクター p ET 28 aに組み込んだものを、大腸菌 B L 21に形質転換して、 I P TGで発現誘導するのがよい。

Kg pと R g pとの両者を認識する抗体としては、例えば、ジンジバリス菌の培養上清から精製した Kg pと R g pとを混合してゥサギに免役して得られたポリクローナル抗体などを使用することができる。

この発明に係る歯周病検出用キットは、試料採取用具と、合成墓質含有反応液と、ポジティブコント口ールとしての上記歯周病マーカーと、から構成されているのがよレ、。合成基質含有反応液は、合成基質の他に、例えば、バッファ、還元剤などを含んでいるのがよい。

前記合成基質としては、 Rg pに対しては、 Z— P h e— Ar g— MCA (Z=ベンジルォキシカルボ二ノレ； MCA=4—メチルクマリル ^一 7—アミド）、 B o c— P h e— S e r - A r g—MCA (B o c = t一プチノレォキシカノレボニノレ）、 N— a _ ベンゾィル—DL—アルギニン一 b—ナフチルアミド（B APNA)などが挙げられ、また Kg pに対しては、 B o c—Va l—L e u— Ly s -MCA, Z-H i s— G 1 u-L y s— MCAまたは N— p—トシノ G l y— P r o— Ly s— p—二トロァニリド（pNA) などが挙げられる。なお、 Zの他に、ぺプチドのァミノ基末端の保護修飾のために使用されているものであればレ、ずれも使用するこができる。

また、前記還元剤としては、例えば、システィン、ジチオスレィトール、 2—メノレカプトエタノールなどが挙げられる。

この発明に係る歯周病検出用キットは例えば次のようにして使用することができる。ぺリオペ一パーなどの試料採取用具によって、被験者の唾液や歯肉溝浸出液を採取し、この試料の所定量を合成基質含有反応液に添加して反応させた後、蛍光光度計で遊離の AMCを測定することによって、試料中の両酵素活性を測定することができる。 (実施例）

次ぎに、この発明を実施例によって更に詳細に説明する。なお、下記実施例は、この発明を限定する意図で記載するものでは一切なく、この発明をより具体的にかつ例示的に説明するために記載するものである。 .

製造例 1 ：試料の調製

歯肉溝浸出液（GCF) は、ペリオペーパーを 30秒間歯肉溝に 2回挿入して採取し、同ペーパーを 200 μ Lの PBSに浸漬することによって溶出したものを試料として調製した。

唾液または血清は、 1 500 Orpmで 20分間遠心分離して不溶性沈殿物を除去したものを試料として調製した。

実施例 1 ： EIAによる測定法

製造例 1において調製した試料 1 - 50 μ Lに対して、 1— 30 n m ο 1の特異抗体を添加し、 P B Sにて 100 μ Lに調整し、 37 °Cで 10分間反応した後、 4 °Cで一夜静置した。この反応液を、 150001- pmで 20分間遠心分離して抗原抗体複合物を除去し、上清に残った残存活性を測定した。この残存活性を、抗体を添加しない試料中の活性から差し引いた活性を R g p活性または K g p活性とした。

以上の結果、歯周炎の程度の高い患者ほど試料中の両酵素活 ¾、特に高い Rg p活性が検出された。

実施例 2 ：酵素学的測定法

製造例 1において調製した歯肉溝浸出液または唾液 10- 30 μ Lと特異合成基質 (最終濃度 Ι Ο μΜ) を含む反応液（2 OmMリン酸バッファ、 ρΗ7· 5、 5 mM システィン） lmLも 40。Cで 10分間反応させた後、 1 mLの lOmMョード酢酸を含む 0.1M酢酸バッファ、 pH5. 0) を添加して反応を停止させ > 蛍光光度計で遊離の AM Cを測定した（励起波長 38011 m、測定波長 460 nm) 。

合成基質としては、 Rg pに対しては、 Z— Ph e _Ar g— MCAおよび B o c 一 Ph e— S e r— Ar g—MCAを、また g pに対しては、 B o c— Va 1— L e u-Ly s— MCAおよび Z— H i s— G 1 u— Ly s— MCAを使用した。

以上の結果から、歯周炎の程度の高い患者ほど試料中の両酵素活性、特に高い Rg p活性が検出された。

実施例 3 ：ウェスタンプロット法（1次抗体として抗1 § · Kg p抗体を使用）製造例 1において調製した歯肉溝浸出液または唾液 10 /z Lに 0. 1 mMロイぺプチン、 TPCKを添カ卩して（自己分解するため）、メルカプトエタノールを含む可溶化バッファを用いて 100 °Cで 5分間処理した後、 10 %ポリアクリルァミドゲルを用いて SDS— PAGEを行った。電気泳動後のアクリルアミドゲルをニトロセル口ース膜と重ねて転写バッファ（48mMトリス、 39 mMグリシン、 0. 0375% SDS、 20%メタノール）に浸し、セミドライトランスファ装置を用いて 1時間通電（約 15V) してタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。 1次抗体として抗 Rp g · Kg p抗体（1 40000倍希釈）を用い、 2次抗体として HRP標識抗ゥサギ抗体（1/5000倍希釈）を反応させ、 ECLにて検出を行った。

なお、本実施例で 1次抗体として使用した抗 R g p · Kg p抗体は、ジンジハリス菌の培養上清から精製した Kg pと R _g pとを混合してゥサギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。

実施例 4 ：ウェスタンプロット法（1次抗体として抗 Kg p抗体を使用）

製造例 1において調製した歯肉溝浸出液または唾液を、 1次抗体として、抗 R g P ·

Kg p抗体の代わりに Kg p単独に反応する抗体（抗 Kg p抗体） 0. 69mg/mL を使用する以外は実施例 3と同様にして処理し、その酵素活性を測定した。

なお、本実施例で使用した抗 K g p抗体は、 K g p酵素活性型分子の N末端から 1

6アミノ酸に相当する合成ぺプチドを抗原として、ゥサギに免疫して得られたポリクローナル抗体である。

実施例 5 ：ウェスタンプロット法（1次抗体として抗 R g p抗体を使用）

製造例 1において調製した歯肉溝浸出液または唾液を、 1次抗体として、抗 R g P · Kg p抗体の代わりに Rg p単独に反応する抗体（抗 Rg p抗体）を使用する以外は実施例 3と同様にして処理し、その酵素活性を測定した。

なお、本実施例で使用した抗 R g p抗体は、 R g p酵素前駆体分子に相当する DN Aを大腸菌に高発現させ精製したものを抗原として、ゥサギに免疫して得られたポリクローナル抗体（抗血清）である。なお、抗原とする組換え型 Rg pは、アミノ酸にして翻訳開始の Me t (1) 〜Ar g (719) を N末端と C末端の両方に H i sタグが付くように、ベクター p ET 28 aに組み込んだものを、大腸菌 BL 21に形質転換して、 I PTGで発現誘導した。発現した Rg pは、大腸菌の封入体画分に回収されたので、 6Mグァニジン塩酸で可溶ィヒし、ニッケルカラムに結合させ、カラム上で変性剤を徐々に除去することによってリフォ一ルディングさせた後、ィミダゾールにて溶出させて精製した。

参考例 1

抗 K g p抗体、抗 R g p抗体および抗 R g p · Kg p抗体をそれぞれ使用したゥヱスタンプ口ット法の結果を図 1に示す。

なお、図中、 P g =ジンジバリス菌の細胞抽出液； E c =大腸菌の細胞抽出液； P g WT =ジンジバリス菌野生株； P g R g p (―) =ジンジバリス菌 R g p欠損株； P g K g p (-) =ジンジバリス菌 K g p欠損株をそれぞれ示す。

試験例 1

歯周病患者から採取した唾液中の K g p量ならぴに R g p量を、抗 R g p · K g p 抗体を用いたウェスタンプロット法にて測定した。その結果を図 2に示す。図中、 M および Sはそれぞれ歯周炎の程度、つまり軽度および重度を示す。

試験例 2

唾液中の K g p量ならびに R g p量の測定値と、歯周病ならびに全身疾患との関連性について検討した。

健常人、歯周病患者（全身疾患の所見無し）、全身疾患 ·歯周病患者からそれぞれ採取した唾液を、上記実施例に従って合成基質分解活性測定法と、ゥヱスタンプロット法とによってその K g p量ならびに R g p量を測定した。その結果を表 1に示す。その結果、歯周炎の程度の高い患者ほど、試料中に両酵素が高活 1生でかつ高蛋白質量で検出されることが判明した。全身疾患を持つ症例では特に酵素量が高いことが示唆されている。一般的には、 R g pと K g pの相対量を比べてみたときに、狭心症を持つ患者では K g pが、その他の全身疾患を持つ患者では R g pが相対的に高い傾向が示唆された。表 1 ：

活性測定による酵素量ウェスタンプロット法症例全身疾患歯周炎 R G P KG P R G P KG P

P 1 狭心症 . 重度 + + + + + + + + +

P 2 狭心症 ·脳梗塞軽度 + + + + + /- + /-

P 3 狭心症 ·糖尿病軽度 + + + + + + + + + +

P 4 3枝病変虚血性心疾重度 + + + + + + + + + /— 患 ·糖尿病 ·慢性腎不全

P 5 狭心症 ·糖尿病重度 + + + + + + + + +

P 6 大動脈弁閉鎖不全症 - う軽度 + + + + + つ血性心不全

P 7 狭心症 ·子宮筋腫 ·甲状重度 + + + + + + 腺機能亢進症

P 8 一重度 + + + + + + +

P 9 + + +

C 1 ― 症例なし + + /- ― 一 C 2 一症例なし + + /- 一一

C 3 一症例なし + + /— ― ―

C4 ― 症例なし + + 一 ―

C 5 一症例なし + + /- 一 ― 唾液中の KGPおよび RGP量を合成基質分解活性測定とウェスタンプロッ卜法によって測定した。

歯周炎の程度の高い患者ほど、試料中に両酵素の高い活性ならびにタンパク質量が検出される。

全身疾患を持つ症例では、特に酵素量が高いことが示唆される。一般的に RGPと KG Pの相対量で比べて見た時、狭心症を持つ患者では KG Pが、その他の全身疾患を持つ患者では R G Pが相対的に高レ、傾向が示唆される。試験例 3

いずれも歯周病の所見がない I型糖尿病患者（D) から採取した唾液中の Kg p量ならびに Rg p量を、抗 Rg p · Kg p抗体を用いたゥヱスタンプロット法にて測定した。その結果を図 3および図 4に示す。なお、図中、症例の Pは歯周病患者を、 C は健常人を示している。

実施例 6 ：歯周病検出用キット

下記の構成からなる歯周病検出用キットを作成した。

試料採取用具として、ペリオペーパー（商標）、

ポジティブコントロールとしての歯周病マーカー（Rg p/Kg p) 、

合成基質として、 Rg pに対しては、 Z— Ph e— Ar g— MCA、また Kg p に対しては、 B o c— V a 1— L e u_Ly s _MCA、

ノッファとして、 PB S、

還元剤としてもシスティン、

をキットとして調製した。

試験例 4

歯肉溝内にペリオペーパーを 30秒間 2回挿入して、歯肉溝浸出液を採取し、バッファとしての PBS中に浸漬して試料を溶出させた。このように溶出した試料を、特異合成基質（最終濃度 10 M) を含む反応液（ 20 mMリン酸バッファ、 p H 7 · 5、 5 mMシスティン） lmLに添加して、実施例 2と同様にして酵素学的測定法にて蛍光光度計で遊離の AMCを測定した（励起波長 380 n m、測定波長 460 n m)。この結果、実施例 2で得られた同様の測定値が得られた。産業上の利用可能性

この発明は、ジンジバリス菌が産生するシスティンプロテア一ゼ (ジンジパイン) を歯周病検出用マーカーとして使用することによって、歯周病を確実にかつ簡便に検出することが可能になるという大きな利点がある。

また、この発明は、ジンジパインを歯周病検出用マーカーとして使用して歯周病を確実にかつ簡便に検出することによって、同時に狭心症、糖尿病などの全身疾患の診断も可能にすることができるという利点もある。

更に、歯周炎の程度の高い患者ほど、試料中に両酵素が高活性でかつ高蛋白質量で検出されることが判明した。その上、全身疾患を持つ症例では特に酵素量が高く、一般的には、 R g pと K g pの相対量を比べてみたとき、狭心症を持つ患者では K g p が、その他の全身疾患を持つ患者では R g pが相対的に高い傾向が示唆された。したがって、この発明に係る歯周病検出方法や診断方法は、両酵素量の相対比較により歯周炎の程度をも診断することが可能であるという極めて有用な手段を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 ジンジバリス菌が産生するシスティンプロテアーゼからなる歯周病検出のための歯周病マーカー。

2 請求の範囲第 1項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記システィンプロテァーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病マーカー。

3 請求の範囲第 1項または第 2項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記ジンジパインが、アルギニン残基の C末端側にペプチド結合切断特異性を有する A r g— ジンジパインと、リジン残基の C末端側にぺプチド結合切断特異性を有する L y s— ジンジパインとからなることを特徴とする歯周病マーカー。

4 請求の範囲第 1項ないし第 3項のいずれか 1項に記載する歯周病マーカーにおいて、前記 A r g—ジンジパインが配列表の配列番号 1に記載するアミノ酸配列を有すること、また L y s—ジンジパインが配列表の配列番号 2に記載するァミノ酸配列を有することを特徴とする歯周病マーカー。

5 請求の範囲第 1項ないし第 4項のいずれか 1項に記载する歯周病マーカーにおいて、前記 A r g—ジンジパインが配列表の配列番号 3に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有していること、また L y s—ジンジパインが配列表の配列番号 4に記載するァミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有することを特徴とする歯周病マーカー。

6 ジンジパリス菌が産生するシスティンプロテア一ゼを歯周病検出のための歯周病マーカーとして使用することを特徴とする歯周病検出方法。

7 請求の範囲第 6項に記載する歯周病検出方法において、唾液中の前記システィンプロテアーゼを検出することを特徴とする歯周病検出方法

8 請求の範囲第 6項または第 7項に記載する歯周病検出方法において、前記システィンプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病検出方法。

9 請求の範囲第 6項ないし第 8項のいずれか 1項に記載する歯周病検出方法において、前記システィンプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病検出方法。 1 0 請求の範囲第 6項ないし第 9項のいずれか 1項に記載する歯周病検出方法において、前記ジンジパインが、アルギニン残基の C末端側にペプチド結合切断特異' I生を有する A r g—ジンジパインと、リジン残基の C末端側にペプチド結合切断特異性を有する L y s一ジンジパインとからなることを特徴とする歯周病検出方法。

1 1 請求の範囲第 6項ないし第 1 0項のいずれか 1項に記載する歯周病検出方法において、前記 A r g—ジンジパインが配列表の配列番号 1に記載するアミノ酸配列を有すること、また L y s—ジンジパインが配列表の配列番号 2に記載するァミノ酸配列を有することを特¾¾とする歯周病検出方法。

1 2 請求の範囲第 6項ないし第 1 1項のいずれか 1項に記載する歯周病検出方法において、前記 A r g一ジンジパインが配列表の配列番号 3に記載するァミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有していること、また L y s—ジンジパインが配列表の配列番号 4に記載するァミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有することを特徴とする歯周病検出方法。

1 3 ジンジパリス菌が産生するシスティンプロテア一ゼを歯周病検出のための歯周病マーカーとして使用して歯周病を診断することを特徴とする歯周病診断方法。

1 4 請求の範囲第 1 3項に記載する歯周病診断方法において、唾液中の前記システィンプロテア一ゼを歯周病マーカーとして使用することことを特徴とする歯周病診断方法。

1 5 請求の範囲第 1 3項または第 1 4項に記載する歯周病診断方法において、前記システィンプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病診断方法。

1 6 請求の範囲第 1 2項ないし第 1 5項のいずれか 1項に記載する歯周病診断方法において、前記システィンプロテアーゼがジンジパインであることを特徴とする歯周病診断方法。

1 7 請求の範囲第 1 2項ないし第 1 6項のいずれか 1項に記載する歯周病診断方法において、前記ジンジパインが、アルギニン残基の C末端側にペプチド結合切断特異性を有する A r g一ジンジパインと、リジン残基の C末端側にぺプチド結合切断特異性を有する L y s—ジンジパインとからなることを特徴とする歯周病診断方法。 - 1 8 請求の範囲第 1 2項ないし第 17項のいずれか 1項に記載する歯周病診断方法において、前記 A r g一ジンジパインが配列表の配列番号 1に記載するァミノ酸配列を有すること、また L y s—ジンジパインが配列表の配列番号 2に記載するァミノ酸配列を有することを特徴とする歯周病診断方法。

1 9 請求の範囲第 1 2項ないし第 1 8項のいずれか 1項に記載する歯周病診断方法において、前記 A r g一ジンジパインが配列表の配列番号 3に記載するァミノ酸配列からなるプロテアーゼドメインを有していること、また L y s—ジンジパインが配列表の配列番号 4に記載するアミノ酸配列からなるプロテアーゼドメィンを有することを特徴とする歯周病診断方法。

20 試料採取用具と、歯周病検出のための歯周病マーカーと、合成基質と、バッファと、還元剤と、請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載する歯周病マーカーと、から構成されていることを特徴とする歯周病.検出キット。

21 請求の範囲第 20項に記載する歯周病診断キットにおいて、前記合成基質が、 Rg pに対しては、 Z— Ph e— Ar g_MCA ( Z =ベンジルォキシカルボニル； MCA= 4—メチルクマリル一 7—アミド）、 B o c— Ph e— S e r— Ar g— M CAまたは N— a—ベンゾィル— DL—アルギニン一 b—ナフチルアミド（BAPN A) であり、また K g pに対しては、 B o c一 V a 1— L e u_Ly s— MCA (B o c = t—ブチルォキシカルボニル）、 Z— H i s— G 1 u_Ly s— MCAまたは N— p—トシノレー G 1 y— P r o— Ly s— p—ニトロァニリド（p NA) であることを特徴とする歯周病検出キット。

22 請求の範囲第 20項または第 21項に記載する歯周病診断キットにおいて、前記還元剤がシスティンであることを特徴とする歯周病診断キット。

23 請求の範囲第 20項ないし第 22項のいずれか 1項に記載する歯周病診断キットを使用して歯周病を診断することを特徴とする窜周病診断方法。

24 請求の範囲第 23項に記載する歯周病診断方法において、唾液を使用して歯周病を診断することを特徴とする歯周病診断方法。