WO2004106501A1 - 単球株化細胞の凍結保存方法及び該方法に利用される培地 - Google Patents

単球株化細胞の凍結保存方法及び該方法に利用される培地 Download PDF

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    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/34—Sugars

Definitions

  • the present invention relates to a cryopreservation method of a cell line and a medium used in the method, and more particularly, to a cryopreservation method of an animal monocyte cell line and a medium used in the method.
  • Cryopreservation of cells is performed to prevent cell deterioration due to passage, to prevent contamination by various bacteria, and to reduce the complexity of maintaining the passage.
  • the culture media for cryopreservation of cells that have been used to date include, usually, fetal calf serum (hereinafter abbreviated as "FBS") and 5-15% dimethyl sorboxide (hereinafter “FBS”).
  • FBS fetal calf serum
  • FBS 5-15% dimethyl sorboxide
  • DMSO fetal calf serum
  • glycerin glycerin
  • the preservation method is common.
  • the advantage that DMSO has long been used for cryopreservation of cells as the medium is that when the ice crystals present in the cells during the cryopreservation are increased and then the cells are thawed from the preservation state, It is said that cells are not killed.
  • Non-Patent Document 1 Journal of Immunological Methods 272 (2003) 35-48
  • Non-Patent Document 2 New Microbiologica, 23: 441-444
  • Non-Patent Document 3 New Microbiologica, 24: 243-247
  • an object of the present invention is to provide a cryopreservation method suitable for animal monocyte cell lines and a medium used in the method.
  • the object is a method for cryopreservation of a monocyte cell line, comprising: (1) dispersing the monocyte cell line in a medium containing a monosaccharide and serum to prepare a dispersion liquid; 2) freezing the dispersion and storing it under liquid nitrogen.
  • the monosaccharide is glucose
  • the concentration of the glucose is at least 5% by weight based on the total weight of the medium.
  • the above method is characterized in that the serum is fetal calf serum.
  • a medium for cryopreservation of a monocyte cell line comprising a monosaccharide and serum.
  • the monosaccharide is glucose.
  • the glucose concentration is at least 5% by weight based on the total weight of the medium.
  • the serum is fetal calf serum.
  • a cryopreservation method and a cryopreservation medium useful for monocyte cell lines are provided by using the medium according to the present invention containing serum and glucose which is a monosaccharide.
  • Animals used in the present invention are not particularly limited, and include dogs, pigs, cats and humans. Then, cryopreservation of a monocyte cell line of a powerful animal is targeted.
  • the monocyte cell line used in the present invention a cell obtained by passage of monocyte cells collected from peripheral blood of various healthy animals is used.
  • a cell obtained by passage of monocyte cells collected from peripheral blood of various healthy animals is used.
  • heparin was added to the blood immediately after collection, diluted with cooled phosphate buffered saline, and then diluted with prescribed saline.
  • a monocyte cell line obtained by passage of monocyte cells obtained according to the protocol of the present invention can be used in the present invention.
  • the cryopreservation method according to the present invention will be specifically described.
  • the monocyte cell line obtained as described above is dispersed in a medium containing a monosaccharide and serum, and then frozen. Then, it is frozen and stored under liquid nitrogen for a desired period.
  • serum used in the cryopreservation method according to the present invention it is preferable to use fetal serum from the viewpoint of availability.
  • the monosaccharides used in the cryopreservation method according to the present invention include glucose and fructo. And galactose.
  • glucose is an example of a monosaccharide suitable for the culture medium of a monocyte cell line.
  • the amount of the monosaccharide added to the medium used in the cryopreservation method according to the present invention must be at least 5% by weight or more based on the total weight of the medium. If the amount of saccharide added is less than 5% by weight, the viability after thawing after cryopreservation is low, which is not preferable.
  • an inorganic component examples include phosphorus, nitrogen, potassium, calcium, magnesium, zinc, iron, manganese, zinc, boron, copper, molybdenum, chlorine, sodium, iodine, and cobalt.
  • these components include, for example, potassium nitrate, sodium nitrate, calcium nitrate, potassium chloride, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, calcium chloride, magnesium sulfate, sodium sulfate, ferrous sulfate, ferrous sulfate, and the like.
  • It can be added as a compound such as diiron, manganese sulfate, zinc sulfate, boric acid, copper sulfate, sodium molybdate, molybdenum trioxide, potassium iodide, cobalt cobalt salt, and the like.
  • vitamins for example, piotin, thiamine (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), pantothenic acid, inositol, nicotinic acid and the like can be added.
  • amino acids for example, glycine, phenylalanine, leucine, glutamine, cysteine and the like can be added.
  • each of the above-mentioned components can be used at a concentration of about 0.1 ⁇ to 100 ⁇ of inorganic components, and vitamins and amino acids at a concentration of about 0.1 to about 100 mg / 1, respectively. .
  • the culture medium used in the cryopreservation method according to the present invention is added with a cryoprotectant in advance, and after adding cells to be cryopreserved, the mixture is frozen.
  • a cryoprotectant examples include dimethyl sulfoxide, ethylene glycol, glycerin, glucose and the like.
  • the freezing method used in the present invention includes: 1) a method in which monocyte cells are treated with a relatively high concentration of a cryoprotectant and then rapidly cooled with liquid nitrogen; 2) the cells are treated with a cryoprotectant. After the treatment, a method of freezing to 40 ° C to 80 ° C using a program freezer or the like as necessary, followed by rapid cooling with liquid nitrogen (preliminary freezing method) may be mentioned.
  • the freezing method may be appropriately selected depending on the type of the cell.
  • the cells cryopreserved according to the present invention can be used for reculturing after thawing and water supply.
  • liquid Monocyte cells stored in nitrogen for example, can be rapidly thawed in warm water at 35-37 ° C, and then, after removal of the cryoprotectant, preferably contain 1.0-1.2M sugar. Add medium to absorb water. Thereafter, the cells are recultured using a medium used for cell culture, which is well known in the art.
  • the survival rate of the thawed monocyte cells after cryopreservation can be confirmed by a staining method.
  • an example of an animal monocyte cell line will be described.
  • a monocyte cell line from which blood of dogs, pigs, cats and humans was collected was used for the freeze-preservation method of the present invention.
  • PBS cold Dulbecco's phosphate buffered saline
  • the leukocyte fraction obtained in this manner is suspended in a basic cell culture medium (hereinafter referred to as “CGM”) described below so that the number of cells per ml becomes about one million, and 10 ml of each is suspended in a glass.
  • CGM basic cell culture medium
  • the mixture was distributed into flasks (culture area: 4 cm x 8 cm), and cultured statically at 36.5 ° C.
  • the basic cell culture medium used was a slightly modified Dulbecco's modified Eagle medium.
  • the basic cell culture medium contains, per 1000 ml, lg glucose, 2 g galactose, lg fructose, 0.3 g N-acetyl-D (+)-darcosamine, 0.2 g HEPES, and 0.22 g Sodium pyruvate was further added.
  • Heat-inactivated fetal calf serum (hereinafter referred to as “FBS”) was contained in CGM at 10-20%.
  • Antibiotics were added according to the usual method. After one day of culture, the primary culture is rinsed with warm CGM to remove non-adherent cells, and then, during culture, at intervals of 3 days 4 days, One part was replaced. In this way, the cells were cultured for 4 weeks.
  • the leukocyte fraction mainly containing lymphocytes and monocytes was obtained by centrifugation (800 ⁇ g for 15 minutes).
  • the leukocyte fraction thus obtained was suspended in the above-mentioned CGM so that the number of cells per ml became about 1 million, and the cells were cultured at 36.5 ° C for static culture. Dispersed in a flask. To maintain only adherent cells, the primary culture was rinsed with warm CGM during the 20 hour culture. After three weeks of culture, a number of adherent cells were identified.
  • SWZK99 conditioned media removed from porcine monocyte cell cultures
  • the CGM was replaced twice a day to initiate numerous epithelial cell growths, one of which was designated FL / K02 and subcultured in glass flasks.
  • the subcultured cells of the 14th and 14th passages were subjected to the experiments described below.
  • Example 4 Heparin was added to about 30 ml of blood immediately after collection of humans, and diluted with cold dilute cation-free cold dabelco's phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PBS”).
  • PBS cold dilute cation-free cold dabelco's phosphate buffered saline
  • the blood thus obtained was gently layered on the supernatant with an equal volume of a specific gravity solution (1.077 g / ml) and centrifuged (800 xg for 15 minutes). Almost at the center, a band was formed that also had lymphocytes and monocyte power. This band was suspended in CGM, and the centrifugation was repeated.
  • the cells were suspended again in GM so that the number of cells per 1 ml becomes about 2 million, and distributed in a glass cell culture flask (culture area: 32 cm 2 ).
  • One of the lines with particularly excellent proliferative properties was named "K63" and was subcultured up to the 26th generation. For the cryopreservation experiments described below, cells subcultured with the 12th and 24th passages were used.
  • the cells obtained as described above were grown in a glass flask using a nutrient medium containing 10% FBS (hereinafter referred to as “GM”).
  • GM a nutrient medium containing 10% FBS
  • the cells after the culture were dispersed even in an EDTA-tyrosine mixed solution, washed twice with cold GM, and then resuspended in a cryopreservation medium described later.
  • cryopreservation medium used in the experiment of the present invention is shown below.
  • Medium 1 The medium according to the present invention, which is composed of 75 volumes of FBS + 25 volumes of 20% (w / v) dalcose.
  • Medium 2 As a comparative example, consists of 65 volumes of FBS + 25 to 20 weight 0/0 glucose + 10 volumes of volumes DMSO.
  • Medium 3 As a comparative example, consists of glycerin glucose + 10 volumes of 65 20 weight 0/0 of FBS + 25 ml of volume.
  • Medium 4 As a comparative example, it is composed of 90 volumes of a nutrient solution containing 10% FBS + 10 volumes of DMSO.
  • Various monocyte cells are suspended in a cryotube (a serum tube manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) containing the above culture medium so that the number of cells per 1.5 ml becomes about 2 to 3.5 million cells. Let Was. Immediately after, the tubes were maintained at 4 ° C for 40 minutes, then at -80 ° C for 40 minutes, and then stored in liquid nitrogen.
  • a cryotube a serum tube manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • the cells were thawed in a water bath at 38 ° C for 5 minutes, and then the cells were washed once with a sufficient amount of cold GM. In order to examine the cell viability by the trypan blue dye exclusion test, the washed cells were suspended and diluted again with the above GM.
  • the cell suspension was diluted with GM, and seeded on a glass petri dish (6 cm in diameter) at a rate of 10 ml per dish or 1.5 ml per slip. These cultures were incubated at a temperature of 36.5 ° C. and a humidity of 99% for 3 days while refluxing 0.1% CO gas. 5% e
  • FIG. 1 shows the results of the recovery after thawing of all the monocyte cell lines after cryopreservation performed in the experiment of the present invention.
  • the medium 1 according to the present invention contained 97.5% and 95% of each of the monocyte cell lines SW / K99, Cn / K99, FL / K02 and K63, respectively. It was demonstrated that recovery could be achieved with high viability rates of 5%, 98.5% and 92.5%.
  • the recovery rate of each monocyte cell line by thawing after cryopreservation was considerably lower. Specifically, for SW / K99, 72.5%, 70.5% and 73.6% of the culture medium containing DMSO and glycerin, which are mediums 2, 3, and 4, respectively. The recovery rate proved to be impractical. In contrast, the medium 1 according to the present invention was found to be a practically useful cryopreservation medium for monocyte cell lines.
  • FIG. 1 shows the results of the recovery rate after thawing of all monocyte cell lines after cryopreservation performed in the present invention.

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Abstract

　本発明の目的は、単球株化細胞に適する凍結保存方法及び該方法に利用される培地を提供することである。そして、上記目的は、単球株化細胞の凍結保存方法であって、（１）単糖類と、血清と、を含む培地に前記単球株化細胞を分散させて分散液を調製する工程と（２）前記分散液を凍結させるとともに、液体窒素下で保存する工程と、を備える方法により達成される。

Description

明 細 書
単球株化細胞の凍結保存方法及び該方法に利用される培地
技術分野
[0001]
本発明は、株化細胞の凍結保存方法及びその方法に利用される培地に係り、より 詳細には、動物の単球株化細胞の凍結保存方法及びその方法に利用される培地に 関する。
背景技術
[0002]
細胞の凍結保存は、継代による細胞変質の防止や雑菌による汚染の防止、並びに 継代維持の煩雑さの解消のために行われて 、る。
[0003] 現在までに利用されて!ヽる細胞の凍結保存用培地は、通例、ゥシ胎児血清（以下「 FBS」と略称する。）と、 5— 15%のジメチルソルホキシド（以下「DMSO」と略称する 。）やグリセリンが利用される (たとえば、非特許文献 1参照)。そして、多くの細胞がか 力る凍結培地にて十分に保存されることが知られている。そして、前記培地に細胞を 懸濁し、クライオチューブやアンプルに詰め、プログラムフリーザーを用いて、— 1°C/ min前後の速度で冷却し、最終的に液体窒素中（- 196°C)での保存方法が一般的 である。
[0004] 特に、前記培地として DMSOが古くから細胞の凍結保存に用いられる利点は、凍 結保存時の細胞に存在する氷の結晶を大きくし、その後、保存状態から前記細胞を 融解させたときに、細胞が死滅させないためである、といわれている。
[0005] し力しながら、ィヌ、豚やネコなどの単球株化細胞の凍結保存のために、前述した F BSと DMSOとを含む凍結培地を適用した場合には、他の細胞とは異なり、十分な保 存効果を奏しないことを、本発明者は発見した。また、熱失活 FBSの 10%を添加し た増殖培地中で、凍結保存後の前記単球株化細胞が成長したが、前記増殖培地を 頻繁にリフレッシュする必要があるという煩雑さを伴うものであった。
[0006] なお、ィヌゃブタの単球株化細胞の榭立は、本発明者がなしたものである（非特許 文献 2及び 3を参照)。とりわけ、単球株化細胞は免疫学及び感染症学の研究に極め て有用な細胞であるため、長期間の保存が可能となれば、本研究分野のますますの 進展が期待される。
[0007] そのため、ヒトを含む動物の単球株化細胞の凍結保存方法及び該方法に利用され る培地の開発が強く要望されている。
非特許文献 1 : Journal of Immunological Methods 272(2003) 35-48
非特許文献 2 : New Microbiologica, 23: 441-444
非特許文献 3 : New Microbiologica, 24: 243-247
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0008]
そこで、本発明は、上記事情に鑑み、動物の単球株化細胞に適する凍結保存方法 及び該方法に利用される培地を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0009]
上記目的は、単球株化細胞の凍結保存方法であって、（1)単糖類と、血清と、を含 む培地に前記単球株化細胞を分散させて分散液を調製する工程と (2)前記分散液 を凍結させるとともに、液体窒素下で保存する工程と、を備える方法により達成される
[0010] 本発明の好ま 、態様によれば、前記方法にお!、て、前記単糖類がグルコースで あることを特徴とする。
[0011] 本発明の好ましい態様によれば、前記方法において、前記グルコースの濃度が、 培地の全重量に対して、少なくとも 5重量％であることを特徴とする。
[0012] 本発明の好ま 、態様によれば、前記方法にお!、て、前記血清がゥシ胎児血清で あることを特徴とする。
[0013] また、上記の目的は、単糖類と、血清と、を含む、単球株化細胞の凍結保存用培地 により達成される。
[0014] 本発明の好ま 、態様によれば、前記培地にお!、て、前記単糖類がグルコースで あることを特徴とする。
[0015] 本発明の好ましい態様によれば、前記培地において、前記グルコースの濃度が、 培地の全重量に対して、少なくとも 5重量％であることを特徴とする。
[0016] 本発明の好ま 、態様によれば、前記培地にお!、て、前記血清はゥシ胎児血清で あることを特徴とする。
発明の効果
[0017]
本発明によれば、血清及び単糖類であるグルコースを含有する本発明に係る培地 を用いれば、単球株化細胞にとって、有用な凍結保存方法及び凍結保存用培地が 提供される。
発明を実施するための最良の形態
[0018]
以下の実施形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施形態 にのみ限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、さまざまな形 態で実施することができる。
[0019] 本発明に利用される動物は、特に限定されるものではないが、ィヌ、ブタ、ネコゃヒト などが挙げられる。そして、力かる動物の単球株化細胞の凍結保存を対象とする。
[0020] 本発明に利用される単球株化細胞は、健常な種々の動物の抹消血液中から採取 される単球細胞を継代させたものを利用する。たとえば、ィヌの例では、健常な若年 のメスのビーグル犬力 採取直後の血液にへパリンを添カ卩して、冷却させたリン酸緩 衝ィ匕生理食塩水で希釈したのちに、所定のプロトコールに従って得られた単球細胞 を継代させた、単球株化細胞が、本発明において利用可能である。
[0021] 本発明に係る凍結保存方法について、具体的に説明する。前述のように得られた 単球株化細胞を、単糖類と血清とを含有する培地中に分散させ、その後、凍結させ る。次いで、液体窒素下にて所望の期間、凍結保存する。
[0022] 本発明に係る凍結保存方法に利用される血清には、入手可能の容易性から、ゥシ 胎児血清を利用することが好ま ヽ。
[0023] また、本発明に係る凍結保存方法に利用される単糖類には、グルコース、フルクト ース、ガラクトース等が挙げられる。特に、単球株化細胞の培地に好適な単糖類とし ては、グルコースが挙げられる。そして、本発明に係る凍結保存方法に利用される培 地に添加される単糖類の量は、培地の全重量に対して少なくとも 5重量％以上である 必要がある。糖類の添加量が 5重量％未満の場合、凍結保存後の融解させた際の 生存率が低くなるため、好ましくない。
[0024] 本発明に係る凍結保存方法に利用される培地には、必要に応じて、無機成分、ビ タミン類、アミノ酸類を添加することができる。無機成分としては、たとえば、リン、窒素 、カリウム、カルシウム、マグネシウム、ィォゥ、鉄、マンガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブ デン、塩素、ナトリウム、ヨウ素、コバルト等が挙げられる。これらの成分は、たとえば、 硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、塩ィ匕カリウム、リン酸一水素カリウム、 リン酸二水素カリウム、塩ィ匕カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸第一 鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム 、三酸ィ匕モリブデン、ヨウ化カリウム、塩ィ匕コバルト等の化合物として添加できる。
[0025] ビタミン類としては、たとえば、ピオチン、チアミン (ビタミン B1) ,ピリドキシン (ビタミ ン B6)、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が添加できる。
[0026] アミノ酸類としては、たとえば、グリシン、フエ-ルァラニン、ロイシン、グルタミン、シ スティン等を添加できる。
[0027] 一般に、前述の各成分は、無機成分が約 0. 1 μ Μ— 100 μ Μ、ビタミン類及びアミ ノ酸類が、それぞれ約 0. 1—約 lOOmg/1の濃度で用いることができる。
[0028] 本発明に係る凍結保存方法に利用される培地には、予め凍結防止剤を添加して、 凍結保存させるべき細胞を添加した後に、凍結する。前記凍結防止剤としては、ジメ チルスルホキシド、エチレングリコール、グリセリン、ブドウ糖等が挙げられる。
[0029] 本発明に利用される凍結方法としては、 1)単球細胞を比較的高濃度の凍結防止剤 で処理した後、液体窒素で急速に冷却する方法、 2)細胞を凍結防止剤で処理した後 、必要に応じプラグラムフリーザーなどを用いて、 40°C 80°Cまで凍結し、その 後液体窒素で急冷する方法 (予備凍結法）が挙げられる。凍結方法は細胞の種類に 応じて適当な方法を適宜選択すればよい。
[0030] 本発明により凍結保存した細胞は、融解、給水した後に再培養に使用できる。液体 窒素中に保存した単球細胞は、たとえば、 35— 37°Cの温水で急速に融解し、次い で、凍結防止剤を除去した後、好ましくは 1. 0-1. 2Mの糖を含有する培地を加え て吸水させる。その後、従来力も公知の細胞培養に用いられる培地を用いて再培養 させる。
[0031] なお、凍結保存後に融解させた単球細胞は、染色法によりその生存率を確認する ことができる。
実施例
[0032] 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの 実施例に限定されるものではな 、。
[0033] まず、動物の単球株化細胞についての実施例を説明する。本発明においては、ィ ヌ、ブタ、ネコ及びヒトの血液力も採取した単球株化細胞を用いて、本発明に係る凍 結保存方法の利用に供した。
[実施例 1]
健常な若年のメスのビーグル犬力も採取し、へパリンを添カ卩した血液の約 30mlに 対して、 3倍量の冷ダルベッコリン酸緩衝ィ匕生理食塩水（以下「PBS」という。）で希釈 した。このようにして得られた血液を、 3時間 10°Cに維持し、等量の比重液 = 1. 0 77)の上に、上澄部を静かに重層し、遠心分離 (800xg 15分）に供したところ、遠 心管のほぼ中央部にリンパ細胞と単球力 なるバンドが形成され、白血球フラクショ ンを分離した。このようにして得られた白血球フラクションを、後述する基本細胞培養 培地（以下「CGM」という。）中にて、 1mlあたりの細胞が約百万個となるように懸濁さ せ、 10mlずつ、ガラスフラスコ（培養面積 4cmx8cm)に分配し、 36. 5°Cにて静止培 養した。基本細胞培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地を僅か〖こ修正させたも のを用いた。さらに、その基本細胞培養培地には、 1000mlあたり、 lgのグルコース、 2gのガラクトース、 lgのフルクトース、 0. 3gの N—ァセチルー D ( + )—ダルコサミン、 0 . 2gの HEPESと、 0. 22gのピルビン酸ナトリムを、さらに添カ卩した。 CGM中に、熱失 活させたゥシ胎児血清 (以下「FBS」という。）を、 10— 20%で含有させた。また、常 法にしたがって抗生物質を添加した。 1日培養後、非接着細胞を除去するため、温 C GMで一次培養をリンスし、次いで、培養中、 3日力 4日の間隔で、前記 CGMの 3 分の 1の量を置換した。このようにして、 4週に亘り細胞培養した。そして、このように 培養させた細胞のうちの一部を、ピペットにて取出し、ペトリ皿に移動させ、インビトロ での成長を確保した。そのうちの一つを CnZK99と指称し、継代培養させた。本発 明では、第 12代及び第 15代の継代培養させた細胞を、下記の実験に利用した。
[実験例 2]
健常な大人のメスブタカ 採取した血液であって、直後にへパリンを添カ卩した血液 の約 50mlに対して、カルシウム及びマグネシウム塩を含有しな!、冷 PBSにて希釈し た。リンパ球及び単球を主に含有する白血球フラクションを、遠心分離 (800xg 15 分）により得た。このようにして得られた白血球フラクションを、前述の CGMにて、 lml あたりの細胞が約百万個となるように懸濁させ、 36. 5°Cにて静止培養させるために 細胞培養用ガラスフラスコにて分散させた。接着細胞のみを維持するため、一次培 養を、 20時間培養中に温 CGMでリンスした。 3週間培養後、数多の接着細胞を同定 した。実際に、ブタ単球細胞培養から取出した調製済培地の添加後、細胞成長は、 顕著に向上した。そのうちの一つを、 SWZK99と指称し、ガラスフラスコ及びプラス チックフラスコにて継代培養させた。本発明では、第 48代及び第 49代の継代培養さ せた細胞を、後述する実験に利用した。
[実施例 3]
健常なメスネコ（2歳）から採取した血液であって、直後にへノ^ンを添加した、レトロ ウィルス及びコロナウィルス不存在の血液約 10mlに対し、カルシウム及びマグネシゥ ム塩を含有しない冷 PBSで希釈した。リンパ球及び単球を主に含有する白血球フラ クシヨンを、実施例 1と同様な条件にて濃度勾配遠心分離により得た。このようにして 得られた白血球フラクションを、前述の CGMにて lmlあたりの細胞が約百万個となる ように懸濁させ、細胞培養用ガラスフラスコにて分散させて、 36. 5°Cにて静止培養さ せた。一次培養を、 20時間培養液中にて温 CGMでリンスした。このようにして、非接 着細胞を除去した。 2週間の培養中、 1日に 2回 CGMを置換し、数多の上皮細胞成 長を開始し、そのうちの一つを FL/K02と指称し、ガラスフラスコにて継代培養させ、 第 13代及び第 14代の継代培養させた細胞を後述する実験に供した。
[実施例 4] ヒトの採取直後の約 30mlの血液にへパリンを添カ卩し、二価の陽イオン不含有の冷 ダベルッコリン酸緩衝ィ匕生理食塩水（以下「PBS」という。）で希釈した。このようにして 得られた血液を、等量の比重液 = 1. 077g/ml)の上に、上澄部を静かに重層し 、遠心分離 (800xg 15分）に供したところ、遠心管のほぼ中央にリンパ細胞と単球 力もなるバンドが形成された。このバンドを、 CGMにて懸濁させ、遠心分離を繰り返 した。その後、 1ml当たりの細胞が約 200万個となるように、 10mlずつ、再度 GM中 にて懸濁させ、ガラス製の細胞培養フラスコ（培養面積： 32cm2)にて分配し、 36. 5 °Cにて静止培養した。接着性細胞のみを入手するため、 20時間培養後、少なくとも 1 日 2回、半分量の GMをリフレッシュした。 2週間後、数多の接着性クローン細胞の成 長が確認された。そのうちの特に増殖性の優れた系の一つを「K63」と命名し、 26代 までは継代培養させた。そして、後述する凍結保存の実験には 12代及び 24代と継 代培養させた細胞を利用した。
[凍結保存]
上記のようにして得られた細胞を、 10%FBSを含有する栄養培地（以下「GM」と ヽ う。）を用いて、ガラスフラスコにて成長させた。培養後の細胞を EDTA—チロシン混 合溶液にて分散さえ、冷 GMで 2回洗浄し、次いで、後述する凍結保存培地にて再 懸濁させた。
[0034] 本発明の実験に供した凍結保存培地を、以下に示す。
[0035] (1)培地 1：本発明に係る培地であって、 75容の FBS + 25容の 20% (w/v)ダルコ ースからなる。
[0036] (2)培地 2 :比較例として、 65容の FBS + 25容の 20重量0 /0のグルコース + 10容の DMSOからなる。
[0037] (3)培地 3 :比較例として、 65容の FBS + 25容の 20重量0 /0のグルコース + 10容の グリセリンからなる。
[0038] (4)培地 4 :比較例として、 10%FBSを含有する栄養液 90容 + 10容の DMSOとか らなる。
[0039] 各種単球細胞を、 1. 5mlあたりの細胞が約 200万から 350万個となるように上記培 地を含有する凍結チューブ (住友ベークライト (株)製の血清チューブ）にて懸濁させ た。直後に、これらのチューブを 4°Cで 40分間維持し、次いで、—80°Cで 40分間に 維持させたのち、液体窒素にて保存した。
[0040] 液体窒素にお 、て 30日間保存した後、細胞を 38°Cの水浴中で 5分間融解し、次 いで、十分量の冷 GMで、細胞を 1回洗浄した。トリパンブルー色素排除試験によつ て細胞の生存率を調べるために、洗浄後の細胞を前記 GMにて、再度、懸濁し希釈 した。
[0041] さらに、この細胞懸濁液を GMで希釈して、ガラス製ペトリ皿（直径 6cm)に、 1皿あ たり 10ml、または 1スリップあたり 1. 5mlずつ播種した。これらの培地を、温度 36. 5 °C、湿度 99%で、 0. l%COガスを還流しながら、 3日間インキュベートした。 5%ホ
2
ルマリン含有の 0. 1%クリスタルバイオレット溶液で 2分間染色した後、ペトリ皿中の 細胞クローン数を数えた。スリップ培養をメタノールで固定し、ギムザ染色を行った。
[0042] 図 1は、本発明の実験にて行った凍結保存後の全ての単球株化細胞の融解後の 回収率の結果を示す。図 1に示す結果から明らかなように、本発明に係る培地 1は、 SW/K99、 Cn/K99、 FL/K02及び K63の各単球株化細胞に対して、それぞれ 97 . 5%、 95. 5%、 98. 5%及び 92· 5%という、高い生存率にて回収することが可能で あることが実証された。
[0043] 一方、培地 2— 4の結果が示すように、培地 1と比較すると、各単球株化細胞の凍結 保存後の融解による回収率はかなり低い結果が得られた。具体的には、 SW/K99に ついて、 DMSOやグリセリンを含有する培地である、培地 2、培地 3と培地 4では、そ れぞれ、 72. 5%、 70. 5%と 73. 6%という回収率で、実用的ではないことが明らか となった。対照的に、本発明に係る培地 1では、単球株化細胞にとっては、実用的に 有用な凍結保存用培地であることが判明した。
産業上の利用可能性
[0044] 血清及び単糖類であるグルコースを含有する、本発明に係る培地を用いれば、単 球株化細胞にとって、有用な凍結保存方法及び凍結保存用培地が実現される。 図面の簡単な説明
[0045] [図 1]図 1は、本発明にて行った凍結保存後の全ての単球株化細胞の融解後の回収 率の結果を示す。

Claims

請求の範囲 [1] 単球株化細胞の凍結保存方法であって、
(1)単糖類と、血清と、を含む培地に前記単球株化細胞を分散させて分散液を調 製する工程と
(2)前記分散液を凍結させるとともに、液体窒素下で保存する工程と、 を備える方法。
[2] 前記単糖類はグルコースである、請求項 1記載の方法。
[3] 前記グルコースの濃度は、培地の全重量に対して、少なくとも 5重量％である、請求 項 1又は 2記載の方法。
[4] 前記血清はゥシ胎児血清である、請求項 1記載の方法。
[5] 単糖類と、血清と、を含む、単球株化細胞の凍結保存用培地。
[6] 前記単糖類はグルコースである、請求項 5記載の培地。
[7] 前記グルコースの濃度は、培地の全重量に対して少なくとも 5重量％である、請求 項 5又は 6記載の培地。
[8] 前記血清はゥシ胎児血清である、請求項 5記載の培地。
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