WO2004104222A1 - 蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを用いた蛋白質相互作用の解析方法 - Google Patents
蛋白質相互作用解析用プローブ及びそれを用いた蛋白質相互作用の解析方法 Download PDFInfo
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Definitions
- the invention of this application provides a probe for protein interaction analysis for detecting and quantifying where and when protein-protein interaction has occurred in living cells, and a protein-protein interaction probe using the probe. It concerns the analysis method. More specifically, the invention of this application relates to a protein capable of accurately and rapidly screening Z-inhibitors that enhance the intracellular signal involved in various protein-protein interactions in living cells and individuals. The present invention relates to an interaction analysis probe and a protein-protein interaction analysis method using the same. Background art
- protein-protein interaction plays an important role in the construction and function of living cells. It is also known that protein interactions are involved in gene transcription mechanisms and intracellular signal transduction.
- the split enzyme method has been reported as a method for analyzing protein-protein interaction (Rossi, F., Charlton, CA and Blau, HM, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8405-8410, 1997; Remy, I., and Michnick, SW, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5394-5399, 1999; Pelletier, JN, Arndt, KM, Pluckthun, A., and Michnick, SW, Nature Biotech. 17, 683-690, 1999; Karimova, G., Pidoux, J., Ul Imann, A., and Ladant, D. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752-5756).
- the cleaved enzyme is reconstituted by the protein-protein interaction, and the restored enzyme activity is measured by the phenotype of the bacterial cell or the fluorescent enzyme substrate to determine the protein-protein interaction. To detect.
- a luminescent enzyme or GFP is generated by protein splicing caused by protein interaction as a probe that can easily analyze protein-protein interaction with high accuracy for all proteins
- a probe for the analysis of protein interaction that regenerates enzyme activities such as GFP and the fluorophore of GFP has been prepared and reported (Japanese Patent Application No. 2000-224939;
- the invention of this application was made in view of the circumstances described above, and solves the problems of the prior art to determine where, when, and when protein-protein interaction occurs in living cells. Detect and quantify It is an object of the present invention to provide a probe for the purpose of the present invention and a method for analyzing a protein-protein interaction using the probe. Disclosure of the invention
- a probe for analyzing the interaction between two proteins at least at the N-terminal side of Renilla luciferase.
- a probe for protein interaction analysis comprising two probes, a probe A containing a polypeptide and a probe B containing at least the remaining C-terminal polypeptide of Renilla luciferase You.
- the invention of this application relates to a protein on the N-terminal side of inteiii and a polypeptide on the N-terminal side of Renilla luciferase, in connection with the aforementioned protein interaction analysis probe.
- probe B for analyzing action.
- the invention of the present application is further characterized in that a linker sequence is bonded to the N-terminal polypeptide of Renilla luciferase and the remaining C-terminal polypeptide of Renilla luciferase, respectively.
- the present invention provides the probe for protein interaction analysis according to any one of the above, and fourthly, the probe for protein interaction analysis wherein the linker sequence comprises 3 to 20 amino acid residues.
- the invention of this application is characterized in that the polypeptide at the N-terminal side of Renilla luciferase and the remaining C-terminal polypeptide of Renilla luciferase are defined as Ser91 as Ser91. It is intended to provide any one of the above-mentioned probes for protein interaction analysis, which is obtained by splitting between Tyr92.
- the invention of this application further comprises, in the sixth step, coexisting a protein a linked to any one of the probes A and a protein b linked to any one of the probes B in the presence of coelenterazine and oxygen;
- a method for analyzing protein interaction characterized by measuring luminescence.
- the invention of the present application is directed to a method for introducing into a cell a polynucleotide that expresses a protein a to which any one of the probes A is linked and a protein b to which any one of the probes B is linked. Further, the present invention provides a method for analyzing protein interaction in which protein a linked to probe A and protein b linked to probe B coexist in the presence of coelenterazine and oxygen.
- the invention of the present application provides a method of introducing a polynucleotide expressing a protein a linked to any one of the probes A and a protein b linked to any of the probes B into a cell, A protein that causes the protein a linked to probe A and the protein b linked to probe B to co-exist in the presence of coelenterazine and oxygen in all cells of this animal or its progeny by the ontogenesis of totipotent cells.
- a method for analyzing an interaction is provided.
- the invention of the present application introduces, into a cell, a polynucleotide that expresses a protein a to which any one of the probes A is linked and a protein b to which any one of the probes B is linked,
- Non-human animal Provided is a non-human animal obtained by ontogenizing a totipotent cell or a progeny animal thereof.
- the present invention also provides a method for screening a substance for introducing a sample and analyzing protein interaction in cells of the non-human animal or its progeny.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of the protein interaction analysis probe of the invention of the present application and the principle of its operation.
- FIG. 2 is a schematic diagram showing another example of the protein interaction analysis probe of the invention of the present application and the principle of its operation.
- FIG. 3 is a schematic diagram showing the amino acid sequence of Renilla sipulase used in the examples of the invention of this application and the cleavage site.
- FIG. 4 is a diagram showing the structure of the plasmid of the split renal luciferase fusion protein (sRL) used in Examples of the invention of this application.
- sRL split renal luciferase fusion protein
- FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the division site of Renilla luciferase and the luminescence generated by protein interaction in the example of the present invention.
- A ratio of luminescence in the presence of insulin to luminescence in the absence of insulin
- b relative luminescence of each protein interaction analysis probe with respect to luminescence intensity by full-length Renilla luciferase (hRL124C / A) Strength
- FIG. 6 is a diagram showing the luminescence intensity in the presence and absence of insulin when using SRL91F in the examples of the invention of this application.
- A sRL91F, b: N-terminal side of sL91 only, c: C-terminal side of SRL91F only
- FIG. 7 is a graph showing the time course of the amount of insulin added and the interaction between Y941 and SH2n when SRL91 was used in the examples of the invention of this application.
- FIG. 8 is a diagram showing time-course changes in the interaction between Y941 and SH2n after addition of insulin when SRL91 is used in the examples of the invention of the present application, by means of immunoblotting.
- FIG. 9 is a photograph showing a microscopic image of CH0-IR cells in Examples of the present invention.
- A CH0-IR cells expressing SRL91 in the absence of insulin stimulation; b: 10-7 M in the presence of insulin stimulation; c: CH0-IR expressing full-length Renilla luciferase (hRL124C / A) (IR cells)
- FIG. 10 is a schematic diagram showing the interaction mechanism between the adapter protein She and Grb.
- FIG. 11 shows the interaction between Grb2 and various mutants in which the tyrosine group at the three sites of She was replaced with a phenylalanine group and the serine group in the PTB domain was replaced with a proline group in the example of the invention of this application.
- FIG. 9 is a diagram showing the results of quantitatively evaluating the above. (A: EGF, b: E2, c: DHT, d: DES added)
- the probe for protein interaction analysis of the invention of this application is characterized by using Renilla luciferase as a labeling substance.
- SEQ ID NO: 1 has approximately half the molecular weight (36 kDa) of human luluciferase. It is a monomeric protein having the following properties and is known to be easily expressed in mammalian cells. Although the crystal structure of Renilla luciferase is unknown, the N-terminus and some cysteine residues are important for luminescence activity (Paulmuriigaii, R. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 15608-13 (2002); Liu, J. et al.
- Renilla luciferase The enzymatic reaction of Renilla luciferase is similar to that of L. luciferase. Differently, it is known that ATP is not required (Liu, J. S. Escher, A. Gene 237, 153-159 (1999) ⁇ ).
- coelenterazine a luciferase substrate, is known to penetrate mammalian cell membranes and rapidly diffuse into the cell matrix (Contag, CH & Bacimaim, MHA, Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002); Greer, LF & Szalay, AA Luminescence 17, 43-74 (2002).
- Renilla luciferase catalyzes the oxidation of coelenterazine to an excited state compound (oxy coelenterazine monoanion) in the presence of dissolved oxygen, and emits broad luminescence in the near-infrared region (400 ⁇ ! ⁇ 630nm) with tissue permeability. Produces selentelamide and carbon dioxide.
- the inventors of the present application focused on such an enzyme reaction of Renilla luciferase, and aimed at realizing a probe capable of accurately detecting when and where protein interaction occurred in living cells. As a result of intensive research, the present invention was reached.
- Fig. 1 and Fig. 2 show the structure and working principle of the probe for protein interaction analysis of the invention of this application.
- the probe for protein interaction analysis (1) of the invention of the present application comprises a probe A (la) containing at least the N-terminal polypeptide (2a) of Renilla luciferase. And a probe B (lb) containing at least the C-terminal polypeptide (2b) remaining with Renilla luciferase (hereinafter referred to as N of the Renilla luciferase thus divided).
- N Renilla luciferase thus divided.
- C TJP2004 / 007245 The ends are sometimes called N-split trenilla luciferase and C-split trenilla luciferase. ).
- probe A (la) and probe B (lb) are each used for the two proteins a to be examined.
- b (3a and 3b) which coexist in the presence of coelenterazine and dissolved oxygen (1).
- proteins (3a) and (3b) interact with (II), and N-split torenal shift enzyme (2a) and C-split-train in probes A (la) and B (lb).
- the luciferase (2b) is proximally juxtaposed, causing rearrangement of renilla luciferase (2) (111).
- the Renilla luciferase (2) acts as a photocatalytic enzyme, instantaneously oxidatively decomposes coelenterazine (IV), and the energy when the generated excited carbonyl group returns to the ground state is bioluminescent (4). )) (V). Therefore, by detecting the bioluminescence (4), it becomes possible to analyze the protein-protein interaction.
- the probe A (la) and the probe B (lb) are respectively N- and C-split-trained luciferase. It may be composed of only zeo, but may further contain a polypeptide (6a) on the N-terminal side of intein and a polypeptide (6b) on the C-terminal side of intein.
- probe A is composed of the polypeptide (6a) at the N-terminal side of intein and the N-terminal of Renilla luciferase.
- End Probe B contains the terminal polypeptide (2a) (hereinafter referred to as probe A ') (1c), and probe B is composed of the polypeptide (6b) at the C-terminal side of intein and Renilla luciferase (Hereinafter referred to as probe B ') (1d) containing the remaining C-terminal polypeptide (2b).
- probe A ′ (1c) and probe B ′ (Id) are used for the proteins a and b (3 a and 3 b) and coexist (1).
- the proteins (3a and 3b) interact (11), splicing occurs, and each of the split tranferases (2a, 2b) is linked to the renilla siferase (2). ) Is reconstructed (111).
- the cut-out (II) Renilla luciferase (2) is used as a luminescent catalytic enzyme, instantaneously forming coelenterazine, a membrane-permeable substrate. Oxidation degradation occurs (IV), and the energy when the excited carbonyl group returns to the ground state is released as bioluminescence (4) (V). Therefore, by detecting this bioluminescence (4), it becomes possible to analyze the protein-protein interaction.
- intein used in the probe for protein interaction analysis of the invention of the present application known substances derived from various organisms can be applied.
- Saccharomyces cerevisiae yeast
- VM A Candida tropiallis (Gandhida) Ctr Derived from eukaryotes represented by VMA, etc.
- Mycobacterium tuberculosis mycobacterium tuberculosis
- Mycobacterium tuberculosis examples thereof include those derived from eubacteria such as Mturec A, and those derived from archaebacteria such as Thenoplasma asidopilum (Thermoplasmidophila) Tac VMA.
- inteiii is automatically cut out by the interaction between protein a (3a) and protein b (3b). It is preferably a site-specific endonuclease. Furthermore, in order for the intein splicing to occur effectively in the protein interaction analysis probe (1c, Id) of the invention of the present application, two sites involved in splicing are required in the protein precursor. They must fold correctly and be correctly aligned so that they are adjacent (Duan, X., Gimble, FS and Quiocho, FA, Cell 89, 555-564, 1997). Therefore, as the intein, a biologically-derived one may be used as it is, but some amino acid residues may be changed or deleted, or an appropriate linker sequence may be introduced, so that pricing may easily occur. It may be designed for.
- the probe A (la) and the probe B (lb) are each composed of only N- and C-split trellariferase. It may have a linker sequence (5a, 5b) at each end.
- the linker sequence (5a, 5b) has a linker sequence (5a, 5b)
- the probe A (la) and the probe B (lb) (3 a, 3 b).
- the linker sequence (5a, 5b) include various types, and are not particularly limited. For example, those having 3 to 20 amino acid residues, specifically having a glycine-alanine repeat sequence And the like.
- probe A, (1c) and probe B, (1d) are polypeptides on the N- or C-terminal side of intein, respectively
- the N- and C-split torenilla luciferases (2a and 2b) used are N-
- the N- and C-split torenilla luciferases (2a and 2b), which represent the terminal side and the remaining C-terminal side, are involved in the interaction (III) of proteins a and b (3a, 3b).
- the peptide is directly bound to the peptide and reconstituted (IV) by intein (6) splicing caused by the interaction between proteins a and b (3a, 3b).
- N- and C-split toleriniferases (2a and 2b) do not show luminescence activity before (individually) before reconstitution (IV), and the enzymatic activity is recovered by reconstitution. Like 4007245 To do so, it is necessary to divide the active center into two. Specifically, we attempted to split Renilla luciferase at the position of cystine (Cys), serine (Ser), or tyrosine (Tyr).
- a probe for protein interaction analysis as described above is provided.
- one probe for example, probe ⁇
- the other probe probe B
- the other probe probe B
- Measurement may be performed.
- any method of linking each protein (3a, 3b) to the probe la, lb, lc, Id
- commonly used chemical, biochemical or genetic engineering techniques can be applied.
- the method for coexisting the above-described probe for protein interaction analysis in the presence of coelenterazine and oxygen includes the following: a probe for protein interaction analysis (1a and 1b, or 1c and Id ) To proteins a and b (3 a, 3b) and adding them to a coelenterazine-containing solution to allow them to coexist. In this way, protein-protein interactions can be analyzed and detected in vitro.
- a protein a in which probe A (la) is linked and a protein b in which probe B (lb) is linked or a probe A for protein interaction analysis (1c) -linked protein a (3a) and probe B '(Id) -linked protein b (3b) -integrated expression vector into individual cultured cells.
- b (3a, 3b) can coexist with coelenterazine and oxygen. The concentration of oxygen in the cells is sufficient, and there is no need to supply new oxygen.
- a plasmid vector for animal cell expression is preferably used as the expression vector.
- known methods such as an electroporation method, a phosphorylated calcium method, a ribosome method, and a DEAE dextran method can be employed.
- the method of introducing an expression vector into which a protein (3a and 3b) in which a protein interaction analysis probe (la and lb, or lc and Id) is linked into a cell is used.
- a probe for protein interaction analysis (1), a protein (3), coelenterazine and oxygen can coexist in a cell, and a protein-protein interaction can be detected and quantified without destroying cells.
- the in vivo method becomes possible.
- the protein a (3a) linked to the probe A (la) for protein interaction analysis and the protein b (3b) linked to the probe B (lb) are used.
- a polynucleotide expressing a protein a (3a) linked to a probe A ′ (1c) for protein interaction analysis and a protein b (3b) linked to a probe B ′ (Id) is introduced into cells.
- the probe for protein interaction analysis (1), the protein (3), coelenterazine and oxygen can also be co-present in all cells of this animal or its progeny. At this time, the concentration of oxygen existing in the living body is sufficient, and it is not necessary to newly add oxygen.
- the invention of this application also provides a transgenic non-human animal obtained in this manner.
- the transgenic non-human animal can be prepared according to a known preparation method (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980). Since such transgenic non-human animals have the probe (1) and the protein (3) for protein interaction analysis in all somatic cells, for example, sample substances such as pharmaceuticals and toxic substances are contained in the body. By analyzing the protein-protein interaction in cells and tissues, screening of Z-inhibitors that enhance intracellular signals related to protein-protein interaction can be performed with high accuracy.
- the protein-protein interaction was detected by detecting luminescence (bioluminescence) (4) generated by the above-described principle of operation and operation. Can be confirmed.
- bioluminescence by Renilla luciferase is tissue-permeable, observing luminescence in cells and imaging it will not only indicate when protein-protein interaction has occurred, but also identify sites. Can be identified.
- the change in luminescence intensity when conditions such as addition or concentration of a specific sample are changed is measured. 2004/007245, it is also possible to quantify the protein-protein interaction. Furthermore, by measuring the change in luminescence intensity over time, it is possible to track from the start to the end of the protein-protein interaction.
- Restriction enzymes, modification enzymes and ligase were purchased from Takara Biomedicals (Tokyo, Japan).
- the synthetic Renilla luciferase gene vector Yuichi (hRL-CMV) and Renilla luciferase zeta kit encoding the Renilla luciferase containing the most frequently used codons in mammals were purchased from Proiega Co. (Madison, WI).
- the mammalian expression vectors pcDNA3.1 (+) and pIRES are available from Invitrogen (Groningen ⁇ The Netherlands) and Clonetecli (Palo Alto, CA).
- Ham's F-12 medium, fetal calf serum (FBS) and LipofectAMINE were obtained from Gibco BRL (Rockville, MD).
- Anti-myc antibody, anti-flag antibody and anti-phosphorylated tyrosine antibody were purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA).
- Alkaline phosphatase-labeled anti-magpie and anti-mouse antibodies were purchased from Jacson Immuno esearch Lab., Inc. (Pennsylvania, PA;
- Nitrocellulose membrane was obtained from Amersham Pharmacia Biotech. (Buckinghaisire, UK).
- CDP-STAR chemiluminescent substrate was purchased from New England Biolabs. Inc. (Beverly, MA).
- the 941 tyrosine residue in the Y941 peptide derived from insulin receptor substrate-1 (IRS1) is phosphorylated by the insulin receptor when stimulated with insulin, and dephosphorylated by tyrosine phosphatase.
- Oxidized (Sato, M. et al. Anal Chem. 71, 3948-3954 (1999); Prat ipanawatr, W. et al. Diabetes 50, 2572-2578 (2001).).
- SH2n derived from the P85 subunit of phosphatidyl inositol-3-kinase (p85 330-429) binds to a phosphorylated 941-tyrosine residue inside IRS1 (Yoshimura, R. et al. Diabetes 46, 929). -936 (1997); Golstein, BJ et al. J. Biol. Chem. 1275, 4283-4289 (2000).).
- SEQ ID NO: 1 and FIG. 3 show the amino acid sequence and cleavage site of Renilla luciferase.
- a mutant of Renilla luciferase in which the luminescence activity was increased by replacing the 124-cysteine residue of Renilla luciferase (hRL) with alanine was used.
- Figure 4 shows the plasmid composition of each split trenilla siferase fusion protein (sRL). Each of these plasmids had a CMV-mouth motor sequence upstream of the initiation codon.
- the amino acid sequence of Y941 is TEEAYMKMDLGPG (SEQ ID NO: 2), which is a tyrosine phosphorylation domain within IRS1.
- SH2n is the N-terminal SH2 domain of the p85 subunit of diphosphatidylinositol.
- the dotted line indicates the ribosome internal entry site (IRES).
- each sRL had a cassette consisting of (translation end codon) -one (ribosome internal entry site)-(translation start codon).
- E. coli strain DH5Q! was used as a microbial host for all plasmid-constructed subclonings. All plasmids were confirmed by sequence analysis using a Gene Analyzer AB1 prism 310 (PE Biosystems, Tokyo, Japan).
- CH0-HIR cells were grown in Ham's F-12 medium supplemented with 10% heat-inactivated FBS (Filtron), 100 unit / mL penicillin, and 100 g / mL streptomycin. Transfection was performed using LipoiectAMINE 2000.
- Cells were seeded on a 6-well culture plate, and transfected using 2 ng of any of the above plasmids. Six hours after transfection, the medium containing Lipofect AMINE was replaced with Ham's F-12 medium supplemented with FBS, penicillin and streptomycin, and incubated for 40 hours to obtain probes for each protein interaction analysis. Was expressed.
- CH0-HIR cells were stimulated with 100 nM insulin for 5 minutes at 37, and ice-cooled 2x immunoprecipitation buffer (10 mM Tris-HCl (H 7.4), 1 iM EDTA, 1 mM EGTA, 10 M NaF , 0.2 mM sodium orthovanadate, 10 Mg / mL leptin, lO zg / mL lipoprotein, 0.2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), Crushed mechanically with 2% IGEPALCA630, 1% Triton X-100).
- 2x immunoprecipitation buffer 10 mM Tris-HCl (H 7.4), 1 iM EDTA, 1 mM EGTA, 10 M NaF , 0.2 mM sodium orthovanadate, 10 Mg / mL leptin, lO zg / mL lipoprotein, 0.2 mM phenylmethylsulfony
- the N-fusion protein was treated with anti-myc antibody at 4 for 1 hour and immunoprecipitated from whole cell lysate of CH0-HIR cells.
- the immunoprecipitate was adsorbed using protein G Sepharose 4FF beads, and then washed five times using ice-cold immunoprecipitation buffer.
- Samples were separated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and anti-phosphorylated tyrosine antibody (1: 500) was used for Y941 phosphorylation, and anti-myc antibody (1: 500) was used for N-terminal protein evaluation.
- C-terminal protein was analyzed using an anti-flag antibody (1: 1000).
- the cells were then washed twice with cold PBS and disrupted.
- the crushed liquid was centrifuged at 15,000 g for 30 seconds at 4 and a part of the supernatant was measured for luminescence intensity for 10 seconds using a Minilumat LB9506 luminometer (Berthold GmbH Co. KG, Wildbad, Germany).
- the protein concentration in the supernatant was measured by the Bradford method.
- Figure 5 (a) shows the relationship between the cleavage site of Renilla luciferase and the luminescence generated by protein interaction (the ratio of luminescence in the presence of insulin to luminescence in the absence of insulin).
- FIG. 5 (b) shows the relative luminescence intensity of each protein interaction analysis probe with respect to the luminescence intensity of full-length Renilla luciferase (ML124C / A). In addition, each measurement was performed three times using different wells of the culture plate.
- Renirarushifera one zero is CHO- HIR cells expressing the divided ⁇ white matter interaction analysis probe (SRL9 1) between the Se r9 1 and Tyr92, in 10- 7 M insulin presence, in the absence The emission intensity was 25 times that of the case.
- Renilla luciferase in the split protein phase interactions for analysis probe at other locations increased 2-4 fold in the presence of 10- 7 M insulin was confirmed.
- Example 1 to confirm that complementation of renilla luciferase in CH0-HIR cells expressing SRL91 was caused by protein-protein interaction caused by protein phosphorylation, The phosphorylation site of the tyrosine residue at position 941 in the Y941 peptide in No. 1 was converted to a phenylalanine residue, and an SRL91 mutant (SRL91F was prepared. The N-terminal and C-terminal probes were sequenced, respectively). Numbers 6 and 7 are shown.
- Example 1 The same operation as in Example 1 was performed using this SRL91F, and the luminescence intensity in the presence and absence of insulin stimulation was measured. Similarly, using the plasmids of FIGS. 4 (c) and 4 (d), only the N-terminal side and the C-terminal side of SRL91 are individually expressed in CHO-HIR cells. The emission intensity was measured.
- CHO-HIR cells expressing SRL91F did not show an increase in enzyme activity upon insulin stimulation. Moreover, in CH0-HIR cells that individually expressed only the N-terminal side and C-terminal side of SRL91, The luminescence activity was completely abolished not only in the absence but also in the presence of insulin.
- Cells expressing SRL91 by the method described above were incubated at 37 min for 1 min, 5 min, 10 min, 30 min and 60 min in medium supplemented with 100 nM or 10 M insulin, and luminescence was measured immediately. .
- the luminescence intensity increased 5 minutes after insulin stimulation, and gradually decreased thereafter.
- the above luminescence is caused by the protein-protein interaction occurring in the presence of coelenterazine, a membrane-permeable substrate, and complementing Renilla luciferase.
- the exposure was performed using a CCD camera in PBS supplemented with 20 20 coelenterazine substrate buffer, with exposure times of 300 s (a, b) and 60 s (c), respectively. Emission intensity was expressed in color scale.
- EGF epidermal growth factor
- E2 17 ⁇ -estradiol
- DHT dihydrotestosterone
- DES diet ylstilbestrol
- the present invention provides a probe for protein interaction analysis that can directly visualize protein-protein interaction in living cells.
- a probe for protein interaction analysis uses the complementation of Renilla luciferase by protein-protein interaction.
- diffusible products used in other complementary enzyme systems (Blakely, BT et al. Nat. Biotec nol. 18, 218-22 (2000); Rossi, F. et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA 94, 8405-8410 (1997); Remy, I. & Michnick, SW Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5394-5399 (1999); Galarneau, A. et al. Nat. Biotechnol.
- the bioluminescence of supplemented Renilla luciferase is useful in that it can identify the site and time of protein-protein interaction in living cells and organisms. Is high.
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Abstract
二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブであって、少なくともレニラルシフェラーゼのN-末端側のポリペプチドを含むプローブAと、少なくともレニラルシフェラーゼの残るC-末端側のポリペプチドを含むプローブBの二つのプローブからなる蛋白質相互作用解析用プローブを提供する。
Description
明 細 書 蛋白質相互作用解析用プローブ及び それを用いた蛋白質相互作用の解析方法 技術分野
この出願の発明は、 生細胞内の、 どこで、 いつ蛋白質一蛋白質 相互作甩が生起したかを検出 ·定量するための蛋白質相互作用解 析用プローブと、 それを用いた蛋白質一蛋白質相互作用の解析方 法に関するものである。 さらに詳しくは、 この出願の発明は、 生 細胞内や個体内における種々の蛋白質一蛋白質相互作用に関わる 細胞内シグナル増強 Z抑制物質を、 精度高く、 高速にスクリー二 ングすることを可能とする蛋白質相互作用解析用プローブと、 そ れを用いた蛋白質—蛋白質相互作用解析方法に関するものであ る。 背景技術
生細胞の構築や機能においては、 蛋白質—蛋白質相互作用が重 要な役割を果たしていることが知られている。 また、 遺伝子の転 写機構や細胞内シグナル伝達などにおいても、 蛋白質相互作用が 関連することが知られている。
従来、 蛋白質一蛋白質相互作用を解析するための方法として は、 ス プ リ ッ ト 酵素法が報告 さ れて い る （ Rossi, F. , Charlton, C. A. and Blau, H. M.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 8405-8410, 1997; Remy, I. , and Michnick, S. W. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 5394-5399, 1999;
Pelletier, J. N.， Arndt, K. M. , Pluckthun, A. , and Michnick, S. W.， Nature Biotech. 17, 683-690, 1999; Karimova, G. , Pidoux, J. , Ul Imann, A., and Ladant, D. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 5752-5756 )。 この方法で は、 開裂した酵素が蛋白質一蛋白質相互作用により再構築され、 それにより復旧された酵素活性を菌ゃ細胞の表現型、 あるいは蛍 光性酵素基質によって測定して蛋白質一蛋白質相互作用を検出す る。
しかし、 このようなスプリッ ト酵素法では、 酵素反応に時間を 要する上、 酵素反応により産生された蛍光性酵素基質が安定な物 質であり、 細胞内において拡散するため、 蛋白質相互作用が起き た場所や時を細胞内で特定できないという問題があった。
そこで、 この出願の発明者らは、 あらゆる蛋白質について高い 精度で簡便に蛋白質—蛋白質相互作用を解析できるプローブとし て、 蛋白質相互作用により生起するプロテインスプライシングに より発光酵素や G F Pが生成され、 発光酵素などの酵素活性や G F Pのフルオロフオアが再生される蛋白質相互作用解析用プロ一 ブを作成し、 報告している （特願 2 0 0 0 — 2 2 4 9 3 9 ;
しかし、 酵素の蛍光性生成物や G F Pなどのフルオロフオアは 拡散性であるため、 このような蛋白質相互作用解析用プローブで も、 蛋白質—蛋白質相互作用がいつ、 どの部位で生じたのかを特 定することは困難であったのが実情である。
そこで、 この出願の発明は、 以上の通りの事情に鑑みてなされ たものであり、 従来技術の問題点を解消し、 生細胞内の、 どこ で、 いつ蛋白質一蛋白質相互作用が生起したかを検出 · 定量する
4 007245 ためのプローブと、 それを用いた蛋白質一蛋白質相互作用の解析 方法を提供することを課題としている。 発明の開示
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものとして、 第 1 に は、 二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプロ一ブであつ て、 少なく ともレニラルシフェラーゼの N—末端側のポリべプチ ドを含むプローブ Aと、 少なくともレニラルシフェラ一ゼの残る C —末端側のポリぺプチドを含むプローブ Bの二つのプローブか らなることを特徴とする蛋白質相互作用解析用プローブを提供す る。
この出願の発明は、 第 2には、 前記の蛋白質相互作用解析用プ ローブに関連して、 inte iii の N—末端側のポリペプチドとレニ ラルシフェラ一ゼの N—末端側のポリぺプチドを含むプロ一ブ A と、 int e iii の C—末端側のポリペプチドとレニラルシフェラー ゼの残る C—末端側のポリべプチドを含むプロ一ブ Bの二つのプ ローブからなる蛋.白質相互作用解析用プローブを提供する。
この出願の発明は、 また、 第 3には、 レニラルシフェラ一ゼの N—末端側のポリべプチドと、 レニラルシフェラーゼの残る C - 末端側のポリペプチドに、 各々リンカ一配列が結合している前記 いずれかの蛋白質相互作用解析用プローブを、 第 4には、 リンカ 一配列が 3〜 2 0アミノ酸残基からなるものである前記の蛋白質 相互作用解析用プローブを提供する。
さらに、 この出願の発明は、 第 5には、 レニラルシフェラーゼ の N—末端側のポリぺプチドとレニラルシフェラーゼの残る C 一 末端側のポリペプチドが、 レニラルシフェラ一ゼを Ser91 と
Tyr92 の間で分割して得られるものである前記いずれかの蛋白質 相互作用解析用プローブを提供する。
この出願の発明は、 さらに、 第 6には、 前記いずれかのプロ一 ブ Aを連結した蛋白質 aと前記いずれかのプローブ Bを連結した 蛋白質 bを、 セレンテラジンと酸素の存在下で共存させ、 発光を 測定することを特徴とする蛋白質相互作用の解析方法を提供す る。
また、 この出願の発明は、 第 7には、 前記いずれかのプローブ Aを連結した蛋白質 aと前記いずれかのプローブ Bを連結した蛋 白質 bを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入することによ りプロ一ブ Aを連結した蛋白質 aとプロ一ブ Bを連結した蛋白質 bをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる蛋白質相互作用 の解析方法を提供する。
この出願の発明は、 第 8には、 前記いずれかのプローブ Aを連 結した蛋白質 aと前記いずれかのプローブ Bを連結した蛋白質 b を発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能 性細胞を個体発生することによって、 この動物またはその子孫動 物の全細胞においてプローブ Aを連'結した蛋白質 aとプローブ B を連結した蛋白質 bをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させ る蛋白質相互作用の解析方法を提供する。
さらに、 この出願の発明は、 第 9には、 前記いずれかのプロ一 ブ Aを連結した蛋白質 aと前記いずれかのプローブ Bを連結した 蛋白質 bを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト 動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒト動物 またはその子孫動物を提供する。
そして、 第 1 0には、 前記非ヒト動物またはその子孫動物に検査
試料を導入し、 該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における 蛋白質相互作用を解析する物質のスクリ一二ング方法をも提供す る。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブの一 例とその作用原理を表す概略模式図である。
図 2は、 この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブの別 の例とその作用原理を表す概略模式図である。
図 3は、 この出願の発明の実施例において使用されたレニラル シフヱラ一ゼのアミノ酸配列と分割部位を示した概略模式図であ る。
図 4は、 この出願の発明の実施例において使用されたスプリッ トレ二ラルシフェラ一ゼ融合蛋白質 （sRL) のプラスミ ドの構成 を示した図である。 （ a ·· L124C/A、 b ： sRL、 c : sRL91 の N —末端側、 d ： sRL91 の C—末端側、 e ： SRL91F)
図 5は、 この出願の発明の実施例において、 レニラルシフェラ ーゼの分割箇所と、 蛋白質相互作用により生起した発光の関係を 示した図である。 （ a ： インスリンの存在下における発光とィン スリンの非存在下における発光の比、 b : 全長レニラルシフェラ ーゼ （hRL124C/A) による発光強度に対する各蛋白質相互作用解 析用プローブの相対発光強度）
図 6は、 この出願の発明の実施例において、 SRL91F を用いた 際のインスリン存在下および非存在下での発光強度を示した図で ある。 （ a ： sRL91F、 b ： s L91 の N—末端側のみ、 c ： SRL91F の C一末端側のみ）
図 7は、 この出願の発明の実施例において、 SRL91 を用いた際 のインスリンの添加量と Y941 と SH2n の間の相互作用の経時変 化を示した図である。
図 8は、 この出願の発明の実施例において、 SRL91 を用いた際 のインスリン添加後の Y941 と SH2n の相互作用の経時変化をィ ムノブロッテイングにより示した図である。
図 9は、 この出願の発明の実施例において、 CH0- IR 細胞の顕 微鏡像を示す写真である。 （ a ： SRL91 を発現した CH0-IR細胞に おいてィンスリン刺激の非存在下、 b ： 10-7M ィンスリン刺激の 存在下、 c ： 全長レニラルシフェラーゼ （hRL 124C/A) を発現し た CH0- IR細胞)
図 1 0は、 アダプタープロテイン She と Grb の相互作用機構 を示した概略模式図である。
図 1 1は、 この出願の発明の実施例において、 She の 3力所の チロシン基をフエ二ルァラニン基に、 PTB ドメイン内のセリン基 をプロリン基に置換した各種変異体と Grb2 との相互作用を定量 的に評価した結果を示した図である。 （ a ： EGF、 b ： E2、 c ： DHT、 d ： DES添加）
なお、 図中の各符号は次のものを示す。
1 蛋白質相互作用解析用プローブ
1 a プローブ A
1 b プローブ B
1 c プローブ C
1 d プローブ D
2 レニラルシフェラーゼ
2 a N—スプリッ トレニラルシフェラーゼ
6
差替え用紙（規則 26)
5
2 b C—スプリッ トレニラルシフェラーゼ
3 a 蛋白質 a
3 b 蛋白質 b
4 生物発光
5 a リンカー配列
5 b リンカ一配列
6 a iiiteinの N—末端側のポリペプチド
6 b inteinの C—末端側のポリペプチド
I 共存
II 相互作用
III 再構成
III' 切り出し
IV 酸化分解
V 発光 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブは、 標識物質 としてレニラルシフェラーゼを用いることを特徵とするものであ る。
レニラルシフェラーゼ （Lorenz, W. W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4438 - 4442 (1991). ) (配列番号 1 ) は、 ホ 夕ルルシフェラ一ゼの約半分の分子量 （36 kDa) を有するモノ マー蛋白質であり、 哺乳類細胞内で容易に発現することが知られ ている。 また、 レニラルシフェラーゼの結晶構造は不明である が、 ルミネッセンス活性のためには N—末端といくつかのシステ イン残基が重要であり （Paulmuriigaii, R. et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 99, 15608-13 (2002)； Liu, J. et al. Gene 203, 141-148 (1997). )、 レニラルシフェラーゼの酵素反応は、 ホ夕ルルシフェラ一ゼの場合とは異なり、 ATP を必要としない (Liu, J. S Escher, A. Gene 237, 153-159 (1999)· ) ことが 知られている。 さらに、 ルシフェラーゼの基質であるセレンテラ ジンは哺乳類の細胞膜を貫通し、 細胞基質中に急速に拡散するこ とも知られている （Contag, C. H. & Bacimaim, M. H. A画. Rev. Biomed. Eng. 4, 235-260 (2002)； Greer, L. F. & Szalay, A. A. Luminescence 17, 43-74 (2002). )。
レニラルシフェラーゼは、 溶存酸素存在下においてセレンテラ ジンの励起状態化合物 （ォキシセレンテラジンモノァニオン） へ の酸化を触媒し、 組織透過性を有する近赤外線領域 （400ηπ！〜 630nm) の広いパンドのルミネッセンスを発し、 セレンテルアミ ドと二酸化炭素を生じさせる。
この出願の発明者らは、 このようなレニラルシフェラーゼの酵 素反応に着目し、 生細胞のどこで、 いつ蛋白質相互作用が起こつ たのかを精度高く検出できるプローブを実現することを目的とし て鋭意研究を進めた結果、 本願発明に至ったのである。
図 1および図 2にこの出願の発明の蛋白質相互作用解析用プロ —ブの構成と作用原理を示した。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ （ 1 ) は、 図 1に示されるように、 少なくともレニラルシフェラーゼの N—末 端側のポリペプチド （ 2 a) を含むプロ一ブ A ( l a) と、 少な くともレニラルシフエラーゼの残る C一末端側のポリべプチド ( 2 b) を含むプローブ B ( l b) からなるものである （以下、 このように分割されたレニラルシフェラーゼの N—および C一末
TJP2004/007245 端を N—スプリッ トレニラルシフェラーゼ、 C—スプリッ トレニ ラルシフェラーゼと呼ぶことがある。）。
そして、 この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブを用 いて蛋白質相互作用を解析するには、 プローブ A ( l a) および プローブ B ( l b) を各々、 その相互作用を調べたい二つの蛋白 質 aおよび b (3 aおよび 3 b) に結合し、 これらをセレンテラ ジンと溶存酸素の存在下で共存させる （ 1 )。 このとき、 蛋白質 (3 a) および （ 3 b) が相互作用する （II) と、 プローブ A (l a) および B (l b) における N—スプリッ トレニラルシフ エラ一ゼ （2 a) と C—スプリ ッ トレニラルシフェラーゼ （ 2 b) が近位に並置され、 レニラルシフェラーゼ （2) の再構成が 起こる （111)。 そして、 このレニラルシフェラーゼ （ 2) が発 光触媒酵素として作用し、 瞬時に、 セレンテラジンを酸化分解し (IV), 生成される励起カルポニル基が基底状態に戻るときのェ ネルギ一が生物発光 （4) として放出されるのである （V)。 し たがって、 この生物発光 （4) を検出することにより蛋白質ー蛋 白質相互作用を解析することが可能となる。
以上のとおりのこの出願の発明の蛋白質相互作用解析用プロ一 ブ （ 1 ) において、 プローブ A ( l a) とプロ一'ブ B ( l b) は、 各々、 N—および C—スプリッ トレニラルシフェラ一ゼのみ からなるものであってもよいが、 それぞれさらに、 intein の N 一末端側のポリペプチド （6 a) と intein の C—末端側のポリ ペプチド （6 b) を含有していてもよい。
すなわち、 この場合、 図 2に示されるように、 蛋白質相互作用 解析用プローブ （ 1) において、 プローブ Aは、 intein の N— 末端側のポリペプチド （6 a) とレニラルシフェラ一ゼの N—末
端側のポリペプチド （2 a) を含むもの （以下プローブ A' と呼 ぶ） （1 c) となり、 プローブ Bは、 intein の C一末端側のポリ ペプチド （6 b) とレニラルシフェラ一ゼの残る C一末端側のポ リペプチド （2 b) を含むもの （以下プロ一ブ B ' と呼ぶ） （ 1 d ) となる。
このような蛋白質相互作用解析用プローブを用いて蛋白質相互 作用解析を解析するには、 プローブ A' ( 1 c ) およびプローブ B ' (I d) を各々相互作用を調べたい蛋白質 aおよび b (3 a および 3 b) に結合し、 共存させる （ 1 )。 このとき、 蛋白質 ( 3 aおよび 3 b) が相互作用すれば （11)、 スプライシングが 起こり、 各スプリツ トレ二ラルシフェラ一ゼ （2 a、 2 b) が連 結してレニラルシフェラ一ゼ （2) が再構成される （111)。
このとき、 系内にセレンテラジンと酸素が共存していると、 切 り出された （ΙΙΓ) レニラルシフェラ一ゼ （ 2) を発光触媒酵 素として、 瞬時に、 膜透過性基質であるセレンテラジンの酸化分 解が起こり （IV)、 励起カルポニル基が基底状態に戻るときのェ ネルギ一が生物発光 （4) として放出される （V)。 したがつ て、 この生物発光 （4) を検出することにより蛋白質—蛋白質相 互作用を解析することが可能となる。
一方、 蛋白質 a (3 a) と蛋白質 b (3 b) が相互作用 （II) しなければ、 intein のスプライシングが起こらないため、 レニ ラルシフヱラーゼ （ 2 ) は再構成 （III) されず、 生物発光 (4) に顕著な変化が現れない。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブにおいて使用 される intein としては、 種々の生物由来の公知物質が適用でき る。 例えば、 Saccharomyces cerevisiae (酵母） S e e V M
A、 Candida tropiallis (ガンジタ菌） C t r VMAなどに代 表される真核生物由来のもの、 Mycobacterium tuberculosis
(結核菌） M t u r e c Aなどの真正細菌由来のもの、 Thenoplasma asidop ilum (サーモプラスマァシドフィ ラム） T a c VMAなどの古細菌由来のもの等が挙げられる。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ （ 1 c、 1 d) において、 蛋白質 a (3 a) と蛋白質 b (3 b) の相互作用 により inteiiiが自動的に切り出されるためには、 inteinは、 部 位特異的エンドヌクレアーゼであることが好ましい。 さらに、 こ の出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ （ 1 c、 I d) に おいて、 intein のスプライシングが有効に起こるためには、 蛋 白質前駆体において、 スプライシングに関与する二つの部位が隣 接するように、 正しく折り畳まれ、 かつ、 各部位が正確に並べら れなければならない （Duan, X. , Gimble, F. S. and Quiocho, F. A., Cell 89, 555-564, 1997)。 したがって、 intein として は、 生物由来のものをそのまま用いてもよいが、 一部のアミノ酸 残基を変換したり、 削除したり、 適当なリンカ一配列を導入した りして、 プライシングが起こりやすいように設計されてもよ い。
以上のとおりのこの出願の発明の蛋白質相互作用解析用プロ一 ブでは、 プローブ A ( l a) およびプローブ B ( l b) は、 各々、 N—および C—スプリツ トレ二ラルシフェラ一ゼのみから なるものであってもよいが、 それぞれの末端にリンカ一配列 （5 a、 5 b) を有していてもよい。 このようにリンカ一配列 （ 5 a、 5 b) を有する場合には、 プローブ A (l a) とプローブ B (l b) はこれらのリンカ一配列 （5 a、 5 b) を介して蛋白質
(3 a、 3 b) と結合する。 リンカ一配列 （5 a、 5 b) として は、 各種のものが例示され、 とくに限定されないが、 例えば 3〜 2 0アミノ酸残基からなるもの、 具体的には、 グリシン—ァラニ ン繰り返し配列を有するもの等が挙げられる。
また、 同様に、 プローブ A， ( 1 c ) およびプローブ B， （ 1 d) は、 各々、 intein の N—または C—末端側のポリペプチド
(6 a、 6 b) と N—または C—スプリッ トレニラルシフェラー ゼ （2 a、 2 b) のみからなるものであってもよいが、 これら以 外に、 前記と同様のリンカ一配列 （5 a、 5 b) 等を含んでいて もよい。 つまり、 プローブ A' ( 1 c ) およびプローブ B ' ( 1 d) において intein のポリペプチド （6 a、 6 b) とスプリツ トレニラルシフェラ一ゼ （ 2 a、 2 b) は、 直接結合されていて もよいし、 リンカ一配列 （5 a、 5 b) を介して結合されていて もよいのである。
この出願の発明の蛋白質相互作用解析用プローブ （ 1) におい て、 用いられる N—および C—スプリッ トレニラルシフェラーゼ (2 aおよび 2 b) とは、 レニラルシフェラーゼを適当な位置で 分割した N—末端側と残る C一末端側を意味するが、 これら N— および C一スプリッ トレニラルシフェラーゼ （2 aおよび 2 b) は、 蛋白質 aおよび b ( 3 a、 3 b) の相互作用 （III) によ り、 あるいは、 蛋白質 aおよび b (3 a、 3 b) の相互作用によ り生じる intein (6) のスプライシングにより、 直接ペプチド 結合し、 再構成 （IV) されるものである。
したがって、 このような N—および C—スプリッ トレニラルシ フェラ一ゼ （2 aおよび 2 b) が再構成 （IV) 前 （個々のとき） には発光活性を示さず、 再構成により酵素活性を取り戾すように
4007245 するために、 活性中心を 2つに分割するような分け方をする必要 がある。 具体的には、 レニラルシフェラーゼをシスティ ン (Cys)、 セリン （Ser)、 またはチロシン （Tyr) の位置で分割す ることを試みた。
なお、 後述の実施例にも示されるとおり、 発明者らの研究によ れば、 プローブ A (または Α') における Ν—スプリ ッ トレニラ ルシフェラ一ゼを、 ルシフェラーゼを Ser91 と Tyr92 の間で分 割して得られる N—スプリッ トレニラルシフェラーゼとし、 残る C—末端側を、 プロ一ブ B (または Β ') における C—スプリ ツ トレ二ラルシフェラ一ゼとすることにより、 とくに精度高い検出 が可能となる。
この出願の発明では、 以上のとおりの蛋白質相互作用解析用プ ローブが提供されるが、 これを用いて蛋白質一蛋白質相互作用を 解析するには、 前記のとおり、 一方のプローブ （例えばプローブ Α) を相互作用を確かめたい一方の蛋白質 aに連結させ、 もう一 方のプローブ （プローブ B) を相互作用を確認したいもう一方の 蛋白質 bに連結して両者を共存させ、 生物発光 （4) を検出、 測 定すればよい。 なお、 このとき、 各蛋白質 （3 a、 3 b) とプロ ーブ （l a、 l b、 l c、 I d) の連結方法は、 蛋白質やプロ一 ブに影響を及ぼさなければどのような方法であってもよい。 例え ば、 通常用いられる化学的、 生物化学的、 あるいは、 遺伝子工学 的手法等が適用できる。
この出願の発明では、 以上のとおりの蛋白質相互作用解析用プ ローブをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる方法として は、 蛋白質相互作用解析用プローブ （1 aおよび 1 b、 または 1 cおよび I d) を各々相互作用を確認した蛋白質 aおよび b (3
a、 3 b) に結合させ、 それらをセレンテラジンを含有する溶液 に添加して共存させる方法があげられる。 このような方法で蛋白 質—蛋白質相互作用を解析を in vitroで検出 ·定量できる。
また、 この出願の発明では、 蛋白質相互作用解析用プローブ (1) におけるプローブ A ( l a) を連結した蛋白質 aとプロ一 ブ B (l b) を連結した蛋白質 b、 または蛋白質相互作用解析用 プローブ A' ( 1 c ) を連結した蛋白質 a (3 a) とプローブ B ' (I d) を連結した蛋白質 b (3 b) を組み込んだ発現ベクター を、 個々の培養細胞に導入する方法により、 蛋白質 aおよび b (3 a、 3 b) をセレンテラジンおよび酸素と共存させることが できる。 なお、 酸素は細胞内に存在する濃度で十分であり、 新た に酸素を供給する必要はない。
このとき、 発現べクタ一としては、 動物細胞発現用のプラスミ ドベクターが好ましく用いられる。 このようなプラスミ ドベクタ 一を細胞に導入する方法としては、 電気穿孔法、 リン酸化カルシ ゥム法、 リボソーム法、 DEAEデキストラン法等の公知の方法 を採用することができる。 このように、 蛋白質相互作用解析用プ ローブ （ l aと l b、 または l cと I d) を連結した蛋白質 （ 3 aと 3 b) を組み込んだ発現べクタ一を細胞に導入する方法を用 いる こ とによ り 、 細胞内で蛋白質相互作用解析用プローブ ( 1)、 蛋白質 （3)、 セレンテラジンおよび酸素が共存でき、 細 胞を破壊することなく、 蛋白質一蛋白質相互作用を検出 ' 定量す る in vivo法が可能となる。
さらに、 この出願の発明の蛋白質相互作用の解析方法では、 蛋 白質相互作用解析用プローブ A (l a) を連結した蛋白質 a (3 a) とプローブ B ( l b) を連結した蛋白質 b (3 b), または
蛋白質相互作用解析用プローブ A' ( 1 c ) を連結した蛋白質 a (3 a) とプローブ B' ( I d) を連結した蛋白質 b (3 b) を 発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性 細胞を個体発生することによって、 この動物またはその子孫動物 の全細胞において蛋白質相互作用解析用プローブ （ 1 )、 蛋白質 (3)、 セレンテラジンおよび酸素を共存させることもできる。 このとき、 酸素は、 生体内に存在する濃度で十分であり、 新たに 添加する必要はない。
なお、 この出願の発明では、 このようにして得られるトランス ジエニック非ヒト動物をも提供する。 トランスジエニック非ヒト 動物は、 公知の作成法 （例えば Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77; 7380-7384, 1980) に従って作成することができる。 このよ うなトランスジエニック非ヒト動物は、 すべての体細胞に蛋白質 相互作用解析用プローブ （1) と蛋白質 （3) を保有しているた め、 例えば、 その体内に医薬品や毒物などの試料物質を導入し、 細胞および組織における蛋白質相互作用を解析することによつ て、 蛋白質一蛋白質相互作用に関わる細胞内シグナル増強 Z抑制 物質を精度高くスクリ一ニングすることができる。
この出願の発明の蛋白質一蛋白質相互作用の解析方法では、 前 記のとおりの作用原理および操作により発せられるルミネッセン ス （生物発光） （4) を検出することにより蛋白質—蛋白質相互 作用が起こったことを確認できる。 また、 レニラルシフェラ一ゼ による生物発光は組織透過性であることから、 細胞内での発光を 観察して画像化すれば、 蛋白質一蛋白質相互作用が起こったタイ ミングのみならず、 部位をも特定できる。 さらに、 特定の試料の 添加や濃度など、 条件を変化させた際の発光強度の変化を測定す
2004/007245 ることにより、 蛋白質一蛋白質相互作用を定量することもでき る。 さらにまた、 発光強度の変化を経時的に測定することによ り、 蛋白質一蛋白質相互作用の開始から終了までを追跡すること もできる。
以下、 添付した図面に沿って実施例を示し、 この発明の実施の 形態についてさらに詳しく説明する。 もちろん、 この発明は以下 の例に限定されるものではなく、 細部については様々な態様が可 能であることは言うまでもない。 実施例
蛋白質のリン酸化に伴って、 Y941 ペプチド （配列番号 2 ) と N—末端 SH2 ドメイン （SH2n) の間で生じる、 公知の蛋白質一 蛋白質相互作用 （Ozawa, T. et al. Anal. Chem. 73, 2516- 2521 (2001)； Sato, M. et al. Nat. Biotechnol. 20, 287- 294 (2002)； Sato, M. et al. Anal Chem. 71, 3948-3954 (1999). ) について、 本願発明の蛋白質相互作用解析用プローブ を用いて可視化した。
なお、 以下の実施例において、 試薬は次のものを使用した。
制限酵素、 修飾酵素およびリガーゼは Takara Biomedicals (東京、 日本） から購入した。
哺乳類において最も頻繁に用いられるコドンを含むレニラルシ フェラーゼをコードする、 合成レニラルシフェラーゼ遺伝子べク 夕一 （hRL- CMV) およびレニラルシフェラ一ゼアツセィキッ トは Proiega Co. (Madison, WI) から購入した。
哺乳類の発現べクタ一である pcDNA3.1 (+)および pIRES は、 そ れぞれ Invitrogen (Groningen^ オランダ） および Clonetecli
(Palo Alto, CA) より入手した。
Ham' s F-12 培地、 ゥシ胎児血清 （FBS) および Lipof ectAMINE は Gibco BRL (Rockville, MD) から入手した。
抗 myc 抗体、 抗 flag 抗体および抗リ ン酸化チロシン抗体 (PY20) は Santa CruzBiotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) より購入した。
アルカリホスファ夕ーゼ標識化抗ゥサギおよぴ抗マウス抗体 は、 Jacson Immuno esearch Lab. , Inc. ( Pennsylvania、 PA; より購入した。 ，
ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 は Amersham Pharmacia Biotech. (Buckinghais ire, イギリス） より入手した。
CDP-STAR の化学ルミネッセンス基質は New England Biolabs. Inc. (Beverly, MA) より購入した。
ぐ実施例 1 > 蛋白質相互作用解析用プローブの最適化
ィンスリ ン受容体基質- Γ ( insulin receptor substrate-1 ： 以下、 IRS1) 由来の Y941 ペプチド内の 941 チロシン残基は、 ィ ンスリン刺激されると、 インスリン受容体によりリン酸化され、 チロシンホスファターゼにより脱リン酸化される （Sato, M. et al. Anal Chem. 71， 3948-3954 (1999)； Prat ipanawatr, W. et al. Diabetes 50, 2572-2578 (2001). )。 また、 ホスファチジル イノシトール- 3-キナーゼの P85 サブユニッ ト （p85 330-429) 由来の SH2n は、 IRS1 内部のリン酸化された 941-チロシン残基 に結合する （Yoshimura, R. et al. Diabetes 46, 929-936 (1997)； Golstein, B. J. et al. J. Biol. Chem. 1275, 4283- 4289 (2000). )。
( 1 ) プラスミ ドの構築
レニラルシフェラーゼの遺伝子をシスティン、 セリンおよびチ 口シン近傍の 8箇所で分割し、 2個の不活性なフラグメント （N
—スプリッ トレニラルシフェラーゼ、 C—スプリッ トレニラルシ フェラ一ゼ） にした。
配列番号 1および図 3にレニラルシフェラ一ゼのアミノ酸配列 と分割部位を示した。 なお、 本実施例においては、 レニラルシフ エラ一ゼ （hRL) の 124-システィン残基がァラニンに置換され、 ルミネッセンス活性が増大されたレニラルシフェラーゼ変異体
( hRL 124C/A： 配列番号 3 ) ( L iu, J. e t a l. Gene 203, 141 - 148 (1997) . ) を用いた。
N—スプリッ トレニラルシフェラ一ゼ （hRLn) および C—スプ リ ッ ト レニラルシフェラ一ゼ （ hRLc ) を、 それぞれ蛋白質
(Y941 と SH2n) に結合させた。 各スプリッ トレニラルシフェラ ーゼ融合蛋白質 （sRL) のプラスミ ドの構成を図 4に示した。 な お、 これらのプラスミ ドは、 いずれも開始コ ドン上流に CMV-プ 口モーター配列を有するものとした。
Y941 のアミ ノ酸配列は TEEAYMKMDLGPG (配列番号 2 ) であ り、 これは IRS 1 内部のチロシンリン酸化ドメインとなってい る。 SH2n はゥシホスファチジルイノシトールの p85 サブュニッ トの N—末端 SH2 ドメインで'ある。 また、 図 4において、 点線 部分はリボソーム内部進入部位 （IRES ) を示す。 さ らに、 sRL は、 いずれも （翻訳終了コドン） 一 （リボソーム内部進入部位） ― (翻訳開始コ ドン） より構成されるカセッ トを有するものとし た。
さらに、 蛋白質一蛋白質相互作用が生じた際に、 N—および C —スプリッ トレニラルシフェラ一ゼが確実に近接するようにする
ために、 N—スプリッ トレニラルシフェラーゼと Y941 の間に、 G-A リピートを含む柔軟な 18 アミノ酸残基からなるリンカ一配 列 （配列番号 4) を、 SH2n と C一スプリッ トレニラルシフェラ ーゼの間に同様のリンカ一配列 （配列番号 5 ) を揷入した。 さら に、 Myc および FLAG ェピトープを N—および C—スプリッ トレ 二ラルシフェラ一ゼの下流に揷入した。
なお、 全てのプラスミ ド構築サブクローニングの微生物宿主と しては、 大腸菌株 DH5Q!を用いた。 また、 プラスミ ドは、 全てジ —ンアナライザー AB1 prism 310 (PE Biosystems、 東京、 日 本） を用いた配列解析により確認した。
( 2 ) 細胞培養と形質移入
CH0-HIR 細胞の生育は、 10 %熱不活性化 FBS (Filtron), 100 unit/mLペニシリン、 および 100 g/mLストレプトマイシンを添 加した Ham' s F-12 培地中で行った。 形質移入は LipoiectAMINE 2000を用いて行った。
細胞を 6ゥエルの培養プレート上に播種し、 前記いずれかのプ ラスミ ドを 2 ng用いて形質移入を行った。 形質移入の 6 時間後 に Lipofect AMINE を含む培地を FBS、 ペニシリンおよびストレブ トマイシンを添加した Ham' s F-12培地に置換し、 40時間ィンキ ュべ一トして各蛋白質相互作用解析用プローブを発現させた。
( 3 ) 免疫沈降およびィムノプロッ ト分析
CH0-HIR細胞を、 100 nMィンスリンを用いて 37 で 5分間剌 激し、 氷冷した 2x 免疫沈降緩衝液 （ 10 mM Tris-HCl ( H 7.4)、 1 iM EDTA、 1 mM EGTA、 10 M NaF、 0.2 mM オルソバナ ジン酸ナトリウム、 10 M g/mL ロイぺプチン、 lO zg/ml ぺプス夕 チン、 0.2 mM フエ二ルメチルスルホニルフルオラィ ド （PMSF)、
2 % IGEPALCA630、 1 % Triton X- 100) により機械的に破碎し た。
N—融合蛋白質は抗 myc 抗体により 4 でで 1 時間処理し、 CH0-HIR 細胞の全細胞破碎液から免疫沈降した。 この免疫沈降物 を、 蛋白質 Gセファロ一ス 4FF ビーズを用いて吸着し、 次いで 氷冷した免疫沈降緩衝液を用いて 5回洗浄した。
試料を SDS—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により分離し、 Y941 リン酸化については抗リン酸化チロシン抗体 （1:500) を用 いて、 N—末端蛋白質の評価には抗 myc 抗体 （1:500) を用い て、 C—末端蛋白質の評価には抗 flag 抗体 （ 1:1000) を用いて 分析した。
(4) 発光測定
37でで CH0- HIR 細胞のインスリン刺激を行った。 また、 発光 強度はレニラルシフェラ一ゼアツセィキッ トを用いて測定した。
次に冷 PBS を用いて細胞を 2 回洗浄し、 破碎した。 破碎液を 4 でで 15, 000 g、 30 秒間遠心分離し、 上澄の一部について、 Minilumat LB9506 照度計 （Berthold GmbH Co. KG、 Wildbad、 ドイツ） を用いて発光強度を 10 秒間測定した。 上澄中の蛋白質 濃度は Bradford法により測定した。
( 5 ) 結果
レニラルシフェラーゼの分割箇所と、 蛋白質相互作用により生 起した発光 （インスリンの存在下における発光とィンスリンの非 存在下における発光の比） の関係を図 5 ( a) に示した。 また、 全長レニラルシフェラーゼ （ML124C/A) による発光強度に対す る各蛋白質相互作用解析用プローブの相対発光強度を図 5 (b) に示した。
なお、 各測定は、 培養プレートの異なるゥエルを用いて 3回行 つた。
レニラルシフェラ一ゼが Se r9 1 と Tyr92 の間で分割された蛋 白質相互作用解析用プローブ （SRL9 1 ) を発現した CHO- HIR 細胞 は、 10— 7 Mインスリン存在下において、 非存在下の場合と比べて 25倍の発光強度を示した。
一方、 レニラルシフェラーゼが他の位置で分割された蛋白質相 互作用解析用プローブでは、 10—7 M インスリン存在下で 2〜4 倍 の増加が確認された。
<実施例 2 >
実施例 1において、 SRL9 1 を発現した CH0-HIR細胞でのレニラ ルシフェラーゼの補完が蛋白質のリン酸化に起因する蛋白質ー蛋 白質相互作用により引き起こされたものであることを確認するた めに、 SRL9 1 における Y941 ペプチド中の 941 番目のチロシン残 基のリン酸化部位をフエ二ルァラニン残基に変換し、 SRL9 1 変異 体 （SRL9 1F を作成した。 N —末端側および C —末端側プローブ を各々配列番号 6および 7に示した。
この SRL91F を用いて実施例 1 と同様の操作を行い、 インスリ ン刺激の存在下および非存在下での発光強度を測定した。 同様 に、 図 4 ( c ) および図 4 ( d ) のプラスミ ドを用いて SRL 9 1 の N —末端側おょぴ C—末端側のみを個別に CHO- HIR 細胞に発 現させ、 各々の発光強度を測定した。
結果を図 6に示した。
SRL9 1F を発現した CHO- HIR 細胞においては、 インスリン剌激 時の酵素活性の増加は見られなかった。 また、 SRL9 1 の N—末端 側および C —末端側のみを個別に発現した CH0-HIR 細胞では、
インスリンの非存在下のみならず存在下においても、 ルミネッセ ンス活性が完全に消失していた。
以上より、 Y941 と SH2n間の蛋白質一蛋白質相互作用により、 レニラルシフェラーゼの補完が起こることが確認された。 したが つて、 レニラルシフェラ一ゼを Ser91 と Tyr92 の間で分割した スプリ ッ トレ二ラルシフェラ一ゼを含む本願発明のプローブ ( SRL91) が蛋白質相互作用解析用プロ一ブとして有効であるこ とが示された。
<実施例 3 > 蛋白質一蛋白質相互作用の経時変化測定
前記の方法により SRL91 を発現した細胞を、 100 nM または 10 M ィンスリンを添加した培地において、 1 分、 5 分、 10 分、 30 分および 60 分間、 37ででインキュベートし、 直ちにルミネッセ ンスを測定した。
Y941 と SH2nの間の相互作用の経時変化を図 7に示した。
発光強度はインスリン刺激の 5 分後に増加し、 以後は漸減し た。
さらに、 SRL91 を発現した細胞を、 10— 7 M インスリンを添加し た培地において、 1分、 5分、 10分、 30分および 60分間、 37で でインキュベートし、 抗 myc 抗体を用いて全細胞の破砕液の免 疫沈降を行った。 抗リン酸化チロシン抗体と抗 myc 抗体を用い て免疫ブロッテイ ングを行った。 なお、 抗体染色の可視化は、 CDP-STAR を用い、 LAS- 1000 とイメージアナライザ （Fuj i i i lm Co.、 東京、 日本） により行った。
得られた結果を図 8に示した。
発光強度の経時変化とィムノブロッティングの結果は一致し、 蛋白質相互作用の時間依存性は、 チロシンのリン酸化および脱リ
ン酸化によるものであることが示唆された。
以上より、 SRL91 の発光強度の変化が生細胞中で進行する蛋白 質—蛋白質相互作用を直接的に反映することが確認された。
<実施例 4>
以上のような発光は、 膜透過性基質であるセレンテラジンの存 在下で、 蛋白質一蛋白質相互作用が起こり、 レニラルシフェラ一 ゼが補完されることにより生じる。
そこで、 次に本願発明の蛋白質相互作用解析用プローブを用い て生細胞内における特定の蛋白質—蛮白質相互作用の発生部位お よび時間について非侵襲的に画像化することを検討した。
そこで、 SRL91 を発現した CH0- HIR細胞における Y941 と SH2n の間の蛋白質一蛋白質相互作用を画像化した。 なお、 細胞は、 力 —ルツアイス社の AxiovertslOO顕微鏡に、 40倍の油浸対物レン ズを付けた Till Vision V3.02 (PHOTONICS, Planegg, ドイツ） によ り 制御さ れた冷却装置付きカ メ ラ MicroMax ( Roper Scientific Inc, Tucson, AZ) を取り付け、 室温下で画像化し た。
図 9に、 SRL91 を発現した CH0- IR細胞の 10— 7 Mインスリン剌 激の非存在下 （a) および存在下 （b) における顕微鏡像と全長 レニラルシフェラーゼ （hRL124C/A) を発現した CH0- IR 細胞の 顕微鏡像を示した。
なお、 撮影は CCD カメラを用い、 20 ¾セレンテラジン基質緩 衝液を添加した PBS 中で、 露出時間をそれぞれ 300 秒 （ a、 b) および 60 秒 （c) として実施した。 発光強度はカラ一スケ —ルで表した。
補完されたレニラルシフェラーゼにより放出された発光の増強
は、 インスリン刺激時には細胞膜下においてのみ見られた （図 9 b)。 一方、 インスリン非存在下では、 このような鮮やかな対照 は見られなかった。
以上より、 インスリン剌激による Y941 と SH2n の間の相互作 用が細胞膜下においてのみ生じることが示された。
さらに、 全長レニラルシフェラーゼ （hRL124C/A) を発現した CH0-HIR 細胞では、 細胞全体において均一にルミネッセンスが放 出された （図 9 c ) ことから、 図 9 bの結果が細胞膜直下におけ るセレンテラジンの過剰蓄積によるものではないことが示され た。
ぐ実施例 5 >
スプリッ トレニラルシフェラーゼを用いて、 リン酸化されたァ ダブタープロテイン She と Grb2 の相互作用 （図 1 0 ) を定量的 に検出することに成功した。
その結果、 epidermal growth factor (EGF)、 17 β -estradiol (E2)、 dihydrotestosterone (DHT) および diet ylstilbestrol (DES) により細胞外から刺激した場合、 She のリン酸化部位お よび Grb2 との相互作用部位に多くの選択性があることが示され た。
リセプタ一型キナーゼに対する刺激、 すなわち EGF 添加の場 合、 317 番目のチロシン基がリン酸化されて Grb2 と結合し、 そ の結合には PTB ドメイン内のセリンが必要であることが示され た。 これは、 Sheが PTB ドメイン内のセリンの存在によりリセプ ター型キナーゼに結合するためであると考えられる。
一方、 E2 添加の場合、 239 および 240 番目のチロシン基がリ ン酸化して Grb2 と結合するためには、 PTB ドメイン内のセリン
の存在が必要であることが示された。 一方、 317 番目のチロシン のリン酸化による Grb2 との結合は、 セリン存在下では起こらな いことが示された。
また、 DHT添加および Estrogen Receptor に対するァゴニスト として知られる DES 添加の場合も、 同様の結果が得られた （図 1 1 )。 産業上の利用可能性
以上詳しく説明したとおり、 この発明によって、 生細胞におけ る蛋白質一蛋白質相互作用を直接可視化できる蛋白質相互作用解 析用プローブが提供される。 このような蛋白質相互作用解析用プ ローブは、 蛋白質—蛋白質相互作用によるレニラルシフェラーゼ の補完を用いるものであるが、 他の補完酵素系で用いられる拡散 性の生成物 （Blakely, B. T. et al. Nat. Biotec nol. 18, 218-22 (2000)； Rossi, F. et al. Pro Natl. Acad. Sci. USA 94, 8405-8410 (1997)； Remy, I. & Michnick, S. W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96， 5394-5399 (1999)； Galarneau, A. et al. Nat. Biotechnol. 20, 619-622 (2002)； Wehrman, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 3469- 3474 (2002). ) とは異なり、 補完レニラルシフェラ一ゼによる 生物発光は、 生細胞や生物内において、 蛋白質一蛋白質相互作用 が発生した部位と時間を特定できる点で有用性が高い。
Claims
1 . 二つの蛋白質間の相互作用を解析するためのプローブで あって、 少なくともレニラルシフェラ一ゼの N—末端側のポリぺ プチドを含むプローブ Aと、 少なくともレニラルシフェラ一ゼの 残る C—末端側のポリペプチドを含むプローブ Bの二つのプロ一 ブからなることを特徴とする蛋白質相互作用解析用プローブ。
2 . プローブ Aは、 レニラルシフェラーゼの N—末端側のポ リペプチドとともに int e iii の N—末端側のポリペプチドを含 み、 プローブ Bは、 レニラルシフェラ一ゼの残る C—末端側のポ リペプチドとともに inte in の C一末端側のポリペプチドを含む 請求項 1の蛋白質相互作用解析用プローブ。
3 . レニラルシフェラ一ゼの N—末端側のポリペプチドと、 レニラルシフェラ一ゼの残る C—末端側のポリべプチドに、 各々 リンカー配列が結合している請求項 1または 2のいずれかの蛋白 質相互作用解析用プロ一プ。
. リンカ一配列は、 3〜 2 0アミノ酸残基からなるもので ある請求項 3の蛋白質相互作用解析用プローブ。
5 . レニラルシフェラーゼの N—末端側のポリペプチドとレ 二ラルシフェラーゼの残る C一末端側のポリペプチドは、 レニラ ルシフェラ一ゼを Ser91 と Tyr92 の間で分割して得られるもの である請求項 1ないし 4の蛋白質相互作用解析用プローブ。
6 . 請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Aを連結し た蛋白質 aと請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Bを連 結した蛋白質 bを、 セレンテラジンと酸素の存在下で共存させ、 発光を測定することを特徴とする蛋白質—蛋白質相互作用の解析
方法。
7 . 請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Aを連結し た蛋白質 aと請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Bを連 結した蛋白質 bを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入する ことによりプローブ Aを連結した蛋白質 aとプローブ Bを連結し た蛋白質 bをセレンテラジンと酸素の存在下で共存させる請求項 6の蛋白質—蛋白質相互作用の解析方法。
8 . 請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Aを連結し た蛋白質 aと請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Bを連 結した蛋白質 bを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって、 この動物ま たはその子孫動物の全細胞においてプローブ Aを連結した蛋白質 aとプローブ Bを連結した蛋白質 bをセレンテラジンと酸素の存 在下で共存させる請求項 6の蛋白質一蛋白質相互作用の解析方 法。
9 . 請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Aを連結し た蛋白質 aと請求項 1ないし 5記載のいずれかのプローブ Bを連 結した蛋白質 bを発現するポリヌクレオチドを細胞内に導入し、 非ヒト動物全能性細胞を個体発生することによって得られる非ヒ ト動物またはその子孫動物。
10. 請求項 9の非ヒ ト動物またはその子孫動物に検査試料を 導入し、 該非ヒト動物またはその子孫動物の細胞における蛋白質 相互作用を解析する物質のスクリーニング方法。
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