WO2004099418A1 - 融合蛋白質 - Google Patents

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein, particularly to a fusion protein that induces an antibody against cariogenic bacteria.
  • Non-Patent Document 1 discloses a technique for creating a fusion protein by connecting sites. Antibodies prepared using the fusion protein as an antigen have been confirmed to strongly inhibit the adhesion of S. mutans to saliva-coated hydroxyapatite.
  • Non-patent document 2 discloses a technique for producing a large amount of a monoclonal antibody against an adhesin (PAc) on the surface of S. mutans using a recombinant plant.
  • PAc adhesin
  • the pathogens of dental caries are not limited to S. mutans, but it is thought that dental caries is induced by multiple kinds of bacteria present in the oral cavity. In particular, human carious lesions are frequently separated from S. mutans and further from Storeptococcus sobrinus.
  • the object of the present invention has been made in view of the above-mentioned problems, and is effective in inducing an antibody against S. sobrinus, which is one of the main pathogens forming carious lesions.
  • An object of the present invention is to provide a fusion protein capable of preventing caries.
  • Non-Patent Document l HAO YU, 4 others, ⁇ Effects of Antibodies against Cell Surface ProteinAntigen P Ac-- Glucosyltransf erase Fusion Protein on LJ lucan Synthesis and Ceil Adhesion of Streptococcus mutans, INF ECTION AND IMMUNITY, America, American Society for Microbi ology, June 1997, Vol. 65, No. 6, p. 2292-2298
  • Non-Patent Document 2 Ma, ft! L2, "Immunotherapeu1: ic potential of antibodies produced in plants", TIBTECH, 1995, Vol. 13, p. 522-527
  • the fusion protein that is useful in the present invention is a macromolecular bacterial surface protein of Streptococcus sobrinus (hereinafter, also referred to as “S. sobrinus”).
  • the alanine repeat region is characterized by comprising the following protein (a) or (b).
  • the gnorecan binding region force S is characterized by comprising the following protein (a) or (b).
  • the alanine repeat region (hereinafter, also referred to as "A_repeat region”) of the high-molecular-weight cell surface protein of S. sobrinus (hereinafter, also referred to as "PAg”) may be referred to.
  • This region constitutes a functional region of PAg, that is, a salivary binding region that binds to a salivary glycoprotein of an oral pellicle, and contains a high concentration of alanine localized near the N-terminus.
  • S. sobrinus is involved in the initial settlement on the tooth surface.
  • S. sobrinus glucan synthase (hereinafter sometimes referred to as "GTF") is a method of synthesizing water-insoluble glucan from sucrose to obtain a hydroxy-treated glucan synthase from S. sobrinus saliva.
  • the glucose binding region (hereinafter, also referred to as “glucan_binding region”) is a functional region of the enzyme that binds to glucose, which makes the adhesion to the apatite particles stronger.
  • the present inventors have found that the mechanism of action of an antibody against S. sobrinus induced in the oral cavity in suppressing dental caries, that is, inhibition of adhesion of bacterial cells to the tooth surface, whitening of bacterial cells bound with the antibody, Among the mechanisms of phagocytosis by blood cells and inhibition of bacterial cell metabolism, we focused on the mechanism of inhibition of bacterial adhesion to tooth surfaces. Then, a fusion protein, which is a functional region of two proteins that play an important role in the adhesion of the protein and enhances the mechanism of action, and which binds the two specific regions, is used as an antigen. And As a result, as described later, it was confirmed that the antibody obtained after administration of the fusion protein according to the present invention inhibited the attachment of S. sobrinus to the tooth surface at a high rate.
  • the present invention relates to the binding order of the alanine repeat region and the glucose binding region, that is, which region is arranged upstream when the amino acid sequence is taken into consideration, or the other peptide that connects the two regions. Import, addition of peptides before and after the above two regions, and the like are not particularly limited.
  • the glucan synthase of S. sobrinus may be incorporated into the fusion protein, including one or more amino acids before and after the glucan binding region.
  • the fusion protein of the present invention includes deletions, substitutions, or additions of one or more amino acids in the two regions. This is, for example, a method for replacing or deleting a specific amino acid by a point mutation performed on a recombinant DNA described later. Chillon method
  • a known method such as the Kunkel method can be used.
  • the C-terminal is esterified or amidated, and ⁇ H, C 0 ⁇ H,
  • Some modifications such as protecting NH, SH, etc. with a suitable protecting group such as formyl group
  • the fusion protein of the present invention thus prepared can be used, for example, as a pharmaceutical composition containing the fusion protein of the present invention as an active ingredient. That is, by directly administering an effective amount of the fusion protein of the present invention capable of inducing immunity to mammals including humans, it is possible to induce an immune response in humans and the like and to carry out long-term caries prevention. Alternatively, as described below, caries can be prevented by recovering an antibody from a mammal to which the fusion protein of the present invention has been administered and administering the antibody into the oral cavity.
  • the fusion protein may be used as it is, but usually, a medicine containing the fusion protein as an active ingredient using a pharmaceutically acceptable additive or excipient for a pharmaceutical preparation. It is preferable to produce and use it as a drug composition.
  • the administration route of the pharmaceutical composition include local administration capable of inducing an immune response, such as nasal mucosal administration. Therefore, the fusion protein of the present invention is used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for local administration such as nasal immunity.
  • the recombinant DNA according to the present invention encodes the fusion protein according to the present invention.
  • the recombinant DNA according to the present invention has the following nucleotide sequence (a) or (b) encoding the alanine repeat region of the surface protein of the high molecular weight bacterial cell of Streptococci! S sobrinus constituting the fusion protein.
  • the fusion protein is characterized by having the following nucleotide sequence (a) or (b) encoding a glucan binding region of a glucan synthase of Streptococcus sobrinus constituting the fusion protein. (a) The base sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
  • an expression vector containing the recombinant DNA according to the present invention and a transformant carrying the expression vector are provided.
  • examples of the DNA that can hybridize under stringent conditions with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 include, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4.
  • DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, preferably 90% or more is used.
  • Hybridization can be performed, for example, according to a method described in a manual of a DIG nucleic acid detection system (Roche).
  • stringent hybridization conditions to tolerate about 20% mismatch include 50% formamide (deionized), 5 ⁇ SSC (sodium concentration 0%).
  • the recombinant DNA of the present invention can be isolated from genomic DNA derived from S. sobrinus, genomic DNA library, and cDNA derived from S. sobrinus by a known method.
  • the combined DNA, synthetic DNA, or deviation may be used.
  • a DNA ligase or the like the combined DNA, synthetic DNA, or deviation may be used.
  • a known method such as the Kunkel method is used.
  • the conversion of the base sequence can be carried out according to the method of or a method analogous thereto.
  • the fusion protein can be easily and massively purified by using the above transformant
  • the fusion protein is not limited to one prepared by introducing the above recombinant DNA into the transformant. Needless to say.
  • a known method of protein synthesis for example, condensing amino acids having a suitably protected amino group and side chain functional group on a resin for protein synthesis in accordance with the above-mentioned amino acid sequence, and after completion of the condensation reaction, various protections By removing the groups and further performing the intramolecular disulfide bond formation reaction in a highly diluted solution, the present invention It is also possible to synthesize a fusion protein.
  • the expression vector of the present invention may be any of a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a Bataterio phage such as ⁇ phage, and an animal virus such as retrovirus / less and baculoinoleth. ,.
  • An expression vector containing a promoter, an enhancer, a splicing signal, a polymerase addition signal, a selection marker and the like depending on the host cell can be used.
  • the host cell used in the transformant of the present invention may be, for example, any of bacteria such as Escherichia coli, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • the antibody preparation of the present invention includes an antibody against the above-mentioned fusion protein. That is, the antibody against the fusion protein according to the present invention has an inhibitory action on the attachment of S. sobrinus to the tooth surface, and the action is based on the antibody containing the antibody produced by other mammals including humans. It is also effective when it is administered into the oral cavity as a preparation.
  • the antibody contained in the antibody preparation of the present invention can be produced according to a known antibody or antiserum production method.
  • the fusion protein is administered to a mammal together with the carrier itself or a carrier and a diluent, and the antibody-containing substance is collected from the immunized mammal and the antibody is separated and purified.
  • the mammal to be immunized include a mouse, a rat, a heron, a sheep, a goat, and a chick.
  • a human artificial chromosome is immunized by administering the fusion protein to a human polyclonal antibody-producing HAC protein or the like, which is prepared through a known method such as cell fusion or nuclear transfer, to thereby produce a human antibody. It may be good.
  • an antibody involved in inhibiting adhesion to the tooth surface as a polyclonal antibody that is simultaneously prepared.
  • antibody-producing cells are recovered from an immunized animal, and the monoclonal antibody is purified by a known method. May be produced.
  • Examples of the form of the antibody preparation according to the present invention include an oral ointment, a jelly preparation, a mouthwash, and a spray.
  • FIG. 1 (a) is a diagram illustrating the PAgA gene region, (b) is a diagram illustrating the configuration of pQE80L-pagA, and (c) is a diagram illustrating the gtfl-GB gene region.
  • FIG. 2D is a diagram illustrating the configuration of one GB of pQE80L-pagA-gt fl.
  • FIG. 2 is an SDS-PAGE image of Escherichia coli expressing the fusion protein.
  • FIG. 3 is an SDS-PAGE image of the purified fusion protein.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the number of bacteria adhering to hydroxyapatite and the amount of IgG antibody added.
  • PAgA DNA fragment encoding the A-repeat region of PAg
  • This fragment was obtained by performing a PCR reaction on chromosomal DNA isolated from S. sobrinus strain OMZ176 using the following forward primer 1 and reverse primer 1.
  • Reverse primer 1 ATATGAGCTCCTTCTTGTACTGAGCAAGC (including the base sequence described in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, including the Sacl site)
  • the PCR reaction was performed for 30 cycles at 98 ° C for 10 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 1.0 minute.
  • the gene region encoding the glucan-binding region of the water-insoluble glucan synthase GTF-I is S. sobrinus.
  • GTF-I water-insoluble glucan synthase GTF-I
  • gtfl-GB a type of GTF derived from S. sobrinus
  • Forward primer 2 ATATGAGCTCCTATACTACTTCGGTAAAGAC (including the base ligation and Sacl site described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing)
  • Reverse primer 2 TTTTAAGCTTAGTTCCAGCCACGGTAGAT (base sequence described in SEQ ID NO: 8 in Sequence Listing, including Hindm site)
  • the PCR reaction was performed for 30 cycles at 98 ° C for 10 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2.0 minutes.
  • the DNA fragment obtained by the above (1) and (2) was incorporated into a plasmid expression vector PQE80L (manufactured by Qiagen) encoding six consecutive His residues as follows.
  • DNA fragment obtained in the above (1) and pQE80L are cleaved by restriction enzymes BamHI and Sacl, respectively, and subjected to electrophoresis in each reaction solution after cleavage. Cut out the band used for integration and dissolve each DNA fragment from the gel.
  • the purified DNA fragment (1) and the purified vector were ligated using DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • DNA ligase Takara Shuzo Co., Ltd.
  • FIG. 1 (b) the vector PQE80L-pagA into which the pagA gene region was inserted was created.
  • the DNA fragment obtained in the above (2) and the vector pQE80L_pagA were subjected to a cleavage reaction using the restriction enzymes Sacl and Hindlll. About the reaction solution after cutting Also, electrophoresis was performed as described above, and the corresponding band was cut out and eluted and purified.
  • the purified DNA fragment (2) and the purified pQE80L_pagA were ligated using a DNA license (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • a vector pQE80L_pagA—gtfl—GB into which a gtfl—GB gene region was further inserted was created.
  • the transformant obtained in the above [Example 1] was mixed with competent Escherichia coli DH5_ and transformed.
  • the obtained transformant was cultured for 1 ⁇ in a 2 X YT medium supplemented with ampicillin so that the concentration of ampicillin became 100 zg / ml, and this culture solution was newly prepared in a 2 X YT medium (ampicillin). (100 ⁇ g / ml) at a ratio of 1:20 and cultured at 37 ° C. for 1 hour.
  • IPTG isopropylthiogalactoside
  • the culture solution was precipitated at 3500 X g for 20 minutes by centrifugation to collect bacteria, and then washed three times with PBS (phosphate-buffered saline).
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the cells obtained as in (1) were lysed by adding 2X SDS-PAGE sample buffer, heated at 100 ° C for 5 minutes, and electrophoresed on a 10% polyacrylamide gel. . After electrophoresis at 100 V (constant voltage) for 1 hour, an image of the gel stained with protein using Coomassie brilliant blue is shown in FIG.
  • lane M is a marker lane
  • lane 1 is a lane in which a lysis reaction solution of cells cultured by heating IPTG as described above is migrated
  • lane 2 is a lane in which IPTG is dissolved.
  • This is a lane in which a lysis reaction solution of bacterial cells cultured without addition, that is, without inducing expression, was electrophoresed.
  • the cells are dissolved in cells (100 mM NaHPO, 10 mM Tris-Cl, 8 mM
  • Mure a pH 8
  • 2X SDS-PAGE sample buffer was added to the mixture to dissolve it, heated at 100 ° C for 5 minutes, and the lysate was mixed with the column bed, introduced into the column, and purified. went.
  • Buffer (1 OOmMNaHPO, 10 mM Tris-Cl, 8Murea, pH 6.3) is passed through the column after the adsorption reaction to remove unadsorbed substances.
  • the eluted protein fraction was subjected to electrophoresis on a 10% polyacrylamide gel in the same manner as described above. After electrophoresis at 100V (constant voltage) for 1 hour, the gel image stained with protein using Coomassie Brilliant Blue is shown in FIG.
  • lane M is a marker lane
  • lane 1 is a lane in which a lysate before purification was run
  • lane 2 is a lane in which the non-protein fraction in the above purification procedure was run
  • lane 3 is a lane in which the protein fraction was run.
  • Antibodies were prepared by administering the fusion protein prepared in Example 2 to rabbits (Japanese white, female).
  • the fusion protein was administered by intradermal injection together with 0.3 mg of a complete Freund's adjuvant six times every two weeks, and IgG antibody was purified and obtained from the blood.
  • IgG antibody For purification of IgG antibody, use Affi-Gel Protein A MAPS II Kit (Bio-Rad) And the method described in the manual. That is, Affi-Gel protein A agarose equilibrated with the binding buffer (adjusted to pH 9.0) attached to the kit was packed in the column.
  • an equivalent amount of binding buffer was added to the serum of the rabbit immunized with the fusion protein, and then added to the column to allow the rabbit IgG to be adsorbed to Affi-Gel protein A agarose.
  • elute IgG is eluted with the elution buffer (adjusted to pH 3.0) included in the kit, dialyzed with phosphate buffered saline (pH 7.4), and concentrated to 1 Omg / ml. It was used as a purified IgG antibody.
  • n 3 mean ⁇ SD
  • FIG. 4 is a hydroxyapatite lOmg coated with saliva, S. sobrinus (bacterial number 3 X 1 0 7) and Ka ⁇ E IgG antibodies, 3 hours, measured after incubation at 37 ° C for the hydroxyapatite 4 is a graph showing the relationship between the number of bacteria adherent to the cells and the amount of IgG antibody added g). Table 1 shows the measured values of the number of adherent bacteria at each amount of IgG antibody added.
  • the anti-PAgA-GTF-IGB IgG in the figure is an IgG antibody prepared as described in (1) above, and is a preimmunized IgG (hereinafter sometimes referred to as "preimm. IgG").
  • Is an IgG antibody purified from the blood of non-immunized egrets to which no fusion protein is administered.
  • contorol is a measured value when no IgG antibody was added.
  • Saliva coated hydroxyapatite The, for the same state as the tooth surface in the oral cavity, the ceramic beads surfaced with Bruno tight a tooth surface component (manufactured by diameter 80 beta m, Biorad Corp.) soaked in saliva, 1 hour, 37 ° The one kept at C was used.
  • the number of adherent bacteria was determined by fluorescently labeling S. sobrinus with BCECF-AM (2 ', 7_bis [2_carboxyethyl] _5 [6] _carboxyfluorescemacetoxymethyl thyl ester) and attaching to hydroxyapatite after the attachment reaction time. was obtained by measuring with a photo counter.
  • preimm IgG deposition number of bacteria during addition can 1. 0 X 10 7 -. To 0.7 of which was a X 10 7, anti PAgA-GTF- When IGB IgG was added, the ratio was 0.6 ⁇ 10 7 —0.2 ⁇ 10 7 , and there was a statistically significant difference in the number of adherent bacteria at each amount of IgG added (P 0.05). From this, it was confirmed that the adhesion of S. sobrinus to saliva-coated hydroxyapatite was significantly suppressed by anti-PAgA-GTF-IGB IgG.
  • the fusion protein of the present invention for example, by administering to a human as a pharmaceutical composition containing the fusion protein of the present invention as an active ingredient, the immune response of a human or the like can be improved.
  • the fusion protein according to the present invention it becomes possible to efficiently generate and recover a plurality of types of antibodies involved in inhibiting the adhesion of S. sobrinus to the tooth surface from mammals.
  • the adhesion of S. sobrinus to the tooth surface is inhibited, or the metabolism of bacteria is inhibited, and the phagocytosis of bacteria by leukocytes and the like is brought about.
  • Prevent caries Therefore, it is possible to easily prevent caries without administering a vaccine containing the fusion protein by subcutaneous injection or the like for the purpose of caries prevention by the antibody.

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Description

明 細 書
融合蛋白質
技術分野
[0001] 本発明は融合蛋白質に関し、特にう蝕菌に対する抗体を誘導する融合蛋白質に関 する。
^景技術
[0002] 従来、う蝕予防として、例えば、フッ化物を歯磨剤に添加したり、スクロースに代わる 代用甘味料を菓子に添加することなどが行われてきた。
更に、近年においては、ワクチン投与などによって、う蝕病原菌やう蝕病原菌により 産生されるう蝕原因物質等に対する免疫反応を誘導するう蝕予防法が注目されてい る。このような技術の一例として、う蝕病原菌の 1つである Streptococcus mutans ( 以下、「S. mutans」と表記することもある）の菌体表層に局在する 2つの物質のそれ ぞれの機能部位をつなぎ合わせて融合蛋白質を作成する技術が非特許文献 1に示 されている。当該融合蛋白質を抗原として作成された抗体は、実際に S. mutansの 唾液被覆ハイドロキシアパタイトへの付着を強く阻害することが確認されてレ、る。
[0003] また、非特許文献 2には、 S. mutansの菌体表層の付着因子（PAc)に対するモノ クローナル抗体を、組み換え植物により大量生成する技術が示されている。
上述のように、 S. mutansに特異的に作用する免疫学的方法を用いることにより、 口腔内の他の細胞等を傷めることなぐ S. mutansの歯面への付着や S. mutansに よる酸生成を抑制することが可能となる。
[0004] し力、しながら、う蝕の病原菌は S. mutansに限られるものではなぐ口腔内に存在 する複数種類の細菌によりう蝕が誘発されると考えられている。特に、ヒトのう蝕病巣 力、らは、 S. mutansと、更に Storeptococcuss sobrinusと、力高頻度に分離され ている。
このため、上述のように免疫学的手法を用いる場合には、特定の病原菌に対して特 異的に作用させることができる反面、その特異性は非常に厳密であるため S. mutan s以外の病原菌に作用させることができない。すなわち、たとえ上述の抗体によって、 S. mutansの歯面への付着や、 S. mutansの増殖を抑制できても、これに代わって その他のう蝕病原菌、特に S. sobrinusが増殖することとなり、効果的にう蝕予防を行 うことができない。
[0005] 本発明の目的は、上述の課題に鑑みてなされたものであり、う蝕病巣を形成する主 要な病原菌の 1つである S. sobrinusに対する抗体を誘導することにより、効果的なう 蝕予防を可能とする融合蛋白質を提供することにある。
非特許文献 l : HAO YU、他 4名、 " Effects of Antibodies against Cell Su rface ProteinAntigen P Ac— Glucosyltransf erase Fusion Protein on LJ lucan Synthesis and Ceil Adhesion of Streptococcus mutans , INF ECTION AND IMMUNITY, America, American Society for Microbi ology, June 1997, Vol. 65, No. 6, p. 2292-2298
非特許文献 2 : Ma、ft!l2 、"Immunotherapeu1:ic potential of antibodies p roduced in plants", TIBTECH, 1995, Vol. 13, p. 522-527
発明の開示
[0006] 本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意研究した結果、 S. sobrinusの歯面への定着 を効果的に阻害する抗体を誘導可能な融合蛋白質を開発するに至った。
すなわち、本発明に力かる融合蛋白質は、 Streptococcus sobrinus (以下、「S. sobrinus]と表記することもある）の、高分子菌体表層蛋白
質のァラニン繰り返し領域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む。
[0007] また、前記ァラニン繰り返し領域が、以下の（a)又は (b)の蛋白質からなることを特 徴とする。
(a)配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加 されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
[0008] また、前記グノレカン結合領域力 S、以下の（a)又は (b)の蛋白質からなることを特徴と する。
(a)配列表の配列番号： 2に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質。
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加 されたアミノ酸配列からなる蛋白質。
[0009] ここで、 S. sobrinusの高分子菌体表層蛋白質（以下、「PAg」と表記することもある 。）のァラニン繰り返し領域 (以下、「A_repeat領域」と表記することもある。）は、 PAg の機能領域すなわち口腔内ペリクルの唾液糖蛋白質に結合する唾液結合領域を構 成し、その N末付近において局在するァラニンを高濃度に含む領域である。この唾液 結合領域は、 S. sobrinusが歯面に初期定着に関与している。
[0010] また、 S. sobrinusのグルカン合成酵素（以下、「GTF」と表記することもある。 )は、 スクロースから非水溶性グルカンを合成することにより、 S. sobrinusの唾液で処理し たハイドロキシアパタイト粒子への付着をより強固にするものであり、グルコース結合 領域（以下、「glucan_binding領域」と表記することもある。）は、グルコースに結合 する当該酵素の機能領域である。
[0011] 本発明者らは、 口腔内に誘導された S. sobrinusに対する抗体がう蝕抑制におい て果たす作用機序、すなわち菌体の歯面への付着阻害、抗体が結合した菌体の白 血球による貪食促進、及び、菌体の代謝阻害機序などのうち、特に菌体の歯面への 付着阻害機序に着目した。そして、当該作用機序の強化すベぐこの付着の際に重 要な役割をなす 2つの蛋白質の機能領域でありかつ特異的な 2つの領域を結合した 融合蛋白を作成し、抗原として用いることとした。この結果、後述するように、本発明 による融合蛋白質を投与後に得られた抗体は、 S. sobrinusの歯面への付着を高率 で阻害することが確認された。
[0012] ここで、本発明は、上記ァラニン繰り返し領域及びグルコース結合領域の結合順序 、すなわちアミノ酸配列を考慮したときにどちらの領域が上流に配列するか、上記 2 領域を連結する他のペプチドの揷入、上記 2領域の前後へのペプチドの付加等につ いて、特に限定するものではなレ、。例えば、 S. sobrinusのグルカン合成酵素につい て、グルカン結合領域の前後の 1以上のアミノ酸をも含めて、融合蛋白質に組み入れ るようにしてもよい。
[0013] また、上記 2領域について 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ れたものも、本発明の融合蛋白質に含められる。これは例えば、特定のアミノ酸を置 換又は欠失する方法としては、後述の組み換え DNAについて行うポイントミューテー シヨン法
、 Kunkel法などの公知の方法が用いることができる。
また、上記 2領域のアミノ酸について、例えば、上記領域が C末端となる場合にその C末端をエステル化やアミド化し、上記領域の分子内のアミノ酸の側鎖にある〇H、 C 0〇H、 NH、 SHなどをホルミル基などの適当な保護基で保護するなど、若干の化
2
学的修飾を行うことも可能である。
[0014] 尚、このようにして作成された本発明による融合蛋白質は、例えば、本発明による融 合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物としての利用することができる。すなわち 、免疫誘導可能な有効量の本発明の融合蛋白質をヒトを含む哺乳動物に直接投与 することにより、ヒト等の免疫応答を誘導し、長期的なう蝕予防を行うことが可能になる 。あるいは、後述のように、本発明による融合蛋白質を投与した哺乳動物から抗体を 回収し、当該抗体を口腔内に投与することによりう蝕予防を行うことも可能である。
[0015] この場合には、融合蛋白質をそのまま使用してもよいが、通常は、製剤学的に許容 しうる製剤用添加剤ゃ賦形剤などを用いて上記融合蛋白質を有効成分として含む医 薬組成物として製造し、用いることが好ましい。この医薬組成物の投与経路としては、 例えば、経鼻粘膜投与などの免疫応答が誘導可能な局所投与を挙げることができる 。このため本発明の融合蛋白質は経鼻免疫などの局所投与剤の医薬組成物の有効 成分として用いられる。
[0016] さらに、本発明による組み換え DNAは、本発明による融合蛋白質をコードする。
また、本発明による組み換え DNAは、前記融合蛋白質を構成する Streptococci! s sobrinusの高分子菌体表層蛋白質のァラニン繰り返し領域をコードする以下の（ a)又は (b)の塩基配列を有することを特徴とする。
(a)配列表の配列番号： 3に示される塩基配列。
(b)塩基配列（a)からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA の塩基配列。
[0017] また、前記融合蛋白質を構成する Streptococcus sobrinusのグルカン合成酵素 のグルカン結合領域をコードする以下の（a)又は (b)の塩基配列を有することを特徴 とする。 (a)配列表の配列番号: 4に示される塩基配列。
(b)塩基配列（a)からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA の塩基配列。
[0018] 更に、本発明による組み換え DNAを含有する発現ベクター、及び、当該発現べク ターを保持する形質転換体が提供される。
ここで、配列番号： 3あるいは配列番号: 4で表される塩基配列とストリンジェントな条 件下でハイブリダィズできる DNAとしては、例えば、配列番号： 3あるいは配列番号： 4で表される塩基配列と約 80%以上、好ましくは 90%以上の相同性を有する塩基配 列を含有する DNAなどが用いられる。ハイブリダィゼーシヨンは、例えば DIG核酸検 出システム（Roche社）のマニュアル記載の方法に従って行わせることができる。この 場合において、約 20%のミスマッチを許容するストリンジヱントなハイブリダィゼーショ ン条件（約 80%の相同性を保証する）としては、 50%フオルムアミド（脱イオン）、 5 X SSC (ナトリウム濃度 0. 975M)、 0. 1 % (w/v) N-lauroylsarcosine, 0. 02% (w /v) SDSで、温度が 42°Cである。さらにハイブリダィゼーシヨン温度を 1 · 4°C上げる ことでミスマッチを 1%下げることができる。
[0019] また、本発明の組み換え DNAは、 S. sobrinus由来のゲノム DNA、ゲノム DNAラ イブラリー、 S. sobrinus由来の cDNAより公知の方法により単離さ
れたものを DNAライゲース等を用 V、て結合したもの、合成 DNAのレ、ずれでもよレ、。 また、配列番号： 3あるいは配列番号: 4で表される塩基配列とストリンジェントな条 件下でハイブリダィズできる DNAを作成するためには、例えば、市販のキットなどを 用いて、 Kunkel法などの公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って、塩基配 列の変換を行うことができる。
[0020] 尚、上記形質転換体を用いれば融合蛋白質を容易かつ大量に精製させることがで きるが、上記融合蛋白質は、上記組み換え DNAを形質転換体に導入し、作成される ものに限定されないことはいうまでもなレ、。蛋白質合成の公知の方法、例えば、蛋白 質合成用樹脂に、上述のアミノ酸配列通りに、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保 護したアミノ酸を縮合させていき、縮合反応終了後に各種保護基を除去し、さらに高 希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施することにより、本発明による 融合蛋白質を合成することなども可能である。
[0021] また、本発明の発現ベクターは、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド 、 λファージなどのバタテリオファージ、レトロウイ/レス，バキュロウイノレスなどの動物ゥ ィルスなどいずれであってもよレ、。発現ベクターには、宿主細胞に応じたプロモータ 一、ェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ Α付加シグナル、選択マーカーなど を含有しているものを用いることができる。
[0022] また、本発明の形質転換体に用いられる宿主細胞としては、例えば、大腸菌などの 細菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などのいずれでもよい。
更に、本発明の抗体製剤によれば、上述の融合蛋白質に対する抗体を含む。 すなわち、本発明による融合蛋白質に対する抗体は、 S. sobrinusの歯面への付 着阻害作用を有するものであり、当該作用は、ヒトを含む他の哺乳動物等により作成 された当該抗体を含む抗体製剤として口腔内へ投与した場合にも有効に発揮しうる ものである。
[0023] また、本発明による抗体製剤に含有される抗体は、公知の抗体または抗血清の製 造法に従って製造することができる。例えば、ポリクローナル抗体であれば、哺乳動 物に対して上記融合蛋白質をそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与し、免疫さ れた哺乳動物から抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより取得する 。免疫を行う哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、ニヮト リなどが挙げられる。例えば、ゥシ、ニヮトリなどの家畜動物である場合には、乳や卵 等をそのまま回収し、融合蛋白質に対する抗体を含む食品として口腔内に投与する ことが可能である。特に、ゥシからは大量に牛乳を回収することができるため、分離精 製して用いることもできる。この場合には、ヒト人工染色体 (HAC)を、細胞融合や核 移植等公知の方法を経て作成されるヒトポリクローナル抗体産生 HACゥシ等に融合 蛋白質を投与して免疫し、ヒト抗体を作成させることとしてもよい。このように、歯面へ の付着阻害に関与する抗体を、同時に作成されるポリクローナル抗体として取得する ことが望ましいが、免疫された動物から抗体産生細胞を回収し、公知の方法によりモ ノクローナル抗体を産生してもよい。また、本発明による抗体製剤の形態としては、、 例えば、口腔用の軟膏、ゼリー製剤、洗口剤、若しくは噴霧剤などが挙げられる。 図面の簡単な説明
[0024] [図 1] (a)は、 PAg A遺伝子領域を説明する図、（b)は、 pQE80L— pagAの構成を説 明する図、（c)は、 gtfl— GB遺伝子領域を説明する図、（d)は、 pQE80L-pagA-gt fl一 GBの構成を説明する図である。
[図 2]融合蛋白質を発現した大腸菌の SDS—PAGE像である。
[図 3]精製後の融合蛋白質の SDS— PAGE像である。
[図 4]ハイドロキシアパタイトへの付着菌数と、 IgG抗体の添加量と、の関係を示したグ ラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 次に、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。なお、以下の説明 において参照する各図においては、他の図と同等の部分が同一符号によって示され ている。
[実施例 1]融合蛋白質発現ベクターの作成
(1) PAgの A—repeat領域（以下、「PAgA」と表記することもある。）をコードする DN A断片の調整
この断片は、 S. sobrinus菌株 OMZ176から単離された染色体 DNAについて、 以下のフォワードプライマー 1及びリバースプライマー 1を用いて、 PCR反応を行うこ とにより取得した。
[0026] プライマーの合成は、 DNA合成機を用いて行った。 配列表の配列番号： 5に記載の塩基配歹 lj、開始コドン及び BamHIサイトを含む） リバースプライマー 1： ATATGAGCTCCTTCTTGTACTGAGCAAGC (配列 表の配列番号: 6に記載の塩基配歹 lj、 Saclサイトを含む）
PCR反応は、 98°Cで 10秒間、 60°Cで 30秒間、 72°Cで 1. 0分間を 1サイクルとし て 30サイクル行った。
[0027] これにより、図 1 (a)に示されるように、 PAgAをコードする遺伝子領域（以下、「pag Ajと表記することもある）の 5 '末端側に BamHIサイト及び 3'末端側に Saclサイトを 有する DNA断片 1を作成した。 (2) GTF_Iの glucan—binding領域をコードする DNA断片の調整
S. sobrinus由来の GTFの 1種類である非水溶性グルカン合成酵素 GTF— Iの glu can— binding領域をコードする遺伝子領域（以下、「gtfl— GB」と表記することもある 。）は、 S. sobrinus菌株 OMZ176から単離された染色体 DNAについて、以下のフ ォワードプライマー 2及びリバースプライマー 2を用いて、 PCR反応を行うことにより取 得した。
[0028] プライマーの合成は、 DNA合成機を用いて行った。
フォワードプライマー 2： ATATGAGCTCCTATACTACTTCGGTAAAGAC ( 配列表の配列番号： 7に記載の塩基配歹 lj、 Saclサイトを含む）
リバースプライマー 2： TTTTAAGCTTAGTTCCAGCCACGGTAGAT (配列 表の配列番号: 8に記載の塩基配歹 lj、 Hindmサイトを含む）
PCR反応は、 98°Cで 10秒間、 65°Cで 30秒間、 72°Cで 2. 0分間を 1サイクルとし て 30サイクル行った。
[0029] これにより、図 1 (c)に示されるように、 gtfト GBの 5 '末端側に Saclサイト及び 3 '末 端側に Hindlllサイトを有する DNA断片 2を作成した。
(3) pagA及び gtfI_GBのベクターへの挿入
上記（1)及び（2)により得られた DNA断片を以下のようにして、 6個の連続する His 残基をコードするプラスミド発現ベクター PQE80L (キアゲン社製）に組み込んだ。
[0030] 上記（1)で得られた DNA断片、及び、 pQE80Lを、それぞれ制限酵素 BamHI及 び Saclにより切断反応を行い、切断後のそれぞれの反応液にっレ、てそれぞれ電気 泳動を行い、組み込みに使用するバンドを切り出し、ゲルからそれぞれの DNA断片 を溶
出、精製した。
そして、精製後の（1)の DNA断片と精製後のベクターとを DNAライゲース（宝酒造 (株)製）を用いて結合させた。これにより、図 1 (b)に示されるように、 pagA遺伝子領 域を揷入したベクター PQE80L— pagAが作成された。
[0031] また、上記（2)におレ、てられた DNA断片、及び、ベクター pQE80L_pagAにつレヽ て、制限酵素 Sacl及び Hindlllを用いて切断反応を行った。切断後の反応液につい ても上述のようにそれぞれ電気泳動を行い、対応するバンドを切り出し、溶出精製し た。
さらに、精製後の（2)の DNA断片と精製後の pQE80L_pagAとを、 DNAライゲー ス（宝酒造 (株)製）を用いて、結合させた。これにより、図 1 (d)に示されるように、更に gtfl— GB遺伝子領域を揷入したベクター pQE80L_pagA— gtfl— GBが作成された
[実施例 2]形質転換体の作成、融合蛋白質の発現、及び、融合蛋白質の精製
(1)形質転換体の作成、及び、融合蛋白質の発現
上述の [実施例 1]において得られた形質転換体をコンビテント大腸菌 DH5_ひに 混合し、形質転換した。得られた形質転換体を、アンピシリン濃度が 100 z g/mlと なるようにアンピシリンをカ卩えた 2 X YT培地にて 1晚培養し、この培養液を新たに準 備した 2 X YT培地（アンピシリンを 100 μ g/ml含む）に 1： 20の割合で加え、 37°C で 1時間培養した。更に、この培養液に IPTG (イソプロピルチオガラクトシド）を終末 濃度 ImMになるように加えた後、 37°Cで 3時間培養し、発現誘導を行った。
[0032] その後、培養液を 3500 X g、 20分間、遠心機にかけて沈殿し集菌し、さらに PBS ( phosphate-buffered saline)にて 3回洗净した。
(2) SDS-P AGEによる融合蛋白質の発現の確認
(1)のようにして得られた菌体に 2 X SDS—PAGE sample bufferを添加して溶 解し、 100°Cにて 5分間加熱後、 10%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行った。 100V (定電圧）、 1時間の泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて蛋白質染 色したゲルの像が図 2に示されている。
[0033] 同図において、レーン Mは、マーカーレーンであり、レーン 1は、上述のように IPTG をカロえて培養した菌体の溶解反応液を泳動させたレーンであり、レーン 2は、 IPTG を加えずに、すなわち発現誘導せずに、そのまま培養した菌体の溶解反応液を泳動 させたレーンである。
同図に示されるように、レーン 1には、レーン 2には確認できなレ、 82kDa付近の太い バンドが出現しており、約 82kDaの融合蛋白質の発現が確認された。
(3)融合蛋白質の精製 又、（1)のようにして得られた菌体を溶解し、 Ni— nitrilotriacetic acid (Ni— NTA )樹脂カラム (キアゲン社製）を用いて精製した。この操作は、キアゲン社のマ二ユア ノレに従って行った。
[0034] 簡潔に記載すれば、菌体に溶解 Buffer (100mMNaH PO , 10mMTris-Cl, 8
2 4
Mure a, pH8)を菌体 lg当たり 5ml添加して懸濁したうえに、 10， 000 X gで 20分一 30分間遠心機にかけて細胞片を破砕した。更に、 2 X SDS—P AGE sample buff erを添カ卩して溶解し、 100°Cにて 5分間加熱したあと、この溶菌液とカラムベッドとを 混合してカラムに導入し、精製操作を行った。この吸着反応後のカラムに、 Buffer (1 OOmMNaH PO , 10mMTris-Cl, 8Murea, pH6. 3)を流して未吸着の物質を
2 4
洗浄した。その後、 PH5. 9及び pH4. 5に調整された同組成の Bufferをそれぞれ順 に流し、カラムに吸着している His残基を含む蛋白質を溶出した。
[0035] 溶出した蛋白質画分を上述と同様に 10%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行 つた。 100V (定電圧）、 1時間の泳動後、クーマシーブリリアントブルーを用いて蛋白 質染色したゲルの像が図 3に示されている。
同図において、レーン Mは、マーカーレーンであり、レーン 1は、精製を行う前の溶 菌液を泳動させたレーンであり、レーン 2は、上記精製操作における非蛋白質画分を 泳動させたレーンであり、レーン 3は、蛋白質画分を泳動させたレーンである。
[0036] 同図に示されるように、レーン 3には、レーン 1と同様に 82kDa付近に太いバンドが 出現しており、 6個の His残基を付加した融合蛋白質の発現が確認された。また、レ ーン 1、 2に出現する融合蛋白質以外の蛋白質のバンドはほとんど確認することがで きず、 pH4. 5条件での溶出により、その他の蛋白質は除去され、融合蛋白質が精製 されてレ、ることが確認された。
[実施例 3]抗体の作成、及び、 S. sobrinusの歯面成分への付着抑制効果の確認 (1)抗体の作成
[実施例 2]におレ、て作成された融合蛋白質を家兎（日本白色種、メス）に投与する ことにより抗体を作成した。融合蛋白質は 2週間毎に 6回にわたって 0. 3mgずつ完 全フロイントアジュバントと共に皮内注射により投与し、血中から IgG抗体を精製、取 得した。 IgG抗体の精製は Affi-Gel Protein A MAPS II Kit (Bio-Rad社）を 用いて、マニュアル記載の方法で行った。すなわち kitに付属している binding buff er (pH9. 0に調整）で平衡化した Affi- Gel protein A ァガロースをカラムに充填 した。その後、融合蛋白質で免疫されたゥサギの血清に等量の binding bufferをカロ えた後、カラムに添加してゥサギ IgGを Affi- Gel protein A ァガロースに吸着さ せた。平衡 bufferでカラムを十分洗浄した後、 kitに付属した elution buffer (pH3 . 0に調整）でゥサギ IgGを溶出し、 phosphate buffered saline(pH7. 4)で透析 後、 1 Omg/mlに濃縮して精製 IgG抗体として用レ、た。
(2) S. sobrinusの歯面成分への付着抑制実験
(1)により作成された IgG抗体を用いて行った、 S. sobrinusの歯面成分への付着 抑制効果を確認するための実験結果が図 4及び表 1に示されてレ、る。
[0037] [表 1]
抗体 添加量 付着菌数 ( 107 )
anti PAgA-GTF-IGB IgG preimmunized IgG
Figure imgf000013_0001
control 1 .06 ±0.08
n = 3 mean≠SD
* ： p<0. 05
[0038] 図 4は、唾液でコートしたハイドロキシアパタイト lOmgに、 S. sobrinus (菌数 3 X 1 07)及び IgG抗体をカ卩え、 3時間、 37°Cで保温後に測定されたハイドロキシアパタイト への付着菌数と、 IgG抗体の添加量 g)と、の関係を示したグラフである。また、表 1は、 IgG抗体の各添加量における付着菌数の測定値を示している。
[0039] 同図中の anti PAgA-GTF-IGB IgGは、上述の（1)のように作成された IgG抗 体であり、 preimmunized IgG (以下、「preimm. IgG」と表記することもある）は、融 合蛋白質を投与しない非免疫ゥサギの血中から精製した IgG抗体である。 contorol は、 IgG抗体を加えなかった場合の測定値である。唾液コートハイドロキシアパタイト には、 口腔における歯面と同様の状態とするため、歯面成分であるノ タイトで表面加工されたセラミックビーズ（直径 80 β m、 Biorad社製）を唾液に浸して 、 1時間、 37°Cで保温したものを用いた。また、付着菌数は、 S. sobrinusを BCECF — AM (2 '、 7 _bis [2_carboxyethyl]_5 [6」_carboxyfluorescem acetoxyme thyl ester)で蛍光ラベルし、付着反応時間後においてハイドロキシアパタイトに付 着する当該菌をフォトカウンターで測定することにより取得した。
[0040] 表 1及び図 4に示されるように、 preimm. IgG添加時の菌の付着数は 1. 0 X 107— 0. 7 X 107であったのに対し、 anti PAgA-GTF-IGB IgG添加時では 0. 6 X 10 7— 0. 2 X 107であり、 IgGの各添加量におけるそれぞれの付着菌数について統計的 有意差が認められた（Pく 0. 05)。このことから、 anti PAgA-GTF-IGB IgGによ つて、 S. sobrinusの唾液コートハイドロキシアパタイトへの付着が有意に抑制される ことが確認された。
産業状の利用可能性
[0041] 以上説明詳細に説明したように、本発明の融合蛋白質によれば、例えば、本発明 による融合蛋白質を有効成分として含む医薬組成物としてヒトに投与することにより、 ヒト等の免疫応答を誘導し、 口腔内あるいは血中等に抗体が長期的に生成されて、う 蝕予防を行うことが可能になる。あるいは、本発明による融合蛋白質を投与すること により、哺乳動物から S. sobrinusの歯面への付着阻害に関与する複数種の抗体を 効率的に生成させて、回収することが可能になる。
[0042] 本発明による組み換え DNA、ベクター、及び、形質転換体によれば、融合蛋白質 の効率的な生産が可能になる。
本発明による抗体製剤によれば、 口腔内に投与することにより、 S. sobrinusの歯 面への付着を阻害し、あるいは、菌体の代謝阻害や白血球等による菌体の貪食をも たらして、う蝕予防が可能になる。このため、抗体によりう蝕予防のために、皮下注射 等により上記融合蛋白質を含むワクチンを投与しなくても、簡便にう蝕予防を行うこと が可能になる。

Claims

請求の範囲
[1] Streptococcus sobrinusの、高分子菌体表層タンパク質のァラニン,操り返し領 域と、グルカン合成酵素のグルカン結合領域と、を含む融合蛋白質。
[2] 前記ァラニン繰り返し領域が、以下の（a)又は (b)のタンパク質からなることを特徴と する請求の範囲第 1項に記載の融合蛋白質。
(a)配列表の配列番号： 1に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加 されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
[3] 前記グノレカン結合領域が、以下の（a)又は (b)のタンパク質からなることを特徴とす る請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の融合蛋白質。
(a)配列表の配列番号： 2に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(b)アミノ酸配列（a)において 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加 されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
[4] 請求の範囲第 1項から第 3項のいずれかに記載の融合蛋白質をコードする組み換 え DNA。
[5] 前記融合蛋白質を構成する Streptococcus sobrinusの高分子菌体表層タンパ ク質のァラニン繰り返し領域をコードする以下の（a)又は (b)の塩基配列を有すること を特徴とする請求の範囲第 4項に記載の組み換え DNA。
(a)配列表の配列番号： 3に示される塩基配列。
(b)塩基配列（a)からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA の塩基配列。
[6] 前記融合蛋白質を構成する Streptococcus sobrinusのグルカン合成酵素のグ ルカン結合領域をコードする以下の（a)又は (b)の塩基配列を有することを特徴とす る請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の組み換え DNA。
(a)配列表の配列番号: 4に示される塩基配列。
(b)塩基配列（a)からなる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNA の塩基配列。
[7] 請求の範囲第 4項から第 6項のレ、ずれかに記載の組み換え DNAを含有する発現 ベクター。
[8] 請求の範囲第 7項に記載の発現ベクターを保持する形質転換体。
[9] 請求の範囲第 1項から第 8項のいずれかに記載の融合蛋白質に対する抗体を含む 抗体製剤。
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