WO2004091662A1 - 角膜知覚回復剤 - Google Patents

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WO2004091662A1
WO2004091662A1 PCT/JP2004/005456 JP2004005456W WO2004091662A1 WO 2004091662 A1 WO2004091662 A1 WO 2004091662A1 JP 2004005456 W JP2004005456 W JP 2004005456W WO 2004091662 A1 WO2004091662 A1 WO 2004091662A1
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corneal
protein inhibitor
rho protein
rho
cells
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PCT/JP2004/005456
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Yoshiko Takayama
Yoshikuni Nakamura
Jun Inoue
Mitsuyoshi Azuma
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Senju Pharmaceutical Co. Ltd.
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    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22054—Calpain-3 (3.4.22.54), i.e. calpain p94

Definitions

  • the present invention relates to a corneal neurite formation-promoting agent containing a Rho protein inhibitor, and a corneal neurite formation promoting, corneal sensation recovery, improvement, and dry eye therapeutic agent.
  • corneal surgery such as laser refractive correction keratotomy (PRK :), laser keratoplasty (LASIK), and corneal transplantation
  • PRK laser refractive correction keratotomy
  • LASIK laser keratoplasty
  • corneal transplantation the corneal nerve is cut, so the cornea perception function is usually about 3 weeks to 1 year. It is said that symptoms of lowering occur.
  • the corneal nerve is clearly severed after LASIK (Tuuli U. Linna et al., Experimental Eye Research 66: 755-763, 1998), and no neurological image is observed after LASIK. It has been reported that corneal perception is reduced in corneal regions where nerve fiber bundles are not connected shortly (Tuuli U. Linna et al., Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, 41: 393-397, 2000).
  • Decreased corneal perception after PRK and LASIK has been suggested to be a cause of decreased lacrimal gland response and decreased lacrimal fluid (Ang, Robert T. et al., Current Opinion in Ophthalmology 12: 318-322, 2001) ). Due to this decrease in corneal sensory function, the number of blinks is decreased and dry eye symptoms are observed in patients after corneal surgery. On the other hand, in dry eye patients, a decrease in tear function causes a decrease in corneal perception, and this decrease in corneal sensitivity further exacerbates a decrease in tear function, resulting in a serious corneal surface symptom. It has become.
  • Rho protein is a small G protein that is included in the Rho family (including Rho, Rac, C dc 42, etc.) and is known to be involved in actin cytoskeleton formation and neurite outgrowth / regression reactions. It has been.
  • Rho protein inhibitor C3 enzyme is known to extend 3T3 fibroblast cell protrusion (Hirose, M. et al., The Journal of Cell Biology, 141: 1625). -1636, 1998), a method of promoting central nerve axon growth by administering an effective amount of a Rho protein inhibitor to a patient has been disclosed (JP 2000 1-5 1 50 18), Europe Patent Application Publication No. 1, 0 111, 330).
  • an inhibitor of Rho kinase which is one of the effector molecules of Rho protein, is known to have neurite outgrowth action of retinal ganglion cells and to promote regeneration of optic nerve cells (International publication) No. 02Z83 1 75 Pamphlet, European Patent Application Publication No.
  • neurotrophic factor-induced neuronal axonal extension such as nerve growth factor (NGF) is a Rho activator (lysophosphatidic acid).
  • NGF nerve growth factor
  • Rho activator lysophosphatidic acid
  • Rho protein inhibitors on trigeminal nerves has not yet been clarified.
  • a compound having Rho activation activity has a corneal epithelial spreading action, and C3 enzyme, an Rlio protein inhibitor, suppresses the spreading of the corneal epithelium.
  • C3 enzyme an Rlio protein inhibitor
  • a compound having a Rho activating action is useful for corneal disorders such as corneal ulcer, corneal epithelial detachment, and keratitis (JP 2000-264847 A, European Patent Application Publication No. 1, 142, 585).
  • Rh ⁇ protein inhibitor is a trigeminal nerve ( (It is sometimes referred to as the corneal nerve.) It was first discovered to have the effect of promoting neurite formation of cells, and further research was conducted based on these findings, and the Rho protein inhibitor was used as a medicine for corneal sensory recovery. The present invention has been completed.
  • a composition for promoting corneal neurite formation containing an Rho protein inhibitor (6) a composition for promoting corneal nerve axon extension containing an Rho protein inhibitor;
  • Rho protein inhibitor for producing a composition for promoting corneal neurite formation
  • Rho protein inhibitor for producing a composition for promoting corneal nerve axon extension
  • a method for restoring corneal sensation by administering an effective amount of a Rho protein inhibitor to a subject in need of corneal sensation restoration;
  • FIG. 1 shows a fluorescence microscope image of the rabbit cultivated trigeminal nerve cell in Test Example 1.
  • A shows rabbit trigeminal nerve cells cultured for 24 hours in C 3 enzyme-free medium
  • B shows cells cultured for 24 hours in medium containing C 3 enzyme added to a final concentration of 2 ⁇ g / mL. Indicates.
  • Fig. 2 shows the ratio (%) of the total number of neurite-forming cells in Test Example 1.
  • the vertical axis shows the ratio of neurite-forming cells to total cells.
  • Each value represents the average soil standard error of 3 cases.
  • * indicates a significant difference from the control (P ⁇ 0.05).
  • FIG. 3 shows a fluorescence microscope image of the cultured rabbit trigeminal nerve cells in Test Example 2.
  • A Culture medium without test substance
  • B Compound 1 added (final concentration 10 M) culture solution
  • C Compound 2 added (final concentration 10 ⁇ )
  • D Compound 3 added (final concentration 1 ⁇ m) ⁇ )
  • Culture medium ⁇ indicates cells cultured for 48 hours in culture medium with compound 4 added (final concentration 10 ⁇ ).
  • FIG. 4 is a graph showing the ratio (%) of neurite-forming cells to the total number of cells counted in Test Example 2. Each value represents the average soil standard error of 3 cases.
  • * indicates a significant difference with respect to the additive-free group ⁇ ⁇ 0.05
  • * * indicates a significant difference with respect to the additive-free group. ⁇ ⁇ 0. 0 1
  • FIG. 5 shows the results of Western blotting of ROCK I and ROCK I I in the rabbit cornea (C) and trigeminal ganglion ( ⁇ ) in Test Example 3.
  • Rho protein inhibitor refers to any substance that inhibits the inactive GDP-bound Rho protein from being activated into the active GTP-bound Rho protein. Inhibitors, and antibodies against Rho protein or Rho tampafragment, as well as a single effector molecule that mediates the action of Rho protein, such as all inhibitors that inhibit the action of Rho kinase (ROCK). It is included.
  • the “corneal nerve” refers to the cranial plexus formed around the cornea under the control of the trigeminal nerve that is a sensory nerve, the intraparenchymal plexus distributed over the corneal stroma, and the subepithelial nerve formed directly below the Paumann membrane Plexus, the basal cell plexus and nerve fibers that form through the Bowman membrane.
  • nerve refers to a process (dendritic protrusion axon) that emerges from the cell body of a neuron (neuron cell), and “formation” generates the neurite from the cell body. Or / and extension. It is clear to those skilled in the art how much neurite formation is promoted.
  • the promotion of neurite formation can be confirmed, for example, by fluorescently staining neuronal cells and observing the state of the cells using a fluorescence microscope. Further, the observation result with a fluorescence microscope may be analyzed using image analysis software or the like. Furthermore, the neurite formation status can be quantified by statistically processing the results. Yet another method is to label with the neuronal cell body and neurite component, eg, an antibody that recognizes the eurofilament, and a horseradish peroxidase (HRP) -binding antibody that reacts with it, and then HR The amount of neurofilament can be measured by developing P and measuring the absorbance, which can be used as an indicator of neurite formation.
  • HR horseradish peroxidase
  • Rho protein inhibitors examples include C 3 extracellular enzyme (Exoenzyme C3, also referred to as C 3 enzyme in this specification), toxin A (T oxin A) and toxin B (To xin B) and Rho kinase inhibitors.
  • Rho kinase inhibitors include, for example, compounds described in JP-A-61-227581 (US Pat. No. 4,678,783).
  • isoquinoline sulfonyl derivatives represented by puasdil hydrochloride compounds described in International Publication No. 00Z57914 pamphlet and Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-44513, such as etacric acid and 4- [2- (2, 3, 4, 5, 6-Pentafluorofur) Atari Loyl] Rho kinase inhibitors such as cinnamic acid; WO 02/076977 (European Patent Publication No. 1,370,552, No.
  • the pharmaceutical composition containing the Rho protein inhibitor used in the present invention may be collectively referred to as “the pharmaceutical of the present invention”.
  • the medicament according to the present invention has a disorder, cut or deficiency in corneal nerves in mammals (eg, humans, rats, mice, rabbits, rabbits, peta, nu, cats, etc.), for example, reduction after PR K or LAS IK
  • a therapeutic agent for the recovery of corneal perception or as a treatment for dry eye with reduced corneal or corneal perception associated with corneal neurodegeneration such as neuroparalytic keratopathy, corneal ulcer, diabetic keratopathy It is.
  • the medicament of the present invention is administered systemically or locally. Systemically, in addition to oral administration, it can also be administered parenterally, such as intravenous injection, subcutaneous injection, and intramuscular injection. Topically administered to the eye.
  • the pharmaceutical preparation forms of the present invention include powders, granules, tablets, capsules and suppositories. Examples of such solid preparations and liquid preparations such as syrups, injections, and eye drops.
  • excipients lactose, sucrose, pudou sugar, starch, crystalline cellulose, etc.
  • lubricants magnesium stearate, talc, stearic acid, calcium stearate) Etc.
  • disintegrants starch, carmellose sodium, calcium carbonate, etc.
  • binders denpun glue solution, hydroxypropylcellulose solution, carmellose solution, gum arabic solution, gelatin solution, sodium alginate solution, etc.
  • Any dosage form can be produced by using
  • suitable coating agents gelatin, sucrose, gum arabic, carnapa wax, etc.
  • enteric coating agents eg cellulose acetate phthalate, methacrylic acid cop
  • an appropriate excipient for example, magnesium stearate, calcium stearate, talc, light anhydrous key acid to improve fluidity and lubricity, Crystal cell for pressure fluidity Mouth mixed with the addition of the above-mentioned disintegrant, etc. in addition to mouth-mouthed lactose, etc. or coated with a suitable coating agent on granules or granules It is also possible to encapsulate with a capsule base that has increased plasticity by adding glycerin or sorbitol to a suitable capsule base (such as gelatin).
  • a suitable capsule base such as gelatin
  • Capsules can be enteric coated capsules, gastric resistant capsules, controlled release capsules, as well as regular capsules.
  • an enteric capsule a compound coated with an enteric coating agent, or a compound obtained by adding the above-mentioned appropriate excipient to a normal capsule or filled with an enteric coating agent. It can be molded using a coating or enteric polymer as a base.
  • a suppository base for example, cocoa butter, macrogol, etc.
  • a stabilizer such as sodium edetate
  • a suspending agent such as gum arabic or carmellose
  • a corrigent such as simple syrup or pudou sugar
  • an aroma An agent or the like can be appropriately selected and used.
  • pharmaceutically acceptable additives such as isotonic agents (sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, pudou Sugar, propylene glycol, etc.), buffer (phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, phosphate buffer, tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer, etc.
  • isotonic agents sodium chloride, potassium chloride, glycerin, mannitol, sorbitol, boric acid, borax, pudou Sugar, propylene glycol, etc.
  • buffer phosphate buffer, acetate buffer, borate buffer, carbonate buffer, phosphate buffer, tris buffer, glutamate buffer, epsilon aminocaproate buffer, etc.
  • Preservatives paraoxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, benzalkonium chloride, sodium dehydroacetate, sodium edetate, boric acid, borax, etc.
  • thickeners hydroxyethylcellulose, hydroxy
  • Stabilizers sodium bisulfite, sodium thiosulfate, sodium edetate, sodium citrate, ascorbic acid, dibutylhydroxyl ⁇ / en
  • pH adjusters hydroochloric acid, sodium hydroxide, phosphoric acid, It can be produced by dissolving or dispersing it in a solution appropriately added with acetic acid or the like.
  • the amount of additive in the syrup, injection, and eye drop varies depending on the type and use of the additive to be added, but a concentration that can achieve the purpose of the additive may be added. Usually, about 0.5 to about 5. Ow / v% is added so that the osmotic pressure is about 229 to about 343 mO S : m.
  • the buffering agent is about 0.01 to about 2.0%
  • the thickening agent is about 0.01 to about 1.0 w / v%
  • the stabilizing agent is about 0.001 to about 1.0. Add so that it is about V%.
  • the pH adjusting agent is added as appropriate, usually at a pH of about 3 to about 9, preferably about 4 to about 8.
  • the concentration of the ho protein inhibitor is usually about 0.00001 w / V% at the lower limit, preferably about 0.00005 wZv%, more preferably about 0.0001 wZv%, and the upper limit is about 0.1 v. // v%, preferably about 0.05 w / v%, more preferably about 0.01 wZ v%, more preferably about 0.005 w / v%, still more preferably about 0.001 wZv % Prepared.
  • the dose of the medicament of the present invention varies depending on the target disease, symptom, administration target, type of Rho protein inhibitor, administration method, etc., for example, as a corneal sensory recovery agent after PRK surgery locally in the adult eye
  • ophthalmic solution containing about 0.0 0 1 wZv% of C 3 enzyme, or N- (1 benzil 4-piperidyl) 1 1 H-indazole-5-amine 2 hydrochloric acid Salt
  • An ophthalmic solution containing about 0.003 wZv% of a Rho protein inhibitor such as 1Z dihydrate should be instilled about 20 to about 50 / z L at a time, 1 ⁇ several times.
  • Test Example 1 Promotion of neurite formation by cultured Usagi trigeminal neurons
  • Trigeminal nerve cells were isolated by Chan et al. (Chan, Krun Y. and Haschke, Richard H., Exp. Eye Res., 41: 687-699, 1985). In other words, the Usagi was anesthetized with ether, the heart was perfused with saline, the trigeminal ganglion was excised, and the trigeminal ganglion was dispersed using a nerve dispersion (manufactured by Sumitomo Bakelite). Cells were seeded on 8well culture slide (BECT0N DICKINSON) coated with polylysine.
  • the number of cells was about 3 X 10 3 cells per Uweru, culture conditions are 5% C0 2, 95% air under 100% humidity, and a 37.
  • culture conditions are 5% C0 2, 95% air under 100% humidity, and a 37.
  • For cell culture use a culture solution containing B27 Supplement (GIBC0; 0.02 mLZmL culture) and L monoglutamate (GIBC0; final concentration lmM) in a Neurobasal culture (GIBC0).
  • C 3 enzyme (2 ⁇ g / mL final concentration) was added and cultured for 24 hours.
  • Fig. 1 shows a fluorescence microscope image of cultured rabbit trigeminal nerve cells.
  • A is the control group cells cultured for 24 hours in C 3 enzyme-free medium
  • B is C 3
  • Figure 2 shows the ratio of the number of neurite-forming cells to the total number of cells in each group of cells cultured for 24 hours in a culture medium supplemented with 2 ⁇ g ZmL of enzyme.
  • the ratio of neurite-forming cells is about 21% of all cells in the control mouth group, and about 46% of all cells in the group added with C3 enzyme.
  • the addition of C3 enzyme significantly increases the number of neurite-forming cells. Recognized ( Figure 2).
  • C3 enzyme having Rho inhibitory activity promotes the formation of trigeminal neurons.
  • Test Example 2 Process of promoting the formation of processes in the cultured rabbit trigeminal nerve
  • fasudil hydrochloride As the fasudil hydrochloride (hereinafter referred to as compound 4), a commercially available fasudil hydrochloride hydrate injection solution “Eryl Injection 3 OmgJ (Asahi Kasei Co., Ltd.) was used.
  • Usagi trigeminal nerve cells were isolated in the same manner as in Test Example 1.
  • New for cell culture Use a culture solution containing B27 Supplement (GIBC0; final concentration 2% V / V) and L-glutamine (GIBC0; final concentration 1 mM) in an oral basal medium (GIBC0).
  • GIBC0 B27 Supplement
  • GIBC0 L-glutamine
  • GIBC0 oral basal medium
  • each test substance-added culture solution (compound 1, final concentration 10 M; compound 2, final concentration 10 M; compound 3, final concentration 1).
  • Compound 4 was exchanged to a final concentration of 10 ⁇ ) and cultured for 48 hours.
  • the culture conditions were 5% C 2 , 95% under air, humidity 100% and temperature 37 ° C.
  • the cells after 48 hours of culture were fixed with 4% paraformaldehyde for 2 hours at room temperature.
  • Fig. 3 shows a fluorescence microscope image of cultured rabbit trigeminal nerve cells.
  • Figure 3A shows cells cultured for 48 hours in culture medium without test substance
  • Figure 3B shows cells cultured for 48 hours in medium containing compound 1
  • Figure 3C shows culture with compound 2 added
  • Fig. 3D shows cells cultured for 48 hours in a culture solution supplemented with Compound 3
  • Fig. 3E shows cells cultured for 48 hours in a culture solution added with Compound 4. .
  • Figure 4 shows the ratio of the number of neurite cells in the test substance-added group to the total cell number in the non-added group.
  • the ratio of neurite-forming cells to total cells is approximately 31% in the additive-free group, approximately 41% in the compound 1 addition group, approximately 57% in the compound 2 addition group, approximately 51% in the compound 3 addition group, compound It was about 70% in the 4 addition group, and a significant increase or increase in the neurite-forming cell ratio was observed in the test substance addition group. From the above results, it was clarified that ROCK inhibitors have an action of promoting neurite formation of trigeminal nerve cells.
  • 2,7-Dichloroquine 6,7-Dimethoxyquinazoline (8.6 g, 64. 58 mmo 1), 5-Aminoindazole (4.8 g, 36. 04 mmo 1) and Potassium acetate (7.3 5 1 g, 74.9 1 mmo 1) was added to tetrahydrofuran Z purified water (138 mL Z62 mL), and the mixture was stirred overnight at room temperature. Purified water (1 30 mL) was added to the mixture to precipitate crystals.
  • Japanese white male rabbits were purchased from Kitayama Labes Co., Ltd. and used for experiments.
  • the trigeminal ganglia and cornea were removed.
  • the excised tissue was transferred to ice-cold phosphate buffered saline (Invitrogen), washed, and ice-cold 0.1% Triton X-100 (Pharmacia Biotech) and 1 tablet / 10
  • the mixture was transferred into 2 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing ml of Proteasei nh ibitorcocktai 1 (complete, Mini; manufactured by Roche) and subjected to ultrasonic crushing.
  • the crude cell lysate derived from each tissue obtained by ultrasonic disruption was centrifuged (10,000 Xg, 15 minutes, 4 ° C), and the supernatant was recovered to obtain a tissue soluble protein solution.
  • the amount of protein in the solution was quantified using a BCA protein accessory (manufactured by PIERCE).
  • 3) Detection of ROCK I and ROCK II using Western plotting method Included in the prepared tissue soluble proteins: OCK I and ROCK II were detected using Western plotting method.
  • the prepared solution containing 25 ⁇ g of protein was separated by electrophoresis using 8% SDS polyacrylamide gel (TEFC0), and the protein separated in the gel was placed on a PVDF membrane (Immobilon-P; Millipore). Was transferred electrically.
  • the protein-transferred membrane is probed with 5% skim milk and then reacted with goat anti-ROCK I antibody or goat anti-RO CK II antibody (both from SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY) Then, secondary labeling was performed using an alkaline phosphatase (AP) -conjugated anti-goat IgG antibody (manufactured by Bio-Rad). Immunodetection of the antigen was performed using an AP color development kit (Piolad).
  • AP alkaline phosphatase
  • Fig. 5 shows the results of Western blotting. : OCK I and ROC
  • Both K II were confirmed to be expressed at the protein level in the soluble protein in the rabbit trigeminal ganglion corneal tissue.
  • tablets are formed by conventional methods. Tablets may be applied with an enteric coating agent (for example, hydroxypropyl phthalate, methylmethyl phthalate, etc.), sugar coating and phenolic (for example, ethylcellulose), which are usually used, if necessary.
  • the active ingredient C 3 enzyme may be changed to compound 1, 2, 3 or 4. Also, tablets with 20 mg, 5 mg, 1 mg, 0.5 mg, and 0.1 mg / tablet of the active ingredient can be prepared by changing the mixing ratio with additives.
  • Example 2 Capsule
  • the above ingredients are uniformly mixed as a capsule material, granulated by a conventional method, and filled into hard capsules. If necessary before filling, enteric coating agents commonly used (eg hydroxypropylmethylcellulose phthalate), sugar coating or May apply a film (eg, ethyl cellulose) to the granules.
  • enteric coating agents commonly used eg hydroxypropylmethylcellulose phthalate
  • the active ingredient C 3 enzyme may be changed to compound 1, 2, 3 or 4.
  • capsules with 2 Omg, 1 Omg, 5 mg, 1 mg ⁇ 0.5 mg, and 0.1 mg Z capsules can be prepared.
  • the above ingredients are mixed aseptically by a conventional method to prepare an injection.
  • the active ingredient C 3 enzyme may be changed to compound 1, 2, 3 or 4.
  • the mixing ratio of the additives it is possible to prepare injections with the main ingredient component amounts of 1000 mg, 500 mg, 200 mg, 10 Omg / 10 OmL.
  • the active ingredient C 3 enzyme may be changed to compound 1, 2, 3 or 4.
  • the concentration of the active ingredient is lw / v%, 0.5 w / v% N 0.3 w% ⁇ 0. lwZv%, 0.05 w / v%, 0.03%, 0.01 w / v%, 0.003 w / v%-0. Eye drops that are 001 w / v% can be prepared.
  • the active ingredient C 3 enzyme may be changed to compound 1, 2, 3 or 4. Moreover, you may change the mixture ratio of an additive.
  • the concentration of the active ingredient becomes IZ 0.5 w / v%, 0.3 w / v%, 0.1 w / v%, 0.05 w / v%, 0.03 wZv% , 0.005w / v%, 0.
  • An eye drop of 003 w / v% N 0.001 wZv% can be prepared.
  • the medicament containing the Rho protein inhibitor of the present invention has an action to promote neurite formation of trigeminal nerve cells, improvement of corneal sensory function deterioration accompanying corneal nerve damage and the like and dry eye accompanying corneal sensory function decrease Useful for improving symptoms.
  • a Rho protein inhibitor after cataract surgery or LAS

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Abstract

本発明は、角膜手術後の角膜知覚の回復やドライアイの症状を改善する新規な医薬を提供し、この医薬は、Ｒｈｏタンパク阻害剤を含有することにより、白内障手術後、ＬＡＳＩＫ手術後、ＰＲＫ手術後、角膜移植手術後、神経麻痺性角膜症、角膜潰瘍、糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下、ドライアイ症状の改善に有用である。

Description

明細書
角膜知覚回復剤
技術分野
本発明は R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤、 および 角膜神経突起形成促進による角膜知覚の回復、 改善、 並びにドライアイの治療 剤に関する。
背景技術
レーザー屈折矯正角膜切除術（P R K：)、 レーザー角膜切削形成術（レーシッ ク； L A S I K)、角膜移植などの角膜手術後には、角膜神経が切断されるため、 通常約 3週間から 1年間角膜知覚機能の低下症状が起きるといわれている。 例 えば、 L A S I K後には明らかに角膜神経が切断されていること （Tuuli U. Linna et al. , Experimental Eye Research 66 : 755 - 763， 1998)、 また、 L A S I K後に神経像が認められないか、 あるいは神経線維束が短く連結していない 角膜領域において、角膜知覚が低下することが報告されている （Tuuli U. Linna et al. , Investigative Ophthalmology & Visual Sciences, 41 : 393-397, 2000)。
P R Kおよび L A S I K後における角膜知覚の低下は涙腺応答低下、 涙液減 少の原因であることカ示唆されて ヽる（Ang， Robert T. et al. , Current Opinion in Ophthalmology 12 : 318-322， 2001)。 そしてこの角膜知覚機能低下のため角 膜手術後の患者では瞬目回数が減少しドライアイ症状が認められることが問題 となっている。 一方、 ドライアイ患者では、 涙液機能の低下が角膜知覚の低下 をもたらし、 この角膜知覚の低下がさらに涙液機能の低下を悪化させ、 角膜表 面の症状を重篤化させることが問題となっている。
しかし、 現在角膜手術後の角膜知覚の回復は自然回復に委ねられ、 またドラ ィアイの治療においても角膜知覚を回復させるための積極的治療は施されてい ないのが現状である。
また、 神経麻痺性角膜症、 角膜潰瘍、 糖尿病性角膜症などの角膜神経変性を 伴う疾患でも角膜知覚低下が引き起こされる。 R h oタンパクは R h oファミリー （Rh o、 Ra c、 C d c 42などを含 む） に包含される低分子 Gタンパクであり、 ァクチン細胞骨格形成や、 神経突 起退縮反応に関係することが知られている。
例えば、 R h oタンパク阻害剤である C 3酵素は 3 T 3線維芽細胞の細胞突 起を伸展させることが知られており (Hirose, M. et al.， The Journal of Cell Biology, 141:1625-1636, 1998)、 R h oタンパク阻害剤の有効量を患者に投与 することによって中枢神経軸索成長を促進する方法が開示されている （特表 2 00 1 - 5 1 50 18号公報、 欧州特許出願公開第 1 , 0 1 1， 330号明細 書）。また、 Rh oタンパクのエフェクター分子の一つである Rh oキナーゼの 阻害剤が網膜神経節細胞の軸索伸展作用を有し、 視神経細胞の再生促進作用を 有することが知られている （国際公開第 02Z83 1 75号パンフレツト、 欧 州特許出願公開第 1， 142， 58 5号明細書)。 国際公開第 03/02028 1号パンフレツトでは、 LAS I Kなどの手術後の角膜神経傷害に起因する病 態を治療する目的に神経再生または神経突起伸展を促進する化合物が使えると されており、 それら化合物の例として神経栄養性因子刺激物質であるネオトロ フィンなどの化合物が例示されているが、 Rh oタンパク阻害剤の記載はなく、 またそれらを示唆する記載もない。
三叉神経に対しては、 ラット三叉神経組織培養 (trigeminal tract in whole mount cultures) 系において、 神経成長因子 （NGF) などの神経栄養因子誘 発神経軸索伸展が Rh o活性化剤 （リゾホスファチジン酸） で阻害され、 ドミ ナントネガティブ R h oを細胞に導入することで促進されることが報告されて レヽる (Ozdinler, P. Hande et al. , The Journal of Comparative Neurology, 438:377-387, 2001)。 その一方、 神経栄養因子非存在下では、 R h oが三叉神 経軸索伸展に有効かどうかについては分からないとの記載があり、 Rh oタン パク阻害剤の三叉神経に対する効果についても未だ判明していない。
一方、 Rh o活性化作用を有する化合物が角膜上皮伸展作用を有し、 Rli o タンパク阻害剤である C 3酵素によってその角膜上皮の伸展が抑制されること から、 Rh o活性化作用を有する化合物が、 角膜潰瘍、 角膜上皮剥離、 角膜炎 などの角膜障害に有用であることが開示されている（特開 2000-26484 7号公報、 欧州特許出願公開第 1， 142， 585号明細書)。
発明の開示
レーザー屈折矯正角膜切除術（PRK：)、 レーザー角膜切削形成術（レ一シッ ク； LAS I K)、角膜移植などの角膜手術後などの角膜知覚機能低下や、 ドラ ィアイ患者における角膜知覚低下を回復させる医薬を提供することである。 本発明者らは、 角膜術後の角膜知覚回復やドライアイにおける角膜知覚症状 を改善する新しいタイプの医薬を提供することを目的に検討を行ったとこ 5、 Rh οタンパク阻害剤が三叉神経（以後、角膜神経ということもある。）細胞の 神経突起形成促進効果を有することを初めて見出し、 これらの知見に基づいて さらに研究をすすめ、 R h oタンパク阻害剤を角膜知覚回復などの医薬として 利用する本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤；
(2) Rh oタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進剤；
(3) Rh oタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復剤；
(4) Rh oタンパク阻害剤を含有する.ドライアイ治療剤；
(5) R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進用組成物； ( 6 ) R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進用組成物；
(7) Rh oタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復用組成物；
(8) Rh oタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療用組成物；
(9) 角膜神経突起形成促進用組成物を製造するための Rh oタンパク阻害剤 の使用；
(10) 角膜神経軸索伸展促進用組成物を製造するための Rh oタンパク阻害剤 の使用；
(11) 角膜知覚回復用組成物を製造するための： Rh oタンパク阻害剤の使用； (12)ドライアイ治療用組成物を製造するための R h oタンパク阻害剤の使用；
(13) 角膜神経の神経突起形成促進が必要とされる対象に R h oタンパク阻害 剤の有効量を投与することによる角膜神経の神経突起形成を促進する方法；
(14) 角膜神経の軸索伸展促進が必要とされる対象に R h oタンパク阻害剤の 有効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展を促進する方法；
(15) 角膜知覚の回復が必要とされる対象に R h oタンパク阻害剤の有効量を 投与することによる角膜知覚を回復する方法；
(16) ドライアイに罹患した対象に R h oタンパク阻害剤の有効量を投与する ことによるドライアイを治療する方法
に関するものである。
図面の簡単な説明
図 1は試験例 1におけるゥサギ培養三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。 A は C 3酵素無添加培養液で 2 4時間培養したゥサギ三叉神経細胞を、 Bは C 3 酵素を最終濃度 2 μ g /m Lになるよう添加した培養液で 2 4時間培養した細 胞を示す。
図 2は試験例 1における神経突起形成細胞の全細胞数に対する比率 （％) を 示す。 縦軸は全細胞に対する神経突起形成細胞の割合を示す。 各値は 3例の平 均値土標準誤差を示す。 図中 *はコントロールに対する有意差（P < 0 . 0 5 ) を示す。
図 3は試験例 2における培養ゥサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。 A は被験物質無添加培養液、 Bは化合物 1添加 （最終濃度 1 0 M) 培養液、 C は化合物 2添加 （最終濃度 1 0 μ Μ) 培養液、 Dは化合物 3添加 （最終濃度 1 μ Μ) 培養液、 Εは化合物 4添加 （最終濃度 1 0 μ Μ) 培養液で 4 8時間培養 した細胞を示す。
図 4は試験例 2におけるカウントした全細胞数に対する神経突起形成細胞の 比率 （％) を示すグラフである。 各値は 3例の平均値土標準誤差を示す。 図中 *は無添加群に対する有意差 ρ < 0 . 0 5を、 * *は無添加群に対する有意差 ρ < 0. 0 1を示す。
図 5は試験例 3において、 ゥサギ角膜 （C) と三叉神経節 （Τ) における R OCK Iおよび ROCK I I ウェスタンブロッテイングの結果を示す。
発明の詳細な説明
本明細書中において、 「Rh oタンパク阻害剤」 とは、不活性型の G DP結合 型 Rh oタンパク質が活性型の G TP結合型 Rh oタンパク質へと活性化され るのを阻害する全ての阻害剤、 および Rh oタンパクまたは Rh oタンパタフ ラグメントに対する抗体など、 並びに Rh oタンパクの作用を伝達するェフエ クタ一分子、 例えば R h oキナーゼ （ROCK) の働きを阻害するすべての阻 害剤などをも包含するものである。 「角膜神経」 とは、知覚神経である三叉神経 の支配をうけ角膜周囲に形成される輪状神経叢、 角膜実質に網目上に分布する 実質内神経叢、 ポーマン膜直下で形成される上皮下神経叢、 ボーマン膜を貫通 したところで形成される基底細胞神経叢およぴ神経線維をいう。 本発明におけ る 「神経突起」 とは、 ニューロン （神経細胞） の細胞体から出る突起 （樹状突 起おょぴ軸索） をいい、 「形成」とは細胞体から前記神経突起が生成または/お よび伸展することをいう。 どの程度の神経突起形成をもって促進されている状 態というかは、 当業者には明らかである。 神経突起形成の促進は、 例えば、 神 経細胞を蛍光染色し、 蛍光顕微鏡を用いて細胞の状態を観察することにより確 認することができる。 また、 蛍光顕微鏡での観察結果を画像解析ソフトなどを 用いて解析してもよい。 さらに、 その結果を統計学的処理することにより神経 突起形成の状態を数値化することも可能である。 さらに別の方法として、 神経 細胞体および神経突起を構成するもの、 例えば-ユーロフィラメントを認識す る抗体、 およびこれと反応する西洋ヮサビペルォキシダーゼ （HRP) 結合抗 体で標識した後、 HR Pを発色させて吸光度を測定することによりニューロ フィラメント量を測定し、 神経突起形成の指標とすることもできる。
R h oタンパク阻害剤としては、 例えば C 3細胞外酵素 （Exoenzyme C3、 本 明細書においては単に C 3酵素ということもある。）、 トキシン A (T o x i n A) およびトキシン B (To x i n B) 並びに R h oキナーゼ阻害剤が挙げら れる。
このうち、 Rh oキナーゼ阻害剤（以後、 ROCK阻害剤ということもある。） としては、例えば、特開昭 61 - 227581号公報 (米国特許第 4， 678, 783号明細書） に記載の化合物、 例えば、 塩酸プアスジルなどで代表される イソキノリンスルホニル誘導体；国際公開第 00Z57914号パンフレツト および特開 2000— 44513号公報に記載の化合物、 例えば、 エタクリン 酸および 4— [2 - (2, 3 , 4， 5, 6—ペンタフルオロフェュル） アタリ ロイル] 桂皮酸などの Rh oキナーゼ阻害剤；国際公開第 02/076977 号パンフレット （欧州特許公開第 1, 370, 552号明細書、 同第 1， 37 0 , 553号明細書） 記載の化合物、 例えば、 2—クロロー6， 7—ジメ トキ シー N— [5- 1 H—ィンダゾリル] キナゾリン一 4ーァミンなどの Rh oキ ナーゼ阻害剤；および国際公開第 02Z100833号パンフレツトに記載の 化合物、例えば、 N—（1一べンジルー 4ーピペリジニル） 一 1 H—ィンダゾ一 ルー 5—ァミン · 2塩酸塩 · 1水和物などの Rh oキナーゼ阻害剤が挙げられ る。
なお、 以下の説明において、 本発明で用いる Rh oタンパク阻害剤を含有す る薬剤おょぴ組成物をまとめて、 「本発明の医薬」 ということもある。
本発明の医薬は、 哺乳動物 （例えばヒト、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ゥシ、 プタ、 ィヌ、 ネコなど） における角膜神経が障害、 切断または欠損した、 例え ば PR Kや LAS I K後の低下した角膜知覚回復のための治療薬として、 ある いは神経麻痺性角膜症、 角膜潰瘍、 糖尿病性角膜症などの角膜神経変性に伴う 角膜知覚低下や角膜知覚の低下したドライアイの治療薬として有用である。 本発明の医薬は全身的または局所的に投与される。 全身的には、 経口投与に 加え、 静脈内注射、 皮下注射、 筋肉内注射など非経口的にも投与される。 局所 的には、 眼に投与される。
本発明の医薬の製剤形態としては、 粉末、 顆粒、 錠剤、 カプセル剤、 坐剤な どの固形剤、およぴシロップ剤、注射剤、点眼剤などの液剤などが挙げられる。 本発明の医薬を顆粒および錠剤として製造する場合には、 例えば賦形剤 （乳 糖、 白糖、 プドウ糖、 デンプン、 結晶セルロースなど）、 滑沢剤 （ステアリン酸 マグネシウム、 タルク、 ステアリン酸、 ステアリン酸カルシウムなど）、 崩壊剤 (デンプン、 カルメロースナトリゥム、 炭酸カルシウムなど）、結合剤 (デンプ ン糊液、ヒ ドロキシプロピルセルロース液、カルメロース液、アラビアゴム液、 ゼラチン液、 アルギン酸ナトリゥム液など) などを用いることにより任意の剤 形を製造することができる。 また、 顆粒剤おょぴ錠剤には、 適当なコーティン グ剤 （ゼラチン、 白糖、 アラビアゴム、 カルナパロウなど）、 腸溶性コーティン グ剤 （例えば酢酸フタル酸セルロース、 メタアクリル酸コポリマー、 ヒドロキ シプロピルセルロースフタレート、 力/レポキシメチルェチルセルロースなど) などで剤皮を施してもよい。
本発明の医薬をカプセル剤として製造する場合には、 適当な賦形剤、 例えば 流動性と滑沢性を向上させるためのステアリン酸マグネシウム、 ステアリン酸 カルシウム、 タルク、 軽質無水ケィ酸など、 また加圧流動性のための結晶セル 口一スゃ乳糖などの他、 上記崩壊剤などを適宜添加したものを均等に混和また は粒状もしくは粒状としたものに適当なコーティング剤で剤皮を施したものを 充填するか、 適当なカプセル基剤 （ゼラチンなど） にグリセリンまたはソルビ トールなどを加えて塑性を増したカプセル基剤で被包成形することもできる。 これらカプセル剤には必要に応じて、 着色剤、 保存剤 [二酸化イオウ、 パラべ ン類 （パラォキシ安息香酸メチル、 ェチル、 プロピルエステル）] などを加える ことができる。 カプセル剤は通常のカプセルの他、 腸溶性コーティングカプセ ル、 胃内抵抗性カプセル、 放出制御力プセルとすることもできる。 腸溶性カブ セルとする場合、 腸溶性コーティング剤でコーティングした化合物、 または化 合物に上記の適当な賦形剤を添加したものを、 通常のカプセルに充填または、 カプセル自身を腸溶性コーティング剤でコーティング、 もしくは腸溶性高分子 を基剤として成形することができる。 本発明の医薬を坐剤として製造する場合には、 坐剤基剤 （例えばカカオ脂、 マクロゴールなど） を適宜選択して使用することができる。
本発明の医薬をシロップ剤として製造する場合、 例えば安定剤 （ェデト酸ナ トリウムなど）、 懸濁化剤 （アラビアゴム、 カルメロースなど）、 矯味剤 （単シ 口ップ、 プドウ糖など）、 芳香剤などを適宜選択して使用することができる。 本発明の医薬を注射剤または点眼剤として製造する場合、 医薬上許容される 添加物、 例えば等張化剤 (塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 グリセリン、 マン 二トール、 ソルビトール、 ホウ酸、 ホウ砂、 プドウ糖、 プロピレングリコール など）、 緩衝剤 （リン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 炭酸緩衝液、 タエ ン酸緩衝液、 トリス緩衝液、 グルタミン酸緩衝液、 ィプシロンアミノカプロン 酸緩衝液など）、 保存剤 （パラォキシ安息香酸エステル類、 クロロブタノール、 ベンジルアルコール、 塩化ベンザルコニゥム、 デヒドロ酢酸ナトリウム、 ェデ ト酸ナトリゥム、ホウ酸、ホウ砂など）、増粘剤（ヒドロキシェチルセルロース、 ヒ ドロキシプロピルセルロース、ポリビニノレアルコール、ポリエチレングリコー ルなど）、 安定化剤 （亜硫酸水素ナトリウム、 チォ硫酸ナトリウム、 ェデト酸ナ トリウム、 クェン酸ナトリウム、 ァスコルビン酸、 ジブチルヒドロキシト^/ェ ンなど）、 pH調整剤 （塩酸、 水酸化ナトリウム、 リン酸、 酢酸など） などを適 宜添加した溶液に溶解または分散することによって製造することができる。 上記シロップ剤、 注射剤および点眼剤における添加剤の添加量は、 添加する 添加剤の種類、 用途などによって異なるが、 添加剤の目的を達成し得る濃度を 添加すればよく、 等張化剤は、 通常、 浸透圧が約 229〜約 343mO S:mと なるよう、 約 0. 5〜約 5. Ow/v%を添カ卩する。 また、 緩衝剤は約 0. 0 1〜約 2. 0 ％程度、 増粘剤は約0. 01〜約1. 0w/v%程度、 安 定化剤は約 0. 001〜約 1 · 0 V %程度になるように添加する。 p H調 整剤は、 適宜添加し、 通常 pH約 3〜約 9、 好ましくは約 4〜約 8になるよう に添加する。
特に本発明の医薬を点眼剤として使用する場合、 本発明の医薬に含まれる R h oタンパク阻害剤の濃度は、 通常下限は約 0. 00001 w/ V %、 好まし くは約 0. 00005 wZv%、 より好ましくは約 0. 0001wZv%であ り、 上限は約 0. 1 v//v %、 好ましくは約 0. 05 w/v%、 より好ましく は約 0. 0 1 wZ v%、 さらに好ましくは約 0. 005 w/v%, なおさらに 好ましくは約 0. 00 1 wZv%に調製される。
本発明の医薬の投与量は対象となる疾患、 症状、 投与対象、 Rh oタンパク 阻害剤の種類、 投与方法などにより異なるが、 例えば PRK手術後の角膜知覚 回復剤として成人の眼に局所的に使用する場合には、 例えば C 3酵素約 0. 0 0 1 wZv%含有する点眼液を、 あるいは、 N— （1一べンジルー 4ーピペリ ジ -ル） 一 1 H—インダゾールー 5—ァミン · 2塩酸塩 · 1Z 2水和物などの Rh oタンパク阻害剤を約 0. 003 wZv%含有する点眼液を、 1回約 20 〜約 50 /z L、 1 Θ数回点眼するのがよレ、。
また、 本発明の医薬を LAS I K手術後の角膜知覚回復剤として成人に経口 投与する場合、 例えば、 4一 [2— （2， 3, 4， 5, 6—ペンタフルオロフェ -ル） アタリロイル] 桂皮酸などの R h oタンパク阻害剤を約 1 0 m g含有す る錠剤を 1日 1回ないし 2回服用するのがよい。
実施例
本発明を以下の試験例及び実施例に従いさらに詳細に説明するが、 本発明は これらにより何ら限定されるものではない。
試験例 1 培養ゥサギ三叉神経細胞の神経突起形成促進作用
1) 使用動物
福崎養兎組合より購入した日本白色種ゥサギ （生後 2〜3日） を使用した。
2) 被験物質
C 3酵茶 [upstate ¾ ； Exoenzyme C3 (recombinant enzyme expressed in E. coli) ； Catalog #13—118， Lot #23330]
3) 試験方法
細胞培養：三叉神経細胞の単離は Chanらの報告（Chan, Kwan Y. andHaschke, Richard H. , Exp. Eye Res. , 41： 687-699， 1985) を参考にして行った。 すな わち、 ゥサギをエーテル麻酔下、 生理食塩水で心臓を灌流後、 三叉神経節を切 り出し、 神経分散液 （住友ベークライト社製） を用いて、 三叉神経節を分散さ せた後、 ポリ リジンでコートした 8ゥエルカルチャースライ ド (BECT0N DICKINSON社製） に細胞を播種した。細胞数は 1ゥヱルあたり約 3 X 103細胞 とし、 培養条件は 5% C02、 95%空気下、 湿度 100%、 37 とした。 細胞培養にはニューロベーサル培養液 （GIBC0社製） に B27 Supplement (GIBC0 社製； 0. 02mLZmL培養液） および L一グルタミン酸 （GIBC0社製；最 終濃度 lmM) を添カ卩した培養液を用い、 細胞播種直後に C 3酵素 （2 μ g/ mL最終濃度） を添加して 24時間培養した。
免疫染色：培養 24時間後に、 細胞を 4%パラホルムアルデヒドを用いて室 温で 2時間固定し、 神経細胞に特異的な中間径フィラメントであるニューロ フィラメントを特異的に認識する抗ニューロフィラメント 200抗体 （Sigma 社製） およびこれと反応する蛍光二次抗体 （Molecular Probes社製） を用いて 神経細胞体おょぴ神経突起を蛍光染色した。 染色細胞は蛍光顕微鏡からコン ピュータに画像 （1画像： 1 : 83mmX 1. 36 mm) として取り込み、 画 像中の全細胞数（t)をカウントすると共に、画像解析ソフト（MacSCOPE, MITANI CO.社製） を用いて細胞の神経突起の長さを測定し、細胞体の直径の 2倍以上長 さの神経突起を持つ細胞を神経突起形成細胞 （a) としてカウントした。 各画 像中の全細胞数の合計 （t i+ t s + + t n-S t) が約 100以上となるま で複数の画像を取り込んだ。 その時の総神経突起形成細胞数 （a i+a 2 +— + an =∑ a) の全細胞数合計 （∑ t) に対する比率 （％) を計算した。 この比 率について、 C 3酵素添加群と無添加群 （コントロール群） とを比較するため に、 t -testにより検定して危険率 5 %未満を有意であると判定した。
4) 試験結果
図 1は培養ゥサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示している。 図 1中、 Aは C 3酵素無添加培養液で 24時間培養したコントロール群の細胞を、 Bは C 3 酵素を最終濃度 2 μ gZmL添加した培養液で 24時間培養した細胞を、 図 2 は各群の全細胞数に対する神経突起形成細胞数の比率を示す。
神経突起形成細胞の比率はコント口ール群では全細胞の約 21 %、 C 3酵素 添加群では全細胞の約 46 %であり、 C 3酵素添加により突起形成細胞数の有 意な増加が認められた （図 2)。
以上のことから、 Rh o阻害活性を有する C 3酵素は三叉神経細胞の突起形 成を促進することが分かつた。
試験例 2 培養ゥサギ三叉神経の突起形成促進作用
1) 使用動物
北山ラベス社より購入した日本白色種ゥサギ （生後 2〜3日） を使用した。
2) 被験物質
ROCK阻害剤として、 2—クロロー 6, 7—ジメ トキシー N— [5— 1 H ーィンダゾリル] キナゾリン一 4—ァミン、 N— ( 1一ベンジル一 4ーピペリ ジ -ル） 一 iH一インダゾールー 5ーァミン. 2塩酸塩、 4一 [2— (2， 3， 4, 5, 6—ペンタフルオロフヱエル） アタリロイル] 桂皮酸おょぴ塩酸ファ スジルを使用した。
2—クロロー 6, 7—ジメ トキシー N— [5- 1 H—ィンダゾリル] キナゾ リンー 4ーァミン（以下、化合物 1と記載する。） は参考例 1に従い合成したも のを使用した。 N— （ 1一べンジルー 4ーピベリジ-ル） 一 1H— ^ f ンダゾ一 ルー 5—アミン * 2塩酸塩. 1/2水和物 （以下、 化合物 2と記載する。） は参 考例 2に従い合成したものを使用した。 4一 [2— (2, 3, 4, 5, 6—ぺ ンタフルオロフェニル） アタリロイル] 桂皮酸 （以下、 化合物 3と記載する。） は参考例 3に従い合成したものを使用した。 塩酸ファスジル (以下、 化合物 4 と記載する。 ) は市販の塩酸ファスジル水和物注射液 「ェリル注 3 OmgJ (旭 化成株式会社製) を使用した。
3) 細胞培養
ゥサギ三叉神経細胞の単離は試験例 1と同様に行った。 細胞培養にはニュー 口ベーサル培養液（GIBC0社製） に B27 Supplement (GIBC0社製；最終濃度 2 % V / V ) および L一グルタミン （GIBC0社製；最終濃度 1 mM) を添カ卩した培 養液を用い、 24ウエノレプレートの各ゥエルにポリリジン/ラミニンコーティ ング済み円形カバーグラス (直径 1 2mm；住友べ一クライト社製） を入れ、 そのカバ一グラス上に約 3 X 1 03細胞 Zゥエルとなるように細胞を播種した。 細胞が力パーグラスに接着後（約 2時間）、上記培養液をそれぞれの被験物質添 加培養液 （化合物 1， 最終濃度 10 M；化合物 2， 最終濃度 1 0 M；化合 物 3， 最終濃度 1 ；化合物 4， 最終濃度 10 Μ) に交換し、 48時間培 養した。 培養条件は、 5 % C Ο 2、 9 5 %空気下、 湿度 1 00 %、 温度 3 7 °C で行った。
4) 免疫染色
培養 48時間後の細胞を 4%パラホルムアルデヒドを用いて室温で 2時間固 定した。
神経細胞に特異的な中間径フィラメントであるニューロフィラメントを認識 する杭-ユーロフィラメント 200抗体 （Sigma社製） およびこれと反応する 蛍光二次抗体 （Molecular Probes社製） を用いて固定した標本を蛍光染色し、 蛍光顕微鏡を用いて染色された細胞を検出した。 染色像は、 コンピュータに画 像 1画像： 1. 83mmX l. 36 mmとして取り込んだ。 画像中の全細胞数 (t) をカウントすると共に、 画像解析ソフト （MacSCOPE, MITANI CO.) を用 いて細胞の神経突起長および細胞体直径を測定し、 細胞体直径の 2倍以上長さ の神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞 （a) としてカウントした。 各画 像中の全細胞数の合計 （t i+ t 2 +…十 t n=∑ t) が約 100以上となるま で画像を取り込んだ。 その時の総神経突起形成細胞数 （& 1+ & 2 +— + & η = ∑ a) の全細胞数 (∑ t) に対する比率 (%) を計算した。
5 ) 統計学的処理
神経突起形成細胞比率について、 無添加群 （コントロール） と被験物質添加 群との比較を Dunnett' s多重比較検定法により行ない、 危険率 5 %未満を有意 であると判定した。
6) 試験結果
図 3に培養ゥサギ三叉神経細胞の蛍光顕微鏡像を示す。
図 3 Aは、 被験物質無添加培養液で 48時間培養した細胞を、 図 3 Bは化合 物 1を添加した培養液で 48時間培養した細胞を、 図 3 Cは化合物 2を添加し た培養液で 48時間培養した細胞を、 図 3Dは化合物 3を添加した培養液で 4 8時間培養した細胞を、 図 3 Eは化合物 4を添加した培養液で 48時間培養し た細胞を示している。
図 4は、 全細胞数に対する無添加群おょぴそれぞれ被験物質添加群の神経突 起形成細胞数の比率を示している。全細胞に対する神経突起形成細胞の比率は、 無添加群で約 3 1 %、化合物 1添加群で約 41 %、化合物 2添加群で約 5 7 %、 化合物 3添加群で約 5 1 %、 化合物 4添加群で約 70 %であり、 被験物質添加 群では神経突起形成細胞比率の有意な增加あるいは増加傾向が認められた。 以上の結果から R O C K阻害剤は、 三叉神経細胞の神経突起形成を促進する 作用を有することが明らかとなった。
参考例 1 2—クロロー 6， 7—ジメ トキシ一 N— [5— 1 H—インダゾリル] キナゾリンー 4ーァミンの合成 （国際公開第 02 076977号パンフレツ ト、 実施例 1)
2， 4ージクロ口一 6， 7—ジメ トキシキナゾリン （8. 6 g, 64. 58 mmo 1)、 5—ァミノインダゾール （4. 8 g, 36. 04mmo 1 ) および 酢酸カリウム （7. 3 5 1 g, 74. 9 1 mmo 1 ) をテトラヒドロフラン Z 精製水 （138mLZ62mL) 中に加え、 一晩室温下で攪拌した。 混合物に 精製水 （1 30mL) を加え、 結晶を析出させた。 析出した結晶は精製水で洗 浄し、 DMF—水から再結晶し目的とする 2—クロ口一 6， 7—ジメ トキシ一 N— [5— 1H—インダゾリル]キナゾリン— 4一アミンの微黄色粉末を得た。 mp 278.7-283.8 °C. NMR (300 MHz, DMSO -も) δ 3.93 (s, 3Η) , 3.96 (s, 3Η)， 7.16 (s， 1H), 7.60 (m, 2H)， 7.90 (s， 1H), 8.03 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 9.94 (s, 1H), 13.13 (br s, 1H). Anal. Calcd. for C17H15N502C1 - 1/2¾0： C, 55.97, H, 4.14, N, 19.20. Found: C, 56.05, H, 4.46, N, 19.22.
参考例 2 N— ( 1—ベンジル一 4ーピペリジニル） 一 1H—インダゾールー 5—ァミン . 2塩酸塩 · 1/2水和物の合成 (国際公開第 0 2/ 1 0 0 8 3 3 号パンフレツト、 実施例 1 )
1一ペンジノレー 4 -ピペリ ドン （1 4. 2 1 g , 7 5. 1 mm o 1 , 1 3. 9 2mL) の 1 , 2—ジクロロェタン (8 0 mL) 溶液中に、 室温にて 5—ァ ミノィンダゾール (1 0. 0 g, 7 5. 1 0 mm o 1 )、 トリァセトキシ水素化 ホウ素ナトリウム （1 1. 5 g， 5 2. 6mmo 1 )、 酢酸 （4. 2 9 mL, 7 5. 1 mmo 1 ) を加え、 室温にて終夜攪拌した。 次に、 反応液を 1 N—水酸 化ナトリウム水溶液に注ぎ、 酢酸ェチルで抽出した。 有機層を飽和食塩水で洗 浄してから、 無水硫酸マグネシウムで乾燥した。 溶媒を減圧留去して得られた 残渣をメタノールから再結晶することにより、 N— （1一べンジルー 4ーピぺ リジニル） 一 1 H—ィンダゾ一ルー 5—ァミン (7. 8 g, 3 4 %) を得た。 m 150.1-152.2 °C. 3H-NMR (300 MHz, DMS0- ） δ 1.39 (m, 2H), 1.94 (m, 2H)， 2.08 (t， 2H, J = 10.8), 2.79 (d， 2H， J = 11.4), 3.19 (m, 1H)， 3.47 (s, 3H), 5.11 (d, 1H, J = 7.8), 6.68 (br s， 1H), 6.83 (dd, 1H, J = 8.9， 1.7)， 7.20-7.37 (m, 6H), 12.58 (br s, 1H). Anal. Calcd. for C19H22N4: C， 74.48, H, 7.24, N, 18.29. Found: C, 74.42, H, 7.27, N， 18.37
得られた N— （1一べンジルー 4ーピペリジニル） 一 1 H—ィンダゾ一ルー 5—ァミン （6. 0 g， 1 9. 5 8mmo 1 ) のテトラヒ ドロフラン （6 Om L) 溶液中に、 室温にて 1 N—塩酸 エ一テル溶液 （3 8mL) および 4N— 塩酸/酢酸ェチル溶液 （1 3mL) を加え、 室温にて 3 0分間攪拌した。 析出 した固体を濾取し、 メタノールから再結晶することにより、 N— ( 1—ベンジ ルー 一ピペリジニル） 一 1 H—ィンダゾ一ルー 5—アミン · 2塩酸塩 · 1 / 2水和物 （4. 3 2 g, 5 6%) を得た。
mp 193.0-194.6 。C. ¾- NMR (300 MHz, DMS0—も） δ 2.18 (m, 1.75H) , 2.51 (m， 0.25H) , 2.98 (m, 1.5H), 3.17 (m, 0.5H) , 3.41 (m, 2H), 3.68 (m, 0.75H), 3.90 (m, 0.25H) , 4.25 (ra， 1.5H), 4.46 (m， 0.5H) , 7.40-7.64 (m， 6H), 7.59 (m， 1H)， 7.70 (m, 1H)， 7.92 (in, 1H)， 8.20 (s， 1H)， 11.02 (br s, 0.75H), 11.53 (br s, 0.25H) . Anal. Calcd. for C19H22N42HC1 1/2H20: C, 58.76, H, 6.49, N， 14.43. Found: C， 58.49, H， 6. 8, N, 14.45.
参考例 3 4— [2— (2， 3， 4， 5， 6—ペンタフルォロフエ-ル）ァクリ 口ィル] 桂皮酸の合成 (特開 2 0 0 0 - 44 5 1 3号公報、 実施例 8 ) 工程 1
窒素雰囲気下、ドライアイスで冷却しながら、イソプテン（2 7mL)に（2， 3, 4， 5， 6—ペンタフルオロフヱニル） 酢酸 （20 g,， 9 3. 5mo l )、 エーテル （7mL) および濃硫酸 （0. 5mL) を加え、 耐圧管中、 室温で 3 日間撹拌した。 1 0%炭酸水素ナトリウム水溶液と氷との混合物に、 ドライア イスで冷却した反応液を加え撹拌した。 エーテルを加えて抽出し、 有機層を飽 和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、 （2， 3， 4, 5， 6—ペンタフルオロフェニル） 酢酸 t—プチノレエステル （24 · 4 g , 9 7 %) を得た。
工程 2
4一ホルミル安息香酸 （2 0 g， 0. 1 3 3mo 1 ) のピリジン （1 3 8m L) 溶液にマロン酸ェチルモノカリゥム塩 （4 6 g, 0. 2 7 Omo 1 )s p - トルエンスルホン酸 · 1水和物 （5 0 g， 0. 2 6 3mo 1 ) およぴピぺリジ ン （2. OmL) を加え、 混合液を徐々に加熱したのち 1 20°Cで 1. 5時間 撹拌した。 氷冷下、 反応液に 2 N塩酸を加えて酸性とし、 析出物を濾取するこ とにより 4—カルボキシ桂皮酸 ェチルエステル （2 6. 5 8 g, 9 1 %) を 結晶として得た。
工程 3
窒素雰囲気下、 4一カルボキシ桂皮酸 ェチルエステル （5. 0 g, 2 2. 7mmo 1 ) のクロ口ホルム （1 5mL) 溶液に塩化チォニル （8. 4mL) を滴下したのち、ジメチルホルムアミ ド（1滴）を加え 30分間加熱還流した。 反応液を減圧濃縮し酸ク口ライドを得た。
窒素雰囲気下、 工程 1で得た (2， 3, 4， 5 , 6一ペンタフルォロフエ二 ル） 酢酸 t一ブチルエステル (6. 35 g, 23. 5 mm o 1 ) のテトラヒ ドロフラン （1 0 OmL) 溶液に、 ドライアイスで冷却しながらリチウムビス (トリメチルシリル) アミ ドの 1Mトルエン溶液 (26mL) を滴下した。 5 分後、 さらに工程 2で得た酸クロライドのテトラヒドロフラン （10 OmL) 溶液を滴下した。 滴下終了 20分後に、 室温で 1. 5時間撹拌した。 反応液に 5%クェン酸水溶液（1 2 OmL) を加え、エーテルで抽出した。有機層を水、 飽和食塩水で洗浄し、 無水硫酸マグネシウムで乾燥後減圧濃縮した。，得られる 残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、 4— [(2RS) — 2 一 ( t—ブトキシカルボ二ノレ) - 2 - (2， 3, 4, 5 , 6—ペンタフノレォロ フエュル） ァセチル] 桂皮酸 ェチルエステル （4. 83 g , 44 %) を結晶 として得た。
工程 4
工程 3で得た 4一 [(2RS)—2—（t一ブトキシカルボニル）一 2—（ 2， 3， 4， 5， 6—ペンタフルオロフェニル） ァセチル] 桂皮酸 ェチルエステ ル （5. 6 g, 1 1. 6mmo 1 ) のジォキサン （24m 1 ) 溶液を耐圧管に 入れ、濃塩酸（24m l ) を加えた。 1 30°Cに加熱しながら 4時間撹拌した。 反応液を氷冷して析出物を濾取し、 4一 [(2， 3, 4， 5, 6—ペンタフルォ 口フエニル） ァセチル] 桂皮酸 （3. 7 g, 90%) を結晶として得た。 この 4 - [(2, 3, 4， 5， 6—ペンタフ/レオ口フエ-ル） ァセチル]桂皮酸（2. 03 g， 5. 7mmo 1 ) のジォキサン (1 1 5mL) 溶液を耐圧管に入れ、 パラホルムアルデヒ ド（0. 7 g)、 ジメチルァミン塩酸塩 (1. 86 g, 22. 8 mmo 1)、 酢酸 （1 0滴） および無水硫酸マグネシウム （8 g) を加えて 1 30°Cに加熱しながら一晩撹拌した。 氷冷下、 反応液に 0. 1N塩酸を加えて 酸性とし酢酸ェチルで抽出した。 有機層を飽和食塩水で洗浄、 無水硫酸マグネ シゥムで乾燥後減圧濃縮した。析出物を濾取し、標記化合物 1. 46 g (93%) を結晶として得た。
mp 214.0-217.0°C. ¾ー丽 R (300 MHz, CDC13) δ 6.25 (s, 1H)， 6.30 (s, 1H) , 6.46 (d, 1H, J = 16.2), 7.57 (d, 2H, J - 8.4), 7.64 (d, 1H, J = 15.9), 7.78 (d, 2H， J = 8.4)
試験例 3 ゥサギ三叉神経節おょぴ角膜組織における ROCK I， ROCK I Iのタンパク質発現
1) 使用動物
日本白色種雄性ゥサギを北山ラベス社より購入して実験に使用した。
2) 組織可溶性タンパク質の調製
動物を安楽死させた後、 三叉神経節および角膜を摘出した。 摘出した組織は 氷冷したリン酸緩衝生理食塩水 （Invitrogen社製） 中に移して洗浄し、 氷冷し た 0. 1 %の T r i t o n X- 100 (Pharmacia Biotech社製） および 1 t a b l e t/ 10 m lの P r o t e a s e i nh i b i t o r c o c k t a i 1 (complete, Mini; Roche社製） を含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 (pH 7. 5) 中に移して超音波破砕をおこなった。超音波破碎処理により得 られた各組織由来の細胞粗破砕液を遠心分離（10， 000 X g， 1 5分， 4°C) し、 上清を回収して組織可溶性タンパク質溶液を得た。 溶液中のタンパク質量 は BC Aプロテインアツセィリージヱント （PIERCE社製） を用いて定量した。 3) ウェスタンプロッティング法を用いた ROCK I， ROCK I Iの検出 調製した組織可溶性タンパク質に含まれる: OCK I， ROCK I Iを ウェスタンプロッティング法を用いて検出した。 25 μ gのタンパク質を含む 調製溶液を 8 %の S D Sポリアクリルアミドゲル （TEFC0社製） を用いて電気 泳動法により分離し、 ゲル内に分離されたタンパク質を P V D F膜 (Immobilon-P; Millipore) 上に電気的に転写した。 タンパク質の転写された 膜を 5 %のスキムミルクでプロッキングした後、ャギ抗 R OCK I抗体あるい はャギ抗 R O CK I I抗体 （ともに SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY社製） と反応 させ、 アルカリフォスファターゼ （AP) 結合抗ャギ I gG抗体 （バイオラッド 社製） を用いて二次標識した。 抗原の免疫検出は AP発色キット （パイオラッ ド社製） を用いておこなった。
4) 試験結果
図 5にウェスタンブロッティングの結果を示した。： OCK Iおよび ROC
K I I ともにゥサギ三叉神経節おょぴ角膜組織の可溶性タンパク質中にタン パク質レベルで発現していることが確認できた。
実施例 1 錠剤
C 3酵素 10 m g
乳糖 80 mg
デンプン 1 7 mg
ステアリン酸マグネシウム 3 mg
結晶セノレロース 10 m g
以上の成分を 1錠分の材料として、 常法により錠剤を成形する。 錠剤は必要 に応じて通常用いられる腸溶性コーティング剤 （例えばフタル酸ヒ ドロキシプ 口ピルメチルセルロースなど）、糖衣およびフイノレム（例えばェチルセルロース） を適用してもよい。 主薬成分である C 3酵素を、 化合物 1、 2、 3又は 4に変 えてもよい。 また添加剤との配合比を変えることにより、 主薬の成分量が 20 mg、 5mg、 lmg、 0. 5mg、 0. 1 m g /錠の錠剤を調製しうる。 実施例 2 カプセル剤
C 3酵素 50 mg
マンニ トーノレ 75 m g
デンプン 1 7 m g
ステアリン酸カルシウム 3 m g
以上の成分を 1カプセル分の材料として均一に混合し、 常法により顆粒状と し、硬カプセルに充填する。充填前に必要に応じて、通常用いられる腸溶性コー ティング剤（例えばフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、糖衣また はフィルム （例えばェチルセルロース） を顆粒に適用してもよい。 主薬成分で ある C 3酵素を、 化合物 1、 2、 3又は 4に変えてもよい。 また添加剤との配 合比を変えることにより、 主薬の成分量が 2 Omg、 1 Omg、 5mg、 1 m gゝ 0. 5mg、 0. 1 mgZカプセルのカプセル剤を調製しうる。
実施例 3 注射剤
C 3酵素 750 mg
カノレボキシメチ/レセノレロースナトリウム 500 m g
注射用水 全量 1 00 m L
以上の成分を常法により無菌的に混和して注射剤を調製する。 主薬成分であ る C 3酵素を、 化合物 1、 2、 3又は 4に変えてもよい。 また添加剤の配合比 を変えることにより、主薬の成分量が 1 000mg、 500mg、 200mg、 10 Omg/10 OmLである注射剤を調製することができる。
実施例 4 点眼剤
C 3酵素 5 m g
ホウ酸 700 m g
ホウ砂 適量 （pH7
Figure imgf000021_0001
塩化ナトリウム 500 m g
ヒ ドロキシメチノレセノレ口 0. 5 g
ェデト酸ナトリウム 0. 05 m g
塩化ベンザノレコニゥム 0. 005 m g
滅菌精製水 全量 1 00 m L
滅菌精製水 8 OmLを約 80。Cまで加温し、 ヒ ドロキシメチルセルロースを 加えて攪拌し、 液温を室温まで戻す。 この液に C 3酵素、 塩化ナトリウム、 ホ ゥ酸、 ェデト酸ナトリゥムおよび塩化ベンザルコニゥムを加えて溶解する。 ホ ゥ砂を適量加えて pHを 7に調整する。 滅菌精製水を加えて 10 OmLまでメ スアップする。 主薬成分である C 3酵素を、 化合物 1、 2、 3又は 4に変えて もよい。 また添加剤の配合比を変えることにより、 主薬の濃度が lw/v%、 0. 5 w/v%N 0. 3 w %^ 0. lwZv%、 0. 05 w/v%, 0. 03 %、 0. 01 w/v%、 0. 003 w/ v %- 0. 001 w/v% である点眼剤を調製することができる。
実施例 5 点眼剤
C 3酵素 10 m g
D—マン-トール 4. 5 g
リン酸ニ水素ナトリウム 0. 1 g
水酸化ナトリウム 適量 （ p H 7. 0)
滅菌精製水 全量 100 mL
滅菌精製水 8 OmLに C 3酵素、 D—マンニトール、 リン酸二水素ナトリウ ムを加えて溶解する。水酸化ナトリゥムを適量加えて を 5.0に調整する。 滅菌精製水を加えて 10 OmLまでメスアップする。 調製した点眼剤をメンプ ランフィルターで滅菌ろ過後、 デイスポーザプル （ュニッ トドーズ） 容器に充 填、 密封する。 主薬成分である C 3酵素を、 化合物 1、 2、 3又は 4に変えて もよい。 また添加剤の配合比を変えてもよい。 また添加剤の配合比を変えるこ とにより、 主薬の濃度が I Z 0. 5w/v%、 0. 3w/v%、 0. 1 w/ v %, 0. 05w/v%、 0. 03wZv%、 0. 005w/v%、 0.
003 w/v%N 0. 001 wZv%である点眼剤を調製することができる。
産業上の利用可能性
本発明の Rh oタンパク阻害剤を含有する医薬は三叉神経細胞の神経突起形 成促進作用を有することから、 角膜神経の損傷などに伴う角膜知覚機能低下の 改善および角膜知覚機能低下に伴う ドライアイ症状の改善に有用である。 具体 的には、 Rh oタンパク阻害剤を適用することにより、 白内障手術後や LAS
1 K手術後の角膜知覚の低下、 神経麻痺性角膜症、 角膜潰瘍、 糖尿病性角膜症 などの角膜神経変性に伴う角膜知覚低下やドライアイ症状の改善効果が期待で さる。 以上、 本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、 当業者であれ ば示された特定の態様には、 本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲 で様々な修正と変更をなすことは可能である。 従って、 そのような修正おょぴ 変更も、 すべて後記の特許請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含 まれるものである。
本出願は、 日本で出願された特願 2003- 1 148 1 9およぴ特願 200 3- 273 1 7 7を基礎としており、 それらの内容は本出願にすべて包含され るものである。

Claims

請求の範囲
1. R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進剤。
2. R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進剤。
3. R h oタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復剤。
4. R h oタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療剤。
5. R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経突起形成促進用組成物。
6. R h oタンパク阻害剤を含有する角膜神経軸索伸展促進用組成物。
7. R h oタンパク阻害剤を含有する角膜知覚回復用組成物。
8. R h oタンパク阻害剤を含有するドライアイ治療用組成物。
9. 角膜神経突起形成促進用組成物を製造するための R h oタンパク阻害剤の 使用。
10. 角膜神経軸索伸展促進用組成物を製造するための R h oタンパク阻害剤の 使用。
11. 角膜知覚回復用組成物を製造するための R h oタンパク阻害剤の使用。
12. ドライアイ治療用組成物を製造するための R h oタンパク阻害剤の使用。
13. 角膜神経の神経突起形成促進が必要とされる対象に R h oタンパク阻害剤 の有効量を投与することによる角膜神経の神経突起形成を促進する方法。
14. 角膜神経の軸索伸展促進が必要どされる対象に] h oタンパク阻害剤の有 効量を投与することによる角膜神経の軸索伸展を促進する方法。
15. 角膜知覚の回復が必要とされる対象に R h oタンパク阻害剤の有効量を投 与することによる角膜知覚を回復する方法。
16. ドライアイに罹患した対象に R h oタンパク阻害剤の有効量を投与するこ とによるドライアイを治療する方法。
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