WO2004091660A1 - Lklf/klf2遺伝子発現促進剤 - Google Patents

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lklf
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klf2
klf2 gene
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PCT/JP2004/005316
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Tatsuhiko Kodama
Shigeru Morikawa
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Kowa Co., Ltd.
Nissan Chemical Industries Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to vascular related diseases such as diabetes, exertional angina, unstable angina, resting angina, myocardial infarction, atherosclerosis, vascular endothelial dysfunction, restenosis after PTCA, irritability Treatment of allergic pneumonia, interstitial pneumonia, airway stenosis, airway obstruction, fundus bleeding (retinal vein occlusion, flying mosquitoes, etc.), cerebrovascular dementia, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, hemorrhoids, etc.
  • the present invention relates to a gene expression promoting agent useful for kurtzpel-like factor 2 (lung Kruppel-like factor / KLF2, hereinafter abbreviated as LKLF / KLF2).
  • LKLF / KLF2 kurtzpel-like factor 2
  • LKLF / KLF2 is a transcription factor protein having a proline repeat sequence, an active site, a nuclear localization signal, and a structure of a zinc finger portion (Kozyrev SV et al., FEBS Lett. 1999 Apr 1; 448 (1 ): 149-52) 0
  • the role of LKLF / KLF2 is important for blood cell differentiation (Kuo CT et al. Genes Dev. 1997 11 (22): 2996-3006, Anderson KP et al. Mol. Cell Biol. 1995) 15 (11): 5957-65), and important signaling factors of vascular endothelial cells and smooth muscle cells (Monajemi H et al. Thromb. Haemost.
  • LKLF / KLF2 is expressed from vascular endothelial cells by shear stress (Dekker RJ et al., Blood 2002 100 (5): 1689-98), and it is pointed out that LKLF / KLF2 is suppressively involved in the development of atherosclerosis. (Kar in Arkenbout E et al. Thromb. Haemost. 2003 89 (3): 52 2-9). Thus, it is presumed that LKLF / KLF2 expressed from vascular endothelial cells acts suppressively on vascular-derived lesions.
  • LKLF / KLF2 gene is expected to be able to alleviate or treat the symptoms of vascular-related diseases such as arteriosclerosis.
  • No substance that promotes expression is known, including physiological ones. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a blood vessel-related disease such as diabetes, exertional angina, unstable angina, resting angina, myocardial infarction, atherosclerosis, vascular endothelial dysfunction, restenosis after PTCA. , Irritable pneumonia, interstitial pneumonia, airway stenosis, airway obstruction, fundus bleeding (retinal vein occlusion, flying mosquitoes, etc.), cerebrovascular dementia, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, hemorrhoids, etc.
  • An object of the present invention is to provide a LKLF / KLF2 gene expression promoter effective for mitigation.
  • the present inventors searched for a substance that affects the expression of the LKLF / KLF2 gene using a cultured human cell line, and as a result, surprisingly, a substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway was expressed in the LKLF / KLF2 gene.
  • the present inventors have found that they have an effect of promoting the above, and have completed the present invention.
  • the present inventors among the substances that inhibit the mevalonate metabolic pathway, include a compound represented by the following general formula (1), which is known as an HMG-CoA reductase inhibitor, a lactone derivative thereof, It has been found that their salts, in particular, calcium phosphate calcium have an action to promote the expression of the LKLF / KLF2 gene.
  • phthalnesyltransferase inhibitors such as FTI-276 and geranylgeraeltran such as GGT 1-286
  • spherolase I inhibitors or darcosyltransferases such as TcdB (Clostridium difficile Toxin B) also have an LKLF / KLF2 gene expression promoting effect.
  • the present invention provides an LK LF / KLF2 gene expression promoter comprising, as an active ingredient, a substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway.
  • R 1 represents an organic group
  • R 2 represents a hydrogen atom or an alkyl group.
  • an LKLF / KLF2 gene expression promoter comprising as an active ingredient a compound represented by the formula: or a lactone form or a salt thereof.
  • the present invention also provides an LK LF / KLF2 gene expression promoter containing a pharmacophorase inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a LKLF / KLF2 gene expression promoter comprising a geranylgeranyltransferase I inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention also provides a LKLF / KLF2 gene expression promoter comprising darcosyltransferase as an active ingredient.
  • the present invention also provides use of a substance that inhibits mevalonate metabolism for producing an LKLF / KLF2 gene expression promoter.
  • the present invention also provides use of the compound represented by the general formula (1), a lactone form or a salt thereof for producing an LKLF / KLF2 gene expression promoter.
  • the present invention also provides use of a pharmacotransferase inhibitor for producing an LKLF / KLF2 gene expression promoter.
  • the present invention also provides a geranylgeranyl for producing an LKLF / LF2 gene expression promoter. It provides for the use of erase I inhibitors.
  • the present invention also provides use of glucosyltransferase for producing an LKLF / KLF2 gene expression promoter.
  • the present invention also provides a method for promoting LKLF / KLF2 gene expression, which comprises administering an effective amount of a substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway.
  • the present invention also provides a method for promoting LKLF / KLF2 gene expression, which comprises administering an effective amount of a compound represented by the above general formula (1), a lactone form or a salt thereof.
  • the present invention also provides a method for promoting LKLF / KLF2 gene expression, which comprises administering an effective amount of a pharmacophorase inhibitor.
  • the present invention also provides a method for promoting LKLF / KLF2 gene expression, which comprises administering an effective amount of a geranylgeranyltransferase I inhibitor. Furthermore, the present invention provides a method for promoting LKLF / KLF2 gene expression, which comprises administering an effective amount of darcosyltransferase.
  • diseases related to blood vessels such as diabetes, exertional angina, unstable angina, resting angina, myocardial infarction, atherosclerosis, vascular endothelial dysfunction, restenosis after PTCA , Irritable pneumonia, interstitial pneumonia, airway stenosis, airway obstruction, fundus bleeding (retinal vein occlusion, flying mosquitoes, etc.), cerebrovascular dementia, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, subarachnoid hemorrhage, hemorrhoids, etc. It is possible to provide a method for promoting LLF / KLF2 gene expression that is effective for relaxation. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a diagram showing the expression of the LKLF / KLF2 gene in the calcium phosphate bath.
  • FIG. 2 is a graph showing the effects of mevalonic acid and various metabolites thereof on the expression of the LKLF / KLF2 gene in calcium phosphate.
  • Figure 3 shows LKLF / KLF2 gene expression of a substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway It is.
  • FIG. 4 is a graph showing the concentration dependency of a substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway on LKLF / KLF2 gene expression.
  • the substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway used in the present invention is acetyl-CoA ⁇ acetoacetyl-CoA ⁇ HMG-CoA ⁇ mevalonic acid ⁇ mevalonyl-5-phosphate ⁇ mevalonyl-5-pyrophosphate ⁇ isopentenyl pyrophosphate ⁇ Geranylpyrophosphate ⁇ pharynesylpyrophosphate ⁇ squalene ⁇ squalene epoxide ⁇ lanosterol ⁇ (desmosterol or lasosterol) ⁇ cholesterol main pathway, as well as (isopentenylpyrophosphate or huanesylpyrophosphate) — geranyl
  • the pathway of geranyl pyrophosphate ⁇ geranylgeranylated protein group for example, Rho protein family such as RhoAB, Rapla, Rac, Cdc42, etc.
  • HMG-CoA reductase inhibitor pharmacosyltransferase inhibitor, geranylgeranyltransferase I inhibitor, and darcosyltransferase are preferred.
  • HMG-CoA reductase inhibitor particularly pitavasutin Or a salt thereof is most preferred.
  • the compound represented by the general formula (1), its lactone or a salt thereof used in the present invention is a compound known as an HMG-CoA reductase inhibitor useful as a therapeutic agent for hyperlipidemia. It is.
  • the organic group represented by R 1 in the compound represented by the general formula (1) is preferably an organic group having a ring structure which may have a substituent.
  • Examples of the organic group having a ring structure include an indolyl group, an indenyl group, a pyridyl group, a pyridyl pyrrolyl group, a pyrazolyl pyridyl group, a chenobiridyl group, a pyrimidyl group, Lazolyl group, pyrrolyl group, imidazolyl group, indolizyl group, quinolyl group, naphthyl group, hexahydronaphthyl group, cyclohexyl group, phenylsilylphenyl group, phenylenyl group or phenylfuryl group, especially hexahydronaphthyl Groups, indolyl groups, pyridyl groups, pyrimidyl groups, pyrrolyl groups and quinolyl groups are preferred.
  • Examples of the substituent which may be substituted on the organic group having a ring structure include a hydroxy group, a linear, branched or cyclic alkyl group, an alkyloxyalkyl group, an alkylcarbonyloxy group, and an alkyl substituent.
  • Examples of the alkyl group represented by R 1 include a linear, branched or cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the lactone is obtained by subjecting the corresponding compound represented by the general formula (1) to lactonization in a conventional manner, for example, under acidic conditions.
  • the compound represented by the general formula (1) and its lactone salt are physiologically acceptable salts, such as alkali metal salts such as sodium salt and potassium salt, and calcium. Salts, alkaline earth metal salts such as magnesium salts, organic amine salts such as phenethylamine salts, and ammonium salts, and the like, with sodium salts and calcium salts being more preferred.
  • the active ingredient of the method for promoting LKLF / KLF2 gene expression of the present invention includes
  • Examples of the geranylgeranyltransferase I inhibitor used in the present invention include GGTI-286, GGTI-287, GGTI-297, GGTI-298, GGTI-2133, GGTI-2147 (all manufactured by Calbiochem) and the like.
  • darcosyltransferase used in the present invention examples include TcdB (Clos tridiuw difficile Toxin B), Clostridium sordellii haemorrhagic toxin, and C 1 os iridium sordellii lethal toxin (all manufactured by Sigma).
  • the substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway of the present invention in particular, the compound (1), a lactone thereof and a salt of the compound or the lactone, or a huanesyltransferase inhibitor, a geranylgeranyltransferase I inhibitor, and a darcosyltransferase are Since it significantly promotes the expression of LKLF / KLF2 mRNA in human cells, it is useful for the method for promoting LKLF / KLF2 gene expression of the present invention, and is used for treatment of diseases involving LKLF / KLF2, particularly diseases related to blood vessels. Useful for the treatment of
  • substances that inhibit the mevalonate metabolic pathway in particular, the compound (1), a lactone thereof and a salt of the compound or the lactone, or a huanesyltransferase inhibitor, a geranylgeranyltransferase I inhibitor, and a darcosyltransferase
  • the compound (1), a lactone thereof and a salt of the compound or the lactone or a huanesyltransferase inhibitor, a geranylgeranyltransferase I inhibitor, and a darcosyltransferase
  • the substance that inhibits the mevalonate metabolic pathway in the present invention in particular, the compound (1)
  • Examples of the route of administration of the lactone form and the compound or a salt of the compound or the lactone form, or a phenylene transferase inhibitor, a geranylgeranyl transferase I inhibitor, and a darcosyl transferase include, for example, tablets, capsules, granules, and powders.
  • parenteral administration such as intravenous injection, intramuscular injection, suppository, inhalant, transdermal absorption, eye drop, nasal drop, etc., by syrup and the like.
  • the active ingredient may be used alone or in combination with other pharmaceutically acceptable excipients, binders, bulking agents, disintegrants, surfactants, Lubricants, dispersants, buffers, preservatives, flavoring agents, fragrances, coating agents, carriers, diluents and the like can be used in appropriate combination with one or more of them.
  • oral administration is particularly preferred.
  • the pH is adjusted in consideration of the stability of the active ingredient (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-6406, Japanese Patent No. 2,774,037, W ⁇ 97 No. 23200).
  • the dosage of these medicines varies depending on the patient's body weight, age, sex, symptoms, etc.
  • the active ingredient is expressed as a compound represented by the general formula (1) in a daily amount of 0.01 to L; 00 Omg, especially 0.1 to: LO Omg is preferably administered orally or parenterally in one or several divided doses.
  • Gene expression analysis method Fragmented cRNA was injected into “Human Genome Focus Arrayj (trade name, manufactured by Asymetrix), and hybridization was performed at 45 for 16 hours. After washing, phycoerythrin labeling The cells were stained with streptavidin and a biotinylated streptavidin antibody, and gene expression information was captured using a “GeneChip scanner” (trade name, manufactured by Hewlett Packard). The obtained information was analyzed by GEN ECHIP SOFTWARE (manufactured by Aifymetrix) and the expression levels were compared.
  • Figure 1 shows the measurement results.
  • Kruppel-like factor 2 (KLF2): the forward primer (TCTCTCCCACCGGGTCTACAC: SEQ ID NO: 1); the reverse prime r (GCAGACAGTACAAATTAAGGCCCTTA: SEQ ID NO: 2) and the TaciMan probe (AGAGGA TCGAGGCTTGTGATGCCTTGT: SEQ ID NO: 3).
  • Internal standard the forward primer (GCTG GAAGTACCAGGCAGTGA: SEQ ID NO: 4); the reverse primer (TCCGGTAGTGGATCTTGGC TTT: SEQ ID NO: 5) and the TaqMan probe (TCTTTCCTCTTCTCCTCCAGGGTGGCT: SEQ ID NO: 6).
  • each drug that inhibits the mevalonate metabolic pathway has a concentration-dependent promoting action on LKLF / KLF2 gene expression.

Abstract

１．本発明は、メバロン酸代謝経路を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とするLKLF/KLF2遺伝子発現促進方法に関する。

Description

明 細 書
LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤 技術分野
本発明は、 血管に関連する疾患、 例えば糖尿病、 労作狭心症、 不安定狭心症、 安静狭心症、 心筋梗塞、 粥状動脈硬化症、 血管内皮機能障害、 PTCA後の再狭窄、 過敏性肺炎、 間質性肺炎、 気道狭窄、 気道閉塞、 眼底出血 （網膜静脈閉塞症、 飛 蚊症等） 、 脳血管性痴呆、 脳梗塞、 脳出血、 くも膜下出血、 痔等の治療 ·症状緩 和に有用な、 クルツペルライクファクター 2 (lung Kruppel-l ike fac tor/KLF 2、 以下 LKLF/KLF2と略す） 遺伝子発現促進剤に関する。 背景技術
LKLF/KLF2は、 プロリン繰り返し配列、 活性部位、 核内局在シグナル、 及びジ ンクフィンガー部分の構造を有する転写調節因子蛋白質である （Kozyrev SVら FE BS Le t t. 1999 Apr 1 ; 448 (1)： 149-52) 0 LKLF/KLF2の作用としては、 血球の分化 に重要であること (Kuo CTら Genes Dev. 1997 11 (22) : 2996- 3006、 Anderson KP ら Mol. Cel l Biol. 1995 15 (11) : 5957-65) や、 血管内皮細胞と平滑筋細胞の重 要な情報伝達因子であること （Monaj emi Hら Thromb. Haemost. 2001 86 (1) : 40 4-12) 、 また、 T cel lの増殖を抑制し、 細胞の大きさや蛋白合成を抑制し、 細胞 表面の活性因子を減少させること（Buckley AFら Nat. Immunol. 2001 2 (8) : 698- 704)、 さらには血管の安定化に必須であること（Kuo CTら Genes Dev. 1997 11 (2 2) : 2996- 3006)等が知られている。
一方、 粥状動脈硬化症の初期病変は、 血流が大きく変化する血管の湾曲部や分 岐部に高発することが知られている。 その発生原因として、 血流の血管内皮に及 ぼす剪断応力 （shear s tress) が関与しているといわれているが、 最近の報告に よると、 LKLF/KLF2は shear stressにより血管内皮細胞から発現し （Dekker RJら Blood 2002 100 (5) : 1689-98) 、 粥状動脈硬化症の発生に対して抑制的に関わる ことが指摘されている (Kar in Arkenbout Eら Thromb. Haemost. 2003 89 (3) : 52 2-9) 。 このように、 血管内皮細胞から発現する LKLF/KLF2は、 血管由来の病変に 対して抑制的に作用することが推測される。
従って、 LKLF/KLF2遺伝子の発現を促進することにより、 動脈硬化症をはじめ とする、 血管に関連する疾患の症状の緩和、 あるいは治療ができることが期待さ れるが、 これまで、 LKLF/KLF2遺伝子の発現を促進する物質は、 生理的なものも 含めて全く知られていない。 発明の開示
本発明の目的は、 血管に関連する疾患、 例えば糖尿病、 労作狭心症、 不安定狭 心症、 安静狭心症、 心筋梗塞、 粥状動脈硬化症、 血管内皮機能障害、 PTCA後の再 狭窄、 過敏性肺炎、 間質性肺炎、 気道狭窄、 気道閉塞、 眼底出血 （網膜静脈閉塞 症、 飛蚊症等） 、 脳血管性痴呆、 脳梗塞、 脳出血、 くも膜下出血、 痔等の治療 · 症状緩和に有効な LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤を提供することにある。
そこで本発明者らは、 ヒ卜の培養細胞系を用いて LKLF/KLF2遺伝子発現に影響 を及ぼす物質を探索した結果、 全く意外にもメバロン酸代謝経路を阻害する物質 力 LKLF/KLF2遺伝子の発現を促進する作用を有することを見出し、 本発明を完 成した。
また、 本発明者らは上記メバロン酸代謝経路を阻害する物質の内、 HMG— C o A還元酵素阻害剤として知られている後記一般式 （1 ) で表される化合物、 そ のラクトン体又はそれらの塩、 特にピ夕バス夕チンカルシウムが、 LKLF/KLF2遺 伝子の発現を促進する作用を有することを見出した。
さらに、 本発明者らはメバロン酸代謝経路を阻害する物質の内、 FTI- 276等の フアルネシルトランスフエラーゼ阻害剤や GGT 1-286等のゲラニルゲラエルトラン スフエラーゼ I阻害剤、 あるいは TcdB { Clostridium difficile Toxin B) 等の ダルコシルトランスフエラーゼにも LKLF/KLF2遺伝子発現促進作用を有すること を見出した。
すなわち、 本発明は、 メバロン酸代謝経路を阻害する物質を有効成分とする LK LF/KLF2遺伝子発現促進剤を提供するものである。
また、 本発明は、 一般式 （1 )
OH OH
R1― X— CH— CH2CH- CH2- COOR2 ( 1 )
(式中、 R 1は有機基を示し、 Xは- CH2CH2-又は- CH=CH-を示し、 R2は水素原子又 はアルキル基示す。 ）
で表される化合物、 そのラクトン体又はそれらの塩を有効成分とする LKLF/KLF2 遺伝子発現促進剤を提供するものである。
また、 本発明は、 フアルネシルトランスフェラ一ゼ阻害剤を有効成分とする LK LF/KLF2遺伝子発現促進剤を提供するものである。
また、 本発明は、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤を有効成分と する LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤を提供するものである。
また、 本発明は、 ダルコシルトランスフェラーゼを有効成分とする LKLF/KLF2 遺伝子発現促進剤を提供するものである。
また、 本発明は、 LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのメバロン酸代謝経 を阻害する物質の使用を提供するものである。
また、 本発明は上記一般式 （1 ) で表される化合物、 そのラクトン体又はそれ らの塩の、 LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のための使用を提供するものであ る。
また、 本発明は、 LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのフアルネシルトラ ンスフェラーゼ阻害剤の使用を提供するものである。
また、 本発明は、 LKLF/ LF2遺伝子発現促進剤製造のためのゲラニルゲラニル エラーゼ I阻害剤の使用を提供するものである。
また、 本発明は、 LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのグルコシルトラン スフエラ一ゼの使用を提供するものである。
また、 本発明は、 メバロン酸代謝経路を阻害する物質の有効量を投与すること を特徴とする LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法を提供するものである。
また、 本発明は上記一般式 （1 ) で表される化合物、 そのラクトン体又はそれ らの塩の有効量を投与することを特徴とする LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法を提 供するものである。
また、 本発明は、 フアルネシルトランスフェラ一ゼ阻害剤の有効量を投与する ことを特徴とする LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法を提供するものである。
また、 本発明は、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤の有効量を投 与することを特徴とする LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法を提供するものである。 さらにまた、 本発明は、 ダルコシルトランスフェラ一ゼの有効量を投与するこ とを特徴とする LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法を提供するものである。
本発明によれば、 血管に関連する疾患、 例えば糖尿病、 労作狭心症、 不安定狭 心症、 安静狭心症、 心筋梗塞、 粥状動脈硬化症、 血管内皮機能障害、 PTCA後の再 狭窄、 過敏性肺炎、 間質性肺炎、 気道狭窄、 気道閉塞、 眼底出血 （網膜静脈閉塞 症、 飛蚊症等） 、 脳血管性痴呆、 脳梗塞、 脳出血、 くも膜下出血、 痔等の治療 · 症状緩和に有効な L LF/KLF2遺伝子発現促進方法を提供することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 ピ夕バス夕チンカルシウムの LKLF/KLF2遺伝子の発現を示す図であ る。
図 2は、 ピ夕バス夕チンカルシウムの LKLF/KLF2遺伝子発現に対するメバロン 酸及びその各種代謝物の影響を示す図である。
図 3は、 メバロン酸代謝経路を阻害する物質の LKLF/KLF2遺伝子発現を示す図 である。
図 4は、 メバロン酸代謝経路を阻害する物質の LKLF/KLF2遺伝子発現に対する 濃度依存性を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明で使用するメバロン酸代謝経路を阻害する物質とは、 ァセチル -CoA→ ァセトァセチル- CoA→ HMG-CoA→ メバロン酸 → メバロニル- 5 -リン酸 → メバロニル - 5 -ピロリン酸 → イソペンテニルピロリン酸 → ゲラニルピロリン 酸 → フアルネシルピロリン酸 → スクアレン → スクアレンエポキシド → ラ ノステロール → (デスモステロール又はラソステロール） → コレステロールの 主経路の他、 （イソペンテニルピロリン酸又はフアルネシルピロリン酸） — ゲ ラニルゲラニルピロリン酸 → ゲラニルゲラニル化タンパク質群 （例えば、 RhoA B、 Rapl a, Rac、 Cdc42等の Rhoタンパク質ファミリ一等） の経路、 及び、 フアル ネシルピロリン酸 → フアルネシル化タンパク質群 （例えば、 Ras、 RhoB等） の 経路を含む、 メバロン酸代謝に関わるあらゆる代謝経路を阻害する物質が含まれ る。 このうち、 HMG— C o A還元酵素阻害剤、 フアルネシルトランスフェラー ゼ阻害剤、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤、 ダルコシルトランス フェラーゼが好ましく、 中でも HM G— C o A還元酵素阻害剤、 特にピタバス夕 チンまたはその塩が最も好ましい。
本発明で使用する一般式 （1 ) で表される化合物、 そのラクトン体又はそれら の塩は、 高脂血症治療薬として有用な HM G— C o A還元酵素阻害剤として知ら れている化合物である。
一般式 （1 ) で表される化合物の R 1で示される有機基は、 置換基を有してい てもよい環構造を有する有機基が好ましい。
環構造を有する有機基としては、 インドリル基、 インデニル基、 ピリジル基、 ピロ口ピリジル基、 ピラゾ口ピリジル基、 チェノビリジル基、 ピリミジル基、 ピ ラゾリル基、 ピロリル基、 イミダゾリル基、 インドリジル基、 キノリル基、 ナフ チル基、 へキサヒドロナフチル基、 シクロへキシル基、 フエニルシリルフエニル 基、 フエニルチェニル基又はフエニルフリル基が挙げられ、 特にへキサヒドロナ フチル基、 インドリル基、 ピリジル基、 ピリミジル基、 ピロリル基又はキノリル 基が好ましい。
これらの環構造を有する有機基に置換していてもよい置換基としては、 ヒドロ キシ基、 直鎖、 分岐鎖又は環状のアルキル基、 アルキルォキシアルキル基、 アル キルカルボニルォキシ基、 アルキル置換アミノ基、 置換アルキルスルホニルアミ ノ基、 置換フエニルスルホニルァミノ基、 アルキル、 フエニル等が 1個又は 2個 置換していてもよい力ルバモイル基、 ハロフエニル基、 アルキルフエニル基、 ァ ルコキシフエニル基、 フエニル基、 ォキソ基等が挙げられる。
これらの環構造を有する有機基に置換してもよい置換基のうち、 炭素数 1〜6 の直鎖、 分岐鎖又は環状アルキル基、 炭素数 2〜 7のアルキルォキシアルキル 基、 炭素数 1〜4のァシルォキシ基、 炭素数 1〜4のアルキル置換アミノ基、 炭 素数 1〜 4のアルキル置換炭素数 1〜 4のアルキルスルホニルァミノ基、 炭素数 1〜4のアルキル置換フエニルスルホニルァミノ基、 炭素数 1〜4のアルキル置 換カルバモイル基、 フエニル置換力ルバモイル基、 フルオロフェニル基、 ブロモ フエニル基、 ョードフエニル基、 メチルフエニル基、 ェチルフエニル基、 メトキ シフエ二ル基、 エトキシフエニル基又はフエニル基が好ましく、 特にイソプロピ ル基、 シクロプロピル基又は p—フルオロフェニル基が好ましい。
R 1で示されるアルキル基としては、 炭素数 1〜6の直鎖、 分岐鎖又は環状ァ ルキル基が挙げられる。
ラクトン体は、 対応する一般式 （1 ) で表される化合物を、 常法、 例えば酸性 条件下にラクトン化することにより得られる。
一般式 （1 ) で表される化合物及びそのラクトン体の塩は、 生理学的に許容し 得る塩であって、 ナトリウム塩、 カリウム塩等のアルカリ金属塩、 カルシウム 塩、 マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、 フエネチルァミン塩等の有機アミ ン塩又はアンモニゥム塩等が挙げられるが、 ナトリウム塩、 カルシウム塩がより 好ましい。
これらの化合物は、 例えば米国特許第 4， 739, 073号及びヨーロッパ特 許出願公開第 1 14， 027号； ヨーロッパ特許出願公開第 367， 895号； 米国特許第 5， 001, 255号、 第 4, 613， 610号、 第 4， 851, 4 27号、 第 4， 755, 606号、 第 4， 808, 607号、 第 4， 751, 2 35号、 第 4， 939， 1 59号、 第 4， 822, 799号、 第 4， 804， 6 79号、 第 4， 876, 280号、 第 4, 829, 08 1号、 第 4， 927, 8 51号、 第 4， 588, 7 15号；及び F. G. athawala, Medical Research Re views, 11， 121-146 (1991) 、 ヨーロッパ特許出願公開第 304, 063号； ョ 一口ッパ特許出願公開第 330, 057号、 米国特許第 5, 026, 708号、 第 4， 868， 185号； ヨーロッパ特許出願公開第 324， 347号； ョ一口 ッパ特許出願公開第 300， 278号；米国特許第 5, 0 1 3, 749号、 第 5, 872, 130号、 第 5， 856, 336号、 米国特許第 4, 23 1， 93 8号、 米国特許第 4， 444， 784号、 米国特許第 4， 346, 227号、 米 国特許第 5， 354, 772号、 米国特許第 5 , 273, 995号、 米国特許第 5, 177, 080号、 米国特許第 3， 983, 140号、 日本国特許第 2， 6 48， 897号、 米国特許第 5， 260, 440号、 Bioorganic & Medicinal C hemistry, 5， 437, (1977)、 日本国特許第 2， 569, 746号、 ヨーロッパ特 許第 304, 063号、 米国特許第 5， 856, 336号等に記載されている。 本発明の LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法の有効成分としては、 口バス夕チン
(米国特許第 4, 231, 938号： （+ ) - (I S, 3 R, 7 S, 8 S， 8 a R) — 1， 2, 3, 7， 8， 8 a—へキサヒドロ— 3， 7—ジメチルー 8—
[2 - [ (2R, 4R) —テトラヒドロ一 4—ヒドロキシー 6—ォキソ一 2 H— ピラン _ 2 _ィル] ェチル] — 1—ナフチル （S) — 2—メチルブチレ一 ト） 、 シンバス夕チン （米国特許第 4, 444, 784号： （+ ) _ (1 S, 3R, 7 S, 8 S, 8 a R) — 1, 2, 3， 7, 8， 8 a—へキサヒドロ一 3, 7—ジメチル一 8— [2 - [ (2R, 4R) —テトラヒドロ一 4—ヒドロキシー 6—ォキソ一 2H—ピラン— 2—ィル] ェチル] 一 1—ナフチル 2, 2—ジメ チルブ夕ノエート） 、 プラバス夕チン （米国特許第 4, 346, 22 7号：
(+ ) - (3 R, 5 R) -3, 5—ジヒドロキシ一 7— [ (1 S, 2 S, 6 S, 8 S, 8 aR) — 6—ヒドロキシー 2—メチルー 8— [ (S) —2—メチルプチ リルォキシ] — 1, 2, 6, 7, 8, 8 a—へキサヒドロー 1—ナフチル] ヘプ タン酸） 、 フルバス夕チン （米国特許第 5， 354， 772号： （3RS， 5 SR, 6 E) - 7 - [3— (4—フルオロフェニル） — 1— (1—メチルェチ ル） - 1 H一^ f ンドール— 2—ィル] — 3, 5—ジヒドロキシ— 6 _ヘプテン 酸） 、 アトルバス夕チン （米国特許第 5, 273, 995号： （3R， 5 R) - 7 - [2 - (4—フルオロフェニル） 一 5 Γソプロピル— 3—フエ二ルー 4 —フエ二ルカルバモイル— 1 H—ピロル— 1—ィル] —3， 5—ジヒドロキシへ ブタン酸） 、 セリバス夕チン （米国特許第 5， 1 77, 080号： （3 R， 5 S) —エリス口一 （E) - 7 - [4— (4—フルオロフェニル） 一 2, 6—ジィ ソプロピル一 5—メトキシメチルーピリジン— 3 Γル] —3, 5—ジヒドロキ シ _ 6 _ヘプテン酸） 、 メバス夕チン （米国特許第 3， 983, 140号：
(+ ) - (1 S， 3 R, 7 S, 8 S， 8 aR) — 1， 2， 3， 7, 8, 8 a—へ キサヒドロ一 7 _メチル一 8— [2 - [ (2 R, 4R) —テトラヒドロ一 4—ヒ ドロキシ— 6—ォキソ一 2H—ピラン— 2—ィル] ェチル] 一 1—ナフチル
(S) _ 2 _メチルプチレート） 、 ロスバス夕チン （米国特許第 5, 260, 4 40号、 日本国特許第 2， 648, 897号： 7— [4— （4—フルオロフェニ ル） 一 6—イソプロピル _ 2— （N—メチル _N_メタンスルホニルァミノピリミ ジン） _ 5—ィル] ― (3R, 5S) —ジヒドロキシ— （E) — 6—ヘプテン 酸） 、 ピ夕バス夕チン （米国特許第 5, 856, 336号、 日本国特許第 2, 5 69， 746号： （3 R, 5 S, 6 E) — 7— [ 2—シクロプロピル一 4— (4一フルオロフェニル） _ 3—キノリル] 一 3, 5—ジヒドロキシ _ 6—ヘプ テン酸、 又はそれらの塩等が好ましく、 特にピタバス夕チン又はその塩が好まし い。
本発明で使用するフアルネシルトランスフェラーゼ阻害剤としては、 FTI - 27 6、 FTI-277, FPT Inhibitor I、 FPT Inhibitor II、 FPT Inhibitor III、 FTase Inhibitor I、 FTase Inhibitor II、 FTase Inhibitor III、 FTase Inhibitor IV
(いずれも Ca 1 b i ochem社製） 等が挙げられる。
また、 本発明で使用するゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤として は、 GGTI-286, GGTI-287, GGTI- 297、 GGTI- 298、 GGTI-2133, GGTI-2147 (いずれ も Calbiochem社製） 等が挙げられる。
また、 本発明で使用するダルコシルトランスフェラ一ゼとしては、 TcdB {Clos tridiuw difficile Toxin B) 、 Clostridium sordellii haemorrhagic toxin, C 1 os iridium sordellii lethal toxin (いずれも Sigma 社製） 等が挙げられる。 本発明のメバロン酸代謝経路を阻害する物質、 中でも前記化合物 （1) 、 その ラクトン体及び該化合物又はラクトン体の塩、 あるいはフアルネシルトランスフ エラーゼ阻害剤、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤及びダルコシル トランスフェラーゼ等は、 ヒト細胞において LKLF/KLF2の mRNAの発現を有意 に促進するので、 本発明の LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法に有用であり、 LKLF/KL F2が関与する疾患の処置、 特に血管に関連する疾患の処置に有用である。
またメバロン酸代謝経路を阻害する物質、 中でも前記化合物 （1) 、 そのラク トン体及び該化合物又はラクトン体の塩、 あるいはフアルネシルトランスフェラ —ゼ阻害剤、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤及びダルコシルトラ ンスフェラーゼ等を用いれば、 LKLF/KLF2が関与する実験系の開発、 新規な医薬 のスクリーニング等が可能となる。
本発明におけるメバロン酸代謝経路を阻害する物質、 中でも前記化合物 (1) 、 そのラクトン体及び該化合物又はラクトン体の塩、 あるいはフアルネシ ルトランスフェラーゼ阻害剤、 ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ I阻害剤及 びダルコシルトランスフェラーゼ等の投与経路としては、 例えば錠剤、 カプセル 剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤等による経口投与又は静脈内注射剤、 筋肉内注射 剤、 坐剤、 吸入剤、 経皮吸収剤、 点眼剤、 点鼻剤等による非経口投与が挙げられ る。
またこのような種々の剤型の医薬製剤を調製するには、 この有効成分を単独 で、 又は他の薬学的に許容される賦形剤、 結合剤、 増量剤、 崩壊剤、 界面活性 剤、 滑沢剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 嬌味剤、 香料、 被膜剤、 担体、 希釈剤等 を 1種又はそれ以上と適宜組み合わせて用いることができる。
これらの投与経路のうち、 経口投与が特に好ましい。
例えば前記化合物 （1) の経口投与用製剤の調製にあたっては、 有効成分の安 定性を考慮して pHを調整 （特開平 2— 6406号、 日本国特許第 2， 774, 0 37号、 W〇97ノ 23200号等） するのが好ましい。
これらの医薬の投与量は、 患者の体重、 年齢、 性別、 症状等によって異なる が、 通常成人の場合、 有効成分を一般式 （1) で表される化合物として、 一日 0. 01〜； L 00 Omg、 特に 0. 1〜： L O Omgを、 1回又は数回に分けて経口投 与又は非経口投与するのが好ましい。 実施例
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定され るものではない。
実施例 1
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) を 3 X 105 eel Is/ 10 cm dishに 蒔いた 2日後に、 ピ夕バス夕チンカルシウム （図中 Pitと表示） を 1. 1 zmol/L になるように添加した。 コントロールには、 ピ夕バス夕チンカルシウムの溶媒で あるジメチルスルホキシド （終濃度 0. 0066v/v%) を添加した。 添加後 8 時間後に、 「I S〇GEN」 （商標名、 日本ジーン社製） を用いて全 RNAを抽 出した。 以下の操作は、 Asymetrix社の使用手順書に従った。 すなわち、 得られ た全 RNAより常法に従い、 mRNAを精製し、 これを元に c D N Aを合成し た。 さらに in vitro転写によりピオチン標識 c RNAを合成し、 精製した後、 熱 処理により断片化し、 遺伝子発現解析に用いるための断片化 c RNAを調整し た。
遺伝子発現解析方法：断片化 c RNAを、 「Human Genome Focus Arrayj (商 標名、 Asymetrix社製） に注入し、 45で、 16時間ハイブリダィゼーシヨンを 行った。 洗浄後、 フィコエリスリン標識したストレプトアビジン及びピオチン化 ストレプトアビジン抗体による染色を施し、 「GeneChip 用スキャナー」 （商標 名、 Hewlett Packard製） にて遺伝子発現情報を取り込んだ。 得られた情報は GEN ECHIP SOFTWARE (Aifymetrix社製) にて解析し、 発現量を比較した。
測定結果を図 1に示す。
HUVECにおいて、 サンプル添加 8時間後の LKLF/KLF2遺伝子の発現は、 コ ントロールでは発現量で 271であるのに対し、 ピ夕バス夕チンカルシウム添加群 では 761と有意に促進された。 また、 このピ夕バス夕チンカルシウム添加の効果 は、 ゲラニルゲラニルピロリン酸 （GGPP) IO Mの添加によって 355まで減少し た。 従って、 その作用機序として Rho因子ファミリ一が関与していることが示唆 された。
実施例 2
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) を 6 X 104 cells/6 well plate に蒔いた 4日後に、 ピ夕バス夕チンカルシウム （1 mol /し 図中 Pitと表示） 及 び、 メバロン酸 （lOO^mol/し 図中 MVAと表示） 、 フアルネシルピロリン酸 （10 mol/L, 図中 FPPと表示） 、 ゲラニルゲラニルピロリン酸 （lO mol /し 図中 GGP Ρと表示） またはコレステロール （10/ mol/し 図中 Choと表示） のメバロン酸及 びその各種代謝物を添加した。 なおコントロールとして、 薬物無添加群 （終濃度
0.1%の DMSO) を、 対照群としてピ夕バス夕チンカルシウム （l mol/L) 単 独添加群も用意した。 各薬物添加 8時間後に 「I SOGEN」 （商標名、 日本ジ ーン社製） を用いて全 RNAを抽出した。 得られた全 RNAから逆転写酵素を用 いて DNAを合成し、 以下のプライマーを用いて AM PRISM 7000 Sequence Detecti on System (Applied Biosystems)で測定した。 Kruppel-like factor 2 (KLF2)： the forward primer (TCTCTCCCACCGGGTCTACAC:配列番号 1 ) ； the reverse prime r (GCAGACAGTACAAATTAAGGCCCTTA：配列番号 2 ) and the TaciMan probe (AGAGGA TCGAGGCTTGTGATGCCTTGT：配列番号 3) 。 内部標準： the forward primer (GCTG GAAGTACCAGGCAGTGA：配列番号 4) ； the reverse primer (TCCGGTAGTGGATCTTGGC TTT：配列番号 5) and the TaqMan probe (TCTTTCCTCTTCTCCTCCAGGGTGGCT：配 列番号 6) 。
結果を図 2に示す。 ピタバス夕チンカルシウム単独添加群では、 対薬物無添加 群比 693 %の LKLF/KLF2遺伝子発現の増加が見られた。 この増加は、 メバロン 酸、 フアルネシルピロリン酸、 ゲラニルゲラニルピロリン酸の添加により、 減少 したが、 コレステロールには影響されなかった。 従って、 ピ夕バス夕チンカルシ ゥムによる LKLF/KLF2遺伝子発現の促進は、 メバロン酸代謝経路の中でも、 最終 産物であるコレステロール以外の中間産物により減少することが判明した。
実施例 3
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) を 6 X 104 cells/6 well plate に蒔いた 4日後に、 ピ夕パスタチンカルシウム （l Diol /し 図中 Pitと表示） 、 FTI-276 (10 1 /し 図中 FTIと表示） 、 GGTI- 286 (10/ mol/L、 図中 GGTIと表 示） 、 Clostridium difficile (5 Ong/mK 図中 TcdBと表示） の各薬 物、 及びコントロールとして DMSO (終濃度 0.1%) を添加した。 添加 24時間 後に 「I S〇GEN」 （商標名、 日本ジーン社製） を用いて全 RNAを抽出し た。 測定は実施例 2と同様に行った。 結果を図 3に示す。 メバロン酸代謝経路を阻害する各薬物は LKLF/KLF2遺伝子 発現に対し、 いずれもコントロール比 544 %〜 2157%と強い発現促進作用 を示した。
実施例 4
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞 （HUVEC) を 6 X 104 cells/6 well plate に蒔いた 4日後に、 ピ夕バス夕チンカルシウム （0.1， 1, 10 mol/L 図中 Pitと 表示） 、 FTI-276 (0.1， 1， lO^mol/L 図中 FTIと表示） 、 GGTI-286 (0.1， 1, 1 O/imol/L, 図中 GGTIと表示） の各薬物、 及びコントロールとして DM S O (終濃 度 0.1%) を添加した。 添加 8時間後及び 24時間後に 「I SOGEN」 （商標名、 日本ジーン社製） を用いて全 RNAを抽出した。 測定は実施例 2と同様に行つ た。
図 4に示すごとく、 メバロン酸代謝経路を阻害する各薬物は LKLF/KLF2遺伝子 発現に対し、 いずれも濃度依存的な促進作用があることが判明した。

Claims

請求の範囲
1 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質を有効成分とする LKLF/KLF2遺伝子発現 促進剤。
2 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質が次の一般式 （1 )
OH OH
R 1—X— CH— CH2CH— CH2- COOR2 V上 )
(式中、 R 1は有機基を示し、 Xは- CH2CH2-又は- CH=CH-を示し、 R2は水素原子又 はアルキル基示す）
で表される化合物、 そのラクトン体又はそれらの塩である請求項 1記載の LKLF/K LF2遺伝子発現促進剤。
3 . R 1が、 置換基を有していてもよいインドリル基、 インデニル基、 ピリジ ル基、 ピロ口ピリジル基、 ピラゾ口ピリジル基、 チェノビリジル基、 ピリミジル 基、 ピラゾリル基、 ピロリル基、 イミダゾリル基、 インドリジル基、 キノリル 基、 ナフチル基、 へキサヒドロナフチル基、 シクロへキシル基、 フエニルシリル フエニル基、 フエニルチェニル基又はフエニルフリル基である請求項 2記載の LF/KLF2遺伝子発現促進剤。
4 . 有効成分が、 口バス夕チン、 プラバス夕チン、 シンバス夕チン、 フルバス 夕チン、 セリバス夕チン、 アトルバス夕チン、 ロスバス夕チン、 メバス夕チン、 ピ夕バス夕チン又はそれらの塩である請求項 2記載の LKLF/KLF2遺伝子発現促進 剤。
5 . 有効成分が、 ピ夕バス夕チン又はその塩である請求項 2記載の LKLF/KLF2 遺伝子発現促進剤。
6 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質がフアルネシルトランスフェラーゼ阻 害剤である請求項 1記載の LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤。
7 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質がゲラニルゲラニルトランスフェラ ーゼ I阻害剤である請求項 1記載の LKLF/KLF2遗伝子発現促進剤。
8 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質がダルコシルトランスフエラ一ゼであ る請求項 1記載の LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤。
9 . LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのメバロン酸代謝経路を阻害する 物質の使用。
1 0 . 一般式 （ 1 )
OH OH
R1― X— CH— CH2CH- CH2- COOR2 ( 1 )
(式中、 R 1は有機基を示し、 Xは- CH2CH2-又は- CH=CH-を示し、 R2は水素原子又 はアルキル基示す）
で表される化合物、 そのラクトン体又はそれらの塩の LKLF/KLF2遺伝子発現促進 剤製造のための使用。
1 1 . R 1が、 置換基を有していてもよいインドリル基、 インデニル基、 ピリ ジル基、 ピロ口ピリジル基、 ピラゾ口ピリジル基、 チェノビリジル基、 ピリミジ ル基、 ピラゾリル基、 ピロリル基、 イミダゾリル基、 インドリジル基、 キノリル 基、 ナフチル基、 へキサヒドロナフチル基、 シクロへキシル基、 フエニルシリル フエニル基、 フエニルチェニル基又はフエニルフリル基である請求項 1 0記載の 使用。
1 2 . 有効成分が、 口バス夕チン、 プラバス夕チン、 シンバス夕チン、 フルバ ス夕チン、 セリバスタチン、 アトルバス夕チン、 ロスバス夕チン、 メバス夕チ ン、 ピ夕バス夕チン又はそれらの塩である請求項 1 0記載の使用。
1 3 . 有効成分が、 ピ夕バス夕チン又はその塩である請求項 1 0記載の使用。
1 4 . LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのフアルネシルトランスフェラ ーゼ阻害剤の使用。
1 5 . LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのゲラニルゲラニルトランスフ エラーゼ I阻害剤の使用。
1 6 . LKLF/KLF2遺伝子発現促進剤製造のためのグルコシルトランスフェラー ゼの使用。
1 7 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とす る LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法。
1 8 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質が次の一般式 （1 )
OH OH
R1― X— CH— CH2CH— CH2- COOR2 ( 1 )
(式中、 R 1は有機基を示し、 Xは- C¾CH「又は- CH=CH-を示し、 R 2は水素原子又 はアルキル基示す）
で表される化合物、 そのラクトン体又はそれらの塩である請求項 1 7記載の LKLF /KLF2遺伝子発現促進方法。
1 9 . R 1が、 置換基を有していてもよいインドリル基、 インデニル基、 ピリ ジル基、 ピロ口ピリジル基、 ピラゾ口ピリジル基、 チェノビリジル基、 ピリミジ ル基、 ピラゾリル基、 ピロリル基、 イミダゾリル基、 インドリジル基、 キノリル 基、 ナフチル基、 へキサヒドロナフチル基、 シクロへキシル基、 フエニル.シリル フエニル基、 フエニルチェニル基又はフエニルフリル基である請求項 1 8記載の 方法。
2 0 . 有効成分が、 口バス夕チン、 プラバス夕チン、 シンバス夕チン、 フルバ ス夕チン、 セリバス夕チン、 アトルバス夕チン、 ロスバス夕チン、 メバス夕チ ン、 ピ夕バス夕チン又はそれらの塩である請求項 1 8記載の方法。
2 1 . 有効成分が、 ピ夕バス夕チン又はその塩である請求項 1 8記載の方法。
2 2 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質がフアルネシルトランスフェラーゼ 阻害剤である請求項 1 7記載の LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法。
2 3 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質がゲラニルゲラニルトランスフエ ラーゼ I阻害剤である請求項 1 7記載の LKLF/KLF2遺伝子発現促進方法。
2 4 . メバロン酸代謝経路を阻害する物質がダルコシルトランスフエラーゼで ある請求項 1 7記載の LKLF/KLF2遗伝子発現促進方法。
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