WO2004087082A1 - 発毛促進剤組成物 - Google Patents

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WO2004087082A1
WO2004087082A1 PCT/JP2003/003985 JP0303985W WO2004087082A1 WO 2004087082 A1 WO2004087082 A1 WO 2004087082A1 JP 0303985 W JP0303985 W JP 0303985W WO 2004087082 A1 WO2004087082 A1 WO 2004087082A1
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WO
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hair growth
csf
cells
hair
promoter
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Application number
PCT/JP2003/003985
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Kokai
Original Assignee
Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd.
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Publication date
Application filed by Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd. filed Critical Hokkaido Technology Licensing Office Co., Ltd.
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Priority to PCT/JP2003/003985 priority patent/WO2004087082A1/ja
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/64—Proteins; Peptides; Derivatives or degradation products thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q7/00—Preparations for affecting hair growth

Definitions

  • the present invention relates to a hair growth promoter, and more particularly, to a hair growth promoter having a safe and excellent hair growth effect.
  • Alopecia is broadly divided into two types: alopecia areata due to genetic background and male hormones, and alopecia areata, a self-immune disease. These alopecia are diseases caused by the above-mentioned abnormalities in the hair cycle, and if the hair cycle can be made normal, any of these can be expected to develop hair. Is used for the prevention and treatment of alopecia symptoms.
  • the active ingredient of a hair growth and hair growth agent is to enhance the metabolic function of hair follicles and hair bulbs by improving blood circulation in the scalp and improving skin functions. Ingredients that can be used or that maintain scalp physiology normally by preventing dandruff and itching, providing nutrition, and moisturizing are used.
  • the above-mentioned therapeutic agents may be effective.However, if the symptoms are severe or the lesions are large, the above-mentioned therapeutic agents may be effective. At present, it cannot be expected, and research and development on more effective hair growth agents are being conducted.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-125542 discloses a hair growth promoter characterized by containing interferon as an active ingredient. According to the hair growth promoter disclosed in this publication, the effect of promoting hair growth is recognized. However, it was necessary to use a high concentration of interferon in order to exert the hair growth promoting effect, and there was a problem in terms of side effects.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-520202 discloses a method of inducing animal hair growth, which comprises treating an animal with a Hesizihog-like therapeutic drug. According to the method disclosed in this publication, it is possible to induce hair growth in animals, but hedgehog-like proteins have carcinogenic properties and are safe as hair growth agents. But it is 7
  • an object of the present invention is to provide a hair growth agent that is safe and has an excellent hair growth promoting effect. Disclosure of the invention The present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, have found that granulocyte colony stimulating factor is a site force receptor that selectively acts on hematopoietic cells and promotes neutrophil differentiation and proliferation. Have been found to have a hair growth promoting effect, and have completed the present invention.
  • the present invention has been made based on the above-mentioned findings, and provides a hair growth promoting composition containing a granulocyte clonal stimulating factor.
  • the granulocyte colony stimulating factor contained in the hair growth promoting composition of the present invention may be a recombinant granulocyte colony stimulating factor.
  • the hair growth promoter composition of the present invention is preferably a sustained-release preparation. Further, the sustained release preparation is preferably formulated so as to release granulocyte colony stimulating factor for at least 7 days, and may be a medical pump.
  • the present invention also provides a cosmetic composition containing the above-mentioned hair growth promoter composition.
  • the present invention provides a hair growth promoting composition characterized by containing a granulocyte colony stimulating factor gene.
  • the present invention also provides a method for promoting hair growth, comprising using the above-mentioned hair growth promoter composition or the above-mentioned cosmetic.
  • FIG. 1 shows the results of testing the hair growth promoting effect of hG—CSF.
  • FIG. 2 shows the results of testing the hair growth promoting effect of hG_CSF.
  • FIG. 3 shows the results of testing the hair growth promoting effect of hG_CSF.
  • the hair growth promoting composition of the present invention contains granulocyte colony stimulating factor (hereinafter, also referred to as “G-CSF” in the present specification).
  • G-CSF contained in the hair growth-promoting composition of the present invention is defined as a sitekine that selectively acts on hematopoietic cells and promotes neutrophil differentiation and proliferation. Any polypeptide that has G-CSF activity may be included, such as those extracted, separated, and purified from natural products (such as human biological samples), and cultured G-CSF-producing cells.
  • any one having at least a certain degree of homology with any of the aforementioned G-CSFs can be used.
  • This homology is preferably at least 30%, and more preferably at least 50%.
  • a recombinant G-CSF may be used.
  • G-CSF is prepared using gene recombination technology
  • an appropriate DNA portion is prepared based on the information of the gene encoding G-CSF, for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. It can be used as a PCR primer, for example, by performing RT-PCR primer reaction.
  • PCR primer for example, by performing RT-PCR primer reaction.
  • the G-CSF gene used in the present invention is not limited to the one represented by SEQ ID NO: 1, but may have a modification or the like that does not impair the activity.
  • the DNA represented by SEQ ID NO: 1 by expressing (i) DNA that hybridizes with the DNA represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions, or (ii) expression of the DNA represented by SEQ ID NO: 1
  • any DNA that can exhibit G-CSF activity can be used in the present invention.
  • the DNA of the above (i) can be obtained by a normal hybridization method, and the DNA of the above (ii) can be obtained by introducing a mutation into the DNA of the above (i).
  • a method for introducing a mutation into DNA for example, a known method such as the Kunkel method and the Gapped duple method or a method analogous thereto can be employed.
  • mutations can be introduced using a mutagenesis kit (Mutant-K (TAKARA) or Mutant-G (TAKARA)) using site-directed mutagenesis. .
  • Examples of the “stringent conditions” include the conditions for hybridization described in the above-mentioned olecular Cloning. Specifically, DIG DNA Labeling (Roche Diagnostics) If the probe is labeled with a DIG Easy Hyb solution (Roche Diagnostics) at 32 ° C, the probe is Southern blotting at 0 ° C in O.lxSSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) under conditions (IxSSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate) It refers to the conditions under which hybridization to the above DNA probe occurs during hybridization.
  • the G-CSF used in the present invention is prepared by preparing a recombinant vector containing the above DNA by a method known in the art, transforming the obtained recombinant vector into a host cell, The transformant is cultured to produce and accumulate G-CSF, and the protein is harvested for production. Can be. After culturing, the accumulation of the protein means not only the culture supernatant, but also any of the cultured cells or the cultured cells or the cells or the disrupted cells.
  • the method of culturing the transformant is not particularly limited, and may be a usual method used in culturing a host.
  • the vector to be used is not particularly limited as long as it can be replicated in a host, and examples thereof include plasmid DNA and phage DNA. This is carried out by cutting out a DNA fragment containing the DNA represented by SEQ ID NO: 1 and ligating the DNA fragment downstream of the promoter in an appropriate expression vector.
  • the vector include a plasmid derived from Escherichia coli (eg, pBR322, pBR325, pUC18, pUC19, pUC118 or pBuescript).
  • Bacillus subtilis-derived plasmid eg, pUB110, pTP5 or pC194
  • yeast-derived plasmid eg, pSH19, pSH15, YEp13 or Bacteriophages such as YCp50
  • bacteriophages such as ⁇ phage
  • animal viruses / residues such as retrodinores, Vxinazinores or Bacchus virus
  • the promoter used in the present invention may be any promoter that is appropriate for the host used for gene expression. For example, when the host is Escherichia coli, the trp promoter and the 1 ac promoter are used. Mouth monitor, rec A promoter, promoter, 1 PP monitor, T7 promoter,
  • the T3 promoter, the araBAD promoter, etc. may be the SP01 promoter, the penP promoter, the XYL promoter,
  • the host is Bacillus subtilis, such as the HWP promoter, CWP promoter, etc., the SPOL promoter, the SP02 promoter, the pen P promoter, etc., and if the host is yeast, the PHO5 promoter, etc. Mouth motors, PGK promoters, GAP promoters, ADH promoters, etc. are preferred.
  • a polyhedrin promoter, an OplE2 promoter and the like are preferable.
  • expression vectors include, if desired, an enhancer, a splicing signal, a poly-A addition signal, a selection primer, an SV40 replication origin (hereinafter referred to as SV40 ori) known in the art. Etc.) may be added.
  • the protein encoded by the DNA of the present invention can be expressed as a fusion protein with another protein (eg, daltathione S transferase and protein A). .
  • a fusion protein can be cleaved using a site-specific protease and separated into the respective proteins.
  • Escherichia coli for example, Escherichia coli, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Specific examples of the genus Escherichia include Escherichia coli K1 2 'DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 16 (19) 6 8)), JM 103 (Nucleic Acids Research, Vol. 9, 309 (19981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, Vol. 120, 510 (197) 8))), HB101 (Journal of Molecular Biology, Vol. 41, 45 (1969)), DH5a and JM109 are used.
  • Bacillus subtilis include, for example, / Chinoles' Bacillus subtilis MI 11 4 (Gene, 24, 25 5 (1983)), 20 7-21 [journal of Biochemistry, Vol. 95, 87 (19894)] and Bacillus previs.
  • yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, and Shizosaccharomyces Bomb (Schizosaccaromyces pombe) NCYC 1 9 1 3, NCYC 2 0 3 6.
  • Pichia pastoris and Hansenula polymorpha are used.
  • animal cells examples include monkey cell COS — 7, Vero, Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), and dhfr gene-deficient Chinese hamster single cell CHO (hereinafter CHO (dhfr-) cell). Abbreviations), mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, HEK293 cells, and the like.
  • Transformation of the above-described host cells can be performed according to a method known in the art.
  • the following literature describes a method for transforming a host cell. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 211 (1972); Gene, 17, 107 (1982); Molecular & General Genetics, 168 , 11 1 (1977); Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991); Proc. Natl. Acad Sci. USA), 75, 19 2 9 (1978); Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 26 3-26 7 (1995) (published by Shujunsha); and ⁇ Virology, 52 2, 4. 5 6 (1 9 7 3).
  • the method of introducing the recombinant vector into a bacterium such as Escherichia coli is not particularly limited as long as it can introduce DNA into the bacterium.
  • a method using a potassium ion can be used. Et al .: Proc. Atl. Acad. Sci., USA, 69: 2110 (1972), and the electroporation method.
  • the method of introducing the recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it can introduce DNA into yeast, and examples thereof include an electoral poration method, a spheroplast method, and the like.
  • the lithium acetate method and the like can be mentioned.
  • the method is not particularly limited as long as the method can introduce DNA into animal cells, and examples thereof include an electroporation method, a calcium phosphate method, and a reboaction method.
  • the method of introducing the recombinant vector into the insect cell is not particularly limited as long as it can introduce DNA into the insect cell.
  • the calcium phosphate method examples include the lipofection method and the electroporation method.
  • a PCR method for example, a Southern hybridization method, a Northern hybridization method, or the like can be used.
  • DNA is prepared from a transformant, a DNA-specific primer is designed, and PCR is performed. The PCR is performed under the same conditions as those used for preparing the plasmid.
  • the amplified product is subjected to agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, or capillary electrophoresis, and stained with bromide solution, SYBR Green solution, and the like. It can be detected as a band and the transformation can be confirmed.
  • PCR may be performed using a primer that has been labeled with a fluorescent dye or the like in advance to detect the amplification product. Furthermore, a method can be used in which the amplified product is bound to a solid phase such as microplate, and then the amplified product is confirmed using fluorescence or an enzyme reaction.
  • G-CSF used in the hair growth promoter composition of the present invention can be produced by culturing the transformant, producing and accumulating G-CSF, and collecting the protein. .
  • the accumulation of G-CSF means not only culture supernatant but also cultured cells or cultured cells or cells or crushed cells.
  • the method for culturing the transformant is not particularly limited, and may be a conventional method used for culturing a host. ⁇
  • the culture medium for culturing the transformant contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the microorganism to efficiently culture the transformant.
  • a carbon source include carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose, and starch; organic acids such as acetic acid and propionic acid; and alcohols such as ethanol and pro% ethanol.
  • the nitrogen source examples include ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, and other inorganic or organic acid ammonium salts, and other nitrogen-containing compounds, as well as peptone and meat kiss. And corn steep liquor.
  • Inorganic substances include lithium phosphate, potassium sulfate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, Calcium carbonate and the like.
  • the cultivation is usually carried out under aerobic conditions such as osmotic culturing or aeration and stirring culturing.
  • the culturing is performed at a temperature of about 15 to 43 ° C for about 12 to 48 hours.
  • the reaction is carried out at a temperature of about 30 to 40 ° C for about 12 to 100 hours.
  • the host is yeast, the reaction is carried out at a temperature of about 20 to 35 a C for about 24 to 100 hours.
  • ventilation and stirring can be added as needed.
  • the pH needs to be adjusted, use an inorganic or organic acid, an alkaline solution or the like.
  • a commonly used RPMI164 medium, DMEM medium, or fetal bovine serum can be added to these mediums. And the like.
  • Culture is Preferably, it is performed in the presence of about 5% of carbon dioxide at a temperature of about 37 C for 1 to 30 days.
  • G-CSF is produced in the cells or cells after the culture, the cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and then mixed with ultrasonic waves, lysozyme and After disrupting the cells or cells by freeze-thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the protein by centrifugation or filtration may be used.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 (registered trademark). If G-CSF is secreted into the culture solution, after the culture is completed, the supernatant is separated from the cells or cells by a known method, and the supernatant is collected.
  • the protein contained in the culture supernatant or extract obtained in this way can be purified by appropriately combining known separation and purification methods. That is, the target protein can be produced by using, for example, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography or the like alone or in an appropriate combination. It is out.
  • the G-CSF thus obtained can be converted to a salt by a known method or a method analogous thereto.
  • a known method or a method analogous thereto can be used. It can be converted to a free form or other salts.
  • the protein produced by the recombinant can be arbitrarily fragmented before or after purification by the action of an appropriate protein-modifying enzyme such as trypsin and chymotrypsin. You can also.
  • the protein can be arbitrarily modified by the action of a protein-modifying enzyme such as a kinase.
  • the presence of G-CSF can be measured by various binding assays and enzyme immunoassays using specific antibodies.
  • G-CSF used in the hair growth promoter composition of the present invention is used as it is. Orally or parenterally as a pharmaceutical composition by mixing with a pharmacologically acceptable carrier or excipient known per se, or as necessary. Can be.
  • Dosage forms for oral administration include, for example, tablets, pills, capsules, granules, syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a dosage form can be produced by a method known per se, and contains a carrier or an excipient usually used in the field of formulation.
  • the carrier include carriers for tablets, and examples of the excipient include lactose, maltose, saccharose, starch, magnesium stearate and the like.
  • Dosage forms for parenteral administration include, for example, ointments, injections, compresses, liniments, suppositories, nasal absorbents, pulmonary absorbents, transdermal absorbents, topical sustained release agents, etc.
  • No. Solution preparations can be used in a manner known per se, for example, in a state in which G_CSF is usually dissolved in a sterile aqueous solution used for injection, or suspended in an extract, and further emulsified and embedded in liposomes. .
  • Solid preparations may be prepared by a method known per se, for example, adding G-CSF to mannitol, trenose, sonorebitone, lactose, gnorecoose, etc. as an excipient and freezing. It can be prepared as a dried product. Further, the freeze-dried product may be used in the form of a powder. Further, the freeze-dried product in the form of powder may be mixed with polylactic acid / glycolic acid or the like and solidified before use. It may be used after gelation.
  • the hair growth promoter composition of the present invention is preferably used as a sustained release preparation.
  • a sustained release formulation means that the release of the active ingredient is not all performed immediately after administration, but is delayed by some period. The release can be immediate, or can occur gradually and continuously. It is preferable to use a sustained-release preparation formulated so as to release G-CSF for at least 7 days. Moreover It is preferred to use one that is formulated to release G-CSF over 14 days. Examples of such sustained-release preparations include medical pumps (osmotic pumps). By using an osmotic pump, G-CSF is continuously released.
  • the hair growth promoter composition of the present invention is administered in such a manner that the amount of G—CSF is preferably 0:! To lg / kg Z days.
  • the G-CSF content in the composition for promoting hair growth of the present invention is not particularly limited, and may be contained so as to be in the above-mentioned dosage.
  • the cosmetic of the present invention comprises the above hair growth promoter composition.
  • the cosmetic of the present invention is used as a cosmetic for hair, a cosmetic for scalp, and a cosmetic for hair growth utilizing the hair growth promoting effect of the hair growth promoting composition of the present invention.
  • the dosage form of the cosmetic of the present invention is not particularly limited as long as it can be expected to act on hair.
  • hair tonic, shampoo, rinse, pomade, hair lotion, hair cream Examples include those commonly used as cosmetics, such as hair treatments.
  • These cosmetics can be manufactured according to a conventionally known manufacturing method.
  • the cosmetics of the present invention may contain various additives commonly used in hair cosmetics, scalp cosmetics, hair growth cosmetics and the like.
  • additives include, for example, hydrocarbons, roux, oils and fats, esters, higher fatty acids, higher alcohols, surfactants, fragrances, pigments, preservatives, antioxidants, Includes UV absorbers, alcohols, pH adjusters and other medicinal ingredients.
  • the cosmetic of the present invention may contain a conventionally known component having a hair growth promoting effect other than G-CSF.
  • a hair growth promoting composition containing the granulocyte colony stimulating factor gene of the present invention (hereinafter also referred to as “gene-containing hair growth promoting composition” in the present specification) will be described.
  • Hair growth containing G-CSF gene of the present invention The gene used in the promoter composition is cloned by, for example, performing an RT-PCR primer reaction using an appropriate DNA portion as a PCR primer based on the information of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1. Can be used.
  • a gene that can be scattered even in the above-mentioned hair growth promoter composition can be used.
  • the method of administering the hair growth promoter composition containing the G—CSF gene of the present invention includes a case where a non-viral vector is used and a case where a viral vector is used.
  • Such administration methods are described in, for example, Separate Volume Experimental Medicine, Basic Technology of Gene Therapy, Yodosha, 1996, Separate Volume Experimental Medicine, Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method, Yodosha, 1997, The Japan Society for Gene Therapy This is described in detail in the Handbook of Gene Therapy Research and Development, N.T.S. These methods are briefly described below.
  • a recombinant gene expression vector in which the G-CSF gene is incorporated into a conventional gene expression vector is used, and the G-CSF is obtained by the following method.
  • Genes can be introduced into cells and tissues.
  • Examples of a method for introducing a gene into cells include a coprecipitation method of calcium phosphate and calcium; a direct injection method of DNA using a micro glass tube.
  • Examples of the method for gene transfer into tissues include a gene transfer method using an internal type liposome, a gene transfer method using an electrostatic type liposome, an HVJ-liposome method, and the like.
  • Improved HVJ — ribosome method HVJ-AVE ribosome method
  • receptor-mediated gene transfer method method of transferring DNA molecules into cells with carrier (metal particles) using a particle gun, naked — DNA And a method using a positively charged polymer.
  • carrier metal particles
  • expression vectors used in the above-mentioned method include pCAGGS (Gene 108, 193-200 (1991)), pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeo SV (invitrogen). And Stratagene).
  • examples of the virus vector include a recombinant adenovirus and a retrovirus. More specifically, detoxified retroviruses, adenoviruses, adeno-associated vinoles, henoreinus vinoles, vaccinia vinoles, box vinoles, poliovirus, Cymbis virus, Sendai virus, SV40,
  • the G-CSFR gene is introduced into cells by introducing the PGIS gene of the present invention into a DNA virus or RNA virus such as immunodeficiency virus (HIV) and infecting the cells with the recombinant virus. It is possible. It is known that among the above-mentioned virus vectors, the infection efficiency of adenovirus is much higher than when other virus vectors are used. Therefore, it is preferable to use an adenovirus vector system.
  • Examples of a method for introducing the gene-containing hair growth promoter composition of the present invention into a patient include an in vivo method in which the gene-containing hair growth promoter composition is directly introduced into the body, and certain cells from humans.
  • the hair growth promoting effect is induced in cells into which the gene-containing hair growth promoter composition has been introduced, and therefore, the inVi method is preferably used.
  • a hair growth promoter composition containing a gene by the in vivo method can be administered by an appropriate administration route according to the target cell, tissue, target organ and the like.
  • it can be administered intravenously, intraarterially, subcutaneously, intradermally, intramuscularly, etc., or it can be topically administered directly to the tissue itself which is to promote hair growth.
  • the preparation may be in the form of a solution or the like suitable for each of the above-mentioned administration forms.
  • the injection in the case of an injection containing the active ingredient DNA, the injection can be prepared by a conventional method. For example, by dissolving in an appropriate solvent (buffer such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.), filtering and sterilizing with a filter if necessary, and filling in a sterile container. Can be prepared. A commonly used carrier or the like may be added to the injection, if necessary.
  • an appropriate solvent buffer such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.
  • a commonly used carrier or the like may be added to the injection, if necessary.
  • a sustained-release preparation such as a millipellet preparation
  • implant it near the affected area or use an osmotic pump or the like. It is also possible to administer the drug gradually and continuously to the affected area.
  • the content of the G—CSF gene in the preparation can be appropriately adjusted depending on the disease to be treated, the age and weight of the patient, and the like.
  • the amount of DNA of the active ingredient is preferably 0.0001 to 100 mg, more preferably 0.001 to :! O mg.
  • Transgenic mice expressing human granulocyte colony-stimulating factor were generated.
  • SRa human granulocyte colony-stimulating factor
  • a promoter was used.
  • the SRa promoter is constructed from the RU5 sequence of human T cell leukemia virus and the SV40 early promoter.
  • the full length cDNA of hG—CSF was inserted into the EcoRI site of pSR296 plasmid, and the transgene expression unit was cut with 'Sa1I to obtain pSRahG—CSF.
  • SRa human granulocyte colony-stimulating factor
  • the 2.3 kilobase Sail fragment of pSRcchG—CSF was purified with a glass pad (DNAPREP, manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.), and 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA (pH 7.5) was used. Then, it was dissolved to 10 g / ml to perform microinjection.
  • Mouse fertilized eggs were collected from the cumulus of the oviduct of superovulated (C57BL / 6XDBA2) BDF1 female mice mated with BDF-1 os mice. The DNA fragment was injected into the most accessible pronucleus of the fertilized egg (1-5 f1). 0.5 days later, the embryos into which DNA had been injected were transplanted into the oviducts of pseudopregnant MCH-ICR mice and delivered, and transgenic mice expressing hG-CSF were obtained.
  • hG-CSF protein is quantified by ELISA, and hG-CSF biological activity is measured by assay using a G-CSF-dependent mouse promyelocytic leukemia cell line (NSF60). I went.
  • the hair growth promoting effect was tested as follows.
  • the skin of the transgenic mouse obtained as described above is collected from the head, the back, and the leg, stretch-fixed, and left overnight in formalin. Next, the skin is cut vertically to prepare a sample that allows the entire hair development to be observed, stained with hematoxylin and eosin, and the number of hairs, the hair cycle, and the position of the hair root are observed with a microscope. did.
  • h G Control mice that do not express CSF
  • Fig. 1 (b) shows the results of transgenic mice expressing hG-CSF.
  • FIGS. 1 (a) and (b) show the epidermis, dermis, and subcutaneous fat from above.
  • the black circles or ellipses in Fig. 1 are hairs.
  • FIG. 1 (a) in transgenic mice expressing hG—CSF, the number of hairs increased in the dermis and subcutaneous fat.
  • FIG. 1 (b) no increase in the number of hairs was observed in the dermis and subcutaneous fat.
  • Fig. 1 (a) hair growth was promoted in transgenic mice expressing hG-CSF, but not only the number of hairs increased, but also the thickness was increased. It can be seen that the color is also black.
  • the bone marrow cells of transgenic mice expressing hG-CSF were examined for their hair growth promoting effect when administered to mice not expressing hG-CSF.
  • Bone marrow cells were collected from the femur of the transgenic mouse expressing hG-CSF obtained in Example 1 by flushing with a 23 G needle, and pipetting with a 27 G needle. As a result, a suspension of individual cells was obtained. Cellular debris and tissue debris were removed by passing through Nylon Mesh. Next, the cells were washed twice with Dulbecco's phosphate buffered saline to obtain bone marrow cells for bone marrow transplantation.
  • C57BLZ6 mice, BALBZc mice and B10.12 mice were administered acidic water and neomycin 7 days before irradiation.
  • 500 ⁇ l of bone marrow cells (5, 000, 0 00 Zml) were injected from the lateral vein of the tail.
  • normal mouse bone marrow cells were prepared as described above. This was used as a control.
  • Fig. 2 (a) shows the results for mice transplanted with bone marrow cells collected from transgenic mice
  • Fig. 2 (b) shows the results for mice transplanted with normal mouse bone marrow cells. It is.
  • the photographs shown in Figs. 2 (a) and (b) show the epidermis, dermis, and subcutaneous fat from above.
  • the black circular or oval part in Fig. 2 is hair.
  • the number of hairs increased in the dermis and subcutaneous fat in mice injected with bone marrow cells collected from hG-CSF-expressing transgenic mice. I understood.
  • mice transplanted with bone marrow cells of normal mice no increase in the number of hairs was observed in the dermis and subcutaneous fat.
  • Fig. 3 (a), (b), (c) and (d) are photographs showing the hair growth promoting effect after 7, 14, 21, 21 and 28 days after pump insertion, respectively. .
  • FIGS. 3 (a;), (b), (c) and (d) show the epidermis, dermis and subcutaneous fat from the top.
  • the black circles or ellipses in Fig. 3 are hairs.
  • h G _ CSF is continuously It was found that when administered gradually, the number of hairs increased in the dermis and subcutaneous fat after 14 days.
  • the hair growth promoting composition of the present invention has an effect of promoting hair growth, and exhibits an effective effect in treating alopecia and thinning hair. Further, the hair growth promoting agent of the present invention has a safe and excellent hair growth promoting effect.

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Abstract

本発明の発毛促進剤組成物は、顆粒球コロニー刺激因子を含有する。本発明の発毛促進剤組成物は、発毛を促進する効果を有し、脱毛症の治療及び薄毛の治療等に有効な効果を発揮する。また、本発明の発毛促進剤組成物は、安全でかつ優れたものである。

Description

明 細 書 発毛促進剤組成物 技術分野
本発明は、 発毛促進剤に関し、 更に詳細には、 安全でかつ優れた発毛 効果を有する発毛促進剤に関する。 背景技術
我が国で、 脱毛、 薄毛に悩む人は約 1 0 0 0万人いる と言われており 、 治療薬、 治療法の開発が期待されている。 ヒ トの毛髪は約 1 0万本あ り 、 1 日 に約 0 . 3 5 m m , 1 ヶ月 に約 l c m成長する といわれている 。 また、 毛髮には寿命があ り 、 成長した後に自然に抜け、 再び新しい毛 が生えてく る。 これをへアサイ クル (毛周期） といい、 このへアサイク ルは、 成長期、 退行期及び休止期の 3つのサイクルに分けられる。
脱毛症は、 遺伝的背景及び男性ホルモンによる壮年性脱毛症と 自己免 疫疾患である円形脱毛症と の 2つのタイプに大き く 分け られる。 これら の脱毛症は、 上述したヘアサイ クルの異常による疾患であ り 、 ヘアサイ クルを正常にするこ とができれば、 いずれも発毛するこ とが期待できる 従来よ り 、 種々の発毛 · 育毛剤が脱毛症の症状に対して、 その予防や 治療のために用いられている。 一般に、 発毛 · 育毛剤の有効成分と して は、 頭皮の血液循環を良好にして皮膚の機能を向上させるこ とによ り 毛 包、 毛球部の新陳代謝機能を活発にするこ とのできる成分、 または、 ふ け、 かゆみの防止、 栄養補給、 保湿等を行って頭皮の生理機能を正常に 維持する成分が用いられている。 従来よ り 、 上記効果を有する成分の開発が行われており、 例えばペン タデカン酸グリ セ リ ド、 セファランチン、 ビタ ミ ン E、 ァロキサジン、 ピリ ジン N—ォキシ ド、 アデノ シン一 3 ' , 5 ' 一サイ ク リ ックモノホ スフェー ト、 ョ クイニン、 イチヨ ウ、 カシュゥ等の抽出エキス、 センプ リ抽出液、 ニンジン抽出液、 1 —メ ン トール、 イ ソプロ ピルメ チルフエ ノール、 グリ チルリ チン酸、 ヒ ノキチオール、 ト ウガラシチンキ、 甘草 エキス、 ニコチン酸アミ ド、 サリ チル酸、 ステロイ ド配糖体、 ト リ テル ぺノ ィ ド配糖体、 ミ ノ キシジル等を含有する発毛剤が用いられている。 症状が軽いか、 又は病巣が比較的小さいよ う な場合には、 上述の治療 剤が効果を奏する場合もあるが、 症状が重い場合や病巣が大きい場合に は、 上述の治療剤では効果を期待するこ とができないのが現状であ り 、 更に効果的な発毛剤に関する研究開発が行われている。
例えば、 特開 2 0 0 3 — 1 2 5 4 2号公報には、 イ ンターフェ ロ ンを 有効成分とするこ と を特徴とする発毛促進剤が開示されている。 該公報 に開示された発毛促進剤によれば、 発毛を促進する効果は認められる。 しかし、 発毛促進効果を発揮するには高濃度のイ ンターフェ ロ ンを用い る必要があ り 、 副作用の点で問題があった。
また、 特開 2 0 0 1 - 5 2 0 2 0 2号公報には、 へシジホッグ様 '?Ρ療 薬によつて動物を処置する、 動物の毛髪成長を誘導する方法が開示され ている。 該公報に開示された方法によれば、 動物の毛髪成長を誘導する こ とが可能であるが、 ヘッジホッグ様タ ンパク質には発ガン性があ り 、 発毛剤と して安全なものとは言えなかつ 7こ
従って 、 本発明の目的は、 安全でかつ優れた発毛促進効果を有する発 毛剤を提供するこ と にめ 。 発明の開示 本発明者らは、 上記目的を達成すべく鋭意検討した結果、 造血系細胞 に選択的に作用 し、好中球の分化や增殖を促進するサイ ト力イ ンである、 顆粒球コロニー刺激因子が発毛促進効果を有する とい う知見を得、 本発 明を完成させた。
本発明は上記知見に基づいてなされたものであ り 、 顆粒球コ ロニー刺 激因子を含有する こ と を特徴とする発毛促進剤組成物を提供するもので ある。
本発明の発毛促進剤組成物に含有される顆粒球コロニー刺激因子は、 遺伝子組み換え型顆粒球コ ロニー刺激因子であってもよい。
本発明の発毛促進剤組成物は、 徐放性製剤であるこ とが好ま しい。 また、 徐放性製剤は、 少なく と も 7 日間にわたって顆粒球コ ロニー刺 激因子を放出するよ う に製剤化されてなるこ とが好ま しく 、 医療ポンプ であってもよい。
また、 本発明は、 上記発毛促進剤組成物を配合する化粧料を提供する ものである。
また、 本発明は、 顆粒球コ ロニー刺激因子遺伝子を含有するこ と を特 徴とする発毛促進剤組成物を提供するものである。
また、 本発明は、 上記発毛促進剤組成物又は上記化粧料を用いるこ と を特徴とする発毛促進方法を提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1 は、 h G— C S Fの発毛促進効果を試験した結果である。
図 2は、 h G _ C S Fの発毛促進効果を試験した結果である。
図 3 は、 h G _ C S Fの発毛促進効果を試験した結果である。
発明を実施するための最良の形態 以下、 まず本発明の発毛促進剤組成物について説明する。
本発明の発毛促進剤組成物は、 顆粒球コ ロニー刺激因子 （以下、 本明 細書において 「G— C S F」 と もいう） を含有する。 本発明の発毛促進 剤組成物に含有される G— C S Fは、 造血系細胞に選択的に作用 し、 好 中球の分化や増殖を促進するサイ トカイ ンである と定義され、 この定義 に包含される G— C S F活性を有するポリべプチ ドであればいずれでも よ く 、 例えば天然物 （人の生体試料等） から抽出、 分離、 精製したもの、 G— C S F産生細胞を培養し、 その培養上清から単離したもの、 細胞融 合法を用いて G— C S F産生ハイプリ ドーマを形成し、 これから取得し たもの、 遺伝子組み換えによって、 大腸菌、 動物細胞等の宿主を形質転 換して得た形質転換対から産生せしめ単離精製したもの、 又はそれを化 学修飾したもの等のいずれも使用可能である。
本発明においては、 上述した G— C S Fのいずれかと一定以上の相同 性を有する ものであれば使用可能である。 この相同性に関しては、 好ま しく は 3 0 %以上であ り 、 更に好ま しく は 5 0 %以上である。
本発明においては、 遺伝子組み換え型 G— C S Fを用いてもよい。 遺 伝子組み換え技術を利用 して G— C S Fを調製する場合には、 G - C S Fをコー ドする遺伝子、 例えば配列番号 ： 1 で表わされる塩基配列の情 報に基づき、 適当な D NA部分を P C Rプライマーと して用い、 例えば R T— P C Rプライマ一反応を行う こ と によってク ローユングするこ と カ できる。 該ク ローニングは、 例えは *、 Molecular Cloning!A Laboratory Manual 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Labroratory Press (1989)等の基本 書に従い、 当業者であれば容易に実施するこ とができる。 また、 本発明 において用いられる G— C S F遺伝子は、 配列番号 ： 1 で表わされる も のに限定されず、 活性を損なわない程度の改変等を有する ものであって もよい。 例えば、 （i)配列番号： 1 で表わされる D N Aとス ト リ ンジェン トな条 件下でハイブリ ダィズする D N A、 又は（i i)配列番号 ： 1 で表わされる D NAが発現するこ とによ り得られるタンパク質のアミ ノ酸配列におい て、 一部のアミ ノ酸が欠失、 置換又は付加されたアミ ノ酸配列からなる タンパク質をコー ドする D NAであって、 かつ発現する こ と によ り 、 G 一 C S F活性を示し得る D N Aであれば、 本発明において用いるこ とが できる。 上記（i)の D N Aは、 通常のハイプリ ダイゼーショ ン法によ り得 るこ とができ、 上記（ii)の D NAは、 上記（i)の D NAに変異を導入する こ とによって得るこ とができる。 D NAに変異を導入する方法と しては、 例えば Kunkel 法、 Gapped duple 法等の公知の手法又はこれに準ずる方 法を採用する こ とができる。 例えば、 部位特異的突然変異誘発法を利用 した変異導入用キッ ト (Mutant - K (TAKARA 社製） や Mutant - G (TAKARA 社製）） 等を用いて、 変異の導入を行う こ とができる。
また、 「ス ト リ ンジェン トな条件」 と しては、 上述した olecular Cloning に記載のハイプリ ダイゼーショ ンの条件等が挙げられ、 具体的 には、 DIG DNA Labeling (ロ シュ · ダイ ァグノ スティ ッ ク ス社製 )で プロ一プをラベルした場合に、 3 2 °Cの DIG Easy Hyb 溶液（ロ シュ · ダイ ァ グ ノ ス テ ィ ッ ク ス社製） 中でハイ プ リ ダイ ズさせ、 4 0 °Cの O . lxSSC 溶液（0.1% [w/v] SDS を含む）中でメ ンプレンを洗浄する条件 ( IxSSC は 0.15M NaCl, 0.015M クェン酸ナ ト リ ウムである） での サザンプロ ッ トハイプリ ダイゼーショ ンで上記 D N Aプローブにハイブ リ ダイズする程度の条件をいう。
本発明において用いられる G— C S Fの調製は、 上記 D NAを含有す る組換ベクターを、 当該技術分野で公知の方法によって作成し、 得られ た組換ベクターを宿主細胞に形質転換し、 該形質転換体を培養し、 G— C S F を生成、 蓄積し、 該タンパク質を採取するこ と によ り製造するこ とができる。 培養し、 前記タンパク質が蓄積されるのは、 培養上清のほ か、 培養細胞も しく は培養菌体又は細胞若しく は菌体の破碎物のいずれ をも意味する ものである。本発明において形質転換体を培養する方法は、 特に制限はなく 、 宿主の培養において用いられる通常の方法でよい。 用いられるベク ターと しては、 宿主中で複製可能なものであれば特に 限定されず、例えばプラス ミ ド D NA、ファージ D N A等が挙げられる。 配列番号 ： 1 で表わされる D N Aを含有する D N A断片を切 り 出し、 該 D N A断片を適当な発現ベクター中のプロモーター下流に連結するこ と によ り実施される。 ベクターと しては、 大腸菌由来のブラス ミ ド （例、 p B R 3 2 2 , p B R 3 2 5 , p U C 1 8、 p U C 1 9、 p U C 1 1 8 又は p B 1 u e s c r i p t等）、 枯草菌由来のプラス ミ ド （例、 p U B 1 1 0 , p T P 5又は p C 1 9 4 )、 酵母由来プラス ミ ド （例、 p S H l 9、 p S H l 5、 Y E p 1 3又は Y C p 5 0等）、 λ ファージ等のバクテ リ オファージ、 レ ト ロ ゥイ ノレス， Vクシ二ァゥィノレス又はバキュ 口 ウイ ルス等の動物ウイ /レス等を利用するこ とがでさ る 。 本発明で用いられる プロモーターと しては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応した適切なプ 口モーターであればいかなるもので レ、 例えば、 宿主が大腸菌であ る場合は、 t r p プロモーター、 1 a c プ口モ一ター、 r e c Aプロモ 一ター、 プロモーター、 1 P Pプ モ一タ一、 T7 プロモーター、
T3 プロモーター、 araBAD プロモ一タ 等が 、 宿主がバチルス属菌であ る場合は、 SP01 プロモーター、 penPプ モ一タ一 、 XYLプロモーター、
HWP プロモーター、 CWP プロモ一タ一等が 宿主が枯草菌である場合 は、 S P O l プロモーター、 S P o 2プ口モ一タ一、 p e n Pプロモー ター等、 宿主が酵母である場合は 、 P H O 5 プ口モーター、 P G Kプロ モーター、 G A Pプロモーター、 A D Hプ モ一ター等が好ま しい。 動 物細胞を宿主と して用いる場合は 、 S R プ モ一ター、 S V 4 0プロ モーター、 L T Rプロモーター、 CMVプロモーター、 H S V-T Kプ 口モーター等が挙げられる。 また、 昆虫細胞を宿主と して用いる場合は ポリヘ ドリ ンプロモーター、 OplE2プロモーター等が好ま しい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によ り 当該技術分野で公知の、 ェンハンサー、 スプライシングシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マ 一力一、 S V 4 0複製オリ ジン （以下、 S V 4 0 o r i と略称する場合 がある） 等を付加するこ とができる。 また、 必要に応じて、 本発明の D NAにコー ドされた蛋白質を他の蛋白質 （例えば、 ダルタチオン S トラ ンスフェラーゼ及びプロテイ ン A) との融合蛋白質と して発現させるこ と も可能である。 このよ う な融合蛋白質は、 部位特異的プロテアーゼを 使用 して切断し、 それぞれの蛋白質に分離するこ とができる。
宿主細胞と しては、 例えば、 ェシヱ リ ヒア厲菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞等が用いられる。 ェシエ リ ヒア属菌の具体例 と しては、 ェシエ リ ヒア · コ リ (Escherichia coli) K 1 2 ' D H 1 (Proc . Natl . Acad . Sci . U S A, 6 0卷， 1 6 0 ( 1 9 6 8 ) ), J M 1 0 3 (Nucleic Acids Research, 9卷， 3 0 9 ( 1 9 8 1 ) ) , J A 2 2 1 (Journal of Molecular Biology, 1 2 0卷， 5 1 7 ( 1 9 7 8 ) ), H B 1 0 1 (Journal of Molecular Biology, 4 1 卷， 4 5 9 ( 1 9 6 9 ) )、 D H 5 a及び J M 1 0 9等が用いられる。 パチル ス属菌と しては、 例えば、 / チノレス ' サチノレス (Bacillus subtilis) M I 1 1 4 (Gene, 2 4卷， 2 5 5 ( 1 9 8 3 ) ), 2 0 7 - 2 1 [journal of Biochemistry, 9 5卷， 8 7 ( 1 9 8 4 )〕 及びバチルス · プレビ ス等が用いられる。 酵母と しては、 例えば、 サッカ ロマイセス セ レビシ ェ ( Saccaromyces cerevisiae) A H 2 2 , AH 2 2 R -， N A 8 7 - 1 1 A, D KD— 5 D , 2 0 B— 1 2、 シゾサッカ ロマイセス ボンべ ( Schizosaccaromyces pombe) N C Y C 1 9 1 3 , N C Y C 2 0 3 6、 ピキア パス ト リ ス （Pichia pastoris) 及びハンセヌ ラ ' ポ リ モ ーフ ァ（Hansenula polymorpha)等が用いられる。 動物細胞と しては、 例え ば、 サル細胞 C O S — 7 , V ero, チャイニーズハムスター細胞 C H O (以下、 C H O細胞と略記）， d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスタ 一細胞 C H O (以下、 C H O ( d h f r -) 細胞と略記）， マウス L細胞， マウス A t T— 2 0 , マウス ミエローマ細胞， ラ ッ ト G H 3 , ヒ ト F L 細胞及ぴ H E K 2 9 3細胞等が用いられる。
上述した宿主細胞の形質転換は、 当該技術分野で公知の方法に従って 行う こ とができる。 例えば、 以下に記載の文献に宿主細胞を形質転換す る方法が記載されている。 Proc . Natl . Acad. Sci . U S A , 6 9卷， 2 1 1 0 ( 1 9 7 2 ) ; Gene, 1 7卷， 1 0 7 ( 1 9 8 2 ) ; Molecular & General Genetics, 1 6 8卷， 1 1 1 ( 1 9 7 9 ) ； Methods in Enzymology, 1 9 4卷， 1 8 2 — 1 8 7 ( 1 9 9 1 ) ; Proc . Natl . Acad Sci . U S A), 7 5卷， 1 9 2 9 ( 1 9 7 8 ) ; 細胞工学別冊 8 新 細胞 工学実験プロ ト コール. 2 6 3 - 2 6 7 ( 1 9 9 5 ) (秀潤社発行） ； 及 ぴ Virology, 5 2卷， 4 5 6 ( 1 9 7 3 )。
大腸菌等の細菌への組換ベク ターの導入方法は、 細菌に D NAを導入 するこ とのできる方法であれば特に限定されるものではなく 、 例えば力 ル シ ゥ ム イ オ ン を 用 レヽ る 方 法 (Cohen , S .N . et al . ： Proc . atl . Acad. Sci . , USA, 69 : 2110 (1972) , エ レク ト ロ ポ レ ーショ ン法等が挙げられる。
酵母を宿主とする場合は、 酵母への組換ベクターの導入方法は、 酵母 に D N Aを導入する こ と のできる方法であれば特に限定されず、 例えば エレク ト 口ポレーシヨ ン法、 スフエロプラス ト法、 酢酸リ チウム法等が 挙げられる。
動物細胞を宿主とする場合は、 動物細胞への組換べクターの導入方法 は、 動物細胞に D N Aを導入するこ とのできる方法であれば特に限定さ れず、 例えばエレク ト ロポレーシヨ ン法 、 リ ン酸カルシウム法、 リ ボフ ェクショ ン法等が挙げられる。
昆虫細胞を宿主とする場合は、 昆虫細胞への組換ぺクタ一の導入方法 は、 昆虫細胞に D N Aを導入するこ とのできる方法であれば特に限定さ れず、 例えばリ ン酸カルシウム法 、 リ ポフェク シヨ ン法、 エレク ト ロポ レーショ ン法等が挙げられる。
遺伝子が宿主に組み込まれたか否かを確認するための方法と しては、 例えば P C R法、 サザンハイブリ ダィゼーシヨ ン法、 ノーザンハイプリ ダイゼーシヨ ン法等によ り行う こ とができる。 例えば、 形質転換体から D N Aを調製し、 D N A特異的プライマーを設計して P C Rを行う。 P C Rは、 前記プラス ミ ドを調製するために用いた条件と同様の条件にて 行われる。 次いで、 増幅産物についてァガロースゲル電気泳動、 ポリ ア ク リルアミ ドゲル電気泳動又はキヤ ピラ リ ー電気泳動等を行い、 臭化工 チジゥム、 S YB R G r e e n液等によ り染色し、 次いで增幅産物を 1本のバ ン ドと して検出し、 形質転換されたこ と を確認するこ とができる。 予め 蛍光色素等によ り標識したプライマーを用いて P C Rを行い、 増幅産物 を検出しても よい。 更に、 マイ ク ロプレー ト等の固相に增幅産物を結合 させた後、 蛍光又は酵素反応を用いて增幅産物を確認する方法を用いる こ と もできる。
本発明の発毛促進剤組成物に用いられる G— C S Fは、 前記形質転換 体を培養し、 G— C S Fを生成、 蓄積し、 該タンパク質を採取する こ と によ り製造するこ とができる。 G— C S Fが蓄積されるのは、 培養上清 のほか、 培養細胞も しく は培養菌体又は細胞若しく は菌体の破砕物のい ずれをも意味する ものである。 本発明において形質転換体を培養する方 法は、 特に制限はなく 、 宿主の培養において用いられる通常の方法でよ レヽ
例えば、 宿主が大腸菌や酵母等の微生物の場合、 形質転換体を培養す る培地は、 微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行う こ とができる培地であれば、天然培地、 合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源と しては、例えばグルコース、 フラ ク ト一ス、 スク ロース、 デンプン等の炭水化物、 酢酸、 プロ ピオン 酸等の有機酸、 エタノール、 プロ％ノ ー留等のアルコール類が挙げられ る。 窒素源と しては、 例えばアンモニア、 塩化アンモニゥム、 硫酸アン モニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リ ン酸アンモニゥム等の無機酸又は有機 酸のアンモニゥム塩、 又はその他の含窒素化合物の他、 ペプ トン、 肉ェ キス、 コーンスティ ープリ カー等が挙げられる。 無機物と しては、 リ ン 酸第一力 リ ウム、 リ ン酸第二カ リ ウム、 リ ン酸マグネシウム、 硫酸マグ ネシゥム、 塩化ナ ト リ ウム、 硫酸第一鐡、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸 カルシウム等が挙げられる。 培養は、 通常、 浸透培養又は通気搅拌培養 等の好気的条件の下で行う。 培養温度、 培養時間は、 宿主が大腸菌の場 合、 約 1 5 〜 4 3 °Cの温度で約 1 2 〜 4 8 時間行う。 宿主がバチルス属 菌の場合、 約 3 0 〜 4 0 °Cの温度で約 1 2 〜 1 0 0時間行う。 宿主が酵 母の場合は、 約 2 0 〜 3 5 aCの温度で約 2 4 〜 1 0 0時間行う。 また、 必要に応じて通気や攪拌を加えるこ とができる。 p Hの調製を行う必要 がある場合、 無機又は有機酸、 アルカ リ溶液等を用いて行う。
プロモーターと して誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形 質転換した形質転換体を培養する場合は、 必要に応じてイ ンデューサー を培地に添加して培養を行う。
動物細胞を宿主と して得られた形質転換体を培養する場合、 用いられ る培地と しては、 一般に用いられている R P M I 1 6 4 0 培地、 D M E M 培地又 はこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地が挙げられる。 培養は、 好ま しく は、 5 %程度の二酸化炭素の存在下で約 3 7 Cの温度で 1 ~ 3 0 日間行う。
培養後、 G— C S Fが菌体内又は細胞内に生産される場合には、 公知 の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リ ゾチームおよびノまたは凍結融解等によって菌体又は細胞を破壊 したのち、 遠心分離やろ過によ り蛋白質の粗抽出液を得る方法が挙げら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジン等の蛋白質変性剤や、 ト リ ト ン X— 1 0 0 (登録商標） 等の界面活性剤が含まれていてもよい。 培養 液中に G— C S Fが分泌される場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌 体あるいは細胞と上清と を分離し、 上清を集める。 このよ う にして得ら れた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる蛋白質の精製は、 公知の分 離 · 精製法を適切に組み合わせて行な う こ とができる。 すなわち、 例え ば硫酸ァンモユウム沈殿、 ゲルク ロマ トグラフィー、 ィオン交換ク 口マ トグラフィー、 ァフィ二ティーク ロマ ト グラフィ一等を単独で又は適宜 組み合わせて用いるこ とによ り 、 目的のタンパク質を生成するこ とがで さ る。
こ う して得られた G— C S Fは、 公知の方法あるいはそれに準じる方 法によって塩に変換するこ とができ、 逆に塩で得られた場合には公知の 方法あるいはそれに準じる方法によ り 、 遊離体または他の塩に変換する こ とができる。 更に、 組換え体が産生する蛋白質を、 精製前または精製 後に、 ト リ プシン及びキモ ト リ ブシンのよ う な適当な蛋白修飾酵素を作 用させる こ と によ り 、 任意に断片化するこ と もできる。 また、 キナーゼ 等のタンパク質修飾酵素を作用させるこ とによ り 、 任意に修飾を加える こ と もできる。 G— C S Fの存在は、 様々な結合アツセィ及び特異抗体 を用いたェンザィムィムノアッセィ等によ り測定するこ とができる。 本発明の'発毛促進剤組成物に用いられる G— C S Fは、 そのままで用 いてもよ く 、 又は必要に応じて、 それら 自体公知の薬理学的に許容され る担体、 賦形剤等と混合して医薬組成物と して、 経口又は非経口的に投 与するこ とができる。
経口投与のための剤型と しては、 例えば錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆 粒剤、 シロ ップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が挙げられる。 このよ う な剤型は、 自体公知の方法によって製造するこ と でき、 製剤分野において通常に 用いられる担体又は賦形剤を含有するものである。 担体と しては、 錠剤 用の担体が挙げられ、 賦形剤と しては、 ラク トース、 マル トース、 サッ 力ロース、 でんぷん、 ステアリ ン酸マグネシウム等が挙げられる。
非経口投与のための剤型と しては、 例えば、 軟膏剤、 注射剤、 湿布剤、 塗布剤、 座薬、 経鼻吸収剤、 経肺吸収剤、 経皮吸収剤、 局所徐放剤等が 挙げられる。 溶液製剤は、 自体公知の方法、 例えば、 G _ C S Fを通常、 注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解、 又は抽出液に懸濁、 更に乳化 して リ ポソームに包埋させた状態で用い得る。
固体製剤と しては、 それら 自体公知の方法、 例えば G— C S Fにマン 二 トーノレ、 ト レノヽ ロ ース 、 ソノレビ トーノレ、 ラク トース 、 グノレ コ ース等を 賦形剤と して加え、 凍結乾燥物と して調製するこ とができ る。 さ らに、 この凍結乾燥物を粉体化して用いてもよい。 また、 粉体化した凍結乾燥 物をポリ乳酸ゃグリ コール酸等と混ぜて固体化して用いてもよい。また、 ゲル化して用いてもよい。
本発明の発毛促進剤組成物は徐放性製剤と して用いる こ とが好ま しい。 徐放性製剤と は、 有効成分の放出の全てが、 投与の直後に行われるので はなく 、 いく らかの期間だけ遅延される ものを意味する。 この放出は一 時に行う よ う にするこ と もでき、 又は徐々に連続して行う こ と も可能で ある。 なお、 徐放性製剤は、 少なく と も 7 日間にわたって G— C S Fを 放出するよ う に製剤化されているものを用いる こ とが好ま しい。 さ らに は、 1 4 日間にわたって G— C S Fを放出するよ う に製剤化されている ものを用いるこ とが好ま しい。 このよ う な徐放性製剤と しては、 例えば 医療ポンプ （ォスモチックポンプ） 等が挙げられる。 ォスモチックボン プを用いるこ とによ り 、 連続的に G— C S Fが放出される。
本発明の発毛促進剤組成物の投与量は、 G— C S Fの量が好ま しく は 0 . ：!〜 l g / k g Z日 になるよ う に投与する。 本発明の発毛促進剤 組成物中の G— C S F含有量に特に制限はなく 、 上記投与量になるよ う に含有させればよい。
本発明の化粧料は、 上記発毛促進剤組成物を配合してなる。 本発明の 化粧料は、 本発明の発毛促進剤組成物の発毛促進効果を利用 した頭髪用 の化粧料、 頭皮用の化粧料、 育毛用の化粧料と して用いられる。 本発明 の化粧料の剤型と しては、 毛髪への作用を期待し得る ものであれば特に 制限はなく 、 例えばヘア トニック、 シャンプー、 リ ンス、 ポマー ド、 へ ァローショ ン、 ヘアク リ ーム、 ヘア ト リ一トメ ン ト等の通常化粧料と し て用いられている ものを例示できる。 これらの化粧料は、 従来公知の製 造方法に従って製造する こ とができる。
本発明の化粧料には、 頭髪用化粧料、 頭皮用化粧料、 育毛用化粧料等 に通常に用いられる各種添加剤を添加してもよい。 このよ う な添加剤と しては、 例えば炭化水素類、 ロ ウ類、 油脂類、 エステル類、 高級脂肪酸 類、 高級アルコール類、 界面活性剤類、 香料、 色素、 防腐剤、 抗酸化剤、 紫外線吸収剤、 アルコール類、 p H 調製剤、 その他の薬効成分が举げら れる。 また、 本発明の化粧料には、 G— C S F以外の、 従来公知の発毛 促進効果を示す成分を配合してもよい。
次に、 本発明の顆粒球コ ロニー刺激因子遺伝子を含有する、 発毛促進 剤組成物 （以下、 本明細書において 「遺伝子含有発毛促進剤組成物」 と もいう） について説明する。 本発明の G— C S F遺伝子を含有する発毛 促進剤組成物において用いられる遺伝子は、 配列番号 ： 1 で表わされる 塩基配列の情報に基づき、 適当な D N A部分を P C Rプライマーと して 用い、 例えば R T— P C Rプライマー反応を行う こ と によってク ロー二 ングするこ とができる。 上記遺伝子は、 上述した発毛促進剤組成物にお いても散られるものを用いるこ とができる。
本発明の G— C S F遺伝子を含有する発毛促進剤組成物の投与方法と しては、 非ウィルスベク ターを用いる場合、 及びウィルスベクターを用 いる場合が挙げられる。 このよ う な投与方法については、 例えば、 別冊 実験医学、 遺伝子治療の基礎技術、 羊土社、 1996、 別冊実験医学、 遺伝 子導入 &発現解析実験法、 羊土社、 1997、 日本遺伝子治療学会編遺伝子 治療開発研究ハン ドブック、 ェヌ ' ティー ' エス 、 1999等の実験手引き 書に詳しく解説されている。 それらの方法について以下、 簡単に説明す る。
非ウィルスベク ターを用いて投与する方法と しては、 慣用の遺伝子発 現ベクターに G— C S F遺伝子が組み込まれた組換え発現ベクターを用 いて、 以下のよ う な手法によ り G— C S F遗伝子を細胞や組織に導入す るこ とができる。
細胞への遺伝子導入法と しては、 例えばリ ン酸ーカルシウム共沈法 ； 微小ガラス管を用いた D N Aの直接注入法等が挙げられる。
また、 組織への遺伝子導入法と しては、 例えば、 内包型リ ボソーム (internal type liposome) による遺伝子導入法、 静電気型リ ボソーム (electrostatic type liposome ) による遺伝子導入法、 H V J — リ ホ ソーム法、 改良型 HV J — リ ボソーム法 （HVJ-AVE リ ボソーム法）、 受容 体介在性遺伝子導入法、 パーティ クル銃で担体 （金属粒子） と と もに D N A 分子を細胞に移入する方法、 n a k e d — DNAの直接導入法、 正電 荷ポリ マーによる導入法等が挙げられる。 このよ う な方法によって、 組 換え発現ベクターを細胞内に取り込ませるこ とが可能である。
上述した方法において用いられる発現ベクターと しては、 例えば、 p C A G G S (Gene 108, 193-200 (1991)) や、 p B K— CMV、 p c D N A 3. 1 、 p Z e o S V (イ ンビ ト ロゲン社、 ス ト ラ タジーン社） 等が 挙げられる。
また、 ウィルスベク ターを用いる場合、 ウィルスベク ターと しては、 例えば、 組換えアデノ ウイルス、 レ ト ロ ウイルス等が挙げられる。 更に 具体的には、 無毒化したレ ト ロ ウイルス、 アデノ ウイルス、 アデノ随伴 ウイノレス 、 へノレぺスゥイ ノレス 、 ワクシニアウイノレス、 ボックスゥイ ノレス 、 ポ リ オウイルス、 シンビス ウイ.ルス、 センダイ ウィルス、 S V 4 0、 免 疫不全症ウィルス ( H I V ) 等の D N Aウィルス又は RNA ウィルスに本 発明の PGIS遗伝子を導入し、細胞に組換えウィルスを感染させるこ とに よって、 細胞内に G— C S F R遺伝子を導入するこ とが可能である。 上述したウィルスベクターの う ち、 アデノ ウィルスの感染効率は、 他 のウィルスベク ターを用いた場合よ り もはるかに高いこ とが知られてい る。 従って、 アデノ ウイルスベク ター系を用いるこ とが好ま しい。
本発明の遺伝子含有発毛促進剤組成物の患者への導入法と しては、 遣 伝子含有発毛促進剤組成物を直接体内に導入する i n v i v o法、及び、 ヒ トからある種の細胞を取り 出して体外で遺伝子含有発毛促進剤組成物 を該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻す e X V i v o法がある （例え ば、 日 経サイ エ ンス， 1994 年 4 月 号， 20- 45 頁、 月 刊薬事， 36(1) , 23 - 48, 1994、 実験医学増刊， 12 ( 15) , 1994、 日本遺伝子治療学会編遺伝子 治療開発研究ハン ドブック， ェヌ · ティー · エス， 1999等参照）。 本発明 においては、 遺伝子含有発毛促進剤組成物を導入した細胞において発毛 促進効果が誘導されるため、 i n V i V o法によるこ とが好ま しい。
i n v i v o法によ り遺伝子含有発毛促進剤組成物を投与する場合 は、 対象となる細胞、 組織、 標的臓器等に応じた適当な投与経路によ り 投与され得る。 例えば、 静脈、 動脈、 皮下、 皮内、 筋肉内などに投与す るか、 又は発毛を促進しょ う とする組織そのものに直接局所投与するこ とができる。
製剤形態と しては、 上記の各投与形態に合った、 液剤等の製剤形態で よい。 例えば、 有効成分の D NA を含有した注射剤の場合には、 該注射 剤は常法によ り調製するこ とができる。 例えば、 適切な溶剤 （ P B S等 の緩衝液、 生理食塩水、 滅菌水等） に溶解した後、 必要に応じてフィル ター等で濾過滅菌した後、 無菌的な容器に充填するこ とによ り調製する こ とができる。 該注射剤には、 必要に応じて通常に用いられる担体等を 加えてもよい。
疾患部位の周囲に遺伝子を存在し易く するために、 徐放性の製剤 （ミ 二ペレッ ト製剤等） を調製し患部近く に埋め込むこ と も可能であ り 、 あ るいはォスモチックポンプなどを用いて患部に連統的に徐々 に投与する こ と も可能である。
前記製剤中の G— C S F遺伝子の含有量は、 治療目的の疾患、 患者の 年齢、 体重等によ り適宜調節するこ とができる。 例えば、 有効成分の D NA量と して好ま しく は 0 . 0 0 0 1 〜 1 0 0 m gであ り 、 更に好ま し く は 0. 0 0 1 〜 ：！ O m g である。
実施例
以下に、 実施例を示し、 本発明をさ らに具体的に説明するが、 本発明 はこれに限定されるものではない。
実施例 1
ヒ ト顆粒球コ ロニー刺激因子 （以下、 h G— C S F とい う） を発現する トランスジヱニックマウスを作製した。 h G— C S Fを発現する ト ラン スジエニックマウスを作製するために、 h G _ C S Fを誘導する S R a プロモーターを用いた。 S R aプロモーターは、 ヒ ト T細胞白血病ウイ ルスの R U 5 シークェンス及ぴ S V 4 0初期プロモーターから構築され ている。 p S R 2 9 6 プラス ミ ドの E c o R I サイ トに h G— C S Fの 全長 c D N Aを挿入し、 導入遺伝子の発現ユニッ トは' S a 1 I で切断し p S R a h G— C S Fを得た。 p S R cc h G— C S Fの 2 . 3 キロ ベース S a i l 断片をガラスパゥダー （旭硝子社製、 D N A P R E P ) で精製し、 1 0 mM T r i s - H C l , 0 . I mM E D T A ( p H 7 . 5 ) に、 マイ ク ロイ ンジェクショ ンをするために 1 0 g /m l になる よ う に溶解した。 マウスの受精卵は、 B D F 1 ォスマウス と交尾 した過排卵の （ C 5 7 B L / 6 X D B A 2 ) B D F 1 メスマウスの卵管 の卵丘から採取した。 上記 D N A断片を受精卵の最も利用 しやすい前核 に注入した （ 1 〜 5 f 1 ) 。 D N Aが注入された胚を 0 . 5 日後に偽妊 娠 M C H— I C Rマウスの卵管に移植し、 分娩させ、 h G— C S Fを発 現する ト ランスジエニックマウスを得た。
上述のよ う にして得られたマウスにおける h G _ C S Fの発現は、 h
G— C S Fタンパク質の定量、 及ぴ h G— C S Fの生物学的活性測定に よ り確認した。 h G— C S Fタンパク質の定量は E L I S A法によ り行 い、 h G— C S Fの生物学的活性測定は、 G— C S F依存マウス前骨髄 性白血病細胞系 （ N S F 6 0 ) を用いた検定によ り行った。
また、 発毛促進効果については以下のよ う にして検定を行った。
上述のよ う にして得られた トランスジヱニックマウスの皮膚を、 頭部 、 背部及ぴ脚部よ り採取し、 伸展固定を行い、 ホルマ リ ン中で一昼夜放 置する。 次いで、 皮膚を垂直断し、 毛の発生を全体で観察可能とする標 本を作製し、 へマ トキシリ ン ' ェォジン染色して、 毛の数、 毛周期及び 毛根部の位置を顕微鏡にて観察した。
結果を図 1 に示す。 h G— C S Fを発現していないマウスをコン ト ロ ールと して用い、 その結果を図 1 ( b ) に示す。 図 1 ( a ) は、 h G— C S Fを発現する ト ランスジエニックマウスの結果である。
図 1 ( a ) 及び （ b ) に示す写真は、 上から表皮、 真皮、 皮下脂肪を 示す。 図 1 中の黒い円形ないし楕円形の部分が毛である。 図 1 ( a ) に 示すよ う に、 h G— C S Fを発現する ト ラ ンスジエニックマウスにおい ては、 真皮及び皮下脂肪に毛の数が増えていた。 これに対し、 図 1 ( b ) に示すコン トロールマウスにおいては、 真皮及び皮下脂肪において毛 の数の增加は認められなかった。 なお、 図 1 ( a ) に示すよ う に、 h G - C S Fを発現する トランスジエニックマウスにおいて発毛促進が認め られたが、 毛の数が増えているばかり でなく 、 その太さが太く な り また 色も黒く なっているこ とがわかる。
実施例 2
h G - C S Fを発現する ト ラ ンスジエニックマ ウスの骨髄細胞を、 h G - C S Fを発現していないマウスに投与した場合の発毛促進効果につ いて調べた。
実施例 1 で得られた、 h G— C S Fを発現する ト ラ ンスジエニックマ ウスの大腿骨から、 2 3 Gの注射針でフラ ッシングして骨髄細胞を採取 し、 2 7 Gの注射針でピペッティ ングするこ と によ り 、 1個ずつの細胞 の懸濁液と した。 ナイ ロンメ ッシュに通すこ と によ り 、 細胞のごみや組 織の残骸を除去した。 次いで、 D u 1 b e c c o のリ ン酸緩衝生理食塩 水で 2 回洗浄し、 骨髄移植用の骨髄細胞と した。
C 5 7 B L Z 6 マウス、 B A L B Z c マウス及び B 1 0 . 1 2マウス に酸性水及びネオマイシンを放射線照射の 7 日前に投与した。 致死量の 放射線 （ 9 0 0 c G yの X線、 2 5 0 c G y /分） を照射して 3時間以 內に、 5 0 0 μ 1 の骨髄細胞 （ 5 , 0 0 0 , 0 0 0個 Zm l ) を尻尾の 側脈から注入した。 なお、 通常のマウスの骨髄細胞を上述のよ う にして 移植し、 これをコン ト ロールと した。
骨髄細胞を注入してから 6 0 日経過した後、 実施例 1 と同様に発毛促 進効果を調べた。 骨髄移植マウスについての結果を図 2 に示す。
図 2 ( a ) に示す写真は、 トランスジエニックマウスから採取した骨 髄細胞を移植したマウスについての結果であり 、 図 2 ( b ) は、 通常の マウスの骨髄細胞を移植したマウスについての結果である。 図 2 ( a ) 及び （ b ) に示す写真は、 上から表皮、 真皮、 皮下脂肪を示す。 図 2 中 の黒い円形ないし楕円形の部分が毛である。 図 2 ( a ) に示すよ う に、 h G - C S Fを発現する トランスジエニックマウスから採取した骨髄細 胞を注入されたマウスにおいては、 真皮及び皮下脂肪に毛の数が増加す るこ とがわかった。 これに対し、 通常のマウスの骨髄細胞を移植したマ ウスにおいては、 真皮及び皮下脂肪において毛の数の増加は認められな かった。
実施例 3
l O O g /m l 濃度の G— C S Fを Alzet ミニォスモチックポンプ
(型 ： 2 0 0 2、 DURECT社製） に 2 0 0 /i 1 注入した。 次いで、 G— C S Fを注入したミ ニォスモチックポンプをマウス皮下 (背部） に全身麻 酔下で挿入した。 用いたポンプは、 G— C S Fを 1 4 日にわたって放出 するよ う になされたものである。 ポンプを挿入後、 7 曰、 1 4 日、 2 1 日及ぴ 2 8 日経過した後、 実施例 1 と同様に発毛促進効果を調べた。 結 果を図 3 に示す。 図 3 ( a ), ( b )、 ( c ) 及び ( d ) は、 それぞれボン プ揷入後 7、 1 4、 2 1及び 2 8 日経過した後の発毛促進効果を示す写 真である。
図 3 ( a ；) 、 （ b ) 、 （ c ) 及び （ d ) に示す写真は、 上から表 皮、 真皮、 皮下脂肪を示す。 図 3 中の黒い円形ないし楕円形の部分が毛 である。 図 3 に示すよ う に、 h G _ C S Fをォスモチックを用い連続的 に徐々に投与した場合、 1 4 日経過後から、 真皮及び皮下脂肪に毛の数 が増加するこ とがわかった。
以上詳述した通り 、 顆粒球コ ロニー刺激因子が発毛促進効果を有する こ とが見出された。 本発明の発毛促進剤組成物は、 発毛を促進する効果 を有し、脱毛症の治療及び薄毛の治療等に有効な効果を発揮する。また、 本発明の発毛促進剤は安全でかつ優れた発毛促進効果を有するものであ る。

Claims

請 求 の 範 囲
1 · 顆粒球コ ロニー刺激因子を含有するこ と を特徴とする発毛促進剤 組成物。
2 . 前記顆粒球コ ロニー刺激因子が、 遺伝子組み換え型顆粒球コ ロニ 一刺激因子である、 請求項 1 に記載の発毛促進剤組成物。
3 . 徐放性製剤である、 請求項 1又は 2 に記載の発毛促進剤組成物。
4 . 徐放性製剤が、 少なく と も 7 日間にわたって顆粒球コ ロニー刺激 因子を放出する よ う に製剤化されてなる、 請求項 3に記載の発毛促進剤 組成物。
5 . 徐放性製剤が医療ポンプである、 請求項 3 に記載の発毛促進剤組 成物。
6 . 請求項 1〜 5 のいずれか 1項に記載の発毛促進剤組成物を配合す るこ と を特徴とする化粧料。
7 . 顆粒球コ ロニー刺激因子遺伝子を含有するこ と を特徴とする発毛 促進剤組成物。
8 . 請求項 1〜 5又は請求項 7のいずれか 1項に記載の発毛促進剤組 成物、 又は請求項 6 に記載の化粧料を用いる こ と を特徴とする発毛促進 方法。
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