WO2004078210A1 - 開腹手術後の癒着の予防剤 - Google Patents

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WO2004078210A1
WO2004078210A1 PCT/JP2004/002888 JP2004002888W WO2004078210A1 WO 2004078210 A1 WO2004078210 A1 WO 2004078210A1 JP 2004002888 W JP2004002888 W JP 2004002888W WO 2004078210 A1 WO2004078210 A1 WO 2004078210A1
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midkine
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Takashi Muramatsu
Kazuhiko Inoh
Hisako Muramatsu
Shuhei Torii
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Takashi Muramatsu
Kazuhiko Inoh
Hisako Muramatsu
Shuhei Torii
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    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators

Definitions

  • the present invention relates to the prevention of adhesion after laparotomy.
  • Adhesive ileus often develops several decades after surgery, and treatment for this often requires relapsing the laparotomy and requiring adhesion detachment. However, this results in further adhesions.
  • adhesions after laparotomy were a major challenge, but were overlooked as an inevitable side effect.
  • an absorptive membrane (Seprafilm; Kaken Pharmaceutical) has been developed to be placed in the abdominal cavity to prevent this. It cannot be effective. Further techniques for preventing post-operative intraperitoneal adhesions are desired. Disclosure of the invention
  • the purpose of this study is to provide a new drug that prevents post-operative intraperitoneal adhesions.
  • the present inventors systematically examined whether the degree of adhesion was different between mice having different genetic backgrounds.
  • the mitdocaine gene knockout mouse mitdocaine (-/ _) mouse
  • mitdocaine (-/ _) mouse had significantly less intraperitoneal adhesions to the wound created in the abdominal cavity than the wild type mouse.
  • adhesion was suppressed in mitdocaine, mice, and mice, but when mitdocaine was given to these mice, the process was restarted. Migration of macrophages and neutrophils into the network was suppressed in mitdocaine (-/-) mice.
  • mitdocaine is crucially involved in intraperitoneal adhesions and is a molecular target for suppressing it.
  • Mitudocaine is a growth factor that promotes cell growth, migration and survival (Muramatsu, T. Wiley Encyclopedia Mol, 2086-2088, 2002; Muramat su, T., J. Biochem., 132, 359-371, 2002). ), Is known to induce neutrophils and macrophages to the site of inflammatory stimulation and play a part in the inflammatory response (Takada, T. et al., J. Biochem., 122, 453-458, 1997, Horiba, M. et al., J. Clin. Invest., 105, 489-495, 2000), and this finding has revealed that mitdocaine is also involved in adhesions.
  • the present invention prevents adhesion by inhibiting the synthesis or action of mitdocaine.
  • suppression of the expression of the mitodkine gene includes both suppression of transcription and translation.
  • Oligonucleotides that suppress the expression of the mitdocaine gene include RNA complementary to the transcript of the mitdocaine gene or the RNA. Can be used. One embodiment of such a compound is an antisense oligonucleotide.
  • Antisense oligonucleotides that strongly suppress the expression of mitdocaine have already been developed (Takei, Y. et al., Cancer Res., 61 8486-8491, 2001, Japanese Patent Application 200 2-142778, Japanese Patent Application 2002-47135). , 2002-47136).
  • the invention is not limited to this particular antisense oligonucleotide.
  • ⁇ oligonucleotide '' refers to the nucleic acid portions of naturally occurring oligomers, such as the deoxyribonucleotide and liponucleotide structures of DNA and RNA, as well as the ability to bind to naturally occurring nucleic acids. Includes both human and analog.
  • Oligonucleotides of the invention may be based on liponucleotide monomers bound by a phosphodiester bond or by an analog linked by methylphosphonate, phosphorothioate, or other bond. They may also have a portion of the monomer that is altered in its basic structure or other modifications, but retains its ability to bind to naturally occurring DNA and RNA structures. Such oligonucleotides can be prepared by methods well known to Applicants, for example, using commercially available machines and reagents available from Perkin-Elmer / Applieds Biosystem (Foster City, CA).
  • Phosphodiester-linked oligonucleotides are particularly susceptible to nuclease action in serum or inside cells, and in a preferred embodiment, the oligonucleotides of the invention have been shown to be nuclease resistant. These include analogs linked to holothioate or methylophosphonate (Stein et al, Cancer Research 48; 2659, 1998). The method developed by the applicants is also effective (Japanese Patent Application 2002-47136).
  • the antisense oligonucleotide inhibits translation of the mitokine mRNA by hybridizing the RNA molecule produced by infecting the target cell with the expression construct to the mRNA. And then It is selected to inhibit the synthesis of midkine.
  • Hybridization of this oligonucleotide with an mRNA target can inhibit the expression of the corresponding gene product by multiple mechanisms.
  • translation arrested In the "translation arrested" state, translation of the target mRNA into protein is blocked (Haeuptle et al .; Nucl. Acids. Res. 14 .: 1427, 1986).
  • intracellular RNase H can digest the target RNA sequence as soon as the target RA sequence hybridizes to the DNA oligomer (Walder & Walder Natl. Acad. Sci. USA. 85: 5011, 198 8).
  • RNA polymerase Gaovannange li et al 1 .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 10013, 1993.
  • RNAi is a phenomenon in which when double-stranded RNA (hereinafter, dsRNA) having the same or similar sequence as the target gene sequence is introduced into cells, the expression of both the introduced foreign gene and the target endogenous gene is suppressed. is there.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • Dicer RNase III-like nuclease
  • RNA short interference RNA
  • a specific protein binds to the siRNA to form a nuclease complex (RISC: RNA-induced silencing complex).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • This complex recognizes and binds to the same sequence as the s iRNA, and cleaves the mRNA of the target gene at the center of the s iRNA by an RNacell-like enzyme activity.
  • the antisense strand of sRNA binds to mRNA and acts as a primer for RNA-dependent RNA polymerase (RsRP) to synthesize dsRNA.
  • RsRP RNA-dependent RNA polymerase
  • This dsRNA is Becomes fine dicer one substrate, are also contemplated et been pathway to amplify the effects caused a new s iRNA. Oligonucleotides of the iRNA method (McManus, M.1, Sharp PA, Nature, 3, 737-747) are also applicable to the present invention.
  • RNAi was first discovered in nematodes (Fire, A. et al. Potent and d specific genet ic interference by double-stranded RNA in Caenorhabd is elegans. Nature 391, 806-811, At present, it has been observed not only in nematodes, but also in various organisms such as plants, nematodes, Drosophila, and protozoa (Fire, A. RNA-triggered gene si ling. Trends Genet. 15, 358-363 (1 99), Sharp, PA RNA interference 2001.Genes Dev.
  • dsRNA When RNAi first appeared, dsRNA was considered to be ineffective if it was not longer than a certain length (40 bases), but Tuschl et al. Of the Rockefeller University in the U.S. produced a single-stranded dsRNA (siRNA) of around 21 base pairs.
  • PKR When introduced into cells, it has been reported that PKR does not cause an anti-viral reaction in mammalian cells and has an RNAi effect (Tuschl, Nature, 411, 494-498 (2001)). As a technology that can be applied to mammalian cells such as these, it has suddenly attracted attention.
  • RNAi When RNAi is used to suppress the expression of the mitdocaine gene, sRNA may be used as dsRNA.
  • siRNA refers to a double-stranded RNA consisting of short strands in a range that is not toxic in cells, and is not limited to the full length 21 to 23 base pairs reported by TuscW et al. There is no particular limitation as long as the length is within a range that does not indicate the above, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, and more preferably. Suitably it may be 21-30 base pairs.
  • the expressed siRNA is transcribed and the final double-stranded RNA portion has a length of, for example, 15 to 49 base pairs, preferably 15 to 35 base pairs, more preferably 21 to 30 base pairs. It can be.
  • a suitable sequence preferably an intron sequence
  • double-stranded RNA having a hairpin structure (self-complementary 'hairpin' RNA (lipRNA))
  • lipRNA self-complementary 'hairpin' RNA
  • the DNA used for RNAi need not be exactly the same as the target gene, but it should be at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more (for example, 96% or more). , 97, 98, 99% or more).
  • the identity of the base sequence is determined by the algorithm of BLAST (Karl in S, Altschul SF, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268 (1990); Karl in S, Altschul) SF, Proc. Natl. Acad Science 'USA, 90: 5873-5877 (1993)).
  • a program called BLASTN based on the BLAST algorithm has been developed (Altschul SF, et al. 'J.
  • the part of the double-stranded RNA in dsRNA where RNAs are paired is not limited to those that are perfectly paired, but mismatches (corresponding bases are not complementary) and bulges (there is no corresponding base in one strand) ) May include an unmatched portion.
  • both the bulge and the mismatch may be contained in the double-stranded RNA region of the dsRNA where the RNAs are paired.
  • micro RNA or DNA to be loaded can also be used to suppress the expression of the mitokine gene. Examples of the compound that suppresses the function of midkine include an antibody that binds to midkine.
  • An anti-mitdkine antibody that suppresses the action of mitdocaine has already been developed and can be prepared by a similar method (Muramatsu, H. et al., Dev. Biol, 159, 392-402, 1993).
  • a monoclonal antibody against human midkine has been produced (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-085058).
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-085058 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-085058
  • the antibody of the present invention is not limited to this. The anti-mitdkine antibody will be described in more detail.
  • the anti-mitskine antibody used in this study can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using generally known means.
  • Monoclonal antibodies can be prepared according to known methods. For example, human mitokine cDNA has been cloned, and its DNA sequence and its encoded amino acid sequence have been reported.
  • Monoclonal antibodies can be raised against whole or part of the mitodocaine (mitsudocaine) protein antibody. Particularly preferred are antibodies raised against a soluble form of the human mitodkine protein antigen.
  • This study also includes antigen-binding fragments, such as F (ad ') 2 and Fad' fragments.
  • Hybridomas producing monoclonal antibodies are basically produced as follows, according to the method of Kohler and Milstein (Kohler, G. & C. Milstein, Nature 256: 495-497, 1975). it can. That is, the mitokine protein is used as a sensitizing antigen, and is immunized according to a normal immunization method.
  • the obtained immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method, and are subjected to a normal screening method. It can be prepared by screening monoclonal antibody producing cells.
  • the mitokine protein used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is a human midkine that has the midkine amino acid sequence described in Japanese Patent Application Laid-Open No. It is obtained by using.
  • Mitudocaine is not limited in the number of amino acid residues as long as it is used as an antigen for obtaining the antibody used in the present invention.
  • the desired mitokine protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • this purified midkine protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion. Animals, for example, mice, rats, hamsters and the like.
  • Immunization of an animal with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitizing antigen is diluted and suspended in an appropriate amount with PBS, physiological saline, or the like, and optionally mixed with a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, and emulsified. Administer several times daily.
  • a suitable carrier can be used at the time of immunization with a sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells include spleen cells in particular.
  • Known mammalian myeloma cells as the other parent cells fused with the above-mentioned immune cells include known cell lines, for example, P3 (P3x63Ag8.653) (Kearny, JF et a1: J. Immnol, , 123: 1548-1550, 1979), P3x63Ag8U.1 (YeIton, DE et a 1 .: Current Topics in Microbiology 81: 1-7, 1978), Ns-1 (Kohler, G. & Milstein, C .: Eur. J. Immunol., 6: 511-519, 1976), SP2 / 0 (Sulian, M.
  • the cell fusion of the above immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Milstein et al. (Gal fre, G. Milstein, C. Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981) and the like.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient culture solution in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus and the like are used.
  • PEG polyethylene glycol
  • Sendai virus Sendai virus
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added.
  • the ratio of the use of the immune cells to the myeloma cells is preferably, for example, 1 to 10 times the number of the immune cells to the myeloma cells.
  • the culture medium used for cell fusion for example, RPMI 1640 culture medium suitable for myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture medium used for this kind of cell culture can be used.
  • a serum supplement such as fetal serum (FCS) can also be used in combination.
  • a predetermined amount of immune cells and myeloma cells are mixed well in the above culture medium, and a PEG solution pre-warmed to about 37 ° C, for example, a PEG solution with an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • a PEG solution pre-warmed to about 37 ° C, for example, a PEG solution with an average molecular weight of about 1000 to 6000 is usually used.
  • the desired fused cells (hybridomas) are formed.
  • an appropriate culture solution, centrifuging, and removing the supernatant, the cell fusion agent and the like that are unfavorable for the growth of the hybridoma can be removed.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selection culture solution, for example, a HAT culture solution.
  • a normal selection culture solution for example, a HAT culture solution.
  • the culturing in the HAT culture solution is continued for a period of time sufficient to kill cells (non-fused cells) other than the target hybridoma, usually several days to several weeks.
  • a conventional limiting dilution method is performed, and a hybridoma screening and single cloning for producing a desired antibody are performed.
  • a recombinant antibody or a modified antibody can be used.
  • a recombinant antibody for example, as a monoclonal antibody, an antibody gene is cloned from a hybridoma, inserted into an appropriate vector, and introduced into a host.
  • -1 o-Recombinant antibodies produced using the recombination technique can be used (for example, Borrebaeck, C, AK & Larrick, JW, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • the modified antibody for example, a chimeric antibody or a humanized antibody can be used.
  • a chimeric antibody is obtained by ligating DNA encoding an antibody V region other than a human antibody to DNA encoding a human antibody C region, incorporating the DNA into an expression vector, introducing the resulting DNA into a host, and producing the antibody ( EP 125023, PCT W096 / 02576).
  • the antibody used in the wood invention may be an antibody fragment or a modified product as long as it binds to midkine and inhibits the activity of midkine.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ') 2, Fv, or a single chain Fv (scFv) in which the Fvs of an H chain and an L chain are linked by an appropriate linker.
  • compounds other than antibodies can be used in the present invention to prevent adhesion after laparotomy, as long as the activity of mitdocaine is suppressed.
  • a compound when the test compound is brought into contact with mitokine, the activity of midkine in the presence of the test compound is measured, and the activity of mitokine is significantly reduced as compared with the absence of the test compound. Identification can be made by selecting those that decrease.
  • the test compound include a cell extract, a purified protein or peptide, and an artificially synthesized low molecular compound, but the present invention is not limited thereto.
  • the test compound may be a compound that inhibits the binding between midkine receptor and mitodkine.
  • activities of mitdocaine are known.
  • a candidate for a compound that suppresses the activity of mitdocaine can be identified using the binding activity to midkine as an index. It can. That is, a test compound is brought into contact with mitokine, the binding activity of the test compound to mitokine is measured, and those exhibiting significant binding activity are selected to obtain candidate compounds that suppress the activity of midkine. be able to.
  • the compound that suppresses the expression of the mitokine gene and the compound that suppresses the function of the mitokine protein can also be formulated and administered by a known pharmaceutical production method.
  • suitable carriers or vehicles commonly used as pharmaceuticals for example, sterile water or physiological saline, vegetable oils (eg, sesame oil, olive oil, etc.), coloring agents, emulsifiers (eg, cholesterol), suspending agents (Eg, gum arabic), surfactant (eg, polyoxyethylene hydrogenated castor oil-based surfactant), solubilizer (eg, sodium phosphate), stabilizer (eg, sugar, sugar alcohol, albumin), or It can be administered to a living body in a dosage form suitable for effective administration to the living body, appropriately combined with a preservative (paraben), and the like.
  • sterile water or physiological saline for example, vegetable oils (eg, sesame oil, olive oil, etc.), coloring agents, emulsifiers (eg, cholesterol), suspending agents (Eg
  • Figure 1 shows the ratio of the adherence area of the rope to the wound created in the wild-type mouse and the mitokine gene knockout mouse.
  • Ratio of the adhesion area of the rope (%) Adhesion area of the omentum ⁇ 100 / area of the wound created] Is a graph showing the average value. A significant difference test was performed between the two uncorrelated groups.
  • FIG. 2 is a photograph (ac) and a diagram (d, e) showing a decrease in intraperitoneal adhesions in mitdocaine ( ⁇ / ⁇ ) mice.
  • b, c Adhesion of the net to the damaged abdominal wall. The area marked by the arrow was detached by surgery and examined for adhesions 7 days later. Representative examples of WT (b) and mitdocaine (-/-) mouse (c) are shown.
  • d, e Quantitative estimation of reduced net adhesions to the damaged abdominal wall.
  • Figure 3 is a photograph (ac) and a diagram (d) showing the localization of mitdocaine in the net.
  • a Anti-mitdocaine staining of the adhesion area on day 5. Dashed lines indicate adhesion sites. 0M, net; PW, abdominal wall. The bar is 100 meters.
  • b The square area is enlarged.
  • ant i-mit staining with anti-mitdkine, anti-Mac, staining with anti-monocyte-macrophage marker. Staining of intraperitoneal macrophages with bars, 100 Dlo c, anti-macrophage marker or anti-mitdkine antibody.
  • Bar, 50 50d Western blot analysis to identify midkine in the web. Lanes 1, 1, 3, and 4 show samples taken on days 0, 3, 5, and 7.
  • FIG. 4 shows photographs (a) and (b-e) showing reduction of inflammatory leukocyte migration in mitdocaine-,-/-and mice.
  • a Immunohistological staining of sections from the omentum on different days after wounding. Bar, 50 / x m. b ⁇ e, the number of macrophages (b, c) and the number of neutrophils (d, e) in the omentum (b, d) and the damaged abdominal wall (e). Black, WT; White, Midkine (-/-). * p ⁇ 0. 05; «p ⁇ 0.01. Statistical significance was assessed by Student's t-test. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Example 1 Influence of mitdocaine on adhesion after laparotomy Surgery of mitdocaine (-/-) mice was performed as described previously (Nakamura, E. et al., Genes Cels, 3, 811-822). , 1998). Heterozygous C57BL / 6J mouse Backcrossed 9 times. Next, they were crossed with each other to obtain a mitdkine, a mouse, and a mouse having a C57BL / 6; r background. C57BL / 6J mice were used as wild-type controls.
  • a 16-week-old wild-type mouse and a mitdocaine gene knockout mouse were administered 1 mg / kg i.p.
  • a peritoneal defect wound was created, and after hemostasis with bipolar, the abdomen was closed using nylon thread. Seven days later, the abdomen was opened by the same procedure, and the ratio of the adhesion area of the general rule to the created wound (the adhesion area of the general rule X 100 / the area of the created wound) was measured using the image analysis software Scion Image (Scion Corporation). .
  • mice Four-month-old female mice were used. Mice were anesthetized with an intraperitoneal injection of 40 mg / kg of Pentobarbi Yunlatorium (Abot Laboratories, North Chicago, Ill.) And laparotomy. Using a No. 11 surgical knife, a 5x5 thigh abrasion was made inside the left upper abdomen. After hemostasis with a bipolar cautery, the abdomen was closed with a 5-0 nylon suture. Seven days later, the laparotomy was re-opened under anesthesia of bentonbital sodium as described above, and the area of adhesion between the omentum and the injection site was determined using Zion Image Image Analysis Software (Sion Corporation (Sion Corporation)). ), City, Mass.).
  • a physiological saline solution (1 mg / ml) of human midkine or a physiological saline solution (1 mg / ml) of human serum albumin (Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) was applied to an osmotic pump (Alza Corporation). (Alza Corporation), Palo Alto, CA) and injected into mitdocaine (_ /-) mice.
  • a pump implanted under the back skin delivered a total of 90 sustained infusions over a 7-day period.
  • Mitudocaine expression as described previously (Murainatsu, H. et al., Dev. Biol,, 159, 392-402, 1993), resulted in the heparin binding protein from 1.7 mg of extract. Was determined by Western blot analysis. Anti-mouse mitdocaine (Muramatsu, H. et al., Dev. Biol, 159, 392-402, 1993) was produced as described.
  • mice of each genotype [WT or Mitochine (-/-)] were examined at each time point and the mean is shown with SD.
  • Mouse intraperitoneal macrophages were isolated as previously described (Xie, B., et al., J. Immunol. 152, 3637-3644, 1994).
  • Mitokine is mainly expressed during embryonic time and is only localized in adult tissues, and its expression often increases after various injuries (Horiba, M. et al., J. Cl. in.Invest., 105, 489-495, 2000; Sato, W., et al., J. I Marauding 1.167, 3463-3469 2001; Kadomatsu, K. et al., J. Cell Biol. 110, 607-616 1990, Mitsiadis, TA et al., Development 121, 37-51 1995, Yoshida, Y. et al., Dev.Brain Res. 85, 25-30 1995). Mitochondine was mainly expressed in the net.
  • FIG. 2a An example of immunohistochemical staining is shown in Figure 2a. Mitochon force-in was mainly present in macrophage-like cells and blood vessels. Mitokine expression by macrophages was not only confirmed by co-staining with anti-mitdkine antibodies and anti-macrophage marker (Figure 3b), but also isolated. Mitochondine expression in peritoneal macrophages was also confirmed (Fig. 3c). Western blot analysis revealed that mitodkine from the web was composed of both monomers and dimers and had a molecular weight of 30 kDa ( Figure 3d).
  • Mitokine stimulates neutrophil and macrophage migration directly and also indirectly through the induction of chemokines (Horiba, M. et al., J. Clin. Inves t., 105, 489-495, 2000, Takada, T. et al., J. Biochem., 122, 453-458, 1997, Sato, W., et al., J. Immunol. 167, 3463-3469 2001).
  • mitdocaine (-/-) mice neointima formation during ischemic injury (Horiba, M. et al., J. CI in. Invest., 105, 489-495, 2000) and nephritis (Sato, W.
  • recruited leukocytes may secrete factors that promote reticulo-adhesive activity.
  • mitdocaine stimulates the net directly as well cannot be completely ruled out.
  • intraperitoneal macrophages play a crucial role in organ-to-organ adhesions, and that mitodocaine is important for this adhesion by promoting macrophage migration and Z or activation. .
  • mammary plaques of the omentum are considered to be an important source of intra-peritoneal macula phage.
  • Mitudocaine is mainly expressed in midgestation embryos and its expression in adult tissues is limited (Kadoma tsu, K. et al., J. Cell Biol. 110, 607-616 1990; Mitsiadis, TA et al. , Development 121, 37-51 1995).
  • mitdocaine is a suitable target in that it has few side effects.
  • Anti-mitdkine antibodies and mitodkine antisense oligo DNA have already been developed and have been shown to be effective in inhibiting mitokine-dependent growth of tumor cells (Muramats u, H. et al., Dev. Biol,, 159, 392-402, 1993, Takei, Y. et al., Cancer. Res., 61 8486-8491, 2001).

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Abstract

ミッドカインの発現を抑えるオリゴヌクレオチドあるいはミッドカインの作用を抑える抗体が術後の腹腔内の癒着を予防に使用することが可能であることを見出した。

Description

明細書 開腹手術後の癒着の予防剤 技術分野
本発明は、 開腹手術後の癒着の予防に関する。 背景技術
術後の開腹術後、 癒着を生じる割合は報告により差があるが、 メジャーな開腹 術では 90%以上のケースに生じ、 婦人科の開腹術では 55-100%の患者に生じると 報告されている。 開腹術の術中操作の機械的刺激により腹腔内臓器に炎症を生じ、 腹腔内臓器間に、 または腹腔内臓器と腹壁間に癒着が生じ、 このことが原因で消 化管の通過障害、 絞扼などが生じ、 癒着性ィレウスにいたるものもある。 癒着性 ィレウスに至らないまでも慢性的な腹痛や、 女性では不妊の原因となり得る。 ま た、 その後の開腹術を非常に因難なものとする原因となる。 術後数十年経過して から癒着性ィレウスを生じるケースもしばしば見られ、 それに対する治療として 再び開腹し癒着剥離術を要する場合も多い。 しかしこの操作により更なる癒着を 生じる結果となる。 従来、 開腹術後の癒着は大きな間題点であつたが、 避けられ ない副作用として見過ごされていた。 近年、 これを防止するために腹腔内に留置 する吸収性の膜 (セプラフイルム；科研製薬) が開発されたが、 膜で隔てられた 部位にしか癒着防止効果は無く、 腹腔内全体に癒着防止効果を発揮することはで きない。 術後の腹腔内の癒着を予防する更なる技術が望まれている。 発明の開示
本研究は、 手術後の腹腔内癒着を予防する新規薬剤を提供することを課題とす る。 本発明者らは、 遺伝的背景の異なるマウス間で、 癒着の程度に差があるかを系 統的に調べた。 そして、 意外にもミツドカイン遺伝子ノックアウトマウス （ミツ ドカイン （- /_) マウス） では腹腔内に作った創部に対して腹腔内癒着が野性型 マウスに比較して有意に少なかった。 さらに、 ミツドカイン 、-卜、 マウスでは、 癒着は抑制されたが、 これらのマウスにミツドカインを与えると、 プロセスは再 開された。 マクロファージおよび好中球の網への遊走は、 ミツドカイン (-/-) マウスにおいて抑制された。 これら事実から、 本発明者は、 ミツドカインが腹腔 内癒着に決定的に関与しており、 それを抑制するための分子標的となることを見 出した。
ミツドカインは細胞の増殖、 移動、 生存を促進する成長因子であり (Muramatsu, T. Wi ley Encyclopedia Mol, 2086-2088, 2002、 Muramat su, T. , J. Biochem. , 132, 359-371, 2002) 、 好中球、 マクロファージを炎症刺激部位に誘導し、 炎症 反応の一翼を担うことが知られているが (Takada, T. et al. , J. Biochem. , 122, 453-458, 1997、 Horiba, M. et al. , J. Cl in. Invest. , 105, 489-495, 2000) 、 本知見により、 ミツドカインが癒着にも関与することが明らかとなった。
すなわち、 本発明は、 ミツドカインの合成あるいは作用を阻害することによつ て癒着を予防するものである。
ミッドカイン遣伝子ノックァゥトマウス (Nakamura, E. et al. , Genes Ce l l s, 3, 811-822, 1998) と対照とする野生型マウスで、 膜壁損傷後の癒着の形成度を 比較すると、 ノックァゥトマウスでは著しく低下していた (図 1 ) ノックァゥ トマウスと野生型マウスの間では、 ミツドカインの存在の有無のみが異なるので、 ミツドカインの発現を抑えるか、 作用を抑えれば、 癒着の予防 ·治療が可能であ る。
本発明における 「ミツドカイン遺伝子の発現の抑制」 には、 転写および翻訳の 抑制の双方が含まれる。 ミツドカイン遺伝子の発現を抑制するオリゴヌクレオチ ドとしては、 ミツドカイン遺伝子の転写産物と相補的な RNAまたは該 RNAをコー ドする DNAを用いることができる。 このような化合物の一つの態様は、 アンチセ ンスオリゴヌクレオチドである。
ミツドカインの発現を強力に抑えるアンチセンスオリゴヌクレオチドは既に開 発されている (Takei, Y. et al. , Cancer Res. , 61 8486-8491, 2001、 特願 200 2-142778、 特願 2002-47135、 2002-47136) ので、 これらを用いれば良い。 しかし、 本発明はこの特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドに限定されるものではない。 本明細書における 「オリゴヌクレオチド」 という用語は、 DNAおよび RNAのデ ォキシリボヌクレオチドおよびリポヌクレオチド構造のような天然に存在するォ リゴマーの核酸部分、 ならびに天然に存在する核酸に結合する能力のある人エア ナログの両方を包含する。 本発明のオリゴヌクレオチドは、 ホスホジエステル結 合によって、 またはメチルホスホネート、 ホスホロチォエー卜、 もしくは他の結 合により結合したアナログによって、 結合したリポヌクレオチドモノマーに基づ いていればよい。 またそれらは、 基本構造または他の修飾は変化しているが、 天 然に存在する DNA構造および RNA構造に結合する能力を保持したままである、 モ ノマ一部分を有していてもよい。 このようなオリゴヌクレオチドは、 出願人らに 周知の方法、 例えば、 市販の機械および Perkin- Elmer/Appl ieds Biosystem (Fos ter Ci ty, CA) より入手できる試薬を用いる方法によって調製することができる。 ホスホジエステル結合したオリゴヌクレオチドは、 血清でまたは細胞内部でヌ クレアーゼの作用を特に受けやすく、 そのため好適な態様において、 本発明のォ リゴヌクレオチドは、 ヌクレアーゼ抵抗性であることが明らかになつているホス ホロチォエート結合あるいはメチロホスホネート結合したアナログなどである （S tein et al,： Cancer Research 48; 2659, 1998) 。 出願人らが開発した方法も有 効である （特願 2002-47136) 。
本発明の他の態様において、 このアンチセンスオリゴヌクレオチドは、 発現構 築を用いて標的細胞を感染させることによって生成される RNA分子が、 ミツドカ イン mRNAにハイブリダィズすることにより、 その mRNAの翻訳を阻害し、 そして、 ミッドカインの合成を阻害するように選択される。
mRNA標的物を用いてこのオリゴヌクレオチドをハイプリッドすると、 相応する 遺伝子産物の発現を多重機構で阻害することができる。 「翻訳停止」 状態では、 標的 mRNAのタンパク質への翻訳が阻止される (Haeupt le et al.； Nucl. Acids. Res. 14.： 1427, 1986) 。 ホスホジエステル DNAまたはホスホロチォエート DNA オリゴヌクレオチドなどの場合では、 標的となる R A配列がその DNAオリゴマー にハイブリダィズするとすぐに、 細胞内 RNase Hがその標的 RNA配列を消化する ことができる （Walder & Walder, Proc. Nat l. Acad. Sci. USA. 85 : 5011, 198 8) 。 「翻訳停止」 状態におけるさらなる作用機構としては、 ある種のオリゴヌク レオチドは、 目的の遺伝子を含む二本鎖の標準的なゲノム DNAとともに 「トリツ プレクス」 すなわち三重らせん構造を形成することが可能で、 それによつて RNA ポリメラーゼによる転写が妨げられることが明らかである (Giovannange l i et a 1.： Proc. Nat l. Acad. Sci. USA. 90 : 10013, 1993) 。
ミッドカイン遣伝子の発現を抑制するォリゴヌクレオチドの他の一つの態様は、 ミッドカイン遺伝子の転写産物と相補的な dsRNAまたはこれをコ一ドする DNAで ある。 RNAiは、 標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖 RNA (以下 dsRNA) を細胞内に導入すると、 導入した外来遺伝子および標的内在性遺 伝子の発現がいずれも抑制される現象である。 細胞に約 40〜数百塩基対の dsRNA が導入されると、 ヘリ力一ゼドメインを持つダイサー（Dicer)と呼ばれる RNase I I I様のヌクレア一ゼが ATP存在下で、 dsRNAを 3 ' 末端から約 21〜23塩基対ずつ 切り出し、 s iRNA (short interference RNA) を生じる。 この s iRNAに特異的な夕 ンパク質が結合して、 ヌクレアーゼ複合体 （RISC： RNA-induced s i lencing compl ex) が形成される。 この複合体は s iRNAと同じ配列を認識して結合し、 RNasel l l 様の酵素活性によって s iRNAの中央部で標的遺伝子の mRNAを切断する。 また、 こ の経路とは別に s iRNAのアンチセンス鎖が mRNAに結合して RNA依存性 RNAポリメ ラーゼ (RsRP)のプライマ一として作用し、 dsRNAが合成される。 この dsRNAが再 びダイサ一の基質となって、 新たな s iRNAを生じて作用を増幅する経路も考えら れている。 s iRNA法のオリゴヌクレオチド （McManus, M. 1 , Sharp P. A. , Natu re, 3, 737-747) も本発明に適用可能である。
上記 RNAiは、 当初、 線虫において発見されたが （Fire, A. et al. Potent an d speci f ic genet ic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdi t is elegans. Nature 391, 806-811, (画）、 現在では、 線虫のみならず、 植物、 線形動物、 ショウジヨウバエ、 原生動物などの種々の生物において観察されてい る (Fire, A. RNA-triggered gene s i lenc ing. Trends Genet. 15, 358-363 (19 99)、 Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)、 Ha匪 ond, S. M. , Caudy, A. A. & Harmon, G. J. Post - transcript ional gene s i lenc ing by double-stranded RNA. Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001) , Zamore, P. D. RNA interference : l istening to the sound of s i lence. Nat S truct Biol. 8, 746-750 (2001) )。 これら生物では、 実際に外来より dsRNAを導 入することにより標的遣伝子の発現が抑制されることが確認され、 さらにはノッ クァゥト個体を創生する方法としも利用されつつある。
RNAi の登場当初は dsRNAはある程度の長さ (40塩基)以上でなければ効果がな いと考えられていたが、 米ロックフェラ一大の Tuschlらは 21塩基対前後の単鎖 dsRNA (siRNA)を細胞に導入すれば、 哺乳動物細胞においても PKRによる抗ウィル ス反応を起こさず、 RNAi の効果があることを報告し (Tuschl, Nature, 411, 49 4-498 (2001) ) RNAi は分化したヒトなどの哺乳動物細胞に応用可能な技術とし て俄然注目を集めることになつた。
ミツドカイン遺伝子の発現の抑制に RNAi を利用する場合においては、 dsRNA として s iRNAが使用されてもよい。 「siRNA」 は、 細胞内で毒性を示さない範囲の 短鎖からなる二重鎖 RNAを意味し、 TuscW ら （前掲） により報告された全長 21 〜23 塩基対に限定されるものではなく、 毒性を示さない範囲の長さであれば特 に限定はなく、 例えば、 15〜49塩基対と、 好適には 15〜35塩基対と、 さらに好 適には 21〜30塩基対とすることができる。 あるいは、 発現される si NAが転写 され最終的な二重鎖 RNA部分の長さが、 例えば、 15〜49塩基対、 好適には 15〜3 5塩基対、 さらに好適には 21〜30塩基対とすることができる。
本発明の DNAとしては、 標的配列のィンバーテツドリピートの間に適当な配列 (イントロン配列が望ましい） を挿入し、 ヘアピン構造を持つダブルストランド RNA (sel f-complementary 'hairpin' RNA (lipRNA) )を作るようなコンストラクト (Smi th, M A, et al. Nature, 407 : 319, 2000、 Wesley, S. V. et al. Plant J. 27 : 581, 2001、 Piccin, A. et al. Nucleic Acids Res. 29 :E55, 2001) を用い ることもできる。
RNAi に用いる DNAは、 標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、 少なく とも 70%以上、 好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは 90%以上、 最も好まし くは 95%以上 (例えば、 96, 97, 98， 99%以上) の配列の同一性を有する。 塩基配 列の同一性は、 カーリンおよびアルチユールによるアルゴリズム BLAST (Karl in S, Al tschul SF, Proc. Nat l. Acad. Sc i. USA, 87 : 2264-2268 (1990) ； Karl in S, Al tschul SF, Proc. Nat l. Acad Sc i' USA, 90 : 5873-5877 〈1993〉） を用 いて決定できる。 BLAST のアルゴリズムに基づいた BLASTN と呼ばれるプログラ ムが開発されている (Al tschul SF, et al. ' J. Mol. Biol. , 215 : 403 〈1990〉）。 BLASTNを用いて塩基配列を解析する場合は、 パラメ一夕一は、 例えば score = 10 0、 wordlength= 12とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合は、 各プログラムのデフォルトパラメ一夕一を用いる。 これらの解析方法の具体的な 手法は公知である。
dsRNAにおける RNA同士が対合した二重鎖 RNAの部分は、 完全に対合している ものに限らず、 ミスマッチ （対応する塩基が相補的でない）、 バルジ （一方の鎖 に対応する塩基がない） などにより不対合部分が含まれていてもよい。 本発明に おいては、 dsRNAにおける RNA同士が対合する二重鎖 RNA領域中に、 バルジおよ びミスマッチの両方が含まれていてもよい。 また、 マイクロ RNAまたはこれをコ ードする DNAも、 ミツドカイン遺伝子の発現の抑制に用いることが可能である。 また、 ミッドカインの機能を抑制する化合物としては、 ミッドカインに結合す る抗体が挙げられる。
ミツドカインの作用を抑える抗ミツドカイン抗体は既に開発されているので、 同様の手法で作成することができる （Muramatsu, H. et al. , Dev. Biol, , 159, 392-402, 1993) 。 また、 ヒトミッドカインに対するモノクローナル抗体も作成さ れている （特開 2002- 085058) 。 しかし、 本発明の抗体はこれに限定されるもの ではない。 抗ミツドカイン抗体についてより詳しく説明する。
本研究で使用される抗ミツドカイン抗体は、 一般的には公知の手段を用いて、 ポリクローナルまたはモノクローナル抗体として得ることができる。 モノクロ一 ナル抗体は、 公知の方法に準じて作製することができる。 例えばヒトミツドカイ ン cDNAはクロ一ニングされ、 その DNA配列とそれにコードされるァミノ酸配列が 報告されている。 モノクローナル抗体はミツドカイン (ミツドカイン） タンパク 抗体全体に対しても、 或いはその一部に対しても作製することができる。 特に好 ましいのは、 可溶性型のヒトミツドカインタンパク抗原に対して作製された抗体 である。 また、 本研究においては、 抗原結合断片、 例えば、 F (ad' ) 2や Fad'断片 を含む。
モノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、 基本的には、 ケーラーとミ ルスタインの方法 (Kohler, G. & C. Mi lstein, Nature 256 : 495-497, 1975) に 準じて、 以下のようにして作製できる。 すなわち、 ミツドカインタンパク質を感 作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法に従って免役し、 得られる免疫細 胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング 法により、 モノクローナル抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製 できる。
例えば、 抗体取得の感作抗原として使用されるミツドカインタンパクは、 ヒト ミッドカインについては、 特開平 9-95454に駝載のミッドカインアミノ酸配列を 用いることによって得られる。
ミツドカインは、 本発明で使用される抗体取得のための抗原として使用される 限りそのアミノ酸残基数を問わない。 ミツドカイン遺伝子配列を公知の発現べク 夕一系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または培 養上清中から目的のミツドカインタンパクを公知の方法で精製し、 この精製ミツ ドカインタンパクを感作抗原として用いればよい。 感作抗原で免疫される哺乳動 物としては、 特に限定されるものではないが、 細胞融合に使用する親細胞との適 合性を考慮して選択するのが好ましく、 一般には、 齧歯類の動物、 例えば、 マウ ス、 ラッ卜、 ハムスター等が使用される。
感作抗原を動物に免役するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することによ り行われる。 具体的には、 感作抗原を PBSや生理食塩水等で適量に希釈、 懸濁し たものを所望により通常のアジュバント、 例えば、 フロイント完全アジュバント を適量混含し、 乳化後哺乳動物に 14〜21日毎に数回投与する。 また、 感作抗原免 疫時に適当な担体を使用することができる。 このようにして免役し、 血清中に所 望の抗体レベルが上昇するのを確認した後、 哺乳動物から免疫細胞を取り出し細 胞融合に付すが、 好ましい免疫細胞として、 特に脾細胞が挙げられる。
上記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞と しては、 公知の各々の細胞株、 例えば P3 (P3x63Ag8. 653) (Kearny, J. F. et a 1. ： J. Immnol, , 123 : 1548-1550, 1979) 、 P3x63Ag8U. 1 (Ye I t on, D. E. et a 1.： Current Topics in Microbiology 81 : 1-7, 1978) 、 Ns- 1 (Kohler, G. & Mi lstein, C. ： Eur. J. Immunol. , 6 : 511-519, 1976) 、 SP2/0 (S ulian, M. et a 1 : Nature, 276 : 269-270, 1978) 、 F0 (de St. Groth, S. F. & Scheidegger, D.： J. Immnol. Methods, 35 : 1-21, 1980) 、 S194 (Trowbridge, I. S.： J. Exp. Med. , 148 : 313-323, 1978) 、 R210 (Gal re, G. et al，： Nature, 277 : 131-133 1979) 、 等が好適である。 上記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は、 基本的には、 公知の方法、 例え ば、 ミルスティンらの方法 （Gal fre, G. Mi lstein, C. Methods Enzymol. 73 : 3-46, 1981) 等に準じて行うことができる。 具体的には、 前記細胞融合は、 例え ば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。 融合促進剤とし ては、 例えば、 ポリエチレングリコール (PEG) 、 センダイウイルス等が使用され、 さらに、 融合効率を高めるため、 ジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用す ることができる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ細胞に対して、 免疫細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。 細胞融合に用いる培養液としては、 例 えば、 ミエローマ細胞株に好適な RPMI 1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種 の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 （F CS) 等の血清補助液を併用することもできる。
細胞融合は、 免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を上記培養液中でよく混合 し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液、 例えば,平均分子量 1000〜6000程度の PE G溶液を、 通常、 30〜60¾ (w/v) の濃度で添加し 混合することによって目的の 融合細胞 ひ、イブリドーマ） が形成される。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して、 上清を除去する操作を繰り返すことにより、 ハイプリドーマの生育に 好ましくない細胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリドーマは、 通常の選択培養液、 例えば、 HAT培養液で培養するこ とにより選択される。 当該 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以 外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間、 通常数日〜数週間継続する。 次いで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリドーマ スクリーニング及び単一クローニングが行われる。
また、 本発明では、 組み換え型抗体や改変抗体が使用できる。 組み換え型抗体 としては、 例えば、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリドーマか らクローニングし、 適当なベクターに組み込んでこれを宿主に導入し、 遺伝子組 - 1 o - み換え技術を用いて産生させた組み換え型抗体を用いることができる （例えば、 B orrebaeck, C, A. K. & Larrick, J. W. , THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Publ ished in the Uni ted Kingdom MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990) 。 改変抗 体としては、 例えばキメラ抗体、 ヒト型化抗体が使用できる。 キメラ抗体は、 ヒ ト抗体以外の抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域をコードする DNAと 連結し、 これを発現べクタ一に組み込んで宿主に導入し、 産生させることにより 得られる (EP 125023, PCT W096/02576) 。
木発明で使用される抗体は、 ミッドカインに結合しミッドカインの活性を阻害 するかぎり、 抗体の断片や修飾物であつてもよい。 例えば、 抗体の断片として、 F ab、 F (ab' ) 2、 Fvまたは H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングル チェイン Fv (scFv)が挙げられる。
また、 ミツドカインの活性を抑制する限り、 抗体以外の化合物も、 本発明にお ける、 開腹手術後の癒着を防止するために用いることができる。 このような化合 物は、 被検化合物をミツドカインと接触させ、 被検化合物の存在下におけるミッ ドカインの活性を測定し、 被検化合物の非存在下と比較して、 有意にミツドカイ ンの活性を低下させるものを選択することにより、 同定することができる。 被検 化合物としては、 細胞抽出液、 精製タンパク質、 もしくはペプチド、 人工的に合 成された低分子化合物、 などが挙げられるが、 本発明は、 これらに制限されない。 被検化合物は、 ミッドカイン受容体とミツドカインとの結合を阻害する化合物で あってもよい。 ミツドカインの種々の活性は公知である。 例えば、 好中球および マクロファージの遊走については、 文献 （Muranmtsu, T.， J. Biochem. , 132, 3 59-371, 2002, Kadomatsu, K. et al. , Biochem. Biop ys. Res. Commun. 151, 1312-1318 1988、 Horiba, M. et al. , J. Cl in. Invest. , 105, 489-495, 2000、 Takada, T. et al. , J. Biochem. , 122, 453-458, 1997, Sato, W. , et al. , J. Immunol. 167, 3463-3469 2001) に開示されている。 また、 ミツドカインの活性 を抑制する化合物の候補は、 ミッドカインとの結合活性を指標に同定することが できる。 即ち、 被検化合物をミツドカインと接触させ、 被検化合物のミツドカイ ンとの結合活性を測定し、 有意な結合活性を示すものを選択することにより、 ミ ッドカインの活性を抑制する化合物の候補を得ることができる。
ミツドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物やミツドカインタンパク質の機能 を抑制する化合物は、 公知の製剤学的製造法によって、 製剤化して投与すること もできる。 例えば、 薬剤として一般的に用いられる適当な担体、 または媒体、 例 えば滅菌水や生理食塩水、 植物油 （例、 ゴマ油、 ォリーブ油等）、 着色剤、 乳化 剤 （例、 コレステロール)、 懸濁剤 （例、 アラビアゴム）、 界面活性剤 （例、 ポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油系界面活性剤）、 溶解補助剤 （例、 リン酸ナトリウ ム）、 安定剤 (例、 糖、 糖アルコール、 アルブミン）、 または保存剤 （パラベン）、 等と適宜組み合わせて、 生体に効果的に投与するのに適した剤型にて生体に投与 することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 野生型マウスとミツドカイン遺伝子ノックアウトマウスでの作成創に 対する大綱の癒着面積の割合を [大綱の癒着面積の割合 （%) =大網の癒着面積 X 10 0/作成創の面積]で計算し、 その平均値を示したグラフである。 相関のない 2群 の有意差検定を行った。
図 2はミツドカイン (-/-) マウスにおける腹腔内癒着の減少を示す写真 (a-c) および図 (d, e) である。 a、 部分的肝切除後 2 週間で認められた腸の癒着。 WT (n= 10) およびミツドカイン (-/-) (n= 10) マウスにおいて認められた代表的 な例を示す。 b、 c、 損傷した腹壁への網の癒着。 矢印で示した領域は、 手術によ つて剥離され、 7 日後に癒着を調べた。 WT (b) およびミツドカイン （- /- ) マウ ス （c) の代表的な例を示す。 d、 e、 損傷した腹壁に対する網の癒着の減少の定 量的推定。 d、 WT (n= 10) およびミツドカイン （- /- ) (n= 10) マウスにおける 癒着領域を欠損領域に対する百分率として示す。 e、 無処置のまま （n= 10)、 ま たはミツドカイン （n= 10) もしくはゥシ血清アルブミン （BSA) (n= 10) を注入 した WTおよびミツドカイン （- /- ) マウスにおける癒着の発生率。
* p<0. 05； «p<0. 01。 統計学的有意性は、 dではスチューデント t検定におい て、 そして eではフィッシヤーの直説法によって評価した。
図 3は、 網におけるミツドカインの局在を示す写真（a- c)および図（d)である。 a、 5 日目での癒着領域の抗ミツドカイン染色。 破線は癒着部位を示す。 0M、 網； PW、 腹壁。 バーは 100 mである。 b、 四角の領域を拡大した。 ant i-ミツド 力イン、 抗ミツドカインによる染色； ant i- Mac、 抗単球-マクロファ一ジマーカ 一による染色。 バー、 100 Dlo c、 抗マクロファージマーカーまたは抗ミツドカ ィン抗体による腹腔内マクロファージの染色。 バー、 50 Πΐο d、 網におけるミ ッドカインを同定するためのウェスタンブロッ卜分析。 レーン 1、 1、 3および 4 は、 0、 3、 5および 7日目に採取した試料を示す。
図 4は、 ミツドカイン 、-/-、 マウスにおける炎症性白血球遊走の減少を示す 写真（a)および図（b-e)である。 a、 創傷後異なる日の網からの切片の免疫組織化 学染色。 バー、 50 /x m。 b~e, 網 （b、 d) および損傷した腹壁 （ e) に存在す るマクロファージ数 （b、 c)、 および好中球数 （d、 e)。 黒い部分、 WT ;白い部分、 ミッドカイン （-/-)。 *p<0. 05； «p<0. 01。 統計学的有意性はスチューデント t検定によって評価した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明は、 これらの実施例 に限定されるものではない。
[実施例 1 ] ミツドカインの開腹手術後の癒着に与える影響 ミツドカイン （- /- ) マウスは既に記述されている通りに作製した （Nakamura, E. e t al.， Genes Cel l s, 3， 811-822, 1998) 。 ヘテロ接合体を C57BL/6Jマウ スに 9 回戻し交配した。 次に、 それらを互いに交配させて、 C57BL/6;r バックグ ラウンドを有するミツドカイン 、-卜、 マウスを得た。 C57BL/6J マウスは野生型 対照として用いた。
( 2 ) 試験例 1
16週齢の野生型マウスとミツドカイン遺伝子ノックアウトマウスにケ夕ラール を 1 mg/kg腹腔内投与し全身麻酔を施行後、 清潔操作下に開腹し左側上腹部腹壁 の腹腔内側に 5 X 5 匪の腹膜欠損創を作成し、 バイポーラで止血後ナイロン糸を 用いて閉腹した。 7日後に同様の処置によって開腹し、 画像解析ソフト Sc ion Ima ge (Sc ion Corporat ion) にて作成創に対する大綱の癒着面積の割合 （大綱の癒着 面積 X 100/作成創の面積） を測定した。
この値は野生型マウスでは 34. 6%、 ノックアウトマウスでは 2. 33%であり、 有意 にノックアウトマウスで低かった （図 1 ) 。
( 3 ) 試験例 2
4 ケ月齢の雌性マウスを用いた。 マウスをペントバルビ夕一ルナトリゥム (ァ ボットラボラトリーズ （Abbot t Laborator i es) , ノースシカゴ、 ィリノィ州) (4 0 mg/kg) の腹腔内注射によって麻酔して、 開腹した。 11 番の手術用ナイフを用 いて、 左上腹部の内側に 5 X 5 腿の擦過傷を作製した。 両極性焼灼器によって止 血した後、 腹部を 5-0ナイロン縫合糸によって閉じた。 7 日後、 上記のようにべ ントバルビタールナトリゥムの麻酔下で再度開腹して、 網と注射部位の癒着領域 をシオンィメージ画像分析ソフトウェアを用いて決定した (シオンコーポレーシ ヨン （Sc ion Corporat ion) , シティ、 マサチューセッツ州）。 ポンプ試験では、 ヒトミッドカインの生理食塩液溶液 （1 mg/ml) またはヒト血清アルブミン （和 光純薬、 大阪、 日本） の生理食塩液溶液 （1 mg/ml ) を、 浸透圧ポンプ （アルザ コーポレーション （Al za Corporat ion) , パロアルト、 カリフォルニア州） を用 いてミツドカイン （_/- ) マウスに注入した。 背部皮膚下に埋め込まれたポンプ は、 7 日間にわたって全体で 90 を持続的に注入した。 ヒトミッドカインは 酵母において産生され、 セルシグナルズインク （Cel l Signal s Inc. ) の Sakuma 博士の好意により提供された。 部分的肝切除の場合、 マウスを用量 40 mg/kg体 重のペントバルビタールによって麻酔して、 左右中葉および左側葉を外科的に切 除した。 癒着は 2週間後に調べた。
その結果、 部分的肝切除を行った際に、 本発明者らは、 腸の癒着がミツドカイ ン （- /- ) マウスでは野生型 （WT) マウスほど重度ではないことを発見した （図 2a) o 癒着は全ての WT マウスにおいて起こったが、 ミツドカイン (-/-) マウス の約 50%は癒着を示さなかった。 詳しい分析を行うため、 本発明者らは網の癒 着アツセィを開発した。 ミツドカイン 、-卜、 または WTマウスの腹壁に創傷を作 製した。 WTマウスでは （図 2b)、 損傷の 7日後、 網は腹壁に癒着したが、 ミツド 力イン (-/-) マウス （図 2c) では癒着は全くまたはほとんど起こらなかった。 癒着した網の領域の平均値 （図 2d) および癒着の発生率 （図 2e) は、 ミツドカ イン (-/-) マウスでは WTマウスより有意に低かった。 ミツドカインを浸透圧ポ ンプによってミツドカイン (-/-) マウスに皮下投与すると、 癒着は有意に元に 戻った。 ゥシ血清アルブミンを投与しても作用を示さなかった (図 2e)。 この知 見は、 ミッドカインの喪失が. ミツドカイン (-/-) マウスにおける癒着の減少 に実際に関与していることを確認した。 これらの全ての結果から、 本発明者らは、 ミツドカインが腹腔内癒着に根本的に関与しているという結論に達する。
[実施例 2 ] 癒着領域におけるミツドカインの発現
ミツドカインの発現は、 既に記述されているように (Murainatsu, H. e t al. , Dev. Biol, , 159, 392-402, 1993)、 抽出物 1. 7 mgに由来するへパリン結合タン パク質のウェスタンブロット分析によって決定した。 抗マウスミツドカイン (Mu ramatsu, H. et al. , Dev. Biol, , 159, 392-402, 1993) は記述通りに産生した。 ァフィ二ティ精製ゥサギ抗マウスミツドカインを第一抗体として、 そして西洋ヮ サビペルォキシダーゼ標識ァフィ二ティ精製ャギ抗ゥサギ IgG (ジャクソンィム ノリサーチラボラトリーズ (Jackson InuiiunoRe search Laboratories) , ウェスト グローブ、 ペンシルバニア州） を二次抗体として用いる免疫組織化学分析 （Naka mura, E. et al. , Genes Cel ls, 3, 811-822, 1998) によって、 ミツドカイン発 現部位が明らかとなった。 染色は、 ジァミノべンジジン四塩酸 （アマシャムファ ルマシアバイオテック （Amersham Pharmacia Biotech)、 東京、 日本） によって 可視化した。 フルォレセインイソチオシァネート標識ャギ抗ゥサギ IgG (シグマ (Sigma)、 セントルイス、 ミズーリ州） も同様に第二抗体として用いた。 マクロ ファージマーカーまたは好中球マーカーの染色は、 同じように行った；切片はラ ット抗マウス単球-マクロファージマーカー F4/80 (セロテック (Serotec Ltd) , オックスフォード、 イギリス） またはラット抗マウス好中球マーカー 7/4 (セロ テック） に対するモノクローナル抗体によって染色した後、 西洋ヮサビペルォキ シダ一ゼ標識ャギ抗ラット IgG (ジャクソンィムノリサ一チラポラトリーズ） と 共にインキュベートした。 倍率 400倍での視野における細胞数を計数した。 全体 で 12 視野を調べて、 平均値を得た。 それぞれの遺伝子型 [WT またはミツドカイ ン (-/-) ]のマウス 4匹をそれぞれの時点で調べて、 平均値を SDと共に示す。 マウスの腹腔内マクロファージは、 既に記述されているとおりに単離した (Xie, B. , et al. , J. Immunol. 152, 3637-3644, 1994)。
ミツドカインは、 胚の時期に主に発現され、 成体組織では限定された部位に存 在するに過ぎず、 その発現はしばしば様々な損傷後に増加するが （Horiba, M. e t al. , J. Cl in. Invest. , 105, 489-495, 2000、 Sato, W. , et al. , J. I匪画 1. 167, 3463-3469 2001、 Kadomatsu, K. et al. , J. Cel l Biol. 110, 607-616 1990、 Mi ts iadis, T. A. et al. , Development 121, 37-51 1995、 Yoshida, Y. et al. , Dev. Brain Res. 85, 25-30 1995)、 癒着の過程において、 ミツドカイ ンは網において主に発現された。 免疫組織化学染色の例を図 2a に示す。 ミツド 力インは、 マクロファージ様細胞および血管に主に存在した。 ミツドカインがマ クロファージによって発現されることは、 抗ミツドカイン抗体および抗マクロフ ァージマーカ一との同時染色によって確認されたのみならず （図 3b)、 単離され た腹腔マクロファージにおけるミツドカイン発現を調べること （図 3c) によつ ても確認された。 ウェスタンプロット分析から、 網からのミツドカインが単量体 および二量体の双方で構成され、 分子量は 30 kDaであることが判明した （図 3 d)。
本発明者らは、 癒着領域周辺の網におけるマクロファージの数が損傷後 3日目 および 5日目でピークに達したことを認め、 癒着の際にこれらの部位へ細胞が動 員されることを示している (図 4a) 一つのマクロファージ源は網における乳状 斑である （Mandache. E. et al. , Morphol. Embryo 1. (Bucur) 31, 137-142 198 5 遊走は WTマウスではミツドカイン (-/-) マウスより顕著であった。 定量的 評価によってこれらの知見を確認した （図 4b)。 網への好中球の遊走に関して、 本発明者らは、 同じ結論に達した （図 4d)。 損傷した腹壁への白血球の遊走は、 WTおよびミツドカイン (-/-) マウスのあいだでごくわずかな差を認めた (図 4c および e)。 産業上の利用の可能性
ミツドカインは、 好中球およびマクロファージの遊走を直接、 そしてまたケモ カインの誘導によって間接的に促進する (Hor iba, M. et al. , J. Cl in. Inves t.， 105, 489-495, 2000、 Takada, T. et al. , J. Biochem. , 122, 453-458, 19 97、 Sato, W.， et al. , J. Immunol. 167, 3463-3469 2001)。 ミツドカイン （― /-) マウスにおいて、 虚血性損傷時の新生内膜形成 (Horiba, M. et al. , J. CI in. Invest. , 105, 489-495, 2000) および腎炎 （Sato, W. , et al. , J. Immuno 1. 167, 3463-3469 2001) は、 野生型マウスと比較して、 炎症性白血球動員の同 時減少と共に有意に抑制される。 本発明者らは、 以下の一連の事象が癒着の場合 に起こると考えている。 損傷した腹壁は、 網を活性化する因子を分泌して、 白血 球の浸潤を誘発する。 炎症性白血球の網への動員は、 血管に存在し、 マクロファ ージによっても分泌されるミツドカインによって促進される。 マクロファージ内 のミツドカインも同様にその活性化に関与しうる。 マクロファージが動員された 後、 それらによって分泌されたミツドカインは、 白血球の動員をさらに加速する であろう。 動員された白血球は、 網の癒着活性を促進する因子を分泌する可能性 がある。 ミツドカインが同様に網を直接刺激する可能性は完全に排除することが できない。 本発明者らは、 臓器間癒着において、 腹腔内マクロファージが重大な 役割を有すること、 そしてミツドカインがマクロファージの遊走および Zまたは 活性化を促進することによってこの癒着にぉレ ^て重要であると考える。 この点に おいて、 網の乳状斑は、 重要な腹腔内マク口ファ一ジ源であると考えられること を指摘すべきである。
腹腔内癒着の形成における重要な要因としてミツドカインが同定されたことは、 プロセスの背後のメ力ニズムおよびその予防法に対して新たな洞察を与える。 特 に、 ミッドカインの活性化またはその生合成を阻害する治療戦略は、 予防におい て有用となるであろう。 最近、 腹腔内癒着を防止するために、 腹腔に残って吸収 される膜が導入されている （Beck, D. E. Eur. J. Surg. Suppl. 577, 49-55 19 97)。 しかし、 技法は、 膜によって隔てられた臓器のみに適用され、 腹腔内癒着 を予防する他の有効な手段が緊急に必要である。 そのような癒着を防止するため に様々な実験が行われている (Vr i j land, W. W. et al.， Ann. Surg. 235, 193-1 99 2002、 Gimbel. M. L. et al. , Arch. Surg. 136, 311-317 2001、 Cervantes- Sanchez, C. R. et al. , J. Surg. Res. 110, 207-210 2003、 Nagler, A. et a 1. , Am. J. Obstet. Gynecol. 180, 558- 563 1999)。 ミツドカインは妊娠中期 胚において主に発現され、 成体組織におけるその発現は限定されている （Kadoma tsu, K. et al. , J. Cel l Biol. 110, 607-616 1990、 Mi tsiadis, T. A. et al. , Development 121, 37-51 1995)。 その発現様式のために、 ミツドカインは副作 用がほとんどないという点において適した標的である。 抗ミツドカイン抗体およ びミツドカインアンチセンスオリゴ DNAは既に開発されており、 腫瘍細胞のミツ ドカイン依存的増殖を阻害するために有効であることが判明している （Muramats u, H. et al. , Dev. Biol, , 159, 392-402, 1993、 Takei, Y. et al. , Cancer. R es.， 61 8486-8491, 2001)。

Claims

請求の範囲
1 . ミツドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物を有効成分とする、 開腹手術後 の癒着を防止するための薬剤。
2 . ミツドカイン遺伝子の発現を抑制する化合物がオリゴヌクレオチドである、 請求項 1に記載の薬剤。
3 . ミツドカインタンパク質の機能を抑制する化合物を有効成分とする、 開腹手 術後の癒着を防止するための薬剤。
4. ミツドカインタンパク質の機能を抑制する化合物がミッドカインに結合する 抗体である、 請求項 3に記載の薬剤。
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