WO2004077944A1 - 殺センチュウ剤 - Google Patents

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Japan Applied Microbiology Research Institute Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a centrifugal pesticide extracted and purified from a culture of a bacterium belonging to the genus Aspergillus sp. Background art
  • Japanese Patent Publication No. 2-32321 proposes a method for exterminating Aspergillus using a bacterium belonging to the genus Aspergillus (Aspergillus sp.) Or a metabolite thereof, and belonging to the genus Aspergillus.
  • Aspergillus melius JAM 402 (Aspergillus me Ileus, picture 022, FERM BP-726) is described as a fungus.
  • this patent document merely suggests the presence of glycosides in the metabolites of the fungus, and studies on the extraction and purification of a component having a centrifugal activity from the culture broth of the fungus. Absent.
  • an object of the present invention is to provide a centrifugal agent extracted and purified from a culture solution of a bacterium belonging to the genus Aspergillus sp. Disclosure of the invention
  • the centrifugal pesticide of the present invention which has been made in view of the above points, is characterized in that the culture filtrate of a bacterium belonging to the genus Aspergillus sp. And then extract with a first organic solvent that separates from water.Partition and extract the obtained first organic solvent-extracted fraction with an aqueous alkaline solution.
  • the method is characterized in that an organic acid fraction extract obtained by partitioning and extracting with a second organic solvent which is separated from water after reducing the water to H7 or less is used as an active ingredient.
  • the centrifugal agent according to claim 2 is characterized in that, in the centrifugal agent according to claim 1, the centrifugal agent is pine wood.
  • centrifugal agent according to claim 3 is the centrifugal agent according to claim 1, wherein the bacterium belonging to the genus Aspergillus is Aspergillus melius JAM4022 (Aspergillus mel leus JAM4022). , FERM BP-726).
  • centrifugal pesticide according to claim 4 is the centrifugal pesticide according to claim 1, wherein both the first organic solvent and the second organic solvent are ethyl acetate. I do.
  • centrifugal agent according to the present invention is characterized in that penicillic acid is used as an active ingredient, as described in claim 5.
  • FIG. 1 is a drawing showing a process of extracting a component having a pine-killing activity in an experimental example of an example.
  • the centrifugal pesticidal agent of the present invention is obtained by partitioning and extracting a culture filtrate of a bacterium belonging to the genus Aspergillus (Aspergillus sp.) With a first organic solvent which is separated from water after adjusting the pH to 7 or less as necessary.
  • the first organic solvent extraction fraction obtained is partitioned and extracted with an aqueous alkaline solution, the resulting aqueous extract extract is adjusted to pH 7 or lower, and then partitioned and extracted with a second organic solvent that separates from water. Characterized in that an extract of the organic acid fraction obtained by the above is used as an active ingredient.
  • the centrifugal pesticide of the present invention is characterized by using penicillic acid as an active ingredient.
  • penicillic acid Penicil ic acid, 3-methoxy-5-methhy1-4-oxo-2, 5-hexadenoenoic acid
  • JAM means the strain classification symbol of Omicron Co., Ltd. (1APAN ⁇ PPLIDE RESEARCH MICROORGANISMS).
  • the specific procedure for obtaining an organic acidic fraction extract from a culture filtrate of a bacterium belonging to the genus Aspergillus sp. Is a general procedure for extracting and purifying an acidic fraction extract containing an organic acid. It may be done in accordance with a suitable method.
  • Ethyl acetate can be suitably used as an organic solvent that separates from water that can be used as the first organic solvent and the second organic solvent.
  • As the alkaline aqueous solution a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution can be suitably used.
  • hydrochloric acid may be used.
  • the obtained organic acidic fraction extract is subjected to a chromatography method using column chromatography or thin-layer chromatography, which is usually employed for the isolation and purification of natural organic compounds.
  • the centrifugal pesticide of the present invention may be further fractionated in this manner, such as an organic acidic fraction extract comprising a plurality of components, and individually isolated and purified benicillic acid. And those containing an organic compound as an active ingredient.
  • benicillic acid is not limited to one isolated and purified from an organic acidic fraction extract, but may be one obtained by chemical synthesis or the like. It is good.
  • the centrifugal pesticide of the present invention contains an active ingredient in an optional amount, It is formulated into various dosage forms, such as powders and liquids, using the preparations and put into practical use.
  • a liquid carrier or a solid carrier can be used depending on the purpose of use.
  • the liquid carrier include water, alcohols, ketones, and ethers.
  • Solid carriers include mineral powder, alumina, sulfur powder, activated carbon, and the like.
  • Additives include emulsifiers, suspending agents, stabilizers, spreading agents, penetrants, dispersants and the like. The amount used can be determined as appropriate according to the dosage form, damage situation, application method, application location, and the like.
  • the centrifugal pesticide of the present invention is effective against pine wood centrifugal, and is expected to have an effect also on cattle cypress centrifugal, cyst centrifugal and kitanegusarecentiyu.
  • the centrifugal agent of the present invention may contain other active ingredients having centrifugal activity.
  • Aspergillus melius JAM4022 (Aspergillus meleus JAM4022, FERM BP-726) as a solid medium in a Petri dish (39 parts by weight of PDA medium manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., distilled water 100%) 0 parts by weight) and cultured at 25 for 2 weeks until a sufficient amount of conidia was generated. Thereafter, sterile distilled water was poured onto the solid medium, and the suspension was stirred so that the culture produced on the surface of the medium was suspended in the liquid.
  • the liquid malt medium [30 parts by weight of malt extract (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.), 3 parts by weight of peptone (manufactured by Far East Pharmaceutical Co., Ltd.), 20 parts by weight of glucose, and 100 parts by weight of distilled water]
  • the suspension was added, and the cells were cultured at 24 ° C for 28 days at the place.
  • a component having a pine-killing activity was extracted and purified from the obtained culture solution as follows.
  • the mixing ratio of a liquid indicates a volume ratio.
  • the resulting culture was filtered using filter paper (No. 5) to separate the culture filtrate from the residue (cells).
  • the pH of the obtained culture filtrate was adjusted to 2 to 3 by adding 2N hydrochloric acid, and the culture filtrate and ethyl acetate were shake-extracted at a ratio of 1: 3 using a separatory funnel and allowed to stand.
  • an ethyl acetate extract fraction in the upper layer and a hydrochloric acid aqueous solution fraction in the lower layer were obtained.
  • Ethyl acetate was newly added to the lower hydrochloric acid aqueous solution fraction at the same ratio as above, and the same operation was repeated twice to obtain each ethyl acetate extract fraction.
  • the obtained ethyl acetate extract fractions for three extractions were mixed to obtain a first ethyl acetate extract fraction.
  • a large amount of culture solution was prepared. That is, 30 L of the liquid malt medium described above was dispensed into 120 flasks in 500 mL portions, and 0.1 L mL of the suspension obtained in the same manner as above was added to each flask, followed by culturing. The obtained culture solution was treated in the same manner as above to obtain a first ethyl acetate extracted fraction.
  • the 1st ethyl acetate extraction fraction and the saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution were shaken and extracted at a ratio of 1: 1 using a separatory funnel, and then allowed to stand still.
  • the upper ethyl acetate fraction and the lower aqueous sodium hydrogen carbonate solution were extracted. An extraction fraction was obtained.
  • a second ethyl acetate extract fraction was obtained, dehydrated with sodium sulfate, concentrated to dryness, and concentrated to dryness to obtain a red extract as an organic acidic fraction extract 5.51 g of a solid was obtained.
  • the extract of the organic acid fraction was found to have a fungicidal activity of 7.0% at a concentration of 500 ppm and 50.0% at a concentration of 100 ppm.
  • the organic acid fraction extract was subjected to silica gel column chromatography using Wakogel C-200 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: inner diameter 3.5 cm, length 40 cm). Hexane-ethyl acetate is used as the solvent, and the mixing ratio of these is changed by 10 between 100: 0 and 0: 100, and 1L of each solvent is mixed at each mixing ratio. 1L of the eluate is collected and concentrated to dryness. did.
  • Table 1 shows the high activity of pine moss, and the activity of the product with a large amount was shown in Table 1.
  • the first 500mL elution fraction using that solvent is indicated as 1, and the latter 500mL elution fraction is indicated as 2.
  • Hexane-acetone (7: 3) was used as the developing solvent for fraction 11
  • hexane-acetone (6: 4) was used for fraction 8 and fraction 12.
  • Each of the fractionated spots was picked up, extracted and separated, and the pinewood nematode activity and the content of each substance were examined. Table 3 shows the results.
  • pine mortar activity was evaluated as follows. That is, 100 zL to 500 L of acetone or methanol is dissolved in 1 Omg of sample (concentrated to dryness) as appropriate, and dissolved or suspended. The stock solution of the test solution was set as 0.000 ppm. Prepare this stock solution at twice the test concentration, add 100 L to each well of a 96-well microplate, and add pine wood nematode suspension in distilled water (400-1000 ZmL) Calorie 100 / L, 25. C.
  • Figure 1 shows the extraction process diagram in the experimental example.
  • the present invention has industrial applicability in that it can provide a centrifugal pesticide extracted and purified from a culture solution of a bacterium belonging to the genus Aspergillus sp.

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Abstract

本発明の課題は、アスペルギルス属(Aspergillus　sp.)に属する菌の培養液から抽出・精製される殺センチュウ剤を提供することである。そして本発明の殺センチュウ剤は、アスペルギルス属(Aspcrgillus　sp.)に属する菌の培養濾液を必要に応じてpH7以下にしてから水と分離する第1の有機溶媒で分配抽出し、得られる第1有機溶媒抽出画分をアルカリ性水溶液で分配抽出し、得られるアルカリ性水溶液抽出画分をpH7以下にしてから水と分離する第2有機溶媒で分配抽出することで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とするものである。また、本発明の殺センチュウ剤は、ペニシリン酸を有効成分とすることを特徴とするものである。

Description

明細書 殺センチユウ剤 技術分野
本発明は、 ァスペルギルス属 （Aspergi l lus sp. ) に属する菌の培養液から抽 出 ·精製される殺センチユウ剤に関する。 背景技術
マツノマダラカミキリを媒介昆虫として松に寄生するマツノザィセンチユウ、 キユウリゃキャベツに寄生するネコブセンチユウ、 ジャガイモに寄生するシスト センチユウなどに対する種々の殺センチユウ剤が開発されて市販されている。 例えば、 特公平 2— 3 2 2 5 1号公報には、 ァスペルギルス属 (Aspergi l lus sp. ) などに属する菌またはその代謝産物を用いたセンチユウの駆除方法が提案 されており、 ァスペルギルス属に属する菌としてァスペルギルス メリウス J A M 4 0 2 2 (Aspergi l lus me I leus 画 022, FERM BP- 726) などが記載されてい る。 しかしながら、 この特許文献では、 菌の代謝産物に関しては配糖体の存在が 示唆されているに過ぎず、 菌の培養液からの殺センチユウ活性を有する成分の抽 出 ·精製については検討がなされていない。
そこで本発明は、 ァスペルギルス属 (Aspergi l lus sp. ) に属する菌の培養液 から抽出 ·精製される殺センチユウ剤を提供することを目的とする。 発明の開示
上記の点に鑑みてなされた本発明の殺センチユウ剤は、 請求の範囲第 1項記載 の通り、 ァスペルギルス属 （Aspergi l lus sp. ) に属する菌の培養濾液を必要に 応じて p H 7以下にしてから水と分離する第 1の有機溶媒で分配抽出し、 得られ る第 1有機溶媒抽出画分をアル力リ性水溶液で分配抽出し、 得られるアル力リ性 水溶液抽出画分を p H 7以下にしてから水と分離する第 2有機溶媒で分配抽出す ることで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とする。 また、 請求の範囲第 2項記載の殺センチユウ剤は、 請求の範囲第 1項記載の殺 センチユウ剤において、 センチユウがマツノザィセンチユウであることを特徴と する。
また、 請求の範囲第 3項記載の殺センチユウ剤は、 請求の範囲第 1項記載の殺 センチユウ剤において、 ァスペルギルス属に属する菌がァスペルギルス メリウ ス J AM 4 0 2 2 (Aspergi l lus mel leus JAM4022, FERM BP-726) であること を特徴とする。
また、 請求の範囲第 4項記載の殺センチユウ剤は、 請求の範囲第 1項記載の殺 センチユウ剤において、 第 1の有機溶媒と第 2の有機溶媒がいずれも酢酸ェチル であることを特徴とする。
また、 本発明の殺センチユウ剤は、 請求の範囲第 5項記載の通り、 ペニシリン 酸を有効成分とすることを特徴とする。
本発明によれば、 ァスペルギルス属 （Aspergi l lus sp. ) に属する菌の培養液 から抽出 ·精製される殺センチユウ剤が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例の実験例における殺マツノザィセンチユウ活性を有する成分の 抽出工程図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明の殺センチユウ剤は、 ァスペルギルス属 (Aspergi l lus sp. ) に属する 菌の培養濾液を必要に応じて p H 7以下にしてから水と分離する第 1の有機溶媒 で分配抽出し、 得られる第 1有機溶媒抽出画分をアル力リ性水溶液で分配抽出し、 得られるアル力リ性水溶液抽出画分を p H 7以下にしてから水と分離する第 2有 機溶媒で分配抽出することで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすること を特徴とするものである。 また、 本発明の殺センチユウ剤は、 ペニシリン酸を有 効成分とすることを特徴とするものである。 ペニシリン酸 （Peni c i l l ic ac id, 3-me t hoxy-5-me t hy 1 -4-oxo-2 , 5-hexad i eno i c ac id) の生物活' I生については、 抗 細菌活性ゃ抗カビ活性ゃ抗ウィルス活性などが知られているが、 殺センチュウ活 性についてはこれまでに報告された例はない。
本発明において、 ァスペルギルス属 （Aspergillus sp.) に属する菌としては、 ァスペルギルス メリウス J AM4022 (Aspergillus melleus JAM4022, FERM BP-726) を好適に用いることができるが、 この他、 ァスペルギルス パラシ テイクス JAM4002 (Aspergillus parasiticus JAM4002, FERM BP- 724)、 ァスペルギルス 夕マリ JAM4007 (Aspergillus tamarii JAM4007, FERM BP- 723)、 ァスペルギルス フミガ夕ス JAM4008 (Aspergillus fumigatus JAM4008, FERM BP-727), ァスペルギルス ニガ一 JAM4054 (Aspergillus niger 〗AM4054, FERM BP- 8300)、 ァスペルギルス ニガ一 J AM40 5 5 (Aspergillus niger JAM4055, FERM BP- 8301) などを用いることもできる。 な お、 J AMとは、 株式会社応微研の菌株分類記号を意味する （1APAN ^PPLIDE RESEARCH MICROORGANISMSの略称）。
ァスペルギルス属 （Aspergillus sp.) に属する菌の培養濾液から有機酸性画 分抽出物を得るための具体的な操作は、 有機酸を含有する酸性画分抽出物を抽 出 ·精製するための一般的な方法に則って行えばよい。 第 1の有機溶媒と第 2の 有機溶媒として用いることができる水と分離する有機溶媒としては酢酸ェチルを 好適に用いることができる。 アル力リ性水溶液としては飽和炭酸水素ナトリゥム 水溶液を好適に用いることができる。 培養濾液ゃアル力リ性水溶液抽出画分を p H 7以下に調整する際には塩酸を用いて行えばよい。
殺センチユウ活性を指標にして、 得られた有機酸性画分抽出物を、 天然有機化 合物の単離 ·精製のために通常採用されるカラムクロマトグラフィ一や薄層クロ マトグラフィ一を用いるクロマトグラフィー法などによってさらに分画してもよ レ^ 本発明の殺センチユウ剤は、 このようにしてさらに分画された複数成分から なる有機酸性画分抽出物や個々に単離 ·精製されたべニシリン酸などの有機化合 物を有効成分とするものも包含する。 なお、 本発明の殺センチユウ剤の有効成分 としてべニシリン酸を用いる場合、 ベニシリン酸は有機酸性画分抽出物から単 離 ·精製されるものに限られず、 化学合成などにより得られるものであってもよ い。
本発明の殺センチユウ剤は、 有効成分を任意の量で含有し、 公知の担体や添加 剤を用いて粉剤や液剤などの各種の剤型に製剤化されて実用に供される。 担体と しては、 液体担体と固体担体のいずれもがその使用目的に応じて用いることがで きる。 液体担体としては水、 アルコール類、 ケトン類、 エーテル類などが挙げら れる。 固体担体としては鉱物性粉末、 アルミナ、 硫黄粉末、 活性炭などが挙げら れる。 添加剤としては、 乳化剤、 懸濁剤、 安定剤、 展着剤、 浸透剤、 分散剤など が挙げられる。 その使用量は、 その剤型、 被害状況、 適用方法、 適用場所などに 応じて適宜決定することができる。
本発明の殺センチユウ剤は、 マツノザィセンチユウに対して効果を発揮する他、 ネコブセンチユウ、 シストセンチユウ、 キタネグサレセンチユウなどに対しても その効果が期待される。 なお、 本発明の殺センチユウ剤は、 殺センチユウ活性を 有するその他の有効成分を含有していてもよい。 実施例
以下、 本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、 本発明はこれに限定 して解釈されるものではない。 なお、 この実施例は、 本発明の殺センチユウ剤を 殺マツノザィセンチュゥ剤として用いることを想定して行つたものである。
実験例：
ァスペルギルス メリウス J AM 4 0 2 2 (Aspergi l lus me I leus JAM4022, FERM BP-726) をシャーレ内の固体培地としての P D A培地 （日水製薬社製 P D A培地 3 9重量部、 蒸留水 1 0 0 0重量部） に接種し、 十分な量の分生子が発生 するまで 2 5 にて 2週間培養した。 その後、 この固体培地上に滅菌蒸留水を注 ぎ、 培地表面に生成された培養物が液中に懸濁するように攪挣して懸濁液を得た。 続いて、 液体麦芽培地 〔モルトエキス （オリエンタル酵母工業社製） 3 0重量部、 ペプトン （極東製薬社製） 3重量部、 グルコース 2 0重量部、 蒸留水 1 0 0 0重 量部〕 にこの懸濁液を加え、 2 4 °Cにて 2 8日間喑所にて培養した。
得られた培養液から殺マツノザィセンチユウ活性を有する成分を以下のように して抽出 ·精製した。 なお、 以下の説明中、 液体の混合比は体積比を表す。 得られた培養液を濾紙 （N o . 5 ) を用いて濾過し、 培養濾液と残渣 （菌体） とに分離した。 得られた培養濾液に 2 N塩酸を加えて p H 2〜 3に調整し、 この培養濾液と酢 酸ェチルを 1 ： 3の比率で分液漏斗を用いて振とう抽出した後、 静置して上層の 酢酸ェチル抽出画分と下層の塩酸水溶液画分を得た。 下層の塩酸水溶液画分に対 して新たに酢酸ェチルを上記と同様の比率で加え、 同様の操作を 2回繰り返し、 それぞれ酢酸ェチル抽出画分を得た。 得られた抽出 3回分の酢酸ェチル抽出画分 を混合して第 1酢酸ェチル抽出画分を得た。
この第 1酢酸ェチル抽出画分、 塩酸水溶液画分の-ブ夕ノール抽出画分、 残渣 (菌体） のァセトン抽出画分について殺マツノザィセンチュゥ活性を調べたとこ ろ、 第 1酢酸ェチル抽出画分に強い活性が認められたので、 この第 1酢酸ェチル 抽出画分についてさらに抽出 ·精製を進めた。
第 1酢酸ェチル抽出画分のさらなる抽出，精製を進めるにあたり、 培養液を大 量に準備した。 すなわち、 上記の液体麦芽培地 3 0 Lを 5 0 0 mLずつ 1 2 0個 のフラスコに分注し、 上記と同様にして得た懸濁液をフラスコ各々に 0 . l mL ずつ加えて培養し 得られた培養液を上記と同様に処理して、 第 1酢酸ェチル抽 出画分を得た。
第 1酢酸ェチル抽出画分と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を 1 ： 1の比率で分 液漏斗を用いて振とう抽出した後、 静置して上層の酢酸ェチル画分と下層の飽和 炭酸水素ナトリゥム水溶液抽出画分を得た。
飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液抽出画分に 2 N塩酸を加えて p H 2〜 3に調整 し、 この酸性水溶液画分と酢酸ェチルを 1 ： 3の比率で分液漏斗を用いて振とう 抽出した後、 静置して上層の酢酸ェチル抽出画分と下層の塩酸水溶液画分を得た。 下層の塩酸水溶液画分に対して新たに酢酸ェチルを上記と同様の比率で加え、 同 様の操作を 2回繰り返して、 それぞれ酢酸ェチル抽出画分を得た。 得られた抽出 3回分の酢酸ェチル抽出画分を混合することで第 2酢酸ェチル抽出画分を得、 硫 酸ナトリゥムを用いて脱水した後、 濃縮乾固して有機酸性画分抽出物として赤色 の固形物 5 . 5 1 gを得た。 この有機酸性画分抽出物の殺マツノザィセンチユウ 活性は、 濃度 5 0 0 p p mにおいて 7 . 0 %、 濃度 1 0 0 0 p p mにおいて 5 0 . 0 %であった。 なお、 上述の第 1酢酸ェチル抽出画分と飽和炭酸水素ナトリウム 水溶液を用いた振とう抽出により分画された酢酸ェチル画分について殺マツノザ ィセンチュウ活性を調べたところ、 弱いながらも活性が認められた。
有機酸性画分抽出物を、 Wakoge l C- 200 (和光純薬社製：内径 3. 5 cm、 長さ 40 cm) を用いてシリカゲルカラムクロマトグラフィーに供した。 溶媒はへキサン—酢酸ェチルを用い、 これらの混合比を 100 : 0〜 0 : 100 の間で 10ずつ変え、 各混合比溶媒 1Lずつを流し、 溶出液を 1Lずつ分取して 濃縮乾固した。 各溶出画分の濃縮乾固物うち、 高い殺マツノザィセンチユウ活性 を示し、 また量が多かったものの活性を表 1に示す。 表 1から明らかなように、 30 %酢酸ェチル溶出画分、 40 %酢酸ェチル溶出画分は濃度 1000 p pmに おいても高い殺マツノザィセンチユウ活性を示した。 よって、 最も殺マツノザィ センチユウ活性が高く、 かつ、 濃縮乾固物量も多かった 30%酢酸ェチル溶出画 分を、 以下のように 2回目のカラムクロマトグラフィーに供した。 丄
Figure imgf000007_0001
上記の 30 %酢酸ェチル溶出画分を、 Wakoge l C— 200 (和光純薬 社製：内径 2. 0 cm、 長さ 35 cm) を用いてシリカゲルカラムクロマトダラ フィ一に供した。 溶媒はへキサン—酢酸ェチルを用い、 これらの混合比を 10 0 ： 0〜0 ： 100の間で 5ずつ変え、 各混合比溶媒 1 Lずつを流し、 溶出液を 50 OmLずつ分取して濃縮乾固した。 各溶出画分の濃縮乾固物のうち、 高い殺 マツノザィセンチュゥ活性を示し、 また濃縮乾固物量が多かつたものの性状と活 性を表 2に示す。 表 2から明らかなように、 フラクション 8、 フラクション 11、 フラクション 12が濃度 1000 p pmにおいても高い殺マツノザィセンチユウ 活性を示した。 よって、 これら 3つのフラクションを、 以下のように薄層クロマ -に供した。 表 2
Figure imgf000008_0001
注）その溶媒を用いた先の 500mL溶出画分を 1として、後の 500mL溶出画分を 2として示す。 上記のフラクション 8、 フラクション 1 1、 フラクション 1 2を、 シリカゲル ( i esel 60 GF2 5 4、 メルク社製） を用いた薄層クロマトグラフィーに供した。 展開溶媒はフラクション 1 1にはへキサン一アセトン ( 7 ： 3 )、 フラクション 8およびフラクション 1 2にはへキサン—アセトン （6 ： 4 ) を用いた。 分画さ れた各々のスポットを搔き取って抽出 ·分離し、 それぞれ殺マツノザィセンチュ ゥ活性と含有物質量を調べた。 結果を表 3に示す。 表 3から明らかなように、 フ ラクシヨン 8においては、 展開開始位置より 1番目の画分 （Rf 値 =0. 01) および 2番目の画分 （Rf 値 =0. 15) に高い殺マツノザィセンチユウ活性が認められた。 フラクション 1 1においては、 展開開始位置より 2番目の画分 （Rf 値 =0. 14) が 高い殺マツノザィセンチユウ活性を示すと共に、 含有物質量が多かった。 この 2 番目の画分はペニシリン酸であることを標準品と比較した薄層クロマトグラフィ ―、 赤外線吸収スぺクトル分析、 核磁気共鳴スぺクトル分析により同定した。 フ ラクシヨン 1 2においては、 展開開始位置より 1番目の画分 （Rf 値 =0. 01)、 2 番目の画分 （Rf 値 =0. 08)、 3番目の画分 （Rf 値 =0. 19)、 4番目画分 （Rf 値 =0. 34) で殺マツノザィセンチュウ活性が認められた。 表 3
Figure imgf000009_0001
注）微量につき測定できず。 上記の殺マツノザィセンチユウ活性は次のようにして評価した。 即ち、 サンプ ル （濃縮乾固物） 1 O m gに 1 0 0 z L〜 5 0 0 Lのアセトンまたはメタノー ルを適宜カ卩えて溶解または懸濁し、 さらに精製水を用いて希釈して 1 0 0 0 0 p pmとして試験溶液の原液とした。 この原液を試験濃度の 2倍濃度に調製し、 9 6穴マイクロプレートの各ゥエルに 1 0 0 Lずつ入れ、 さらにマツノザィセン チュウの蒸留水懸濁液 （4 0 0〜 1 0 0 0頭 ZmL) 1 0 0 / Lをカロえ、 2 5。C、 暗所にて 1週間放置した後、 各ゥエル内のマツノザィセンチユウの生存数と死亡 数とを顕微鏡観察により数え、 その死亡率 ( ) [ (死亡数) / (生存数 +死亡 数） X I 0 0 ] で表した （表 1〜表 3の死亡率は 1濃度につき 3連で試験した 平均値で記載)。 なお、 マツノザィセンチユウが仮死状態である場合を想定して、 上記のようにしてゥエル内にてマツノザィセンチユウの死亡率を測定した後、 各 ゥエル内の液をそれぞれチューブに移し、 遠心分離して上清を取り除き、 さらに 蒸留水で 2 、 3回洗浄した沈渣をセンチユウ計数板上に移した。 顕微鏡観察によ りマツノザィセンチユウの生存数と死亡数とを数え、 上記と同様に死亡率を算出 した。 その結果としてマイクロプレ一トを用いて求められた死亡率とセンチュゥ 計数板を用いて求められた死亡率とはほとんど一致することを確認した。
実験例における抽出工程図を図 1に示す。 製剤例：
ペニシリン酸 1体積％水溶液を調製し、 殺センチユウ剤 （液剤） とした。 産業上の利用可能性
本発明は、 ァスペルギルス属 （Aspergi l lus sp. ) に属する菌の培養液から抽 出 ·精製される殺センチユウ剤を提供することができる点において産業上の利用 可能性を有する。

Claims

請求の範囲
1 . ァスペルギルス属 （Aspergi l lus sp. ) に属する菌の培養濾液を必要に応 じて p H 7以下にしてから水と分離する第 1の有機溶媒で分配抽出し、 得られる 第 1有機溶媒抽出画分をアル力リ性水溶液で分配抽出し、 得られるアル力リ性水 溶液抽出画分を p H 7以下にしてから水と分離する第 2有機溶媒で分配抽出する ことで得られる有機酸性画分抽出物を有効成分とすることを特徴とする殺センチ ユウ剤。
2 . センチユウがマツノザィセンチユウであることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の殺センチユウ剤。
3 . ァスペルギルス属に属する菌がァスペルギルス メリウス J AM 4 0 2 2 (Aspergi l lus me I leus JAM4022, FERM BP- 726) であることを特徵とする請求の 範囲第 1項記載の殺センチュゥ剤。
4. 第 1の有機溶媒と第 2の有機溶媒がいずれも酢酸ェチルであることを特徴 とする請求の範囲第 1項記載の殺センチユウ剤。
5 . ペニシリン酸を有効成分とすることを特徴とする殺センチユウ剤。
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