WO2004076614A2 - Humane nukleinsäuresequenzen aus prostatakarzinomen - Google Patents

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WO2004076614A2
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tissue
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Bernd Hinzmann
Edgar Dahl
André ROSENTHAL
Thomas Specht
Armin Schmitt
Georg Beckmann
Thomas Brümmendorf
Henrik Kinnemann
Stefan Röpcke
Klaus Hermann
Li Xinzhong
Christian Pilarsky
Eike Staub
Original Assignee
Bernd Hinzmann
Edgar Dahl
Rosenthal Andre
Thomas Specht
Armin Schmitt
Georg Beckmann
Bruemmendorf Thomas
Henrik Kinnemann
Roepcke Stefan
Klaus Hermann
Li Xinzhong
Christian Pilarsky
Eike Staub
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE

Definitions

  • the invention relates to new human nucleic acid sequences from prostate carcinomas and to proteins or peptides coded thereby, the use of sequences derived therefrom for screening for substances which bind to them, and the use of substances which bind to such nucleic acid sequences and proteins or peptides for diagnosis and / or Treatment of tumor diseases, especially prostate cancer.
  • Prostate cancer is a disease that appears with increasing incidence with increasing age and requires new therapies to combat it.
  • Patients with prostate tumors are currently divided into two groups.
  • the first group includes patients with an operable tumor (approximately 90% of all patients). In these, the tumor is removed as completely as possible by surgery (radical prostatectomy). Prostate removal has significant medical risks and adverse effects on a patient's quality of life, such as incontinence and impotence.
  • the second group (approximately 10% of all patients) are patients with an inoperable tumor. These cannot be treated curatively by surgery because they already have lymph node metastases. These patients are currently being treated palliatively with nti-androgen or radiation therapy.
  • the anti-androgen therapy which is based on the blocking of hormone effects is very often ineffective after a few years, since the tumor becomes hormone-independent, ie continues to grow without hormone effects and forms metastases. Likewise, not all tumor cells can be removed by radiation therapy.
  • the cancer phenomenon is often associated with the over- or under-expression of a large number of genes in the degenerate cells.
  • the identification of tumor-relevant genes is therefore an important starting point for the development of new therapies against prostate cancer (Welsch et al., Cancer Res 61 (16): 5974-5978 (2001)).
  • DNA microarrays were used to search for tumor-related candidate genes in prostate cancer.
  • the analyzed tumor and normal tissue samples can be obtained by microdissection. Using the microdissection, it is possible to precisely, i.e. at the level of individual cell groups. Comparative studies have shown that the use of microdissection can identify differentially expressed genes that are not found in a gene expression study of whole tissue (Ernst et al., Am J Pathol 160 (6): 2169-2180 ( 2002)).
  • the invention is based on the technical problem of pharmaceutical compositions for diagnosis and / or Specify treatment of prostate cancer diseases and means of finding them.
  • the invention first teaches a nucleic acid containing or consisting of one of the disclosed nucleic acid sequences and a peptide or protein containing an amino acid sequence encoded by one of the disclosed nucleic acid sequences or consisting thereof or containing one or consisting of one of the disclosed amino acid sequences.
  • Nucleic acids or proteins or peptides according to the invention can be produced using conventional molecular biological methods.
  • the invention further relates to various uses of the new nucleic acids or peptides or protein, as well as (same) uses of already known nucleic acids. These are:
  • a nucleic acid according to the invention and / or a peptide or protein according to the invention for the detection of prostate cancer or for the detection of a risk of prostate cancer, wherein a prostate tissue sample is examined for over-transcription of the nucleic acid or for over-expression of the protein.
  • a detector substance that preferably binds to the nucleic acid or to the protein or peptide, preferably containing a reporter group, can be used, whereby said nucleic acid and / or said protein or peptide binds to the detector substance semi-quantitatively or is detected quantitatively.
  • the level of expression can also be measured by amplification, for example quantitative PCR.
  • nucleic acid according to the invention or a protein or peptide according to the invention for screening for substances which bind to it, in particular prospective active substances for inhibiting said nucleic acid or said protein or peptide, or prospective detector substances, with a prospective substance or a mixture of such prospective substances with said nucleic acid or said protein or peptide is contacted, whereby binding events are determined with a binding assay, and a binding prospective substance, optionally after deconvolution, is selected.
  • a substance used in the context of the invention can be selected from the group consisting of: a) antisense oligonucleotides, siRNA, and ribozymes against a nucleic acid according to claim 1, b) binding to a peptide or protein according to claim 2, in particular identified according to claim 5 , organic molecule with a molecular weight below
  • aptamer against a protein or peptide according to claim 2 in particular identified according to claim 5, d) (onoclonal) antibody, in particular human or humanized antibody against a protein or peptide according to claim 2, e) anti-idiotypic non-human (monoclonal) Antibodies generated by means of an antibody of subgroup d) and f) above substances derivatized with a reporter group, a cell toxin of an immunostimulating
  • ribozyme for example, a hammerhead ribozyme can be used as the ribozyme.
  • the ribozyme interface is selected with the proviso that the expression of the protein is either prevented by the activity of the ribozyme, 'or an inactive form or an inactive fragment is expressed of the protein.
  • Both can be determined, for example, by contacting this cell system with one or more ribozyme modeled for defined interfaces in a cell system in which a protein according to the invention is expressed at a defined level and determining the expression level or the biological activity of the expressed protein , This is then compared with a negative sample or the results without contact and ribozymes are selected which lead to lower expression or activity. The same can be done in the case of siRNA or antisense nucleic acids.
  • binding substances can be determined by determining the biological activity of the Proteins in a cell system with and without contacting and comparison of the results obtained. Those substances that lead to reduced biological activity are then selected for therapeutic purposes. It is also possible for the biological activity to be determined instead of the binding in the context of a screening method according to the invention; then a validation in the above sense was carried out at the same time as the screening.
  • Biological activity can be determined, for example, by determining natural association partners of the protein and examining their occurrence and form (eg monomer / dimer). Substances arising further downstream in a metabolic cascade can also be used as indicators; these can be identified, for example, by previously analyzing cell components for the cell expressing the protein and comparing them with the same cells, in which, however, the expression has been genetically deleted.
  • Suitable aptamers (c) can easily be identified, for example, by means of the well-known SELEX method, the protein according to the invention being used as the target.
  • Antibodies (d), in particular monoclonal antibodies, can be obtained in a customary manner by immunizing a non-human mammal with a protein according to the invention, a nucleic acid according to the invention (eg cDNA), a cell constitutively expressing a protein according to the invention (cancer cell or, for example, a cell transfected with a nucleic acid according to the invention , such as COS or .NIH3T3), or by means of recombinantly produced protein or peptide according to the invention, for example in E. coli or eukaryotic cells, for example insect cells.
  • Monoclonal antibodies can be obtained by customary selection and stabilization of hybridoma cells.
  • the phage display technology can also be used to generate the antibodies.
  • anti-idiotypic antibodies these can be generated by using an antibody according to the invention, which does not necessarily have to influence the biological activity of the protein according to the invention, in a non-human mammal, a second anti-idiotypic (monoclonal) antibody is generated.
  • this anti-idiotypic antibody When applied to human cells, this anti-idiotypic antibody then simulates the human immune system and becomes an image of the target molecule. recognized as a foreign epitope due to its non-humanized form. Human beings therefore naturally form antibodies against the anti-idiotypic antibody and thus also against the protein or against the protein-expressing cells. This variant of the invention can only be used for therapeutic purposes.
  • the invention further relates to a method for diagnosing a prostate cancer, wherein a pharmaceutical composition according to the invention in the embodiment with a reporter group is applied to the tissue to be examined in vivo or in vitro, the tissue to be examined then being subjected to a detection method step which is sensitive is for the reporter group, and in the case of detection of a defined minimum value of the reporter group in the tissue the tissue is qualified as containing tumor cells, and a method for the treatment of a prostate cancer disease, wherein a pharmaceutical composition according to the invention is administered to a patient in a physiologically effective dose.
  • the invention is based on the knowledge that genes or gene products according to the invention are differentially expressed in prostate tumor tissue, i.e. in prostate tumor tissue the expression is higher or lower, in particular higher, compared to normal cells of the same tissue. On the one hand, this allows, in particular these new genes or
  • a sample from a tissue which is identified as tumor tissue by other methods in advance of treatment with a pharmaceutical composition according to the invention, and to test the tissue sample for expression or overexpression of the gene or gene product according to the invention investigate.
  • a detector substance according to the invention can be used for diagnosis in vivo to test for dependence on the gene or gene product. If expression or overexpression of the gene or gene product with respect to normal tissue of the same type is found, then the use of the pharmaceutical composition according to the invention is indicated.
  • the substance which binds to the gene or the gene product also has a cytotoxic and / or carries immunostimulating component. This ultimately leads to the fact that almost exclusively tumor cells are killed, either by cytotoxicity or by attack by the stimulated immune system, while normal cells are practically completely preserved in the tissue.
  • the binding substance itself does not have to have an inhibitory effect on the gene or gene product, since the binding substance then only has to function as a marker which carries the components to target tumor cells. If a cytotoxic and / or immunostimulating component is used, it can be particularly recommended if the pharmaceutical composition is prepared for local application in tissue containing tumor cells, for example for injection.
  • sequences disclosed and / or claimed in the description are known per se or are parts of previously known sequences
  • sequences disclosed, insofar as they correspond to previously known sequences are the subject of the invention in that they are used only in accordance with the uses described. Revealed and / or claimed sequences, which are parts of previously known sequences, can be so by means of one or more disclaimers in claims be delimited that the previously known sequences are not included.
  • a sequence comprises all human isoforms, known or new, based on nucleic acids or amino acids. These terms also include the short sequences disclosed in the context of this description, which come from isoforms, for example immunization sequences. Also included are homologs, the homology being at least 80%, preferably more than 90%, most preferably more than 95% (calculated using the MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE program, in the version current at the time of registration). In the case of nucleic acid sequences, complementary or allelic variants and silent mutations are also included.
  • sequences are included which only represent partial sequences of the explicitly disclosed sequences, for example one or more exons, or complementary sequences thereto, with the proviso that, in the case of nucleic acids, these partial sequences have a length sufficient for hybridization with a nucleic acid according to the invention, at least 50 or 150 bases, up to 1700 bases and more, and in the case of the proteins or peptides bind with at least the same affinity to a protein- or peptide-specific target molecule.
  • all nucleic acids hybridizing with nucleic acids according to the invention are included, namely those which are under stringent conditions (5 ° C. to 25 ° C.
  • the invention also includes expression cassettes, ie one or more of the nucleic acid sequences according to the invention with at least one control or regulatory sequence.
  • Such an expression cassette can also comprise a sequence for a known protein, a fusion protein being formed in the course of the translation from a known protein and a protein or peptide according to the invention.
  • Antisense sequences to the above nucleic acid sequences are also included.
  • RNA as well as correlating DNA and vice versa are included, as are genomic DNA as well as correlated cDNA and vice versa.
  • nucleic acids or protein or peptides include, in addition to the full lengths of the disclosed sequences (see also the preceding paragraph), also partial sequences thereof, with a minimum length of 12 nucleotides, preferably 30 to 90 nucleotides, in the case the nucleic acids and a minimum length of 4 amino acids, preferably 10 to 30 amino acids, in the case of the peptides or proteins.
  • detection and / or treatment of prostate cancer also include the detection and / or treatment of metastases from primary tumors in other tissues.
  • treatment also includes prophylaxis.
  • an inhibitor is a compound or substance which either inhibits the formation of the protein or peptide according to the invention or reduces the activity of the protein or peptide formed, based on the latter Activity in the absence of the inhibitor.
  • an inhibitor can on the one hand be a substance that interferes with the protein or peptide cascade.
  • an inhibitor can be a substance that binds to the protein or peptide formed, in such a way that further physiological interactions with endogenous substances are at least reduced.
  • Mimicry molecules encompassed by the invention are compounds which emulate the variable region, in particular the binding region of an antibody, and bind to a target molecule in the same place as the underlying antibody.
  • antibody includes polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, non-human, human and humanized antibodies, as well as phage display antibodies, but also chimeric antibodies and anti-idiotypic antibodies as well as specific fragments of the light and / or heavy chain of the variable region underlying antibodies of the above type.
  • the production or production of such antibodies with predetermined immunogens is well known to the average person skilled in the art and need not be explained in more detail.
  • the term antibody also includes bispecific antibodies. Bispecific antibodies combine a defined immune cell activity with a specific tumor cell recognition, whereby tumor cells are killed. A bispecific antibody binds on the one hand to a trigger molecule of the immune effector cell (eg CD3, CD16, CD64) and on the other hand to antigens of the tumor target cell.
  • a trigger molecule of the immune effector cell eg CD3, CD16, CD64
  • Counter ions for ionic compounds are, for example, Na + , K + , Li + or cyclohexylammonium.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or injectable solutions (IV, IP, IM) and preparations with a protracted active ingredient -Release, in the production of which conventional auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavorings, sweeteners and solubilizers are used.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be produced by mixing at least one substance used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, other suitable active ingredients, additives or auxiliaries with a defined substance dose and preparing it for the desired dosage form ,
  • Tumor cells express one. Protein differential if normal cells of the same tissue type do not or only slightly express it. Tumor cells overexpress a protein specifically or differentially if the protein is in the Compared to normal cells of the same tissue is expressed at least in twice the amount.
  • Cytotoxic components or groups are compounds which directly or indirectly induce apoptosis or lead to necrosis or at least have an inhibitory effect on growth.
  • radioisotopes for example 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu
  • groups or compounds can in particular cytostatics Examples of these are: alkylating agents (for example mechlorethamine, ifosfamide, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, alkylsulfonates, busulphan, nitrosoureas, carmustine, lomustine, semustine, triazenes, dacarbazine), antimetabolites (for example Folic acid antagonists, methotrexate, pyrimidine analogs, fluorouracil, fluorodesoxyuridine, cytarabin, gemcitabine, purine analogs, mercaptopurine), mitotic inhibitors (e.g.
  • antibiotics eg dactinomycin, daunorubicin, idarubicin, anthracycline, bleomycin, L-asparaginase
  • platinum complex compounds eg cisplatin
  • hormones and related compounds eg adrenal gland steroids, aminogluthetimide, progestogens, estrogens, androgens, anti-estrogens, tamoxifen, steroid analogues, flutamide).
  • an immunostimulating component is usually a protein or an effective component thereof, which stimulates cells of the immune system.
  • cytokines such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF, interferons such as IFN-alpha, beta, gamma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8), human LIF , Chemokines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8.
  • a reporter group is an atom, molecule or a compound which, in conjunction with an assay placed thereon, enables the detection of the reporter group and the compound or substance thus connected to the reporter group.
  • reporter groups and associated detection methods are: 32P labeling and intensity measurement using phosphoimager. Many other examples are known to the person skilled in the art and do not need to be listed in detail.
  • a substance that binds to target molecules can be a substance that binds a target protein or to a target RNA.
  • Definitions expanded in the context of the above definition in relation to the narrow sense of the word also include the specific terms in the narrow sense of the word.
  • Figure 1 Chip analysis for the differential expression of CD24 in prostate tumor tissue, analyzed on 54 normal / tumor tissue samples.
  • FIG. 1 Immunohistochemistry with a CD24 antibody (mouse anti human CD24, clone 24C02), CD24 is expressed much more strongly in primary prostate cancer than in benign tissue.
  • FIG. 3 Immunohistochemistry with a CD24 antibody (mouse anti human CD24, clone 24C02), CD24 is expressed much more strongly in lymph node metastases than in primary prostate carcinoma,
  • Figure 4 Table with information on the sequences according to the invention.
  • RNA is isolated, amplified and labeled from samples from Example 1.
  • the RNA obtained in this way is applied to a gene chip which contains a large number of different oligonucleotides, one (or more, for control purposes) in each case being representative of a defined gene, i.e. has a characteristic partial sequence from it.
  • Both qualitative and quantitative information is obtained as to whether a normal and / or tumor sample in question expresses a gene in question, and also in the tumor / normal ratio. In cases in which a gene is expressed more highly in tumor tissue than in the correlated normal tissue, there is differential expression, i.e. the gene is upregulated in the tumor tissue. On the other hand, if the gene is less expressed in tumor tissue, there is down-regulation. It was found that the sequences according to the invention are differentially upregulated in the tumor tissue. The results can be found in detail in Table 1.
  • Example 3 Examination of expression or overexpression using quantitative PCR.
  • a poly-A + RNA preparation is carried out using a modified protocol according to the poly-a-tract 1000 kit (Amersham, Freiburg, Germany).
  • Tissue samples ' for example, but not necessarily obtained according to example 1, are slowly thawed on ice, crushed and mixed with 300 ⁇ l dilution buffer containing 1% ⁇ -mercaptoethanol and biotinylated oligo-dT primer, and for 5 min. heated to 70 ° C. The samples are then kept for 5 min. kept at 20 ° C and then at 20000g for 10 min. centrifuged. 120 ⁇ l of washed streptavidin-coupled paramagnetic particle (SA-PMP) are added to the supernatant and it was stirred at 20 ° C. for 5 min. incubated. The mRNA was then isolated by magnetic separation. After three washing steps with 0.5x SSC solution, the mRNA is diluted in nuclease-free water, evaporated under vacuum and immediately processed in cDNA.
  • the cDNA synthesis then takes place.
  • the mRNA obtained from 2 is dissolved in 10 ⁇ l of nuclease-free water.
  • I ⁇ l T7-dT24- (GGCCAG) primer (100 pmol / ⁇ l) is added and it was kept at 70 ° C. for 5 min. heated. Then the sample was placed on ice and 4 ⁇ l 5x first strand buffer (Invitrogen), 2 ⁇ l DTT (0.1M), l ⁇ l dNTP's (lOmM), and 14U anti-RNAse (Ambion) were added, followed by incubation for 2 min , at 37 ° C. Then 1 ⁇ l of Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) are added, followed by an incubation for 1 h at 37 ° C.
  • the second strand synthesis and DNA purification then take place.
  • 91 ⁇ l water, 30 ⁇ l 5x second strand buffers, 3 ⁇ l dNTP's (10mm), 10U E. coli DNA ligase, 40U DNA polymerase I and 2U RNAse H (all from Invitrogen) added and the mixture is incubated at 16 ° C. for 2 h.
  • 10U T4 DNA polymerase (Invitrogen) are added and a further 5 min. incubated.
  • the reaction is stopped by adding 10 ⁇ l of 0.5 mM EDTA.
  • the DNA is purified in accordance with the GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (A ersham).
  • the second round of in vitro transcription is then carried out.
  • the second round of reinforcements is carried out with only minor deviations from the first round.
  • the synthesis of the first strand is done with random hex primer (250ng / ⁇ l). After incubation for 60 min. the cRNA-cDNA hybrid for 20 min. incubated with 2U RNase H, followed by a 2 minute inactivation step at 37 ° C.
  • the first strand is synthesized using the cRNA from the preceding stage.
  • Ing cDNA are used for amplification with 2.5 ⁇ l lOx SYBR®Green PCR buffer, 3 ⁇ l magnesium chloride (25mM), 2 ⁇ l dNTP's (with dUTP; 12.5mM) and 0, 625U Ampli Taq Gold in a reaction volume of 25 ⁇ l.
  • the reaction is carried out in a GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Rothstadt,
  • the conditions are: 2 min. 50 ° C, 10 min. 95 ° C, 15 s 95 ° C, 1 min. 60 ° C, the last two phases in 40 cycles.
  • the appropriate forward or reverse primers are used.
  • the evaluation is carried out using the ⁇ Ct method according to the manufacturer's instructions.
  • the Ct value of beta actin was measured at a limit of 0.1.
  • the Ct value of the beta actin is subtracted from the Ct value of the gene under investigation. In the case of tumor tissues, this normalized Ct value is related or normalized to the normal tissues, whereby the ⁇ Ct is obtained.
  • this value is used as a power to base 2, a relative size of the over- or under-expression in tumor tissue compared to the normal tissue of the same patient is obtained. As a result, it can be determined whether a specific tumor tissue of a particular patient is sensitive to a treatment according to the invention. This method can also be used to determine whether unclassified tissue should be classified as containing tumor cells. In the latter case, a comparison is made with reference values or classified normal tissue from the same patient or from other people.
  • Example 4 Differential expression measured using the gene chip technology, using the example of CD24.
  • Example 2 The result of experiments according to Example 2 is shown in FIG. 1 using CD24 as an example. It can be seen that CD24 is up-regulated in a significant number of samples from 54 patients. Analogous results were obtained for the further sequences according to the invention, which are not shown for the sake of clarity.
  • Example 5 Detection of an overexpressed gene using antibodies.
  • tumor cells by an antibody directed against a protein according to the invention in vivo (mouse model) is described.
  • an antibody according to the invention is labeled with a marker molecule (e.g. radioisotope).
  • a marker molecule e.g. radioisotope
  • Human cells transfected with a gene according to the invention are transplanted into NMRI nude mice. After a defined period of time, for example 30 days, the labeled antibody is injected into the mice. The control animals are treated with an irrelevant antibody. A few hours after the antibody application, the animals are sacrificed and tissue sections are made from all organs. These sections are examined for the presence of labeled antibody.
  • the antibodies can be polyclonal antibodies against human protein, conjugated to a carrier protein, raised in rabbits and affinity-purified with the specific immobilized peptides.
  • Suitable immunization peptides are formed, for example, from partial sequences of a protein according to the invention.
  • Cells which are transfected with cDNA of the gene or partial sequences thereof, such as, for example, COS cells or NIH3T3 cells, can also be used as immunogens. Tumor cells that express the protein endogenously are also suitable.
  • recombinantly produced protein or partial sequences thereof, which are expressed in producer cells such as E. coli or eukaryotic cells such as insect cells can also be used for the immunization.
  • producer cells such as E. coli or eukaryotic cells such as insect cells
  • Example 6 Immunohistochemical detection of tumor cells.
  • Tissue is isolated from a patient with cancer or suspected to be cancer and prepared as paraffin or frozen sections. These sections are examined with an antibody directed against a protein according to the invention for the overexpression of the protein in tumor cells.
  • the immunohistological examination with the antibody shows higher expression of the protein in the tumor cells compared to surrounding normal tissue.
  • the investigation is carried out in detail by incubation with the antibody as the primary antibody, a biotinylated secondary anti-rabbit antibody and a streptavidin-coupled horseradish peroxidase.
  • the coloring is carried out with DASS as a chromogenic substrate (brown coloring).
  • the counterstaining is done with hemalaun solution (blue staining).
  • Malignant and non-malignant cells can be distinguished, the malignant cells being strongly stained, i.e. have a high content of protein according to the invention, while the non-malignant cells are only moderately stained.
  • FIGS. 2 and 3 show exemplary results using CD24.
  • a CD24 antibody mouse, anti human CD24, clone 24C02
  • left benign tissue was used. It can be seen that benign atrophy shows strong staining in the apical membrane.
  • primary prostate cancer was used.
  • FIG. 3 shows a comparison of primary tumors (left) with lymph node metastases (right) using the same antibodies. Comparatively higher expression can be seen in the lymph node metastases.
  • a monoclonal antibody Abi is generated in a manner which is able to specifically recognize the protein and bind to it. It is immaterial whether a functional domain or another accessible area is recognized.
  • a second anti-idiotypic non-humanized, for example mouse, monoclonal antibody aABl is generated in the same way, which is suitable for the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of prostate tumors.
  • the function of the antibody aABl is based on the fact that it simulates the human immune system an image of the (human) protein antigen, the immune system recognizing the antibody aABl as foreign to the body due to its lack of humanization. The human body consequently forms its own antibodies, which are directed against aABl and thus also against the human protein or tumor cell expressing it.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue humane Nikleinsäuresequenzen aus Prostatakarzinomen, hierdurch codierte Proteine bzw. Peptide sowie deren Verwendungen im Zusammenhang mit der Diagnose und/oder Behandlung von Prostatakrebs.

Description

Humane Nukleinsäuresequenzen aus Prostatakarzinomen.
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft neue humane Nukleinsäuresequenzen aus Prostatakarzinomen sowie hierdurch codierte Proteine bzw. Peptide, die Verwendung von hieraus abgeleiteten Sequenzen zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, so- wie die Verwendung von an solche Nukleinsäuresequenzen und Proteine bzw. Peptide bindenden Substanzen zur Diagnose und/oder Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Prostatakrebs .
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Prostatakrebs ist eine mit zunehmendem Alter mit beachtlicher Incidenz auftretende Erkrankung, für dessen Bekämp- fung neue Therapien notwendig sind. Gegenwärtig werden Patienten mit einem Prostattumor in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe umfasst Patienten mit einem operablen Tumor (ca. 90% aller Patienten) . Bei diesen wird der Tumor chirugisch möglichst vollständig entfernt (radi- kale Prostatektomie) . Die Entfernung der Prostata hat beachtliche medizinische Risiken und nachteilige Effekte auf die Lebensqualität eines Patienten, wie z.B. Inkontinenz und Impotenz. Die zweite Gruppe (ca. 10% aller Patienten) sind Patienten mit inoperablem Tumor. Diese können nicht kurativ durch eine Operation behandelt werden, da sie bereits Lymphknotenmetastasen aufweisen. Diese Patienten werden zur Zeit palliativ mit nti-Androgen- oder Strahlentherapie behandelt. Die Anti-Androgen Therapie, welche auf einer Blockierung von Hormonwirkungen beruht, ist sehr häufig nach wenigen Jahren wirkungslos, da der Tumor hormonunabhängig wird, i.e. ohne Hormonwirkung weiterwächst und Metastasen bildet. Ebenso können durch eine Strahlentherapie nicht alle Tumorzellen beseitigt werden.
Eine verbesserte Diagnose und Behandlung dieser Krebsart, insbesondere auch ohne das Erfordernis einer Entfernung der Prostata, ist daher in hohem Maße wünschenswert. -
Das Phänomen Krebs geht häufig einher mit der Über- oder Unterexpression einer Vielzahl von Genen in den entarteten Zellen. Die Identifikation tumor-relevanter Gene ist daher ein wichtiger Ansatzpunkt für die Entwicklung neuer Thera- pien gegen Prostatakrebs (Welsch et al . , Cancer Res 61 (16) :5974-5978 (2001) ) .
Für die Suche nach Tumor-bezogenen Kandidatengenen beim Prostatakarzinom wurden DNA Microarrays verwendet. Die analysierten Tumor- und Normalgewebeproben können durch Mikrodissektion gewonnen werden. Mittels der Mikrodissek- tion ist es möglich, die zu untersuchenden Gewebe genau, i.e. auf der Ebene einzelner Zellverbände, zu definieren. Vergleichende Untersuchungen haben ergeben, dass durch die Anwendung von Mikrodissektion differentiell expri ierte Gene identifiziert werden können, die in einer Gen-Expres- sionsuntersuchung von Gesamtgewebe nicht gefunden werden (Ernst et al . , Am J Pathol 160 ( 6) : 2169-2180 (2002)).
Technisches Problem der Erfindung
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Diagnose und/oder zur Behandlung von Prostatakrebs-Erkrankungen anzugeben sowie Mittel zu deren Findung.
Grundzüge der Erfindung sowie bevorzugte Ausführungsbeispiele .
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung zunächst eine Nukleinsäure enthaltend oder bestehend aus einer der offenbarten Nukleinsäuresequenz sowie ein Peptid oder Protein enthaltend eine Aminosäurensequenz codiert durch eine der offenbarten Nukleinsäuresequenzen oder be- stehend hieraus bzw. enthaltend eine oder bestehend aus einer der offenbarten Aminosäuresequenzen. Erfindungsge- mäße Nukleinsäuren oder Proteine bzw. Peptide lassen sich mit üblichen molekularbiologischen Methoden herstellen.
Die Erfindung betrifft weiterhin verschiedene Verwendungen der neuen Nukleinsäuren bzw. Peptide oder Protein, ebenso wie (gleiche) Verwendungen bereits bekannter Nukleinsäuren. Diese sind:
i) Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder eines erfindungsgemäßen Peptids oder Proteins, zur Detektion von Prostatakrebs oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostatkrebs, wobei eine Prostata- Gewebeprobe auf Übertranskription der Nukleinsäure oder auf Überexpression des Proteins untersucht wird. Dabei kann eine an die Nukleinsäure oder eine an das Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet werden, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird. Auch kann das Expressionsniveau durch Amplifikation, beispielsweise quantitative PCR, gemessen werden.
ii) Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Proteins oder Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter Nukleinsäure oder besagtem Protein oder Peptid, oder prospektiven Detektor- Substanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter Nukleinsäure oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird.
iii) Verwendung einer eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Peptid bzw. Protein inhibierenden oder daran bindenden Substanz, insbesondere identifi- ■ ziert mit dem erfindungsgemäßen Screening Verfahren, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Behandlung von Prostatakrebs.
Eine im Rahmen der Erfindung eingesetzte Substanz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus: a) Antisense-Oligonukleotide, siRNA, und Ribozyme gegen eine Nukleinsäure nach Anspruch 1, b) an ein Peptid oder Protein nach Anspruch 2 bindendes, insbesondere nach Anspruch 5 identifiziertes, organi- sches Molekül mit einem Molekulargewicht unterhalb
5000, vorzugsweise unterhalb 1000, höchstvorzugsweise unterhalb 300, c) Aptamer gegen ein Protein oder Peptid nach Anspruch 2, insbesondere identifiziert nach Anspruch 5, d) ( onoklonaler) Antikörper, insbesondere humaner oder humanisierter Antikörper gegen ein Protein oder Peptid nach Anspruch 2, e) anti-idiotypische nicht-humane (monoklonale) Antikörper, generiert mittels eines Antikörpers der Unterguppe d) , und f) vorstehende Substanzen derivatisiert mit einer Repor- tergruppe, einem Zelltoxin einer immunstimulierenden
Komponente und/oder einem Radioisotop. Im Falle a) kann als Ribozyme beispielsweise ein Hammer- head Ribozym eingesetzt werden. Die Ribozym-Schnittstelle wird mit der Maßgabe ausgewählt, dass durch die Aktivität des Ribozymes die Expression des Proteins entweder unterbunden wird,' oder eine inaktive Form bzw. ein inaktives Fragment des Proteins exprimiert wird. Beides läßt sich beispielsweise dadurch ermittelt, dass in einem Zellsystem, in welchem ein erfindungsgemäßes Protein auf defi- niertem Niveau exprimiert wird, dieses Zellsystem mit einem oder mehreren für definierte Schnittstellen modelliertes Ribozym kontaktiert wird und das Expressionsniveau bestimmt bzw. die biologische Aktivität des expriiαierten Proteins. Dies wird dann verglichen mit einer Negativprobe bzw. den Ergebnissen ohne Kontaktierung und Ribozyme werden selektiert, die zu niedrigerer Expression oder Aktivi- tat führen. Entsprechend kann im Falle der siRNA oder der antisense Nukleinsäuren vorgegangen werden.
Im Falle b) können chemische Stoffbibliotheken eingesetzt werden, um nach bindenden Substanzen zu screenen. Eine Validierung bindender Substanzen für therapeutische Zwecke kann durch Bestimmung der biologischen Aktivität des Proteins in einem Zellsystem mit und ohne Kontaktierung und Vergleich der erhaltenen Ergebnisse erfolgen. Für therapeutische Zwecke ausgewählt werden dann solche Stoffe, die zu einer reduzierten biologischen Aktivität führen. Es ist auch möglich, dass im Rahmen eines erfindungsgemäßen Screening Verfahren an Stelle der Bindung die biologische Aktivität bestimmt wird; dann ist eine Validierung im vorstehenden Sinne zugleich mit dem Screening erfolgt. Biologische Aktivität läßt sich beispielsweise dadurch bestim- men, dass natürliche Assoziationspartner des Proteins bestimmt und deren Vorkommen und Form (z.B. Monomer/Dimer) untersucht werden. Es lassen sich auch weiter downstream in einer Stoffwechselkaskade entstehende Substanzen als Indikator verwenden; diese lassen sich beispielsweise da- durch identifizieren, dass zuvor Zellkomponenten analysiert werden für die das Protein exprimierende Zelle und ein Vergleich durchgeführt wird mit gleichen Zellen, in welchen jedoch die Expression gentechnisch deletiert ist.
Geeignete Aptamere (c) lassen sich unschwer beispielsweise mittels des wohlbekannten SELEX Verfahren identifizieren, wobei das erfindungsgemäße Protein als Target eingesetzt wird.
Antikörper (d) , insbesondere monoklonale Antikörper, können in üblicher Weise durch Immunisierung eines nichtmenschlichen Säugetiers mit einem erfindungsgemäßen Protein, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure (z.B. cDNA) , einer ein erfindungsgemäßes Protein konstitutiv exprimieren- den Zelle (Krebszelle oder beispielsweise mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfizierte Zelle, wie COS oder .NIH3T3) , oder mittels recombinat hergestelltem erfindungsgemäßem Protein oder Peptid, beispielsweise in E.coli oder Eukaryontenzellen, beispielsweise Insektenzellen, exprimiert, erhalten werden. Monoklonale Antikörper sind durch übliche Selektion und Etabilierung von Hybridomzel- len erhältlich. Auch kann die Phage Display Technologie zur Generierung der Antikörper eingesetzt werden.
Im Falle der anti-idiotypischen Antikörper (e) sind diese dadurch erzeugbar, dass mittels eines erfindungsgemäßen Antikörpers, welcher nicht notwendigerweise die biologi- sehe Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins beeinflussen muss, in einem nicht-menschliche Säugetier ein zweiter anti-idiotypischer (monoklonaler) Antikörper generiert wird. Dieser anti-idiotypische Antikörper täuscht dann bei Applikation in humane Zellen dem humanen Immunsystem ein Bild des Zielmoleküls vor und wird . aufgrund seiner nicht- humanisierten Form als körperfremdes Epitop erkannt. Der Mensch bildet folglich natürlicherweise Antikörper gegen des anti-idiotypischen Antikörper und somit auch gegen das Protein bzw. gegen das Protein exprimierende Zellen. Diese Variante der Erfindung ist ausschließlich für therapeutische Zwecke verwendbar.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein Verfahren zur Diagnose einer Prostatakrebserkrankung, wobei eine erfin- dungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in der Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe in vivo oder in vitro appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird, sowie ein Verfahren zur Behandlung einer Prostatakrebs-Erkrankung, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß erfindungsgemäße Gene bzw. Genprodukte differentiell in Prostatatumorgewebe exprimiert werden, i.e. in Prostatatumorgewebe ist die Expression höher oder niedriger, insbesondere höher, verglichen mit normalen Zellen gleichen Gewebes. Dies er- laubt es einerseits, insbesondere diese neuen Gene bzw.
Genprodukte als Marker zur Identifizierung von Tumorzellen in der Prostata zu nutzen. Auf der anderen Seite bietet die Inhibierung der Gene bzw. Genprodukte, insbesondere auch bei lokaler Applikation, die Möglichkeit, in die Pro- statatumor-spezifischen Genprodukt-Assoziationen mit anderen Prozessen in den Tumorzellen einzugreifen und somit letztendlich den tumorzellenspezifisch veränderten Stoffwechsel zu stören und zu einem Absterben oder zumindest einer Wachstu shemmung der Prostatatumorzellen beizutragen.
Im Rahmen der Erfindung kann es sich empfehlen, im Vorfeld einer Behandlung mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung eine Probe aus einem Gewebe, welches als Tumorgewebe mit anderen Methoden identifiziert ist, zu entnehmen und die Gewebeprobe auf Expression bzw. Überexpression des erfindungsgemäßen Gens bzw. Genproduktes zu untersuchen. Alternativ kann mit einer erfindungsgemäßen Detektorsubstanz zur Diagnose in vivo auf Abhängigkeit von dem Gen bzw. Genprodukt getestet werden. Wird eine Expression bzw. Überexpression des Gens bzw. Genproduktes gegenüber Normalgewebe gleichen Typs festgestellt, so ist die Anwendung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung indiziert.
Handelt es sich bei dem Tumor um einem Typus, bei welchem Tumorzellen ein erfindungsgemäßes Gen exprimieren, Normalzellen gleichen Gewebetyps jedoch nicht oder nur schwach, so ist es besonders bevorzugt, wenn die an das Gen bzw. das Genprodukt bindende Substanz zusätzlich eine zyto- toxische und/oder immunstimulierende Komponente trägt. Dies führt dann letztendlich dazu, dass praktisch ausschließlich Tumorzellen getötet werden, sei es durch die Zytotoxizität, sei es durch Angriff durch das stimulierte Immunsystem, während Normalzellen in dem Gewebe praktisch vollständig erhalten bleiben. In dieser Ausführungsform braucht die bindende Substanz selbst nicht inhibierend auf das Gen bzw. Genprodukt zu wirken, da die bindende Substanz dann lediglich als Marker funktionieren muß, welcher die Komponenten zu Ziel-Tumorzellen trägt. Im Falle des Einsatzes einer zytotoxischen und/oder immunstimulierenden Komponente kann es sich besonders empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist, beispielsweise zur Injektion.
Sofern im Rahmen der Beschreibung offenbarte und/oder beanspruchte Sequenzen per se vorbekannt sind oder Teile vorbekannter Sequenzen sind, sind die offenbarten Sequenzen, soweit sie mit vorbekannten Sequenzen übereinstimmen, insofern Gegenstand der Erfindung, als dass sie lediglich gemäß den beschriebenen Verwendungen eingesetzt werden. Offenbarte und/oder beanspruchte Sequenzen, welche Teile von vorbekannten Sequenzen sind, können mittels eines Disclaimers oder mehrerer Disclaimer in Ansprüchen so abgegrenzt werden, dass die vorbekannten Sequenzen nicht mit umfasst sind.
Definitionen.
Im Rahmen dieser Beschreibung umfaßt eine Sequenz alle humanen Isoformen, bekannt oder neu, auf Nukleinsäurenoder Aminosäurenbasis. Mit diesen Begriffen mit umfaßt sind auch die im Rahmen dieser Beschreibung offenbarten kurzen Sequenzen, welche aus Isoformen stammen, beispielsweise Immunisierungssequenzen. Weiterhin mit umfaßt sind auch Homologe, wobei die Homologie zumindest 80%, vorzugsweise mehr als 90%, höchstvorzugsweise mehr als 95%, be- trägt (berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der zum Anmeldezeitpunkt aktuellen Fassung) . Im Falle der Nukleinsäuresequenzen sind auch komplementäre oder allelische Varianten sowie stille Mutationen mit umfaßt. Weiterhin sind Sequenzen umfaßt, welche lediglich Teilsequenzen der explizit offenbarten Sequenzen, beispielsweise ein Exon oder mehrere Exons, oder komplementärer Sequenzen hierzu darstellen, mit der Maßgabe, daß diese Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende Länge, zumindest 50 oder 150 Basen, bis zu 1700 Basen und mehr, aufweisen und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an ein pro- tein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridi- sierende Nukleinsäuren umfaßt, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al . , A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Es versteht sich, daß die Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i.e. eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen umfaßt. Schließlich sind RNA sowie damit korre- lierende DNA und umgekehrt umfaßt, ebenso wie genomische DNA als auch korrelierte cDNA und umgekehrt.
Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen umfassen die Begriffe der Nukleinsäuren oder Protein bzw. Peptide neben den Volllängen der offenbarten Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch Teilsequenzen hieraus, und zwar mit einer Mindestlänge von 12 Nukleotiden, vorzugs- weise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der Nukleinsäuren und einer Mindestlänge von 4 Aminosäuren, vorzugsweise 10 bis 30 Aminosäuren, im Falle der Peptide oder Proteine.
Die Begriffe der Detektion und/oder der Behandlung von Prostatakrebs umfassen auch die Detektion und/oder Behandlung von Metastasen aus Primärtumoren in sonstigen Geweben. Der Begriff der Behandlung umfaßt auch die Prophylaxe.
Als Inhibitor ist eine Verbindung oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung von des erfindungsgemäßen Proteins bzw. Peptids inhibiert oder gebildetes Protein bzw. Peptid in der Aktivität reduziert, bezogen auf dessen Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors. Insofern kann ein Inhibitor einerseits eine Substanz sein, welche in der Entstehungskaskade des Protein bzw. Peptids inhibierend eingreift. Auf der anderen Seite kann ein Inhibitor eine Substanz sein, welche mit gebildetem Protein bzw. Peptid eine Bindung eingeht, und zwar dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen Substanzen zumindest reduziert sind.
Von der Erfindung mit umfaßte Mimikry-Moleküle sind Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich eines Antikörpers, nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden, wie der zu Grunde liegende Antikörper.
Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper, nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, sowie Phage-Display-Antikörper, aber auch chimäre Antikörper und anti-idiotypische Antikörper sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu werden. Weiterhin umfaßt der Begriff der Antikörper bispezifische Antikörper. Bispezifische Antikörper kombinieren eine definierte Immunzellaktivität ' mit einer spezifischen Tumorzellerkennung, wodurch Tumorzellen getötet werden. Ein bispezifischer Antikörper bin- det einerseits an ein Auslösemolekül der Immun-Effektor- zelle (z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an Antigene der Tumorzielzelle. Die galenische Herrichtung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfolgen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium infrage. Geeigente feste oder flüssige galenische Zubereitungsfor- men sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i.V., i.p., i.m.) sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quel- lungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Sü- ßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd, Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Se- sa öl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, bei- spielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens eine erfindungsgemäß verwendete Substanz in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren ge- eigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Substanzdosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Tumorzellen exprimieren ein. Protein differenziell, wenn Normalzellen des gleichen Gewebetyps dieses nicht oder nur gering exprimieren. Tumorzellen überexprimieren ein Protein spezifisch bzw. differenziell, wenn das Protein im Vergleich zu Normalzellen des gleichen Gewebes zumindest in doppelter Menge exprimiert wird.
Zytotoxische Komponenten bzw. Gruppen sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten bzw. zu Nekrose führen oder zuminde"st wachstumshemmend wirken. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu) insbesondere Zytostatika sein, welche in der Tumortherapie ein- gesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylantien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe, Carmustin, Lomustin, Semustin, Triazene, Dacarbazin) , An- timetaboliten (z.B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin, Cytara- bin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin) , Mitosehemmer (z.B. Vincaalkaloide, Voncristin, Vinblastin, Pacli- taxal,- Docetaxel, Protaxel), Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid) , Antibiotika (z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-As- paraginase) , Platinkomplexverbindungen (z.B. Cisplatin) , Hormone und verwandte Verbindungen (z.B. Nebennierenrin- densteroide, Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, An- drogene, Antiöstrogene, Tamoxifen, Steriodanaloga, Flutamid) . Bei Bindung einer solchen Verbindung mit einer an Targetmoleküle bindenden Substanz erfolgt die Kopplung dergestalt, daß die Affinität zur Nukleinsäure bzw. zum Protein um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Substanz ohne zytostatische Gruppe, reduziert ist und die zytostatische Wirkung der Gruppe um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen auf die Verbindung ohne Substanz, reduziert ist. Eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha, -be- ta, -gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8) , human LIF, Chemokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8.
Eine Reportergruppe ist ein Atom, Molekül oder eine Ver- bindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung mittels Phosphoimager . Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt und bedürfen nicht der detaillierten Aufzählung.
Eine an Targetmoleküle bindende Substanz kann eine Sub- stanz sein, welche ein Target-Protein oder an eine Target- RNA bindet.
Im Rahmen der vorstehenden Definition gegenüber dem engen Wortsinn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch die bestimmten Begriffe im engen Wortsinn.
Beispiele .
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich bevorzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen: Figur 1: Chip-Analyse zur differenziellen Expression von CD24 im Prostatatumorgewebe, an 54 Normal/Tumor Gewebeproben analysiert.
Figur 2: Immunhistochemie mit einem CD24 Antikörper (maus anti human CD24, Klon 24C02), CD24 ist im primären Prostatakarzinom deutlich stärker exprimiert als im benignen Gewebe.
Figur 3: Immunhistochemie mit einem CD24 Antikörper (maus anti human CD24, Klon 24C02), CD24 ist in Lymphknotenmetastasen deutlich stärker exprimiert als im primären Prostatakarzinom,
Figur 4: Tabelle mit Informationen zu den erfindungsgemäßen Sequenzen.
Sequenzprotokoll: erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen,
Sequenzprotokoll: erfindungsgemäße Aminosäuresequenzen,
Beispiel 1: Mikrodissektion
Prostatatumor- und -normalgewebe aus jeweils einem Patienten wurde gefroren und in lOμm Proben geschnitten. Aus jedem Patienten wurden zumindest 30 Proben gewonnen. Normal und maligne Bereiche wurden durch einen Pathologen mit Hilfe eines Mikroskopes identifiziert und markiert. Die jeweiligen Bereiche wurden unter dem Mikroskop resektiert unter Verwendung einer Nadel und jeweils separat auf -80°C eingefroren in 150μl GTC Puffer enthaltend 2% ß-Mercaptoethanol . Beispiel 2: Chipanalyse
Aus Proben aus Beispiel 1 wird RNA isoliert, amplifiziert und markiert. Die so erhaltene RNA wird einem Genchip aufgegeben, welcher eine Vielzahl von verschiedenen Oligonu- kleotiden enthält, wobei jeweils eines (oder auch mehrere, zu Kontrollzwecken) für ein definiertes Gen repräsentativ ist, i.e. eine charakteristische Teilsequenz hieraus aufweist. Man erhält sowohl qualitative, wie auch quantitative Information, ob eine betreffende Normal- und/oder Tumorprobe ein betreffendes Gen exprimiert, und zwar auch im Verhältnis Tumor/Normal . In Fällen, in welchen ein Gen in Tumorgewebe höher exprimiert ist, als im korrelierten Normalgewebe liegt diffentielle Expression vor, i.e. das Gen ist im Tumorgewebe hochreguliert. Wenn das Gen dagegen in Tumorgewebe geringer exprimiert ist, liegt Herunterregulation vor. Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen differenziell im Tumorgewebe hochreguliert sind. Die Ergebnisse sind im einzelnen der Tabelle 1 entnehmbar.
Beispiel 3: Untersuchung der Expression bzw. Überexpressi- on mittels quantitativer PCR.
Eine Poly-A+-RNA Präparation erfolgt unter Verwendung eines modifizierten Protokolls gemäß dem Poly-A-Tract 1000 Kit (Amersham, Freiburg, Deutschland). Gewebeproben, ' bei- spielsweise aber nicht notwendigerweise erhalten gemäß Beispiel 1, werden langsam' auf Eis aufgetaut, zerkleinert und mit 300μl Verdünnungspuffer, enthaltend 1% ß-Mercaptoethanol, sowie biotinyliertem Oligo-dT Primer versetzt, und für 5 min. auf 70 °C erhitzt. Die Proben werden dann für 5 min. bei 20°C gehalten und anschließend bei 20000g für 10 min. zentrifugiert . Dem Überstand werden 120μl gewaschener Streptavidin-gekoppelter paramagnetischer Parti- kel (SA-PMP) zugebenen und es wurde bei 20°C für 5 min. inkubiert. Die mRNA wurde dann durch magnetische Trennung isoliert. Nach drei Waschschritten mit 0,5x SSC Lösung wird die mRNA in Nuklease-freiem Wasser verdünnt, eingedampft unter Vakuum und umgehend in cDNA prozessiert.
Anschließend erfolgt die cDNA Synthese. Die erhaltene mRNA aus 2 wird in lOμl Nuklease-freiem Wasser gelöst. Iμl T7-dT24- (GGCCAG) Primer (100 pmol/μl) wird zugegeben und es wurde auf 70°C für 5 min. erhitzt. Dann wurde die Probe auf Eis gelegt und es werden 4μl 5x first Strand buffer (Invitrogen) , 2μl DTT (0,1M), lμl dNTP's (lOmM), und 14U anti-RNAse (Ambion) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 2 min. bei 37 °C. Dann werden lμl Superscript II Reverse Transskriptase (Invitrogen) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 1 h bei 37°C.
Anschließend erfolgt die Zweitstrangsynthese und DNA Reinigung. Sofort nach der Synthese des ersten Stranges, wie vorstehend, werden 91μl Wasser, 30μl 5x second Strand buf- fer, 3μl dNTP's (lOmM), 10U E. coli DNA-ligase, 40U DNA Polymerase I und 2U RNAse H (alle von Invitrogen) zugegeben und die Mischung wird für 2 h bei 16°C inkubiert. Dann werden 10U T4 DNA Polymerase (Invitrogen) zugegeben und weitere 5 min. inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von lOμl 0,5mM EDTA abgebrochen. Die Reinigung der DNA erfolgt gemäß den Vorschriften des GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits (A ersham) . Gereinigte DNA wird unter Vakuum eingedampft und bei -20°C gelagert. Dann erfolgt die in vitro Transkription und cRNA Reinigung. Die in vitro Transskription wird gemäß- dem Herstel- . lerprotokoll von Ambion (Huntigdon, UK) durchgeführt. Das DNA Pellet wird in 8μl Wasser gelöst und 7,5μl dNTP's
(75mM), 2μl lOx reaction buffer (Ambion), 2μl 10 T7 Enzymmix (Ambion) und 14U anti-RNAse (Ambion) werden zugegeben, gefolgt von einer Inkubation von 6 h bei 37 °C. Die Reinigung der erhaltenen cRNA erfolgt gemäß dem Herstellerpro- tokoll zum Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) . Nach Elution von der Säule wird die verdünnte cRNA eingedampft unter Vakuum und auf -80°C eingefroren.
Anschließend wird die zweite in vitro Transskriptionsrunde durchgeführt. Die zweite Verstärkungsrunde wird mit nur geringen Abweichungen von der ersten Runde durchgeführt. Die Synthese des ersten Stranges erfolgt mit random hexa- er primer (250ng/μl) . Nach Inkubation über 60 min. wird das cRNA-cDNA Hybrid für 20 min. mit 2U RNase H inkubiert, gefolgt von einem 2-minütigen Inaktivierungsschritt bei 37°C.
Schließlich erfolgt die quantitative PCR und Auswertung. Die Synthese des ersten Stranges erfolgt mit der cRNA aus der vorgehenden Stufe. Ing cDNA werden für die Amplifika- tion eingesetzt mit 2,5μl lOx SYBR®Green PCR Puffer, 3μl Magnesiumchlorid (25mM) , 2μl dNTP's (mit dUTP; 12,5 mM) und 0, 625U Ampli Taq Gold in einem Reaktionsvolumen von 25μl. Die Reaktion wird in einem GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt,
Deutschland) durchgeführt. Die Bedingungen sind: 2 min. 50°C, 10 min. 95°C, 15 s 95°C, 1 min. 60°C, die letzten beiden Phasen in 40 Zyklen. Für die jeweiligen Gene werden die geeigneten Vorwärts- bzw. Rückwärtsprimer verwendet. Die Auswertung erfolgt nach der ΔΔCt Methode nach Herstellervorschrift. Der Ct Wert von beta actin wurde bei einer Grenze von 0,1 gemessen. Zur Normalisierung wird der Ct Wert des beta actin vom Ct Wert des untersuchten Gens abgezogen. Dieser normalisierte Ct Wert wird im Falle der Tumorgewebe auf die Normalgewebe bezogen bzw. normalisiert, wodurch der ΔΔCt erhalten wird. Wird dieser Wert als Potenz zur Basis 2 eingesetzt, so wird eine relative Größe der Über- oder Unterexpression in Tumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe des gleichen Patienten erhalten. Im Ergebnis kann so bestimmt werden, ob ein spezifisches Tumorgewebe eines bestimmten Patienten sensitiv für eine erfindungsgemäße Behandlung ist. Auch kann mit dieser Methode bestimmt werden, ob nicht klassifiziertes Gewebe als Tumorzellen enthaltend einzustufen ist. In letzterem Falle erfolgt ein Vergleich zu Referenzwerten bzw. klassifiziertem Normalgewebe des gleichen Patienten oder von anderen Personen.
Beispiel 4: differenzielle Expression gemessen mittels der Genechip-Technologie, am Beispiel CD24.
Beispielhaft ist in Figur 1 das Ergebnis von Experimenten gemäß Beispiel 2 anhand von CD24 dargestellt. Man erkennt, dass in einer signifikanten Anzahl der Proben aus 54 Patienten CD24 hochreguliert ist. Analoge Ergebnisse wurde für die weiteren erfindungsgemäßen Sequenzen erhalten, welche der Übersichtlichkeit halber nicht dargestellt sind. Beispiel 5: Nachweis eines überexprimierten Gens mittels Antikörpern.
In diesem Beispiel wird die Markierung von Tumorzellen durch einen gegen ein erfindungsgemäßes Protein gerichteten Antikörper in vivo (Mausmodell) beschrieben. Ein solcher erfindungsgemäßer Antikörper wird mit einem Markermolekül (z.B. Radioisotop) markiert. In NMRI-Nacktmäuse werden mit einem erfindungsgemäßen Gen transfizierte humane Zellen transplantiert . Nach einem definierten Zeitraum, beispielsweise 3O Tage, wird den Mäusen der markierte Antikörper injiziert. Die Kontrolltiere werden mit einem nicht relevanten Antikörper behandelt. Wenige Stunden nach der Antikörperapplikation werden die Tiere getötet und aus allen Organen Gewebeschnitte angefertigt. Diese Schnitte werden auf die Gegenwart von markiertem Antikörper untersucht .
Bei den Antikörpern kann es sich im einfachsten Fall um polyklonale Antikörper gegen humanes Protein, konjugiert mit einem Trägerprotein, in Kaninchen gezogen und mit den spezifischen immobilisierten Peptiden affinitätsgereinigt, handeln. Geeignete I munisierungspeptide sind beispielsweise aus Teilsequenzen eines erfindungsgemäßen Proteins gebildet. Als Immunogene können ebenso mit cDNA des Gens, oder Teilsequenzen hiervon transfizierte Zellen, wie beispielsweise COS-Zellen oder NIH3T3-Zellen, eingesetzt werden. Ebenso sind Tumorzellen, die endogen das Protein exprimieren, geeignet. Weiterhin kann auch rekombinant her- gestelltes Protein bzw. Teilsequenzen hieraus, die in Pro- ducerzellen, wie E. coli oder Eukaryontenzellen, wie Insektenzellen, exprimiert werden, zur Immunisierung eingesetzt werden. Selbstverständlich können stattdessen auch entsprechende monoklonale Antikörper oder Fragmente hiervon eingesetzt werden.
Beispiel 6: Immunhistochemischer Nachweis von Tumorzellen.
Gewebe wird aus einem Patienten mit Krebs oder dem Verdacht auf Krebs isoliert und als Paraffin- bzw. Gefrierschnitte präpariert. Diese Schnitte werden mit einem gegen ein erfindungsgemäßes Protein gerichteten Antikörper auf die Überexpression des Proteins in Tumorzellen untersucht'. Die immunhistologische Untersuchung mit dem Antikörper zeigt höhere Expression des Proteins in den Tumorzellen im Vergleich zu umliegenden Normalgewebe. Die Untersuchung erfolgt im Einzelnen durch Inkubation mit dem Antikörper als primärem Antikörper, einem biotinyliertem sekundären anti-Kaninchen Antikörper und einer Streptavidin-gekoppel- ten Meerrettichperoxidase. Die Färbung erfolgt mit mit DAß als chromogenen Substrat (braune Färbung) . Die Gegenfär- bung erfolgt mit Hemalaun-Lösung (blaue Färbung) . Es sind maligne und nichtmaligne Zellen unterscheidbar, wobei die malignen Zellen eine starke Färbung, i.e. hohen Gehalt an erfindungsgemäßem Protein, aufweisen, während die nichtmalignen Zellen nur moderat gefärbt sind.
Die Figuren 2 und 3 zeigen beispielhafte Ergebnisse anhand von CD24. In Figur 2 wurde mit einem CD24 Antikörper (Maus, anti human CD24, Klon 24C02) gearbeitet. In Figur 2, links wurde benignes Gewebe eingesetzt. Man erkennt, dass benigne Atrophie starke Färbung in der apikalen Membran zeigt. In Figur 2, rechts, wurde dagegen mit primärem Prostatakarzinom gearbeitet. In 15 von 63 analysierten Adenocarzinomen wurde eine sehr starke Membran- und Zytoplasma-Färbung festgestellt. In Figur 3 ist ein Vergleich primärer Tumor (links) mit Lymphknotenmetastasen (rechts) unter Verwendung der gleichen Antikörper dargestellt. Man erkennt vergleichsweise höhere Expression in den Lymphknotenmetastasen.
Beispiel 7: Erzeugung von anti-idiotypischen monoklonalen Antikörpern zu therapeutischen Zwecken
Ausgehend von einem erfindungsgemäßen Protein wird in fachüblicher Weise ein monoklonaler Antikörper Abi erzeugt, welcher in der Lage ist, das Protein spezifisch zu erkennen und daran zu binden. Dabei ist es unwesentlich, ob eine funktionale Domäne oder ein anderer zugänglicher Bereich erkannt wird. Mit Hilfe des erzeugten Antikörpers Abi wird in ebenso fachüblicher Weise ein zweiter anti-i- diotypischer nicht humanisierter, beispielsweise Maus, monoklonaler Antikörper aABl erzeugt, welcher zur Hers-tel- lung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Prostatatumoren geeignet ist. Die Funktion des Antikörpers aABl beruht dabei darauf, dass dieser dem humanen Immunsystem ein Image des (humanen) Protein-Antigens gleichsam vortäuscht, wobei das Immunsystem den Antikörper aABl aufgrund seiner mangelnden Humanisierung als körperfremd erkennt. Der humane Körper bildet folglich eigene Antikörper, die gegen aABl und somit auch gegen das humane Protein bzw. dieses exprimierende Tumorzellen gerichtet sind.

Claims

Patentansprüche :
1. Nukleinsäure enthaltend oder bestehend aus einer Nu- kleinsäuresequenz gemäß einer der offenbarten Nukleinsäuresequenzen .
2. Peptid oder Protein enthaltend eine Aminosäurensequenz codiert durch eine der offenbarten Nukleinsäuresequenzen oder bestehend hieraus oder enthaltend eine oder bestehend aus einer der offenbarten Aminosäuresequenz.
3. Verwendung einer Nukleinsäure und/oder eines Peptids oder Proteins nach Anspruch 1 oder 2, zur Detektion von Prostatakrebs oder zur Detektion eines Risikos der Erkrankung an Prostatkrebs, wobei eine Prostata-Gewebeprobe auf Übertranskription der Nukleinsäure oder auf Überexpression des Proteins untersucht wird.
4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei eine an die Nukleinsäure oder eine an das Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise enthaltend eine Reportergruppe, verwendet wird, wobei Bindung besagter Nukleinsäure und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ oder quantitativ detektiert wird.
5. Verwendung einer Nukleinsäure oder eines Proteins oder Peptids nach Anspruch 1 oder 2, zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter Nukleinsäure oder besagtem Protein oder Peptid, oder prospektiven Detektorsubstanzen, wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver Substanzen mit besagter Nukleinsäure oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem Bindungsassay Bin- dungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selektiert wird.
6. Verwendung einer eine Nukleinsäure oder ein Peptid bzw. Protein nach Anspruch 1 oder 2 inhibierenden oder daran bindenden Substanz, insbesondere identifiziert nach Anspruch 5, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose und/oder Behandlung von Prostatakrebs.
7. Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
a) Antisense-Oligonukleotide, siRNA, und Ribozyme gegen eine Nukleinsäure nach Anspruch 1, b) an ein Peptid oder Protein nach Anspruch 2 bindendes, insbesondere nach Anspruch 5 identifiziertes, organisches Molekül mit einem Molekulargewicht unterhalb 5000, vorzugsweise unterhalb 1000, höchstvorzugsweise unterhalb 300, c) Aptamer gegen ein Protein oder Peptid nach Anspruch 2 , insbesondere identifiziert nach Anspruch 5, d) (monoklonaler) Antikörper, insbesondere humaner oder humanisierter Antikörper, gegen ein Protein oder Peptid nach Anspruch 2, e) anti-idiotypische nicht-humane (monoklonale) Antikörper, generiert mittels eines Antikörpers der Un- terguppe d) , und f) vorstehende Substanzen derivatisiert mit einer Re- portergruppe, einem Zelltoxin einer immunstimulierenden Komponente und/oder einem Radioisotop.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 6 oder 7, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet ist.
9. Verfahren zur Diagnose einer Prostatakrebserkrankung, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in der Ausführungsform mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe in vivo oder in vitro appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv für die Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen enthaltend qualifiziert wird.
10. Verfahren zur Behandlung einer Prostatakrebs-Erkrankung, wobei eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8 in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten dargereicht wird.
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