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Gebiet der
Erfindung
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Die Erfindung betrifft neue humane
Nukleinsäuresequenzen
aus Prostatakarzinomen sowie hierdurch codierte Proteine bzw. Peptide,
die Verwendung von hieraus abgeleiteten Sequenzen zum Screenen nach
daran bindenden Substanzen, sowie die Verwendung von an solche Nukleinsäuresequenzen
und Proteine bzw. Peptide bindenden Substanzen zur Diagnose und/oder
Behandlung von Tumorerkrankungen, insbesondere Prostatakrebs.
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Hintergrund der Erfindung
und Stand der Technik
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Prostatakrebs ist eine mit zunehmendem
Alter mit beachtlicher Incidenz auftretende Erkrankung, für dessen
Bekämpfung
neue Therapien notwendig sind. Gegenwärtig werden Patienten mit einem
Prostattumor in zwei Gruppen eingeteilt. Die erste Gruppe umfasst
Patienten mit einem operablen Tumor (ca. 90% aller Patienten). Bei
diesen wird der Tumor chirugisch möglichst vollständig entfernt
(radikale Prostatektomie). Die Entfernung der Prostata hat beachtliche
medizinische Risiken und nachteilige Effekte auf die Lebensqualität eines
Patienten, wie z.B. Inkontinenz und Impotenz. Die zweite Gruppe
(ca. 10% aller Patienten) sind Patienten mit inoperablem Tumor.
Diese können
nicht kurativ durch eine Operation behandelt werden, da sie bereits
Lymphknotenmetastasen aufweisen. Diese Patienten werden zur Zeit palliativ
mit Anti-Androgen- oder Strahlentherapie behandelt. Die Anti-Androgen
Therapie, welche auf einer Blockierung von Hormonwirkungen beruht,
ist sehr häufig
nach wenigen Jahren wirkungslos, da der Tumor hormonunabhängig wird,
i.e. ohne Hormonwirkung weiterwächst
und Metastasen bildet. Ebenso können
durch eine Strahlentherapie nicht alle Tumorzellen beseitigt werden.
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Eine verbesserte Diagnose und Behandlung dieser
Krebsart, insbesondere auch ohne das Erfordernis einer Entfernung
der Prostata, ist daher in hohem Maße wünschenswert.
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Das Phänomen Krebs geht häufig einher
mit der Über-
oder Unterexpression einer Vielzahl von Genen in den entarteten
Zellen. Die Identifikation tumor-relevanter Gene ist daher ein wichtiger
Ansatzpunkt für
die Entwicklung neuer Therapien gegen Prostatakrebs (Welsch et al.,
Cancer Res 61 (16): 5974–5978
(2001)).
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Für
die Suche nach Tumor-bezogenen Kandidatengenen beim Prostatakarzinom
wurden DNA Microarrays verwendet. Die analysierten Tumor- und Normalgewebeproben
können
durch Mikrodissektion gewonnen werden. Mittels der Mikrodissektion
ist es möglich,
die zu untersuchenden Gewebe genau, i.e. auf der Ebene einzelner
Zellverbände,
zu definieren. Vergleichende Untersuchungen haben ergeben, dass
durch die Anwendung von Mikrodissektion differentiell exprimierte
Gene identifiziert werden können, die
in einer Gen-Expressionsuntersuchung von Gesamtgewebe nicht gefunden
werden (Ernst et al., Am J Pathol 160(6): 2169–2180 (2002)).
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Technisches
Problem der Erfindung
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Der Erfindung liegt das technische
Problem zugrunde, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Diagnose
und/oder zur Behandlung von Prostatakrebs-Erkrankungen anzugeben
sowie Mittel zu deren Findung.
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Grundzüge der Erfindung sowie bevorzugte
Ausführungsbeispiele.
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Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt
die Erfindung zunächst
eine Nukleinsäure
enthaltend oder bestehend aus einer Nukleinsäuresequenz gemäß einer
der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 129 sowie ein Peptid oder Protein enthaltend
eine Aminosäurensequenz
codiert durch eine der Nukleinsäuresequenzen
Seq.-ID 1 bis 129 oder bestehend hieraus (siehe hierzu auch Tabelle
I). Erfindungsgemäße Nukleinsäuren oder
Proteine bzw. Peptide lassen sich mit den üblichen molekularbiologischen
Methoden herstellen.
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Die Erfindung betrifft weiterhin
verschiedene Verwendungen der neuen Nukleinsäuren bzw. Peptide oder Protein,
ebenso wie (gleiche) Verwendungen bereits bekannter Nukleinsäuren. Diese
sind:
- i) Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und/oder
eines erfindungsgemäßen Peptids
oder Proteins, zur Detektion von Prostatakrebs oder zur Detektion
eines Risikos der Erkrankung an Prostatkrebs, wobei eine Prostata-Gewebeprobe auf Übertranskription
der Nukleinsäure
oder auf Überexpression
des Proteins untersucht wird. Dabei kann eine an die Nukleinsäure oder
eine an das Protein oder Peptid bindende Detektorsubstanz, vorzugsweise
enthaltend eine Reportergruppe, verwendet werden, wobei Bindung
besagter Nukleinsäure
und/oder besagten Proteins oder Peptids an die Detektorsubstanz halbquantitativ
oder quantitativ delektiert wird. Auch kann das Expressionsniveau
durch Amplifikation, beispielsweise quantitative PCR, gemessen werden.
- ii) Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder
eines erfindungsgemäßen Proteins oder
Peptids zum Screenen nach daran bindenden Substanzen, insbesondere
prospektiven Wirkstoffen zur Inhibierung von besagter Nukleinsäure oder
besagtem Protein oder Peptid, oder prospektiven Detektorsubstanzen,
wobei eine prospektive Substanz oder eine Mischung solcher prospektiver
Substanzen mit besagter Nukleinsäure
oder besagtem Protein oder Peptid kontaktiert wird, wobei mit einem
Bindungsassay Bindungsereignisse festgestellt werden, und wobei eine
bindende prospektive Substanz, ggf. nach Dekonvolution, selektiert
wird.
- iii) Verwendung einer eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder ein erfindungsgemäßes Peptid bzw.
Protein inhibierenden oder daran bindenden Substanz, insbesondere
identifiziert mit dem erfindungsgemäßen Screening Verfahren, zur
Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Diagnose
und/oder Behandlung von Prostatakrebs.
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Eine im Rahmen der Erfindung eingesetzte Substanz
kann ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Antisense-Oligonukleotide,
siRNA, und Ribozyme gegen eine Nukleinsäure nach Anspruch 1,
- b) an ein Peptid oder Protein nach Anspruch 2 bindendes, insbesondere
nach Anspruch 5 identifiziertes, organisches Molekül mit einem
Molekulargewicht unterhalb 5000, vorzugsweise unterhalb 1000, höchstvorzugsweise
unterhalb 300,
- c) Aptamer gegen ein Protein oder Peptid nach Anspruch 2, insbesondere
identifiziert nach Anspruch 5,
- d) (monoklonaler) Antikörper,
insbesondere humaner oder humanisierter Antikörper gegen ein Protein oder
Peptid nach Anspruch 2,
- e) anti-idiotypische nicht-humane (monoklonale) Antikörper, generiert
mittels eines Antikörpers
der Unterguppe d) , und
- f) vorstehende Substanzen derivatisiert mit einer Reportergruppe,
einem Zelltoxin einer immunstimulierenden Komponente und/oder einem
Radioisotop.
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Im Falle a) kann als Ribozyme beispielsweise
ein Hammerhead Ribozym eingesetzt werden. Die Ribozym-Schnittstelle
wird mit der Maßgabe
ausgewählt,
dass durch die Aktivität
des Ribozymes die Expression des Proteins entweder unterbunden wird, oder
eine inaktive Form bzw. ein inaktives Fragment des Proteins exprimiert
wird. Beides läßt sich
beispielsweise dadurch ermittelt, dass in einem Zellsystem, in welchem
ein erfindungsgemäßes Protein
auf definiertem Niveau exprimiert wird, dieses Zellsystem mit einem
oder mehreren für
definierte Schnittstellen modelliertes Ribozym kontaktiert wird
und das Expressionsniveau bestimmt bzw. die biologische Aktivität des exprimierten
Proteins. Dies wird dann verglichen mit einer Negativprobe bzw.
den Ergebnissen ohne Kontaktierung und Ribozyme werden selektiert,
die zu niedrigerer Expression oder Aktivität führen. Entsprechend kann im
Falle der siRNA oder der antisense Nukleinsäuren vorgegangen werden.
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Im Falle b) können chemische Stoffbibliotheken
eingesetzt werden, um nach bindenden Substanzen zu screenen. Eine
Validierung bindender Substanzen für therapeutische Zwecke kann
durch Bestimmung der biologischen Aktivität des Proteins in einem Zellsystem
mit und ohne Kontaktierung und Vergleich der erhaltenen Ergebnisse
erfolgen. Für therapeutische
Zwecke ausgewählt
werden dann solche Stoffe, die zu einer reduzierten biologischen
Aktivität
führen.
Es ist auch möglich,
dass im Rahmen eines erfindungsgemäßen Screening Verfahren an Stelle
der Bindung die biologische Aktivität bestimmt wird; dann ist eine
Validierung im vorstehenden Sinne zugleich mit dem Screening erfolgt.
Biologische Aktivität
läßt sich
beispielsweise dadurch bestimmen, dass natürliche Assoziationspartner
des Proteins bestimmt und deren Vorkommen und Form (z.B. Monomer/Dimer)
untersucht werden. Es lassen sich auch weiter downstream in einer
Stoffwechselkaskade entstehende Substanzen als Indikator verwenden;
diese lassen sich beispielsweise dadurch identifizieren, dass zuvor
Zellkomponenten analysiert werden für die das Protein exprimierende
Zelle und ein Vergleich durchgeführt
wird mit gleichen Zellen, in welchen jedoch die Expression gentechnisch
deletiert ist.
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Geeignete Aptamere (c) lassen sich
unschwer beispielsweise mittels des wohlbekannten SELEX Verfahren
identifizieren, wobei das erfindungsgemäße Protein als Target eingesetzt
wird.
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Antikörper (d), insbesondere monoklonale Antikörper, können in üblicher
Weise durch Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers mit einem erfindungsgemäßen Protein,
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure (z.B.
cDNA), einer ein erfindungsgemäßes Protein
konstitutiv exprimierenden Zelle (Krebszelle oder beispielsweise
mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure transfizierte
Zelle, wie COS oder NIH3T3), oder mittels recombinat hergestelltem
erfindungsgemäßem Protein
oder Peptid, beispielsweise in E.coli oder Eukaryontenzellen, beispielsweise
Insektenzellen, exprimiert, erhalten werden. Monoklonale Antikörper sind
durch übliche
Selektion und Etabilierung von Hybridomzellen erhältlich.
Auch kann die Phage Display Technologie zur Generierung der Antikörper eingesetzt
werden.
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Im Falle der anti-idiotypischen Antikörper (e) sind
diese dadurch erzeugbar, dass mittels eines erfindungsgemäßen Antikörpers, welcher
nicht notwendigerweise die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins
beeinflussen muss, in einem nicht-menschliche Säugetier ein zweiter anti-idiotypischer
(monoklonaler) Antikörper
generiert wird. Dieser anti-idiotypische Antikörper täuscht dann bei Applikation
in humane Zellen dem humanen Immunsystem ein Bild des Zielmoleküls vor und
wird aufgrund seiner nicht-humanisierten
Form als körperfremdes
Epitop erkannt. Der Mensch bildet folglich natürlicherweise Antikörper gegen
des anti-idiotypischen Antikörper
und somit auch gegen das Protein bzw. gegen das Protein exprimierende
Zellen. Diese Variante der Erfindung ist ausschließlich für therapeutische
Zwecke verwendbar.
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Die Erfindung betrifft des weiteren
ein Verfahren zur Diagnose einer Prostatakrebserkrankung, wobei
eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung in der Ausführungsform
mit einer Reportergruppe in zu untersuchendes Gewebe in vivo oder
in vitro appliziert wird, wobei das zu untersuchende Gewebe dann
einer Detektionsverfahrenstufe unterworfen wird, welche sensitiv
für die
Reportergruppe ist, und wobei im Fall der Detektion eines definierten
Mindestwertes der Reportergruppe im Gewebe das Gewebe als Tumorzellen
enthaltend qualifiziert wird, sowie ein Verfahren zur Behandlung einer
Prostatakrebs-Erkrankung, wobei eine erfindungsgemäße pharmazeutische
Zusammensetzung in einer physiologisch wirksamen Dosis einem Patienten
dargereicht wird.
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Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis,
daß erfindungsgemäße Gene
bzw. Genprodukte differentiell in Prostatatumorgewebe exprimiert
werden, i.e. in Prostatatumorgewebe ist die Expression höher oder
niedriger, insbesondere höher,
verglichen mit normalen Zellen gleichen Gewebes. Dies erlaubt es einerseits,
insbesondere diese neuen Gene bzw. Genprodukte als Marker zur Identifizierung
von Tumorzellen in der Prostata zu nutzen. Auf der anderen Seite
bietet die Inhibierung der Gene bzw. Genprodukte, insbesondere auch
bei lokaler Applikation, die Möglichkeit,
in die Prostatatumor-spezifischen Genprodukt-Assoziationen mit anderen
Prozessen in den Tumorzellen einzugreifen und somit letztendlich
den tumorzellenspezifisch veränderten
Stoffwechsel zu stören
und zu einem Absterben oder zumindest einer Wachstumshemmung der
Prostatatumorzellen beizutragen.
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Im Rahmen der Erfindung kann es sich
empfehlen, im Vorfeld einer Behandlung mit einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung eine Probe aus einem Gewebe, welches als Tumorgewebe
mit anderen Methoden identifiziert ist, zu entnehmen und die Gewebeprobe
auf Expression bzw. Überexpression
des erfindungsgemäßen Gens bzw.
Genproduktes zu untersuchen. Alternativ kann mit einer erfindungsgemäßen Detektorsubstanz
zur Diagnose in vivo auf Abhängigkeit
von dem Gen bzw. Genprodukt getestet werden. Wird eine Expression bzw. Überexpression
des Gens bzw. Genproduktes gegenüber
Normalgewebe gleichen Typs festgestellt, so ist die Anwendung der
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung indiziert.
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Handelt es sich bei dem Tumor um
einem Typus, bei welchem Tumorzellen ein erfindungsgemäßes Gen
exprimieren, Normalzellen gleichen Gewebetyps jedoch nicht oder
nur schwach, so ist es besonders bevorzugt, wenn die an das Gen
bzw. das Genprodukt bindende Substanz zusätzlich eine zytotoxische und/oder
immunstimulierende Komponente trägt.
Dies führt
dann letztendlich dazu, dass praktisch ausschließlich Tumorzellen getötet werden,
sei es durch die Zytotoxizität,
sei es durch Angriff durch das stimulierte Immunsystem, während Normalzellen in
dem Gewebe praktisch vollständig
erhalten bleiben. In dieser Ausführungsform
braucht die bindende Substanz selbst nicht inhibierend auf das Gen
bzw. Genprodukt zu wirken, da die bindende Substanz dann lediglich
als Marker funktionieren muß,
welcher die Komponenten zu Ziel-Tumorzellen trägt. Im Falle des Einsatzes
einer zytotoxischen und/oder immunstimulierenden Komponente kann
es sich besonders empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung
zur lokalen Applikation in Tumorzellen enthaltendem Gewebe hergerichtet
ist, beispielsweise zur Injektion.
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Sofern im Rahmen der Beschreibung
offenbarte und/oder beanspruchte Sequenzen per se vorbekannt sind
oder Teile vorbekannter Sequenzen sind, sind die offenbarten Sequenzen,
soweit sie mit vorbekannten Sequenzen übereinstimmen, insofern Gegenstand
der Erfindung, als dass sie lediglich gemäß den beschriebenen Verwendungen
eingesetzt werden. Offenbarte und/oder beanspruchte Sequenzen, welche
Teile von vorbekannten Sequenzen sind, können mittels eines Disclaimers
oder mehrerer Disclaimer in Ansprüchen so abgegrenzt werden,
dass die vorbekannten Sequenzen nicht mit umfasst sind.
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Definitionen.
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Im Rahmen dieser Beschreibung umfaßt eine
Sequenz alle humanen Isoformen, bekannt oder neu, auf Nukleinsäuren- oder Aminosäurenbasis.
Mit diesen Begriffen mit umfaßt
sind auch die im Rahmen dieser Beschreibung offenbarten kurzen Sequenzen, welche
aus Isoformen stammen, beispielsweise Immunisierungssequenzen. Weiterhin
mit umfaßt
sind auch Homologe, wobei die Homologie zumindest 80%, vorzugsweise
mehr als 90%, höchstvorzugsweise
mehr als 95%, beträgt
(berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der zum
Anmeldezeitpunkt aktuellen Fassung). Im Falle der Nukleinsäuresequenzen
sind auch komplementäre
oder allelische Varianten sowie stille Mutationen mit umfaßt. Weiterhin
sind Sequenzen umfaßt,
welche lediglich Teilsequenzen der explizit offenbarten Sequenzen,
beispielsweise ein Exon oder mehrere Exons, oder komplementärer Sequenzen
hierzu darstellen, mit der Maßgabe,
daß diese
Teilsequenzen im Falle der Nukleinsäuren eine für eine Hybridisierung mit einer
erfindungsgemäßen Nukleinsäure hinreichende
Länge,
zumindest 50 oder 150 Basen, bis zu 1700 Basen und mehr, aufweisen
und im Falle der Proteine bzw. Peptide mit zumindest gleicher Affinität an ein
protein- oder peptidspezifisches Zielmolekül binden. Weiterhin sind alle
mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuren hybridisierende
Nukleinsäuren
umfaßt,
nämlich
solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25°C unterhalb der Aufschmelztemperatur;
siehe ergänzend
J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren.
Es versteht sich, daß die
Erfindung auch Expressionskassetten umfaßt, i.e. eine oder mehrere
der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz. Eine
solche Expressionskassette kann auch eine Sequenz für ein bekanntes
Protein umfassen, wobei im Zuge der Translation ein Fusionsprotein
aus einem bekannten Protein und einem erfindungsgemäßen Protein
oder Peptid entsteht. Ebenso sind auch antisense Sequenzen zu den
vorstehenden Nukleinsäuresequenzen
umfaßt.
Schließlich
sind RNA sowie damit korrelierende DNA und umgekehrt umfaßt, ebenso
wie genomische DNA als auch korrelierte cDNA und umgekehrt.
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Im Zusammenhang mit erfindungsgemäßen Verwendungen
umfassen die Begriffe der Nukleinsäuren oder Protein bzw. Peptide
neben den Volllängen
der offenbarten Sequenzen (siehe auch vorstehender Absatz) auch
Teilsequenzen hieraus, und zwar mit einer Mindestlänge von
12 Nukleotiden, vorzugsweise 30 bis 90 Nukleotiden, im Falle der
Nukleinsäuren
und einer Mindestlänge
von 4 Aminosäuren,
vorzugsweise 10 bis 30 Aminosäuren,
im Falle der Peptide oder Proteine.
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Die Begriffe der Detektion und/oder
der Behandlung von Prostatakrebs umfassen auch die Detektion und/oder
Behandlung von Metastasen aus Primärtumoren in sonstigen Geweben.
Der Begriff der Behandlung umfaßt
auch die Prophylaxe.
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Als Inhibitor ist eine Verbindung
oder Substanz bezeichnet, welche entweder die Bildung von des erfindungsgemäßen Proteins
bzw. Peptids inhibiert oder gebildetes Protein bzw. Peptid in der
Aktivität
reduziert, bezogen auf dessen Aktivität in Abwesenheit des Inhibitors.
Insofern kann ein Inhibitor einerseits eine Substanz sein, welche
in der Entstehungskaskade des Protein bzw. Peptids inhibierend eingreift.
Ruf der anderen Seite kann ein Inhibitor eine Substanz sein, welche
mit gebildetem Protein bzw. Peptid eine Bindung eingeht, und zwar
dergestalt, dass weitere physiologische Wechselwirkungen mit endogenen
Substanzen zumindest reduziert sind.
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Von der Erfindung mit umfaßte Mimikry-Moleküle sind
Verbindungen, die den variablen Bereich, insbesondere den Bindungsbereich
eines Antikörpers,
nachbilden und an gleicher Stelle eines Zielmoleküls binden,
wie der zu Grunde liegende Antikörper.
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Der Begriff der Antikörper umfaßt polyklonale Antikörper, monoklonale
Antikörper,
nicht-humane, humane und humanisierte Antikörper, sowie Phage-Display-Antikörper, aber
auch chimäre
Antikörper und
anti-idiotypische Antikörper
sowie spezifische Fragmente der leichten und/oder der schweren Kette des
variablen Bereiches zu Grunde liegender Antikörper vorstehender Art. Die
Herstellung bzw. Gewinnung solcher Antikörper mit vorgegebenen Immunogenen
ist dem Durchschnittsfachmann wohl vertraut und braucht nicht näher erläutert zu
werden. Weiterhin umfaßt
der Begriff der Antikörper
bispezifische Antikörper.
Bispezifische Antikörper
kombinieren eine definierte Immunzellaktivität mit einer spezifischen Tumorzellerkennung,
wodurch Tumorzellen getötet
werden. Ein bispezifischer Antikörper
bindet einerseits an ein Auslösemolekül der Immun-Effektorzelle
(z.B. CD3, CD16, CD64) und andererseits an Antigene der Tumorzielzelle.
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Die galenische Herrichtung einer
erfindungsgemäßen pharmazeutischen
Zusammensetzung kann in fachüblicher
Weise erfolgen. Als Gegenionen für
ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexylammonium
infrage. Geeigente feste oder flüssige
galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver,
Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen,
Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen (i.v., i.p., i.m.) sowie
Präparate
mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel
wie Trägerstoffe, Spreng-,
Binde-, Überzugs-,
Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und
Lösungsvermittler,
Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxyd,
Lactose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine,
Stärke,
Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran,
Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel,
wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise
Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung
ist dadurch herstellbar, dass mindestens eine erfindungsgemäß verwendete
Substanz in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten
und physiologisch verträglichen
Träger und
ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter
Substanzdosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet
ist.
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Tumorzellen exprimieren ein Protein
differenziell, wenn Normalzellen des gleichen Gewebetyps dieses
nicht oder nur gering exprimieren. Tumorzellen überexprimieren ein Protein
spezifisch bzw, differenziell, wenn das Protein im Vergleich zu
Normalzellen des gleichen Gewebes zumindest in doppelter Menge exprimiert
wird.
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Zytotoxische Komponenten bzw. Gruppen sind
Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten bzw.
zu Nekrose führen
oder zumindest wachstumshemmend wirken. Solche Gruppen bzw. Verbindungen
können
neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu)
insbesondere Zytostatika sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt
werden. Beispiele hierfür
sind: Alkylantien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil,
Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe,
Carmustin, Lomustin, Semustin, Triazene, Dacarbazin), Antimetaboliten
(z.B. Folsäure-Antagonisten,
Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin,
Cytarabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin), Mitosehemmer
(z.B. Vincaalkaloide, Voncristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel,
Protaxel), Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid), Antibiotika
(z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin,
L-Asparaginase), Platinkomplexverbindungen (z.B. Cisplatin), Hormone
und verwandte Verbindungen (z.B. Nebennierenrindensteroide, Aminogluthetimid,
Gestagene, Östrogene,
Androgene, Antiöstrogene,
Tamoxifen, Steriodanaloga, Flutamid). Bei Bindung einer solchen
Verbindung mit einer an Targetmoleküle bindenden Substanz erfolgt
die Kopplung dergestalt, daß die
Affinität
zur Nukleinsäure
bzw, zum Protein um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%, bezogen
auf die Substanz ohne zytostatische Gruppe, reduziert ist und die
zytostatische Wirkung der Gruppe um nicht mehr als 90%, vorzugsweise 50%,
bezogen auf die Verbindung ohne Substanz, reduziert ist.
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Eine immunstimulierende Komponente
ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches
Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind:
Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Interferone, wie IFN-alpha,
-beta, -gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Chemokine
wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8.
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Eine Reportergruppe ist ein Atom,
Molekül oder
eine Verbindung, welche in Verbindung mit einem hierauf abgestellten
Assay den Nachweis der Reportergruppe und der somit mit der Reportergruppe
verbundenen Verbindung oder Substanz ermöglicht. Beispiele für Reportergruppen
und hiermit assoziierte Detektionsmethoden sind: 32P-Labeling und Intensitätsmessung
mittels Phosphoimager. Viele weitere Beispiele sind dem Durchschnittsfachmann bekannt
und bedürfen
nicht der detaillierten Aufzählung.
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Eine an Targetmoleküle bindende
Substanz kann eine Substanz sein, welche ein Target-Protein oder
an eine Target-RNA
bindet.
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Im Rahmen der vorstehenden Definition
gegenüber
dem engen Wortsinn erweiterte Begriffsbestimmungen umfassen auch
die bestimmten Begriffe im engen Wortsinn.
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Beispiele.
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Im Folgenden wird die Erfindung anhand
von lediglich bevorzugte Ausführungsformen
darstellenden Beispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen:
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1:
Chip-Analyse zur differenziellen Expression von CD24 im Prostatatumorgewebe,
an 54 Normal/Tumor Gewebeproben analysiert.
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2:
Immunhistochemie mit einem CD24 Antikörper (maus anti human CD24,
Klon 24CO2), CD24 ist im primären
Prostatakarzinom deutlich stärker
exprimiert als im benignen Gewebe.
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3:
Immunhistochemie mit einem CD24 Antikörper (maus anti human CD24,
Klon 24CO2), CD24 ist in Lymphknotenmetastasen deutlich stärker exprimiert
als im primären
Prostatakarzinom,
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4:
erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen,
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5:
erfindungsgemäße Aminosäuresequenzen,
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6:
Tabelle mit Informationen zu den erfindungsgemäßen Sequenzen.
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Beispiel 1: Mikrodissektion
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Prostatatumor- und -normalgewebe
aus jeweils einem Patienten wurde gefroren und in 10 μm Proben
geschnitten. Aus jedem Patienten wurden zumindest 30 Proben gewonnen.
Normal und maligne Bereiche wurden durch einen Pathologen mit Hilfe
eines Mikroskopes identifiziert und markiert. Die jeweiligen Bereiche
wurden unter dem Mikroskop resektiert unter Verwendung einer Nadel
und jeweils separat auf –80°C eingefroren
in 150 μl
GTC Puffer enthaltend 2% β-Mercaptoethanol.
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Beispiel 2: Chipanalyse
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Aus Proben aus Beispiel 1 wird RNA
isoliert, amplifiziert und markiert. Die so erhaltene RNA wird einem
Genchip aufgegeben, welcher eine Vielzahl von verschiedenen Oligonukleotiden
enthält,
wobei jeweils eines (oder auch mehrere, zu Kontrollzwecken) für ein definiertes
Gen repräsentativ
ist, i.e. eine charakteristische Teilsequenz hieraus aufweist. Man
erhält
sowohl qualitative, wie auch quantitative Information, ob eine betreffende
Normal- und/oder Tumorprobe ein betreffendes Gen exprimiert, und zwar
auch im Verhältnis
Tumor/Normal. In Fällen,
in welchen ein Gen in Tumorgewebe höher exprimiert ist, als im
korrelierten Normalgewebe liegt diffentielle Expression vor, i.e.
das Gen ist im Tumorgewebe hochreguliert. Wenn das Gen dagegen in
Tumorgewebe geringer exprimiert ist, liegt Herunterregulation vor.
Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemäßen Sequenzen differenziell
im Tumorgewebe hochreguliert sind. Die Ergebnisse sind im einzelnen
der Tabelle 1 entnehmbar.
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Beispiel 3: Untersuchung
der Expression bzw. Überexpression
mittels quantitativer PCR.
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Eine Poly-A+-RNA Präparation
erfolgt unter Verwendung eines modifizierten Protokolls gemäß dem Poly-A-Tract
1000 Kit (Amersham, Freiburg, Deutschland). Gewebeproben, beispielsweise
aber nicht notwendigerweise erhalten gemäß Beispiel 1, werden langsam
auf Eis aufgetaut, zerkleinert und mit 300 μl Verdünnungspuffer, enthaltend 1% β-Mercaptoethanol,
sowie biotinyliertem Oligo-dT Primer versetzt, und für 5 min.
auf 70°C
erhitzt. Die Proben werden dann für 5 min. bei 20°C gehalten
und anschließend
bei 20000 g für
10 min. zentrifugiert. Dem Überstand
werden 120 μl
gewaschener Streptavidin-gekoppelter paramagnetischer Partikel (SA-PMP)
zugebenen und es wurde bei 20°C
für 5 min.
inkubiert. Die mRNA wurde dann durch magnetische Trennung isoliert.
Nach drei Waschschritten mit 0,5x SSC Lösung wird die mRNA in Nuklease-freiem
Wasser verdünnt,
eingedampft unter Vakuum und umgehend in cDNA prozessiert.
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Anschließend erfolgt die cDNA Synthese. Die
erhaltene mRNA aus 2 wird in 10 μl
Nuklease-freiem Wasser gelöst.
1 μl T7-dT24-(GGCCAG) Primer
(100 pmol/μl)
wird zugegeben und es wurde auf 70°C für 5 min. erhitzt. Dann wurde
die Probe auf Eis gelegt und es werden 4 μl 5x first strand buffer (Invitrogen),
2 μl DTT
(0,1M), 1 μl
dNTP's (10 mM),
und 14U anti-RNAse (Ambion) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation
für 2 min.
bei 37°C.
Dann werden 1 μl Superscript
II Reverse Transskriptase (Invitrogen) zugegeben, gefolgt von einer
Inkubation für
1 h bei 37°C.
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Anschließend erfolgt die Zweitstrangsynthese
und DNA Reinigung. Sofort nach der Synthese des ersten Stranges,
wie vorstehend, werden 91 μl Wasser,
30 μl 5x
second strand buffer, 3 μl
dNTP's (10 mM),
10U E. coli DNA-ligase, 40U DNA Polymerase I und 2U RNAse H (alle
von Invitrogen) zugegeben und die Mischung wird für 2 h bei
16°C inkubiert. Dann
werden 10U T4 DNA Polymerase (Invitrogen) zugegeben und weitere
5 min. inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 μl 0,5 mM
EDTA abgebrochen. Die Reinigung der DNA erfolgt gemäß den Vorschriften
des GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kits (Amersham). Gereinigte
DNA wird unter Vakuum eingedampft und bei –20°C gelagert.
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Dann erfolgt die in vitro Transkription
und cRNA Reinigung. Die in vitro Transskription wird gemäß dem Herstellerprotokoll
von Ambion (Huntigdon, UK) durchgeführt. Das DNA Pellet wird in
8 μl Wasser gelöst und 7,5 μl dNTP's (75 mM), 2 μl 10x reaction buffer
(Ambion), 2 μl
10 T7 Enzymmix (Ambion) und 14U anti-RNAse (Ambion) werden zugegeben,
gefolgt von einer Inkubation von 6 h bei 37°C. Die Reinigung der erhaltenen
cRNA erfolgt gemäß dem Herstellerprotokoll
zum Rneasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland). Nach Elution
von der Säule
wird die verdünnte
cRNA eingedampft unter Vakuum und auf –80°C eingefroren.
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Anschließend wird die zweite in vitro
Transskriptionsrunde durchgeführt.
Die zweite Verstärkungsrunde
wird mit nur geringen Abweichungen von der ersten Runde durchgeführt. Die
Synthese des ersten Stranges erfolgt mit random hexamer primer (250
ng/μl).
Nach Inkubation über
60 min. wird das cRNA-cDNA Hybrid für 20 min. mit 2U RNase H inkubiert,
gefolgt von einem 2-minütigen
Inaktivierungsschritt bei 37°C.
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Schließlich erfolgt die quantitative
PCR und Auswertung. Die Synthese des ersten Stranges erfolgt mit
der cRNA aus der vorgehenden Stufe. 1 ng cDNA werden für die Amplifikation
eingesetzt mit 2,5 μl
10x SYBR®Green
PCR Puffer, 3 μl
Magnesiumchlorid (25 mM), 2 μl
dNTP's (mit dUTP;
12,5 mM) und 0,625U Ampli Taq Gold in einem Reaktionsvolumen von
25 μl. Die
Reaktion wird in einem GeneAmp 5700 Sequence Detection System (Applied
Biosystems, Weiterstadt, Deutschland) durchgeführt. Die Bedingungen sind:
2 min. 50°C,
10 min. 95°C,
15 s 95°C,
1 min. 60°C,
die letzten beiden Phasen in 40 Zyklen. Für die jeweiligen Gene werden die
geeigneten Vorwärts-
bzw. Rückwärtsprimer
verwendet. Die Auswertung erfolgt nach der ΔΔCt Methode nach Herstellervorschrift.
Der Ct Wert von beta actin wurde bei einer Grenze von 0,1 gemessen.
Zur Normalisierung wird der Ct Wert des beta actin vom Ct Wert des untersuchten
Gens abgezogen. Dieser normalisierte Ct Wert wird im Falle der Tumorgewebe
auf die Normalgewebe bezogen bzw. normalisiert, wodurch der ΔΔCt erhalten
wird. Wird dieser Wert als Potenz zur Basis 2 eingesetzt, so wird
eine relative Größe der Über- oder
Unterexpression in Tumorgewebe gegenüber dem Normalgewebe des gleichen
Patienten erhalten. Im Ergebnis kann so bestimmt werden, ob ein spezifisches
Tumorgewebe eines bestimmten Patienten sensitiv für eine erfindungsgemäße Behandlung
ist. Auch kann mit dieser Methode bestimmt werden, ob nicht klassifiziertes
Gewebe als Tumorzellen enthaltend einzustufen ist. In letzterem
Falle erfolgt ein Vergleich zu Referenzwerten bzw. klassifiziertem Normalgewebe
des gleichen Patienten oder von anderen Personen.
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Beispiel 4: differenzielle
Expression gemessen mittels der Genechip-Technologie, am Beispiel
CD24.
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Beispielhaft ist in 1 das Ergebnis von Experimenten gemäß Beispiel
2 anhand von CD24 dargestellt. Man erkennt, dass in einer signifikanten Anzahl
der Proben aus 54 Patienten CD24 hochreguliert ist. Analoge Ergebnisse
wurde für
die weiteren erfindungsgemäßen Sequenzen
erhalten, welche der Übersichtlichkeit
halber nicht dargestellt sind.
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Beispiel 5: Nachweis eines überexprimierten
Gens mittels Antikörpern.
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In diesem Beispiel wird die Markierung
von Tumorzellen durch einen gegen ein erfindungsgemäßes Protein
gerichteten Antikörper
in vivo (Mausmodell) beschrieben. Ein solcher erfindungsgemäßer Antikörper wird
mit einem Markermolekül
(z.B. Radioisotop) markiert. In NMRI-Nacktmäuse werden mit einem erfindungsgemäßen Gen
transfizierte humane Zellen transplantiert. Nach einem definierten
Zeitraum, beispielsweise 30 Tage, wird den Mäusen der markierte Antikörper injiziert.
Die Kontrolltiere werden mit einem nicht relevanten Antikörper behandelt. Wenige
Stunden nach der Antikörperapplikation
werden die Tiere getötet
und aus allen Organen Gewebeschnitte angefertigt. Diese Schnitte
werden auf die Gegenwart von markiertem Antikörper untersucht.
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Bei den Antikörpern kann es sich im einfachsten
Fall um polyklonale Antikörper
gegen humanes Protein, konjugiert mit einem Trägerprotein, in Kaninchen gezogen
und mit den spezifischen immobilisierten Peptiden affinitätsgereinigt,
handeln. Geeignete Immunisierungspeptide sind beispielsweise aus
Teilsequenzen eines erfindungsgemäßen Proteins gebildet. Als
Immunogene können
ebenso mit cDNA des Gens, oder Teilsequenzen hiervon transfizierte
Zellen, wie beispielsweise COS-Zellen oder NIH3T3-Zellen, eingesetzt
werden. Ebenso sind Tumorzellen, die endogen das Protein exprimieren,
geeignet. Weiterhin kann auch rekombinant hergestelltes Protein
bzw. Teilsequenzen hieraus, die in Producerzellen, wie E. coli oder
Eukaryontenzellen, wie Insektenzellen, exprimiert werden, zur Immunisierung eingesetzt
werden. Selbstverständlich
können
stattdessen auch entsprechende monoklonale Antikörper oder Fragmente hiervon
eingesetzt werden.
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Beispiel 6: Immunhistochemischer
Nachweis von Tumorzellen.
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Gewebe wird aus einem Patienten mit
Krebs oder dem Verdacht auf Krebs isoliert und als Paraffin- bzw.
Gefrierschnitte präpariert.
Diese Schnitte werden mit einem gegen ein erfindungsgemäßes Protein gerichteten
Antikörper
auf die Überexpression
des Proteins in Tumorzellen untersucht. Die immunhistologische Untersuchung
mit dem Antikörper
zeigt höhere
Expression des Proteins in den Tumorzellen im Vergleich zu umliegenden
Normalgewebe. Die Untersuchung erfolgt im Einzelnen durch Inkubation
mit dem Antikörper
als primärem
Antikörper,
einem biotinyliertem sekundären
anti-Kaninchen Antikörper
und einer Streptavidin-gekoppelten Meerrettichperoxidase. Die Färbung erfolgt
mit mit DRB als chromogenen Substrat (braune Färbung). Die Gegenfärbung erfolgt mit
Hemalaun-Lösung
(blaue Färbung).
Es sind maligne und nichtmaligne Zellen unterscheidbar, wobei die
malignen Zellen eine starke Färbung,
i.e. hohen Gehalt an erfindungsgemäßem Protein, aufweisen, während die
nichtmalignen Zellen nur moderat gefärbt sind.
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Die 2 und 3 zeigen beispielhafte Ergebnisse
anhand von CD24. In 2 wurde
mit einem CD24 Antikörper
(Maus, anti human CD24, Klon 24CO2) gearbeitet. In 2, links wurde benignes Gewebe eingesetzt.
Man erkennt, dass benigne Atrophie starke Färbung in der apikalen Membran
zeigt. In 2, rechts,
wurde dagegen mit primärem
Prostatakarzinom gearbeitet. In 15 von 63 analysierten Adenocarzinomen
wurde eine sehr starke Membran- und Zytoplasma-Färbung festgestellt. In 3 ist ein Vergleich primärer Tumor
(links) mit Lymphknotenmetastasen (rechts) unter Verwendung der
gleichen Antikörper
dargestellt. Man erkennt vergleichsweise höhere Expression in den Lymphknotenmetastasen.
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Beispiel 7: Erzeugung
von anti-idiotypischen monoklonalen Antikörpern zu therapeutischen Zwecken
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Ausgehend von einem erfindungsgemäßen Protein
wird in fachüblicher
Weise ein monoklonaler Antikörper
Ab1 erzeugt, welcher in der Lage ist, das Protein spezifisch zu
erkennen und daran zu binden. Dabei ist es unwesentlich, ob eine
funktionale Domäne
oder ein anderer zugänglicher
Bereich erkannt wird. Mit Hilfe des erzeugten Antikörpers Ab1
wird in ebenso fachüblicher
Weise ein zweiter anti-idiotypischer nicht humanisierter, beispielsweise
Maus, monoklonaler Antikörper
aAB1 erzeugt, welcher zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung
zur Behandlung von Prostatatumoren geeignet ist. Die Funktion des
Antikörpers
aAB1 beruht dabei darauf, dass dieser dem humanen Immunsystem ein Image
des (humanen) Protein-Antigens gleichsam vortäuscht, wobei das Immunsystem
den Antikörper aAB1
aufgrund seiner mangelnden Humanisierung als körperfremd erkennt. Der humane
Körper
bildet folglich eigene Antikörper,
die gegen aAB1 und somit auch gegen das humane Protein bzw. dieses
exprimierende Tumorzellen gerichtet sind.