WO2004074516A2

WO2004074516A2 - モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法

Info

Publication number: WO2004074516A2
Application number: PCT/JP2004/001822
Authority: WO
Inventors: Toshio Murakami; Hirofumi Higuchi; Keiichi Makizumi; Toshihiro Maeda; Hiroshi Mizokami
Original assignee: Chemo Sero Therapeut Res Inst; Toshio Murakami; Hirofumi Higuchi; Keiichi Makizumi; Toshihiro Maeda; Hiroshi Mizokami
Priority date: 2003-02-20
Filing date: 2004-02-18
Publication date: 2004-09-02
Also published as: US20060280751A1; EP1595959A1; ES2528738T3; JP4922613B2; US8332159B2; EP1595959B1; PT1595959E; JPWO2004074516A1; EP1595959A4

Description

明細書

モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法

技術分野

本願発明は、医薬品に係る分野に属する。詳細には、モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させるための、当該抗体が認識する抗原を有する患者を選別するために実施される方法に関する。

背景技術

近年、モノクローナル抗体の臨床応用として、モノクローナル抗体製剤投与による治療が展開されている。モノクローナル抗体製剤は、生体内の抗原と反応し有効性を示すため、当該抗原の発現量を予め検査し投与対象を選別すれば、モノクローナル抗体の奏効性を向上させ得る。また、モノクローナル抗体は極めて特異性が高いため、安全性と有効性に優れる一方で、抗原ェピトープ部分のァミノ酸配列に多様性が存在する場合には抗体との反応性が低下し、有効性に影響を及ぼす可能性が危惧される。このため、モノクローナル抗体製剤を医薬品として用いる場合、患者体内での抗原の発現量のみならず、抗原の多様性を確認し投与対象者を選択することは、当該抗体製剤の奏効性を向上させるために有用な手段と考えられる。

モノクローナル抗体製剤の投与対象者を検査し選択する例として、現在市販されている、抗 H E.R 2モノクローナル抗体 (Trastumab) に係る適用例が挙げられる。 Trastumabは、乳がん患者の約 2 0〜 3 0 %で過剰発現している H E R 2 タンパク質に対する抗体である。抗 H E R 2モノクローナル抗体投与対象者選択のための臨床検査として、 HER2/neu遺伝子の D N A増幅を目的としたサザンプロット法もしくは Furuorescent in situ hybridization ( F I S H) 法、 H E R 2 mR NAの過剰発現を検索するためのノーザンブロット法、もしくは reverse transcription polymerase chain reaction (R T— P C R) 法、または H E R

2タンパク質の過剰発現を検索するためのウェスタンブロット法、 E L I S A法、もしくは免疫組織化学法などが試みられている。これらの検査により、

Trastumabの H E R 2過剰発現症例の奏効率が向上しており、このことは、モノク口ーナ /レ抗体製剤による治療において、対象者を予め選択することが奏効性を向上させるために有用であることを示している（例えば、曰本臨床（Nippon Rinsho) 6 0卷 3号（2 0 0 2 ) ) 。

発明の開示

(発明が解決しようとする技術的課題）

一方、ェピトープ部分のアミノ酸配列に多様性が存在して、このため抗原抗体反応の親和性に変化が生じる場合には、抗原の多様性に伴う抗体製剤の奏効性の低下が予測され、これを予知することは臨床的観点から意義は大きい。そのためには、 Trastumabで実施されるような抗原タンパク質の発現量を調べるだけの検查では不十分であり、新たな検査法が必要である。その理由は、タンパク質として高発現している抗原であって量的には検出され得る場合であっても、当該モノクローナル抗体のェピトープを有する野生型の中にェピトープのアミノ酸配列が変異し反応性が低下した変異体が多数存在する場合には、不適合と判定される必要があるからである。従って、抗原のェピトープ部分に多様性が存在する場合には、了ミノ酸配列の異なる個々のェピトープに対する抗体の反応性の程度を抗原抗体反応により直接確認することが要求される。しかしながら、生体内の微量な抗原の中からェピトープ部分のァミノ酸配列が異なる分子を分別し、当該抗体で捕捉し検出する方法は、高い感度を必要としまた抗原の発現量と抗体の反応性とを区別して検出するのが困難などの問題点がある。

以上の観点から、モノクローナル抗体の認識するェピトープ部分のァミノ酸配列に多様性が認められるタンパク質を抗原とするモノクローナル抗体製剤では、製剤の投与対象者選別のため、高感度かつ迅速に検査する方法の開発が必要とされる。

(その解決方法）

本発明は、モノクローナル抗体製剤を患者に投与するに際し、患者の生体内に存在する標的分子の抗原タンパク質のァミノ酸配列を、当該モノクローナル抗体製剤投与前に予め解析することにより投与対象患者を選別することよりなる、当該モノクローナル抗体製剤の奏功性を向上させる方法に関する。

本発明はまた、上記方法において、 ①患者生体試料中の標的分子の遺伝子を分離 ·解析して得られた核酸配列を基に発現しているタンパク質のアミノ酸配列を予測し、 ②その配列を予め決定された当該モノクローナル抗体の認識し得るアミノ酸配列（以下、参照配列）と比較することによって患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定し、っヽで③当該判定結果に基づヽて奏効性が期待される投与対象患者を選別する工程を含んでなる、モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法に関する。

モノクローナル抗体製剤が認識する抗原ェピトープのァミノ酸配列の多様性により、抗体の抗原に対する結合の親和性は変化する。ェピト^"プ領域に遺伝子多型を示す抗原の場合、免疫化学的検出法などによって直接的にモノクローナル抗体の結合性を測定する方法に代わり、患者の体内で発現している抗原の多様性を塩基配列から解析し、その抗原と当該抗体の結合性を予測することが可能であると本願発明者らは考えた。そして、ェピトープのアミノ酸配列と抗原抗体の反応性に相関が認められるモノクローナル抗体について、予めその相関性に関するデータを取得しておき、そのデータと患者由来の抗原ェピトープ領域の塩基配列とを比較することによって投与対象者を効率的に選択し得る本願発明の方法を発明し /こ

これらの方法は、 P C R法および塩基配列解析技術の進歩により、高感度かつ汎用的に実施可能であり、変異体が混在する D NAをクローユングせずに直接解祈を行うことも可能である。従って、発現タンパク質抗原とモノクローナノレ抗体との結合親和性を実際に測定することなく、ェピトープ領域をコードする塩基配列を調べるのみで、モノクローナル抗体製剤の奏効性を予測することが可能となつた。

(従来技術より有効な効果）

本願発明により、モノクロ一ナル抗体製剤の投与に際し、標的の発現タンパク質抗原と当該モノクローナル抗体との結合親和性を実際に抗原を単,製して測定することなく、予め抗原のェピトープ領域をコードする塩基配列を調べ、予め決定された当該モノクローナル抗体の認識するアミノ酸配列（参照配列）と比較することによって、患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定して投与対象患者を選別することにより、総合的に当該モノクローナル抗体製剤の奏効性を向上せしめる方法を提供することができる。図面の簡単な説明

図 1は、モノクローナル抗体の認識する部位を調べるため、 KD— 247により中和されることが確認されている実験室株 H I V— 1 (MN株）の PND領域の合成ぺプチド I H I G P G R A F Yを基に、 1残基ずつ削除した合成べプチドに対する KD— 247の結合性を示すグラフである。

図 2は、モノクローナル抗体の認識するァミノ酸配列の幅広さを調べるため、 KD- 247により中和されることが確認されている実験室株 H I V- 1 (MN 株）の PND領域の合成ペプチド I H I GPGRAFYを基に、当該合成ぺプチドの N末端側の Iから C末端側の Yまでを順に天然に存在する他の 19種類のァミノ酸残基に 1残基ずつ置換した場合 (図 2 a〜図 2 jにそれぞれ示す) の合成ペプチドに対する KD— 247の結合性を示すグラフである。図 2 a〜図 2 jにおいて斜線の棒グラフはァミノ酸残基を変化させない場合の値を示す。

図 3は、モノクローナル抗体が認識するァミノ酸配列を発現タンパク質で調ぺるため、患者由来の H I V— 1遺伝子より V 3領域を増幅し発現させたタンパク質の V 3領域中央部分のァミノ酸配列に対する KD— 247の結合性を、 MN株由来の遺伝子を基に発現させたタンパク質との結合性を 100%とした相対結合活性で示すダラフである。各配列での平均値を横棒で示した。図 3中、 1〜 33 は、 V 3領域中央部分に以下の配列を含む現タンパク質である。 1 ： IAPG RAF； 2 ： I APGRAL； 3 ： I APG SAF； 4 ： I GLGRAF； 5 ： I GPARAF ; 6 : 1 GPGGAF ; 7 : 1 GPGKAF ； 8 ： I GPGRA

F； 9 ： I GPGRAI ； 10 ： I GPGRAL ； 11 ： I G PGR AS ； 1 2 ： I GPGRAV ; 13 : 1 GPGRAW ; 14 : 1 GPGRAY ; 15 : 1 GPGRPF ; 16 ： I GPGRRF ; 17 ： I GPGRSF ; 18 ： I GPG R S V； 19 ： I GPGRTF ； 20 ： I GPGRTL； 21 ： I GPGRT V； 22 ： I GPGRVF ; 23 : 1 GPGRVY ; 24 : I GPGSAF ; 2

5 ： I GSGRAF ; 26 : LGPGGAF ; 27 : LGPGRAF ； 28 ： M GPGGAF ; 29 : MGPGKAF ; 30 : MGPGRAF ; 31 : MGPG RVY ; 32 : VGPGRAL ; 33 : VGPGRAV。発明を実施するための最良の形態

本発明の方法において、モノクローナル抗体製剤投与の適合性を判定し、奏功性が期待される投与対象患者を逢別するに際して、患者由来の標的分子のァミノ酸配列を、予め決定しておいた「参照配列」と比較することが必須である。本明細書において「参照配列」とは、投与しょうとするモノクローナル抗体製剤の主成分であるモノクローナル抗体が認識し結合することのできる抗原のェピトープ領域のアミノ酸配列をいう。力かるェピトープ領域のアミノ酸配列を「参照配列」として決定した後、当該モノクローナル抗体の有効性 (中和活性など) と「参照配列」との相関を調べることができる。また、ェピトープ領域のアミノ酸配列に多様性が認められる場合（たとえば、ヒト免疫不全ウィルス 1型 (H I V — 1 ) ) には、当該ェピトープ領域の多様なァミノ酸配列に共通する普遍性ある配列を「参照配列」として決定する。

このようにモノクローナル抗体製剤の主成分であるモノクローナル抗体が認識 '結合するェピトープ領域のアミノ酸配列を予め決定しておき、当該モノク口 —ナル抗体が有効性を発揮できるアミノ酸配列を「参照配列」として決定しておくことにより、かかる「参照配列」との比較による当該モノクローナル抗体製剤投与適合性の判断が可能となる。

本明を実施するため、 ①モノクローナル抗体が認識するェピトープ部分のァミノ酸配列 (参照配列) の解析、 ②患者の生体試料中に存在する標的分子のェピト一プ部分を含む領域の塩基配列の分析、 ③抗原タンパク質のァミノ酸配列の多様性とモノクローナル抗体の薬効との相関データの取得などを予め実施する必要がある。

すなわち具体的には以下の工程を経る。当該モノクローナル抗体が認識する典型的な抗原について、タンパク質を構成するぺプチド断片に対する当該モノク口ーナノレ抗体の結合性を調べ、ェピトープ部分を同定する。当該ペプチド断片の作製は、抗原タンパク質のタンパク質分解酵素による消化物、既知のァミノ酸配列情報に基づくペプチド断片の化学合成等により可能となる。また、当該ペプチド断片とモノクローナル抗体との反応性を解析する方法として、 ELISA法やドットプロット法等による免疫化学的な方法、及び表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いた方法等が挙げられる。なお、生体内に存在する抗原としては、外来性のウィルス、細菌、毒素、内在性のがん特異的抗原や疾患関連分子等が考慮され得る。

患者生体内に存在する抗原タンパク質中の当該ェピトープ領域の塩基配列を求めるため、ェピトープ領域周辺に位置し且つアミノ酸配列に変異がほとんど認められない領域を選択し、当該領域の塩基配列を基に核酸増幅反応のためのプライマーを設計する。当該抗原のェピトープ領域の塩基配列を解析するため、血液、組織等を生体試料として、腿より逆転写酵素を用いて得られる cDNAもしくは DNA を铸型とし、当該プライマーを用いた PCR法によりェピトープ領域を増幅する。増幅された DNAは、直接又はクローユング操作を経た後に、 DNA解析装置等を用い塩基配列を解析する。

ェピトープ領域に種々のァミノ酸配列を有する抗原に対する当該モノクローナル抗体の反応性は、上述の方法により得られたェピトープ領域を含む DNAをク口一二ングし、大腸菌などを用いて発現させたタンパク質に対する当該モノクロ一ナル抗体の結合性を測定することにより可能である。さらに、当該ェピトープ領域のアミノ酸配列と当該モノクローナル抗体の有効性の相関は、抗原結合活性のみならず、抗ウィルス活性、抗腫瘍効果などを指標として、 in vitro, ex vivo 又は in vivo試験により確認される。例えば、患者由来のウィルスをクローン化し、当該ェピトープ領域の塩基配列よりアミノ酸配列を求めるとともに、ウィルス中和活性を測定し、ェピトープ領域のァミノ酸配列と有効性の相関を示すデータが取得可能である。

抗原に多様性が存在する代表的な例として、ヒト免疫不全ウィルス 1型（H I V - 1 ) が例示される。 H I V— 1の主要中和決定基 ( P N D) は、外被糖蛋白質 g p 1 2 0の第 3可変領域（V 3領域）の中央部分に位置している。本願発明者らは、 P N Dに対するヒト化モノクローナル抗体を作製し、臨床応用を目的にこれを製剤化した。当該モノクローナル抗体は、当該抗体のェピトープ部分が位置する P N D領域のァミノ酸配列の変異により、 H I V— 1に対する中和活性、すなわち抗原との結合性に影響を受けた。従って、当該抗体の臨床応用では、ェピトープ部分のァミノ酸配列を解析し、投与対象者を選択することが奏効性の向上につながると予測された。

そこで、まず当該抗体と結合可能な抗原の存在を確認するために、以下のような手順により、ェピトープ部分のァミノ酸配列と当該抗体との結合†生の相関性を調べ、当該モノクローナル抗体が認識し有効性が期待されるアミノ酸配列を参照配列として決定した。

① P ND領域の配列から成る合成ぺプチド断片を用い当該モノクローナル抗体が認識するェピトープ配列を確認した。

②患者由来のウィルスより、 V 3領域の遺伝子を増幅後クローユングし、 β—ガラクトシダ一ゼとの融合タンパク質として発現させた。この V 3領域の発現タンパク質に対する当該モノクローナル抗体の結合性を調べ、ェピトープ部分のァミノ酸配列と抗体の結合性との相関を調べた。

③上述の結果から、当該抗体の参照配列の候補を選択した。

④当該モノクローナノレ抗体の H I V- 1に対する中和活性を調べ、上述の参照配列と中和活性に相関性のあることを確認した。

⑤患者血漿または末梢血単核細胞より H I V— 1 V 3領域の遺伝子を増幅し、塩基配列を解析した。その結果から推定されたァミノ酸配列を上述の参照配列と比較し、対象患者に対する当該抗体の適合性を予測した。

かかる知見に基づき、患者の体内で発現している抗原の多様性を塩基配列から解析し、その抗原と当該抗体の結合性を予測することが可能であることが明らかになった。臨床での使用に当たり、例えば標的分子が H I V- 1の場合、以下のような手順により、患者血漿を検体として当該モノクローナル抗体製剤の投与対象者を選択する方法が提供される。

血漿中の H I V— 1 R NAを、逆転写酵素を用いて D N Aに変換し、 V 3領域の核酸増幅反応を行なう。増幅した DNA断片を、直接またはクローニングを実施した後に塩基配列を解析する。この塩基配列から予想されるアミノ酸配列を求め、予め選定されたモノクローナル抗体製剤中の当該モノクローナル抗体が認織し得るアミノ酸配列の参照配列と比較する。参照配列の決定は、前述のような. ぺプチドまたは発現タンパク質への結合性や H I V- 1中和活性の測定結果より決定される。また、臨床試験により患者由来の H I V—1における P ND領域のァミノ酸配列と当該モノクローナル抗体製剤の有効性の関係を角?^することにより、より詳細な参照配列のデータが得られる。

以下に、実施例に従って本願発明を詳説するが、本願発明はこれら実施例に何等限定されるものではない。

実施例 1

合成ぺプチドを用いた抗 H I Vモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列の解近

PND領域に対するヒト化モノクローナル抗体である KD— 247が認識するアミノ酸配列を、 HIV— 1 g p 120の V 3領域の中央部分に由来する合成ぺプチドを用いて調べた。ぺプチドを、 Pepscan法 (Geysen, H.M.ら、 Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002, (1984) ) により合成し、それらのぺプチドに対する KD— 247の結合活性を酵素抗体測定法により確かめた。 KD- 247が認識する最短のアミノ酸配列を調べるため、 KD— 247により中和可能な実験室株 H I V- 1 (MN株）の V 3領域中央部分のァミノ酸配列である、 I H I GP GRAF Yを有する 10アミノ酸残基のペプチド、及ぴそのアミノ酸残基を、 4アミノ酸残基まで 1残基ずつ削除した以下のペプチドを合成した： I H I GPG AF, H I GPGRAF I H I GPGRA H I GPGRAF. I GPGRAF Y I H I GPGR, HI GPGRA、 I GPGRAF, GPG RAFY、 IH I GPG、 HI GPGR、 I GPGRA、 GPGRAF, PGR AFY、 I HI GP、 H I GPG, I GPGR、 GPGRA、 PGRAF、 GR

AFY、 I H I G、 H I GP、 I GPG、 GPGR、 PGRA、 GRAF, RA F Y。

合成ぺプチドが結合しているポリエチレン製の口ッドを、 2 %ゥシ血清アルプミン及び 0. 1 % Tween 20を含むリン酸緩衝生理食塩水中でプレコーティングを実施した後、 2 μ _g m 1の KD— 247と反応させた。ぺプチドに結合した K D— 247を、ペルォキシダーゼ標識抗ヒト κ抗体及び基質を用いて測定した。図 1に示す通り、 KD— 247が反応する最短のアミノ酸配列は、 I GPGRでめった。

KD-247が認識するぺプチドを構成するアミノ酸残基を置換した場合の反応性の変化を調べるため、 H I V— 1 (MN株）株由来の I HI GPGRAFY 配列の各アミノ酸残基を、天然に存在する他の 19種類のアミノ酸残基に置換したぺプチドを合成し、上述の方法を用いて KD— 247との反応性を測定した。図 2のように、中央部分の PGR配列に関し置換可能な他のァミノ酸残基は少なく、特にアルギニン（R) 残基は必須のアミノ酸であることが確認された。その他のァミノ酸残基では、多くの他のァミノ酸残基との置換が可能であつた。

以上の結果より、 KD— 247は I GPG R配列を基本的に認、識し、この配列内及び又はその前後のアミノ酸配列に置換が生じた場合にも認識することが可能であることが判明した。 ' 実施例 2

発現タンパク質を用いた抗 H I Vモノクローナル抗体が認識するアミノ酸配列の解析

実施例 1で明らかになった K D— 247の認識部位は、短!/、ぺプチドと抗体との反応を観測したものであった。抗体の抗原タンパク質との結合性は、結合部分のアミノ酸配列に加えて、立体構造に伴う影響も考盧する必要がある。そのため、 V 3領域を含む領域を発現させたタンパク質に対する KD-247の結合性を調ベた。

先ず、 HI V—1の V 3領域を含む遺伝子を、 HI V—1感染者由来の血漿より得られた H I V- 1 RN A遺伝子を基に逆転写酵素を用いて得た c DNA、または末梢血単核細胞の H I V— 1プロウィルス DNAを铸型として、 nested PCR法により増幅した。第 1 PCRに用いたプライマーは、

5'- ACACATGGMTTAGGCCAGT - 3，（OA- 4) (配列番号 1 ) 及び

5， - AMTTCCCCTCCACMTTM- 3，（0D- 4) (配列番号 2) であり、第 2 PCRに用レヽたプライマーは、

5'-GCCGGATCCTCAACTCAACTGCTGTTAMT-3' (EB-2) (配列番号 3) 及び

5-GCTCTGCAGTCAAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG-3' (EC - 2) (配列番号 4) であった。この増幅 DN A断片を精製後、制限酵素 BaraH I及ひ Tst Iで切断し、ベータガラクトシダーゼ（]3— Ga 1) 遺伝子を有するベクタープラスミド（pUEX I) に揷入した。このベクターをコンビテント細胞に導入し、クローユングを行なった。クローン化 D N Aを鎵型に EB- 2及ぴ EC- 2プライマ一を用いて P C Rを実施し、増幅 DNA断片を錄型として、塩基配列解析装置を用いて V 3領域の核酸配列を解析し、その核酸配列に基づいて V 3領域のァミノ酸配列を決定した。

—方、遺伝子配列を解析した各クローン化大腸菌を培養し、次のようにして、 V3領域とベータガラクトシダーゼの融合タンパク質（V3/j3— Ga 1 ) を得た。先ず、培養した大腸菌を細胞破砕装置で破砕後、遠心分離し、その沈殿を 0. 5 % Triton X- 100含有トリス緩衝液 (pH7.5) で溶解後さらに遠心分離し、封入体を含む沈殿を、 8 M尿素を含むトリス緩衝液 (pH7.5) で溶解し V 3 / J3-Ga 1を精製した。得られた V3/j3—Ga 1 は、 SDS— PAGEにより現に異常がないことを確認し、次に V3/]3— Ga 1濃度を合わせるため、 E L I S Aを行なった。抗 j3— Ga 1抗体を固相化したプレートを用い、発現させた V3/]3— Ga 1または標準品としての j3—Ga 1市販品を添加した。検出抗体としてペルォキシダーゼ標識抗一 G a 1抗体を用いた。標準品の結果を基に検量線を作成し、発現¥3/]3_0& 1濃度を ]3— G a 1濃度換算で求めた。次に、 V3/j3— Ga 1と KD_ 247の反応性を評価するため、別の EL I

S Aを実施した。抗ー Ga 1抗体をプレートに固相化し、 200n g/mlの V3/]3— Ga 1と反応させた。捕捉された V 3 / ]3— G a 1に対し、 1 μ g/m 1の KD— 247を反応させ、ペルォキシダーゼ標識抗ヒト I gG抗体を用いて検出した。各々の V3/j3— Ga 1に対する KD— 247の結合性は、プレートごとに設定された陽性対照である H I V— 1MN株由来の V3/j3— G a 1の吸光度を 100 %とした相対値で示した。

約 120種類の患者由来 H I V— 1クローンを用いて解析された V 3/ ]3—G a 1の V 3中央部分のァミノ酸配列と KD— 247との相対結合活性を図 3に示した。結合性の相対値の平均が 100 %を超えたクローンの V 3領域中央部分のアミノ酸配列は、 I GPARAF (配列番号 5) 、 I GPGRSF (配列番号 6) 、 I GPGRAL (配列番号 7) 、 I GPGRTF (配列番号 8) 、 I GP GRA I (配列番号 9) 、 VGPGRAL (配列番号 10) 、 I GPGRAF

(配列番号 1 1) であった。これらの配列は、 KD— 247適合性を判定する参照配列の一例として挙げられる。実施例 3

H I V— 1の V 3領域のァミノ酸配列とウイノレス中和活性の解析

V 3領域のァミノ酸配列と中和活性の関連を、実験室株及び臨床分離株 H I V - 1を用いて調べた。

H I V- 1の V 3領域の核酸配列を、実施例 2と同様の方法により求めた。さらに、これらのウィルスと、濃度を変化させた KD— 2 4 7とを 3 7 °Cで 1時間反応後、フィトへマダルチュンで活性化した健常人の末梢血単核細胞に接種した。

7日間培養後細胞を洗浄し、 I L一 2存在下でさらに 7日間培養を継続した。培養上清中の H I V- 1 p 2 4抗原量を E L I S A法により測定し、抗体非存在下で培養した値を 1 0 0 %とし、添加した抗体濃度により p 2 4抗原量を 5 0 % ( I C₅₀) または 9 0 % ( I C₉₀) 低下させる KD— 2 4 7濃度を中和活性として表わした。

表 1に示す通り、 KD— 2 4 7の中和活生は、 V 3領域中央部分のァミノ酸配列に依存した。すなわち、実施例 1及び実施例 2で KD—2 4 7との結合性が確認された I G P G R A F配列を V 3領域中央部分に有する H I V— 1は、すべて KD— 2 4 7によって中和された。これは、 V 3領域中央部分のアミノ酸配列力そのウィルスに対する KD— 2 4 7の結合活性及ぴ中和活性と相関する事を示している。

MN株と同一のアミノ酸残基を示す, 実施例 4

臨床検体の V 3領域ァミノ酸配列の解析と KD-247の患者適合性検査

実施例 2の方法を用い、患者の血漿または末梢血単核細胞より、 HIV— 1遺伝子を解析した。これを基に、 HI V—1の V3領域のアミノ酸配列を推定し、実施例 2で得られた KD— 247と強く反応するアミノ酸配列を参照配列として比較し、各患者における KD— 247の適合性を検査した。

患者血漿または末梢血単核細胞中の H I V— 1遺伝子より推定されるアミノ酸配列およぴ各患者における KD— 247の患者適合性を表 2に示した。点線で囲んだアミノ酸配列を、実施例 2で求められた参照配列（配列番号 5 1 ) と比較し、一致した場合を適合、不一致の場合を不適合として判定した。

表 2

久失したァミノ酸残基を示す。

Claims

請求の範囲

1 . モノクローナル抗体製剤を患者に投与するに際し、患者の生体内に存在する標的分子の抗原タンパク質のァミノ酸配列を、当該モノク口ーナル抗体製剤投与前に予め解析することにより投与対象患者を選別することよりなる、当該モノク口ーナル抗体製剤の奏功性を向上させる方法。

2. モノクローナル抗体製剤を患者に投与するに際し、 ①患者生体試料中の標的分子の遺伝子を分離 ·解析して得られた核酸配列を基に発現しているタンパク質のァミノ酸配列を予測し、 ②その配列を予め決定された当該モノク口ーナル抗体の認識し得るアミノ酸配列（以下、参照配列）と比較することによって患者の当該抗体製剤投与における適合性を判定し、ついで③当該判定結果に基づいて奏効性が期待される投与対象患者を選別する工程を含んでなる、請求項 1記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。

3 . 予測された標的タンパク質のァミノ酸配列と参照配列の比較に際し、モノクローナル抗体の当該予測された配列を有するぺプチドもしくは発現タンパク質との結合性、及び/または当該モノクローナル抗体の生物学的活性を指標とするものである、請求項 1または請求項 2記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。

4. 前記投与対象患者生体試料中の標的分子に関し、モノクローナル抗体が認識する抗原ェピトープ部分のァミノ酸配列に多様性が存在する場合であって、モノクローナル抗体との反応性において参照列として共通する普遍性ある配列を指標とし得る、請求項 1ないし請求項 3のいずれかに記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。

5 . モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウィルス 1型 (H I V- 1 ) を抗原として認識する抗体である、請求項 1ないし請求項 4のいずれかに記載のモノク口ーナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。

6. モノクローナル抗体が、ヒト免疫不全ウィルス 1型（H I V— 1 ) の«糖タンパク質 g p 1 2 0の V 3領域に対する抗体である、請求項 5に記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。

7. H I V— 1の参照配列が、 I G P ARA F (配列番号 5 ) 、 I G P G R S F (配列番号 6) 、 I GPGRAL (配列番号 7) 、 I GPGRTF (配列番号 8) 、 I GPGRA I (配列番号 9〉、 VGPGRAL (配列番号 10) 及び I GPGRAF (配列番号 11) より選択され得るものである、請求項 5または請求項 6記載のモノクローナル抗体製剤の奏効性を向上させる方法。