WO2004047522A1

WO2004047522A1 - アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換法

Info

Publication number: WO2004047522A1
Application number: PCT/JP2003/014148
Authority: WO
Inventors: Mineo Kojima; Masayuki Nozue; Hidenari Shioiri; Masahiro Nogawa; Kenji Kiguchi; Tsutomu Shimizu
Original assignee: Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.
Priority date: 2002-11-25
Filing date: 2003-11-06
Publication date: 2004-06-10
Also published as: EP1566097A4; JP4170078B2; US20060048242A1; EP1566097A1; AU2003277579A1; JP2004173525A

Abstract

　ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することを特徴とする、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換法を提供する。

Description

明細書ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスによるケナフ植物の

インプラン夕形質転換法技術分野

本発明は、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ（In plant a)形質転換法に関する。背景技術

近年、以下の点からケナフ植物は、多くの注目を集めている（Se l l ers Tおよび Re i chert N, 「ケナフ：特性、プロセシングおよび産物（Kenaf ： propert ies, process ing and products)」，（米国)，ミシシッピ一大学プレス（Miss iss ippi Univ. Press) , 1999年）。まず第一に、ケナフ植物は非常に早いスピードで成長するという点である。第二に、ケナフ植物から高品質の繊維質が生産されるという点である。このような理由から、ケナフ植物を生育することで、空気中の多量の C0₂を吸収することができ、あるいはパルプ生産において森林にとって代わることができる。このようにケナフ植物は、地球温暖化の抑止に貢献できる植物の一つである。

一方、一般的な植物の形質転換法としては、外来遺伝子をカルスまたは組織培養細胞に導入し、次いで植物体へと再生する方法が知られている（Hooykaas PJJ および Schi lperoort RA, ァグロパクテリゥムおよび植物遺伝子工学

(Agrobacter ium and plant gene t ic engineer ing) , 「プラン卜モレキュラーノ^ ィォロジー（Plant Molecul ar Biology)」， (米国）, 1992年, 第 19巻， . 15-38, 並びに Zupan JRおよび Zambryski P, ァグロパクテリゥムから植物細胞への T- MA の転移（Transfer of T-DNA f rom Agrobac terium to the pl ant cel l) , 「プラントフィジオロジー（Plant Phys iology)」， (米国）, 1995年, 第 107巻， p. 1041-

1047) しかしながら、このような形質転換法には以下の問題点がある。まず第一に、滅菌条件下での作業が必要であり、困難な点である。第二に、長期にわたり時間がかかる点である。第三に、組織培養中に、体細胞突然変異またはソマクローナル変異が頻繁に生じる点である。さらに、ある植物では再生させることが困難である点である。このような問題点を解決するために、インプランタ形質転換法が開発された（Bircli R.G., 植物形質転換 -実際の適用における問題とストラテジ一 (Plant transformation - problems and strategies for practical application), 「ァニユアルレビューォブプラントフイジォロジ一アンドプラン卜モレキュラーノ、、ィォロジ一（An醒 1 Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology)」，（米国）， 1997年，第 48巻， p.297- 326)。「インプランタ形質転換法」とは、上記のような組織培養を経ることなく、生育する植物の細胞を形質転換させる方法である。

以前、本発明者らは、簡便でかつ効率的なァグロパクテリゥム 'ッメファシェンスを用いたソバ植物（Fagopyr i esculentum)のィンプラン夕形質転換法を開発した（Kojima Mら，ァグロパクテリゥム · ッメファシエンスを用いたソバ植物 (Fagopyrum esculentum)の簡便でかつ効率的な形質転換法の開発（Development of a simple and efficient method for transformation of buckwheat plants (Fagopyrum esculentum) using Agrobacterium t匿 faciens), 「ノ、、ィォサイエンス、バイォテクノ口ジーおよびバイオケミストリー（Bioscience, biotechnology, and biochemistry) J , 2000年, 第 64巻， .845-847) ₀ この方法においては、ソバ植物の幼植物の頂点分裂組織に針で孔を穿設し、次いでァグロバクテリウム ·ッメファシエンスを接種する。ここで「頂点分裂組織」とは、植物において成長軸の先端に存在し、細胞が増殖している組織を意味する。

一方、ケナフ植物の形質転換法として、葉の組織片に外来遺伝子を有するァグロバクテリウム ·ッメファシエンスを接種するか、または葉の組織片に外来遺伝子を表面に担持するタングステンもしくは金の微粒子を撃ち込む方法が開示されている（米国特許第 5, 998， 207号）。該方法は、上記で説明した一般的な植物の形質転換法であり、作業性が悪いという問題がある。またケナフ植物に対して、上述したァグロパクテリゥム ' ッメファシエンスを用いたソバ植物（Fagopyrum esculentum)のインプランタ形質転換法（Kojima Mら，ァグロバクテリウム ·ッメファシエンスを用いたソバ植物（Fagopyrum esculentum)の簡便でかつ効率的な形質転換法の開発 (Deve lopment of a s im l e and ef f ic ien t me thod for trans format ion of buckwheat pl ants (Fagopyrum escul ent醒） us ing Agrobacterium tumefaciens) , 「バイオサイエンス、バイオテクノロジ一およびノヾィオケミス卜リー（Bioscience, b io technology, and biochemi s t ry)」， 2000 年，第 64巻， p. 845- 847)を適用しても、効率良く形質転換することはできなかつた。従って、ケナフ植物のインプランタ形質転換法はこれまで確立されていなかつた。発明の開示

そこで本発明は、より簡便でかつ効率的に行うことのできるケナフ植物のインプランタ形質転換法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ケナフ植物の腋芽の傷にァグロバクテリウム ·ッメファシエンスを接種することで、ケナフ植物が効率良く形質転換されることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ケナフ植物の腋芽の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを接種することを特徴とする、ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。

さらに本発明は、ケナフ植物の茎の上部を切除し、腋芽を突出させる工程を含む、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。

さらに本発明は、前記腋芽に傷をつける工程を含む、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。

さらに本発明は、前記傷が穿孔である、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。

さらに本発明は、接種するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスがァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株である、上記ケナフ植物のィンプラン夕形質転換法である。

さらに本発明は、前記接種がァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を塗布することである、上記ケナフ植物のインプラン夕形質転換法である。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明に係るインプラン夕形質転換法においては、ケナフ植物の腋芽を突出させる工程、次に突出した腋芽に傷をつける工程、傷にァグロバクテリウム ·ッメファシエンスを接種する工程、生育後に一つの腋芽を残して全ての腋芽を切除する工程が含まれる。

本発明に係るインプラン夕形質転換法の対象植物はケナフ植物である。ケナフ植物は、いずれの種類であってもよいが、例えば Hibiscus cannabinus var.青皮 3号が挙げられる。本発明に係るインプランタ形質転換法においては、例えば約 70cmに生育した若いケナフ植物を使用することが好ましい。播種から成木までのケナフ植物の生育条件は、例えば照度 30, 000 l ux, 温度 20〜25° (：、および光周期： 10時間明期 /14時間喑期である。

本発明に係るインプランタ形質転換法では、まずケナフ植物の腋芽を突出させる。好ましくは 1個体のケナフ植物に対して、複数の腋芽を突出させる。「腋芽」とは、植物の茎軸の側方へ発生する側芽の 1種であり、葉液から形成されるものを意味する。ケナフ植物の茎の上部を切除し、 6〜7枚の葉が付いた基部の植物を残す。次いで該植物を生育することで、茎と葉柄の付け根に腋芽を突出させることができる。なお、人為的ではなくケナフ植物の生育過程で自然に突出した腋芽に本発明に係るインプランタ形質転換法を適用する場合には、本工程を必要としない。

次いで、上記で得られたケナフ植物の腋芽に傷をつける。傷は、接種するァグロバクテリウム ·ッメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、腋芽に穿設された穿孔または腋芽に切りつけられた切り口が挙げられる。穿設するための器具としては、例えば Φ 0. 71匪の針が挙げられる。また穿孔の個数は、 1腋芽あたり 2〜3個であることが好ましい。一方、切りつけるための器具としては、例えばメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。傷の位置としては、腋芽の葉柄の付け根が好ましい。なお、人為的な傷ではなく、自然による傷に本発明に係るインプランタ形質転換法を適用する場合には、本工程を必要としない。

次いで、上記で得られた腋芽の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを接種する。一般に、ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンスは、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。これは、感染の際に、ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス中の Tiプラスミド上の T- DNA領域と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。例えば、 Πプラスミド上の T-DNA領域中にケナフ植物ゲノム中に組み込みたい外来遺伝子を挿入する。次いでこの T-DNA領域を有するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスをケナフ植物に感染させると、ケナフ植物ゲノム中に該外来遺伝子を組込むことができる。外来遺伝子としては、いかなるタンパク質またはペプチドをコ一ドする遺伝子であっても良い。

本発明に係るィンプラン夕形質転換法において、接種するァグロバクテリゥム -ッメファシエンスとしては、ケナフ植物に感染できる株であればいずれのものでもよいが、非病原性のァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株が好ましい。ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株は、病原性のァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス A208株（C58染色体，ノパリン型 T37pTi)をトランスポゾン 5 (Tn5)変異によって突然変異させることで得られる（Maj umder Pら， J B iosc i Bioeng 90： 328-331, 2000) ₀ 図 1は、ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株の T- DNA領域における Tn5の揷入部位の構造を示す。図 1に示されるように、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株においては、 Tiプラスミドの T- DNA領域にあるィンドール酢酸（IAA)生合成に関与するトリブトファンモノォキシゲナーゼ遺伝子（以下、「iaaM遺伝子」と呼ぶ）に Tn5が挿入されている。ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス M21変異株は、それ自身の Τ - DNA領域を宿主染色体に組み込む能力を保持しているが、クラウンゴールを形成しない。

一方、腋芽の傷へのァグロバクテリウム ·ッメファシエンスの接種方法は、腋芽の傷を通して分裂組織にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでもよいが、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を浸した綿棒を用いて腋芽の傷に塗布する方法、ピぺットまたは注射器などを用いてァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を腋芽の傷に直接注入する方法、または噴霧器を用いてァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を腋芽の傷に噴霧する方法が挙げられる。ァグロパクテリゥム ·ッメファシェンス懸濁液の調製方法は、以下の通りである。まずァグロバクテリウム ·ッメファシエンスをカナマイシン（50 2 g/ml)とリファンピシン（lO i g/ml)を含む LB液体培地中で 28°Cで 18時間振とう培養する。次いで培養物を遠心分離することでァグロバクテリゥム ·ッメファシエンスを回収し、水で洗浄する。さらに 1. 0 X 10⁸菌体/ ml以上の濃度となるようにァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを水に懸濁し、これをァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液とする。

次いで、上記のようにァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを接種したケナフ植物（以下、「ケナフ形質転換植物体」と呼ぶ）を例えば 3〜4日間生育させる。ケナフ形質転換植物体を 3〜4日間生育させることで、腋芽を約 3cniの長さに伸長させることができる。

さらに、ケナフ形質転換植物体を 3〜4日間生育した後に、ァグロバクテリウム ·ッメファシエンスを接種した腋芽の中から 1つを選択し、残り全ての腋芽を切除し、そして成木まで生育する。選択する腋芽は、複数の腋芽のうちでケナフ形質転換植物体の最上部にある腋芽であることが好ましい。

一方、 PCR法、サザンハイブリダィゼーシヨン法、ノーザンハイブリダィゼーシヨン法等によって、ケナフ形質転換植物体のゲノムにァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス由来の T-DNA領域が組み込まれたか否かの確認を行うことができる。例えば、ケナフ形質転換植物体から DNAを調製し、 DNA特異的プライマーを設計して PCRを行う。次いで、 PCR産物についてァガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキヤピラリー電気泳動等を行い、臭化工チジゥム、 SYBR Green液等により染色し、そして 1本のバンドとして PCR産物を検出することにより、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス由来の T-DNA領域が組み込まれたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いて PCRを行い、 PCR産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に PCR産物を結合させ、蛍光または酵素反応等により PCR産物を確認する方法を採用してもよい。

以上で説明した本発明に係るインプラン夕形質転換法により、上記で説明した一般的な形質転換法の問題点を解決することできる。また、本発明に係るインプラン夕形質転換法により所望の外来遺伝子を発現するケナフ形質転換植物体をより簡便でかつ効率的に得ることができる。

本発明に係るインプラン夕形質転換法において、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を用いた場合、ケナフ形質転換植物体は、茎が太くなるという表現型を示す。ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス M21変異株は、唯一 iaaM遺伝子だけが変異しており、 T-DNA領域に存在するサイトカイニン生合成に関わる遺伝子を含む全ての他の遺伝子はそのままである。従って、ァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス M2 I変異株によって誘導されたケナフ形質転換植物体は、高レベルのサイトカイニンを合成することが考えられる。これによりホルモンバランスに支障をきたし、形質転換されたケナフ植物は茎が太くなるという表現型を示すと考えられる。上記で説明したようにァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株によって誘導されたケナフ形質転換植物体は、茎が太くなるという表現型を示すことから、産業的には 1個体から大量の材料を得ることができる。このような理由から、例えばパルフ生産において上記ケナフ形質転換植物体はより良い材料となる。あるいは、上記ケナフ形質転換植物体は茎が太いことから頑丈で、天災に強い樹木となることができる。このことから、上記ケナフ形質転換植物体を植林することで、森林にとって代わることができると考えられる。一方、ケナフ形質転換植物体を自家受粉させ、結実させる。このようにして、ケナフ形質転換植物体の遺伝子型を継いだ次の世代の種子を得ることができる。本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002- 340992号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。図面の簡単な説明

図 1は、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の T- DNA領域における Tn5の挿入部位の構造を示す。

図 2は、形質転換から 1年後の形質転換植物体（TO)と非形質転換植物体（TO)の茎の写真である。

図 3は、種子を播種して 2ヶ月後の形質転換植物体（T1)と非形質転換植物体 (T1)の写真である。

図 4は、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株 Tiプラスミド上の T-DNA領域にあるトリブトファンモノォキシゲナーゼ遺伝子と Tn5にまたがる DNA 断片（l, 488bp)、および該 DNA断片を増幅する nes ted PCR用のプライマーの対応する位置を示す。図中、 F1は第 1回目の PCR用フォワードプライマー、 R1は第 1回目の PCR用リバースプライマー、 F2は第 2回目の PCR用フォワードプライマー、及び R2は第 2回目の PCR用リバースプライマーの位置を示す。さらに図中、 iaaHはインドールァセトアミドヒドロラ一ゼを意味し、 iaaMはトリプトファンモノォキシゲナーゼ遺伝子を意味する。

図 5は、非形質転換植物体（TO)と形質転換植物体（TO)に由来する PCR産物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。

図 6は、非形質転換植物体（T1)と形質転換植物体（T1)に由来する PCR産物のァガロース電気泳動の結果を示す写真である。発明を実施するための最良の形態

〔実施例〕

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。

実施例 1 . ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスによるケナフ植物のィンプランタ形質転換

(1) ケナフ植物の生育

ケナフ植物（Hibiscus cannabinus var. aokawa no. 3) の種子を 4粒ずつ 2つの植木鉢（d) 23cm, 赤玉土：バーミキユライト（1 : 1) ) に播種し、照度 30, 000 lux, 温度 20〜25°C、および光周期： 10時間明期 /14時間暗期の条件下で生育した。播種後 3ヶ月で約 70cmに成長したケナフ植物を形質転換に使用した。

(2) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスの調製

ァグロパクテリゥム · ッメファシエンス M21変異株を、カナマイシン（50 M g/ml)とリファンピシン（10 / g/ml)を含む LB培地中で 28°Cで 18時間培養した。次いで菌体を遠心分離により回収し、水で洗浄した。洗浄後、 l. O x 10⁸菌体/ mlの濃度に菌体を水で懸濁し、これを接種懸濁液とした。

(3) ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換

上記のケナフ植物の茎の上部 35cmを切除し、 6〜7枚の葉が付いた基部約 35cmの植物を残した。この時点では葉柄と茎の連結部には腋芽は全く見られなかった。腋芽が茎と葉柄の付け根に観察されるまで、該植物を 3日間生育した。茎の上部に現れた 2〜3個の腋芽を、針（Φ 0. 71腿）で各腋芽あたり 2〜3点穿設し、穿孔を穿設した。一方の植木鉢の植物においては、上記接種菌懸濁液を浸した綿棒によつて、腋芽の穿孔にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株を接種した (以下、「形質転換植物体（TO)」と呼ぶ）。

一方、比較のため、異なるケナフ植物に対しては、水で浸した綿棒によって、腋芽の穿孔に水を接種した（以下、「非形質転換植物体（TO)」と呼ぶ）。

次いで、腋芽が約 3cmの長さになるまで、形質転換植物体（TO)および非形質転換植物体（TO)を 3〜4日間生育した。 3〜4日間の生育後、最上部の 1つの腋芽を残し、残り全ての腋芽を切除し、形質転換植物体（TO)および非形質転換植物体（TO) を成木まで生育した。また、形質転換植物体（TO)および非形質転換植物体（TO)をそれぞれ自家受粉させ、結実させた。次いでそれぞれ形質転換植物体（TO)および非形質転換植物体 (TO)から得られた種子を、無作為に 7粒ずつ選び、上記（1)に記載した生育条件下で生育した。以下、それぞれ生育した植物体を形質転換植物体 (T1)および非形質転換植物体（T1)と呼ぶ。

実施例 2 . ケナフ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現型の差異

形質転換から 1年後の形質転換植物体（TO)および非形質転換植物体（TO)の茎の写真を図 2に示す。さらに上記の形質転換植物体（TO)および非形質転換植物体 (TO)の茎の太さを以下の表 1に示す。

I— ¹ 表 1 .ケナフ非形質転植物体（TO)とァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス M21

変異株によって形質転換されたケナフ形質転換植物体 (TO)との茎の太さの比較植物番旦：基部から高さ 10cmにある茎の直径（cm) ^a)

非形質転換植物体 (TO) . 形質転換植物体 (TO):

1 1.00 1.50

2 1.15 1.45

3 1.15 1.00

4 · ― . 1.15 ― . . —1.45

平均士標準偏差 ^b) . 1.U ± 0.08 . 1.35 + 0.23

a) 形質転換から 1年後に茎の太さを測定した。

b) 非形質転換植物体 (TO)と形質転換植物体 (T0)との差異は、分散分析より有意である（P < °· ⁰⁵) °

図 2より、形質転換植物体（TO)の 4個体のうち、 3個体の茎が非形質転換植物体 (TO)と比較して太くなつたことが視覚的に分かる。また表 1より、非形質転換植物体（TO)と形質転換植物体（TO)との茎の直径の差異は、統計的に有意なものであつた。他の形質及び外観上の違いは、非形質転換植物体（TO)と形質転換植物体 (TO)の間で見られなかった。

また、種子を播種して 2ヶ月後の形質転換植物体（T1)および非形質転換植物体 (T1)の写真を図 3に示す。さらに種子を播種して 3ヶ月後の形質転換植物体（T1) および非形質転換植物体（Π)の茎の太さを以下の表 2に示す。

表 2 .ケナフ非形質転換植物体 (Tl)とァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス. M21 変異株によつて形質転換：されたケナフ形質転換植物体 (T1)と.の茎の太さの比較基部から高さ 10cmにある茎の直径（cm) ^a)

植物番号

非形質転換植物体 (T1) 形質転換植物体 (Tl)

1 0·30 0.75

2 0.30 0.80

3 0.50 0.35

4 0.45 0.45

5 0.45 0.75

6 0.60 0.50

7 0.50 0.70

0.44 ± 0.11 0.61 + 0.18 a) 種子 (Tl)を播種してから 3ヶ月後に茎の太さを測定した。

b) 非形質転換植物体 (Tl)と形質転換植物体 (Tl)との差異は、分散分析より有意である (p ί 0. 05)。

図 3より、形質転換植物体（T1)は、非形質転換植物体（Π)と比較して、背が高く大きく、かつ茎が太いように外観上顕著に異なることが分かる。また表 2より、非形質転換植物体（T1)と形質転換植物体（T1)との茎の直径の差異は、約 1. 5倍であり、統計的に有意なものであった。このように形質転換植物体（TO)の表現型は、形質転換植物体（T1)に遺伝された。

実施例 3 . ケナフ形質転換植物体からのァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス由来の遺伝子の検出

(1) ケナフ形質転換植物体からのゲノム DNAの単離

Nuc leoli Phytopure for Pl ant DNA ext ract ion Ki t (Amersham B iosc iences)を用いて、製造元のプロトコルに従い、上記の非形質転換植物体（TO)、形質転換植物体（TO)、非形質転換植物体（T1)および形質転換植物体（Π)の上部にある若い葉 (0. 05g)からそれぞれゲノム DNAを抽出した。次いで抽出されたゲノム DNAを、 RNAaseで 37°C、 45分間、その後プロティナーゼ Kで 55^、 16時間処理した。次にゲノム DNA溶液をフエノール、フエノール/クロ口ホルム（1 : 1)溶液およびク口口ホルムで抽出した。最後にゲノム DNAに対してエタノール沈澱を行い、水 100 i l に溶解した。このように調製されたゲノム DNAサンプルをァガロースゲルで電気泳動し、 DNAの純度と量をチェックした。

(2) Nes ted PCRによるァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス由来の遺伝子の検虽—

ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株においては、 Tiプラスミド上の T- DNA領域におけるトリブトファンモノォキシゲナーゼ遺伝子の 1， 055番目と 1， 056番目の塩基の間に Tn5が挿入されている（図 1 ) 。従って、図 4に示されるように、トリプトファンモノォキシゲナ一ゼ遺伝子と Τη5にまたがる DNA断片 (1， 488bp)を増幅するために、以下の nes ted PCRプライマ一を設計した。

1回目の PCR用プライマ一：

フォワードプライマ一（F1) ： 5' -AAG ACC TAA TCC GGC GTT TC-3' (配列番号 1 ) リバースプライマー（R1) ： 5' - TGA GCG TGA TAT TCC CCC TGT-3' (配列番号 2 ) 2回目の PCR用プライマー：

フォワードプライマー（F2) ： 5' -GAG TAG TCT TTC CGT CTC AG - 3' (配列番号 3 ) リバースプライマ一（R2) ： 5' - AGG TTC CGT TCA GGA CGC TA - 3' (配列番号 4 )

1回目の PCRでは、上記のように調製したゲノム DNA (約 lOOng)を、 50mM KC1、 10mM Tr i s-HC l (ρΗ8. 3) , 1. 5mM MgC l₂、 200 dNTP, それぞれ 0. 2 Mの 1回目の PCR用プライマーおよび 0. 63ュニットの TaQ DNAポリメラーゼ（宝酒造）からなる最終容量 25 1の反応混合物に加えた。 PCRは、最初 94°Cで 1分間の変性を行い、次いで 94°Cで 30秒間（変性）、 55°Cで 1分間（アニーリング）、および 72°Cで 1分間（伸長）からなるサイクルを 40回繰り返し、その後 72°Cで 7分間の伸長を行った。

2回目の PCRでは、 .1回目の PCR反応液を錶型とし、 2回目の PCR用プライマ一用いたこと以外は、 1回目の条件と同様にして PCRを行った。 2回目の PCR反応液 10 /i lをァガロースゲル（1 % )電気泳動に供し、臭化工チジゥムで染色し、 PCR産物を確認した。また、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の全 DNAを錶型とし、上記の 2回目の PCR条件で PCRを行った。得られた PCR産物を陽性対照とした。

非形質転換植物体（TO)と形質転換植物体（TO)に由来する PCR産物のァガロース電気泳動の結果を示す写真を、図 5に示す。図 5のパネル（a)および（b)の各レーンは、以下の通りであった：パネル（a)、レーン 1： DNAサイズマーカー、レーン 2：铸型なし、レーン 3：ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株の全 DNA (陽性対照）、レーン 4 :錶型なし、レーン 5〜8：それぞれ異なる非形質転換植物体（TO)に由来するゲノム DNA、およびパネル（b)、レーン 1： DNAサイズマーカー、レーン 2：錶型なし、レ一ン 3：ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の全 DNA (陽性対照）、レーン 4 :铸型なし、レーン 5〜8：それぞれ異なる形質転換植物体（TO)に由来するゲノム DNA。

図 5に示されるように、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異型の Tiプラスミド上の T - DNA領域における Tn5とトリブトフアンモノォキシゲナーゼ遺伝子にまたがる約 1. 5kbDNA断片が、形質転換植物体（TO)の 4個体全てから検出された。一方、非形質転換植物体 (T0)から該 DNA断片は検出されなかった。

また非形質転換植物体（T 1)と形質転換植物体（T1)に由来する PCR産物のァガロース電気泳動の結果を示す写真を、図 6に示す。図 6のパネル（a)および (b)の各レーンは、以下の通りであった：パネル（a)、レーン 1： DNAサイズマーカー、レ —ン 2：铸型なし、レーン 3：ァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の全 MA (陽性対照）、レーン 4 :錶型なし、レーン 5〜11：それぞれ異なる非形質転換植物体（T1)に由来するゲノム DNA、およびパネル（b)、レーン 1 : DNAサイズマ —力一、レーン 2 :铸型なし、レーン 3：ァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス M21変異株の全 DNA (陽性対照）、レーン 4 :錶型なし、レーン 5〜11：それぞれ異なる形質転換植物体（Π)に由来するゲノム DNA。

図 6に示されるように、ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異型の T iプラスミド上の T- DNA領域における Tn5とトリブトファンモノォキシゲナーゼ遺伝子にまたがる約 1. 5kbDNA断片が、形質転換植物体（T1)の 7個体の内、 6個体から検出された。一方、非形質転換植物体（T1)から該 DNA断片は検出されなかった。

これらの結果により、実施例 2で示した形質転換植物体（TO)の表現型が、ァグロバクテリウム ·ッメファシエンス M21変異株に由来する Tiプラスミド上の T-丽 A 領域に起因することが示された。また、形質転換植物体. (TO)の遺伝子型が形質転換植物体（T1)に高い頻度で伝わることが示された。

実施例 4 . ケナフ形質転換植物体におけるァグロパクテリゥム ·ッメファシェンスの存在の検証

形質転換植物体（TO)および形質転換植物体（T1)において、生存するァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株が存在するか否かを検証した。

まず対照実験を行った。非形質転換植物体（TO)の上部にある若い葉を用いて、以下の処理を供した 4サンプルを調製した。

サンプル 1：非滅菌。

サンプル 2： 70%エタノールに 3分間浸漬した後、水で 3回洗浄。

サンプル 3：ァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株の懸濁液（1. 0 X

10³ 菌体/ ml)で減圧浸潤した後、水で 1回洗浄。

サンプル 4：ァグロパクテリゥム *ッメファシエンス M21変異株の懸濁液（1. 0 X

10³ 菌体/ ml)で減圧浸潤した後、水で 1回洗浄し、さらに 70%エタノールに 3分間浸漬した後、水で 3回洗浄。

ここで「減圧湿潤」とは、植物をァグロバクテリウム ·ッメファシエンス懸濁液に浸して弱い陰圧下に置き、懸濁液の植物の内部への浸透を図ることによる形質転換法である。

上記の全てのサンプルを、滅菌水中で無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（50 g/ml )とリファンピシン（ 10 2 g/m 1 )を含む LB培地中で 28°Cで 3日間培養した。なおこの条件下でァグロパクテリゥム ·ッメファシェンス M21変異株は増殖できる。

結果として、サンプル 3および 4のプレートには、多数のコロニーが現れた。また、サンプル 1のプレートには、数個のコロニーが出現した。しかしながら、サンプル 2のプレートには、コロニーは全く見られなかった。この結果より、 70% エタノールによる葉表面の滅菌では、葉組織中のァグロパクテリゥム 'ッメファシエンス M21変異株は死滅しないことが判明した。

次に、形質転換植物体 (TO)および形質転換植物体（T1)の上部にある若い葉を、それぞれ上記のサンプル 2と同様の処理に供した。次いで、処理に供した葉を滅菌水中で無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（50 g/ml)とリファンピシン（lO g/ml)を含む LB培地中で 28°Cで 3日間培養した。

その結果、形質転換植物体（TO)および形質転換植物体（T1)に由来する双方のサンプルのプレートには、コロニーが全く見られなかった。

また、形質転換植物体（TO)から得られた種子を、 1. 7%の次亜塩素酸ナトリウム溶液で 20分間滅菌し、その後無菌状態で発芽させた。生育した幼植物を、無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（50 g/ml)とリファンピシン（10 /2 g/ml)を含む LB培地中で 28°Cで 3日間培養した。その結果、プレート上には全くコロニーは見れなかった。

以上から、形質転換植物体（TO)および形質転換植物体（T1)において、生存するァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株は存在しなかった。また実施例 3で検出されたァグロバクテリゥム ·ッメファシエンス M21変異株由来の T- DNA 領域は、形質転換植物体（TO)および形質転換植物体（T1)のゲノムに組み込まれた T - DNA領域に由来するものであることが判明した。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。産業上の利用の可能性

本発明により、ケナフ植物の形質転換体をより簡便でかつ効率的に得られるケナフ植物のインプランタ形質転換法が提供される。従って、本発明により、経済上及び農業上付加価値を有するケナフ植物が得られる。

Claims

請求の範囲

1 . ケナフ植物の腋芽の傷にァグロパクテリゥム ·ッメファシエンスを接種することを特徴とする、ケナフ植物のィンプラン夕形質転換法。

2 . ケナフ植物の茎の上部を切除し、腋芽を突出させる工程を含む、請求の範囲 1に記載のケナフ植物のインプラン夕形質転換法。

3 . 前記腋芽に傷をつける工程を含む、請求の範囲 1または 2に記載のケナフ植物のィンプラン夕形質転換法。

4 . 前記傷が穿孔である、請求の範囲 1〜3のいずれか 1項に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。

5 . 接種するァグロバクテリゥム ·ッメファシエンスがァグロパクテリゥム .ッメファシエンス M2 I変異株である、請求の範囲 1〜4のいずれか 1項に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。

6 . 前記接種がァグロパクテリゥム ·ッメファシエンス懸濁液を塗布することである、請求の範囲 1〜 5のいずれか 1項に記載のケナフ植物のィンプラン夕形質転換法。 '