JP2004173525A - アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換法 - Google Patents
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Abstract
【課題】アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換法を提供する。
【解決手段】ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。
【選択図】 なし
【解決手段】ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ（Ｉｎ ｐｌａｎｔａ）形質転換法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、以下の点からケナフ植物は、多くの注目を集めている（非特許文献１）。まず第一に、ケナフ植物は非常に早いスピードで成長するという点である。第二に、ケナフ植物から高品質の繊維質が生産されるという点である。このような理由から、ケナフ植物を生育することで、空気中の多量のＣＯ２を吸収することでき、あるいはパルプ生産において森林にとって代わることができる。このようにケナフ植物は、地球温暖化の抑止に貢献できる植物の一つである。
【０００３】
一方、一般的な植物の形質転換法としては、外来遺伝子をカルスまたは組織培養細胞に導入し、次いで植物体へと再生する方法が知られている（非特許文献２および非特許文献３）。しかしながら、このような形質転換法には以下の問題点がある。まず第一に、滅菌条件下での作業が必要であり、困難な点である。第二に、長期にわたり時間がかかる点である。第三に、組織培養中に、体細胞突然変異またはソマクローナル変異が頻繁に生じる点である。さらに、ある植物では再生させることが困難である点である。このような問題点を解決するために、インプランタ形質転換法が開発された（非特許文献４）。「インプランタ形質転換法」とは、上記のような組織培養を経ることなく、生育する植物の細胞を形質転換させる方法である。
【０００４】
以前、本発明者らは、簡便でかつ効率的なアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いたソバ植物（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）のインプランタ形質転換法を開発した（非特許文献５）。この方法においては、ソバ植物の幼植物の頂点分裂組織に針で孔を穿設し、次いでアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。ここで「頂点分裂組織」とは、植物において成長軸の先端に存在し、細胞が増殖している組織を意味する。
【０００５】
一方、ケナフ植物の形質転換法として、葉の組織片に外来遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種するか、または葉の組織片に外来遺伝子を表面に担持するタングステンもしくは金の微粒子を撃ち込む方法が開示されている（特許文献１）。該方法は、上記で説明した一般的な植物の形質転換法であり、作業性が悪いという問題がある。またケナフ植物に対して非特許文献５の方法を適用しても、効率良く形質転換することはできなかった。従って、ケナフ植物のインプランタ形質転換法はこれまで確立されていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，９９８，２０７号
【非特許文献１】
Ｓｅｌｌｅｒｓ ＴおよびＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｎ， 「ケナフ：特性、プロセシングおよび産物（Ｋｅｎａｆ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」， （米国）， ミシシッピー大学プレス（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ）， １９９９年
【非特許文献２】
Ｈｏｏｙｋａａｓ ＰＪＪおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ， アグロバクテリウムおよび植物遺伝子工学（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）， 「プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， （米国）， １９９２年， 第１９巻， ｐ．１５−３８
【非特許文献３】
Ｚｕｐａｎ ＪＲおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ Ｐ， アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの転移（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｔ−ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）， 「プラントフィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」， （米国）， １９９５年， 第１０７巻， ｐ．１０４１−１０４７
【非特許文献４】
Ｂｉｒｃｈ Ｒ．Ｇ．， 植物形質転換‐実際の適用における問題とストラテジー（Ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ − ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）， 「アニュアルレビューオブプラントフィジオロジーアンドプラントモレキュラーバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，（米国）， １９９７年， 第４８巻， ｐ．２９７−３２６
【非特許文献５】
Ｋｏｊｉｍａ Ｍら， アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いたソバ植物（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の簡便でかつ効率的な形質転換法の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｃｋｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）， 「バイオサイエンス、バイオテクノロジーおよびバイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」， ２０００年， 第６４巻， ｐ．８４５−８４７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、より簡便でかつ効率的に行うことのできるケナフ植物のインプランタ形質転換法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することで、ケナフ植物が効率良く形質転換されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することを特徴とする、ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
【００１０】
さらに本発明は、ケナフ植物の茎の上部を切除し、腋芽を突出させる工程を含む、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
さらに本発明は、前記腋芽に傷をつける工程を含む、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
さらに本発明は、前記傷が穿孔である、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
【００１１】
さらに本発明は、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスがアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株である、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
さらに本発明は、前記接種がアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を塗布することである、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るインプランタ形質転換法においては、ケナフ植物の腋芽を突出させる工程、次に突出した腋芽に傷をつける工程、傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する工程、生育後に一つの腋芽を残して全ての腋芽を切除する工程が含まれる。
【００１３】
本発明に係るインプランタ形質転換法の対象植物はケナフ植物である。ケナフ植物は、いずれの種類であってもよいが、例えばＨｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ ｖａｒ．青皮３号が挙げられる。本発明に係るインプランタ形質転換法においては、例えば約７０ｃｍに生育した若いケナフ植物を使用することが好ましい。播種から成木までのケナフ植物の生育条件は、例えば照度３０，０００ ｌｕｘ、温度２０〜２５℃、および光周期：１０時間明期／１４時間暗期である。
【００１４】
本発明に係るインプランタ形質転換法では、まずケナフ植物の腋芽を突出させる。好ましくは１個体のケナフ植物に対して、複数の腋芽を突出させる。「腋芽」とは、植物の茎軸の側方へ発生する側芽の１種であり、葉液から形成されるものを意味する。ケナフ植物の茎の上部を切除し、６〜７枚の葉が付いた基部の植物を残す。次いで該植物を生育することで、茎と葉柄の付け根に腋芽を突出させることができる。なお、人為的ではなくケナフ植物の生育過程で自然に突出した腋芽に本発明に係るインプランタ形質転換法を適用する場合には、本工程を必要としない。
【００１５】
次いで、上記で得られたケナフ植物の腋芽に傷をつける。傷は、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、腋芽に穿設された穿孔または腋芽に切りつけられた切り口が挙げられる。穿設するための器具としては、例えばφ０．７１ｍｍの針が挙げられる。また穿孔の個数は、１腋芽あたり２〜３個であることが好ましい。一方、切りつけるための器具としては、例えばメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。傷の位置としては、腋芽の葉柄の付け根が好ましい。なお、人為的な傷ではなく、自然による傷に本発明に係るインプランタ形質転換法を適用する場合には、本工程を必要としない。
【００１６】
次いで、上記で得られた腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。一般に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。これは、感染の際に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。例えば、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中にケナフ植物ゲノム中に組み込みたい外来遺伝子を挿入する。次いでこのＴ−ＤＮＡ領域を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスをケナフ植物に感染させると、ケナフ植物ゲノム中に該外来遺伝子を組込むことができる。外来遺伝子としては、いかなるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子であっても良い。
【００１７】
本発明に係るインプランタ形質転換法において、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスとしては、ケナフ植物に感染できる株であればいずれのものでよいが、非病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株が好ましい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２０８株（Ｃ５８染色体， ノパリン型 Ｔ３７ｐＴｉ）をトランスポゾン５（Ｔｎ５）変異によって突然変異させることで得られる（Ｍａｊｕｍｄｅｒ Ｐら， Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ９０：３２８−３３１， ２０００）。図１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５の挿入部位の構造を示す。図１に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域にあるインドール酢酸（ＩＡＡ）生合成に関与するトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子（以下、「ｉａａＭ遺伝子」と呼ぶ）にＴｎ５が挿入されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、それ自身のＴ−ＤＮＡ領域を宿主染色体に組み込む能力を保持しているが、クラウンゴールを形成しない。
【００１８】
一方、腋芽の傷へのアグロバクテリウム・ツメファシエンスの接種方法は、腋芽の傷を通して分裂組織にアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を浸した綿棒を用いて腋芽の傷に塗布する方法、ピペットまたは注射器などを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を腋芽の傷に直接注入する方法、または噴霧器を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を腋芽の傷に噴霧する方法が挙げられる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液の調製方法は、以下の通りである。まずアグロバクテリウム・ツメファシエンスをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地中で２８℃で１８時間振とう培養する。次いで培養物を遠心分離することでアグロバクテリウム・ツメファシエンスを回収し、水で洗浄する。さらに１．０ ｘ １０８菌体／ｍｌ以上の濃度となるようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを水に懸濁し、これをアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液とする。
【００１９】
次いで、上記のようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種したケナフ植物（以下、「ケナフ形質転換植物体」と呼ぶ）を例えば３〜４日間生育させる。ケナフ形質転換植物体を３〜４日間生育させることで、腋芽を約３ｃｍの長さに伸長させることができる。
【００２０】
さらに、ケナフ形質転換植物体を３〜４日間生育した後に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種した腋芽の中から１つを選択し、残り全ての腋芽を切除し、そして成木まで生育する。選択する腋芽は、複数の腋芽のうちでケナフ形質転換植物体の最上部にある腋芽であることが好ましい。
【００２１】
一方、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって、ケナフ形質転換植物体のゲノムにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたか否かの確認を行うことができる。例えば、ケナフ形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして１本のバンドとしてＰＣＲ産物を検出することにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相にＰＣＲ産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によりＰＣＲ産物を確認する方法を採用してもよい。
【００２２】
以上で説明した本発明に係るインプランタ形質転換法により、上記で説明した一般的な形質転換法の問題点を解決することできる。また、本発明に係るインプランタ形質転換法により所望の外来遺伝子を発現するケナフ形質転換植物体をより簡便でかつ効率的に得ることができる。
【００２３】
本発明に係るインプランタ形質転換法において、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いた場合、ケナフ形質転換植物体は、茎が太くなるという表現型を示す。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、唯一ｉａａＭ遺伝子だけが変異しており、Ｔ−ＤＮＡ領域に存在するサイトカイニン生合成に関わる遺伝子を含む全ての他の遺伝子はそのままである。従って、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって誘導されたケナフ形質転換植物体は、高レベルのサイトカイニンを合成することが考えられる。これによりホルモンバランスに支障をきたし、形質転換されたケナフ植物は茎が太くなるという表現型を示すと考えられる。上記で説明したようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって誘導されたケナフ形質転換植物体は、茎が太くなるという表現型を示すことから、産業的には１個体から大量の材料を得ることができる。このような理由から、例えばパルフ生産において上記ケナフ形質転換植物体はより良い材料となる。あるいは、上記ケナフ形質転換植物体は茎が太いことから頑丈で、天災に強い樹木となることができる。このことから、上記ケナフ形質転換植物体を植林することで、森林にとって代わることができると考えられる。
一方、ケナフ形質転換植物体を自家受粉させ、結実させる。このようにして、ケナフ形質転換植物体の遺伝子型を継いだ次の世代の種子を得ることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２５】
実施例１．アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換
（１） ケナフ植物の生育
ケナフ植物（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ ｖａｒ． ａｏｋａｗａ ｎｏ．３）の種子を４粒ずつ２つの植木鉢（φ２３ｃｍ， 赤玉土：バーミキュライト（１：１））に播種し、照度３０，０００ ｌｕｘ、温度２０〜２５℃、および光周期：１０時間明期／１４時間暗期の条件下で生育した。播種後３ヶ月で約７０ｃｍに成長したケナフ植物を形質転換に使用した。
【００２６】
（２） アグロバクテリウム・ツメファシエンスの調製
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で１８時間培養した。次いで菌体を遠心分離により回収し、水で洗浄した。洗浄後、１．０ ｘ １０８ 菌体／ｍｌの濃度に菌体を水で懸濁し、これを接種懸濁液とした。
【００２７】
（３） アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換
上記のケナフ植物の茎の上部３５ｃｍを切除し、６〜７枚の葉が付いた基部約３５ｃｍの植物を残した。この時点では葉柄と茎の連結部には腋芽は全く見られなかった。腋芽が茎と葉柄の付け根に観察されるまで、該植物を３日間生育した。茎の上部に現れた２〜３個の腋芽を、針（φ０．７１ｍｍ）で各腋芽あたり２〜３点穿設し、穿孔を穿設した。一方の植木鉢の植物においては、上記接種菌懸濁液を浸した綿棒によって、腋芽の穿孔にアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を接種した（以下、「形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
一方、比較のため、異なるケナフ植物に対しては、水で浸した綿棒によって、腋芽の穿孔に水を接種した（以下、「非形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
【００２８】
次いで、腋芽が約３ｃｍの長さになるまで、形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）を３〜４日間生育した。３〜４日間の生育後、最上部の１つの腋芽を残し、残り全ての腋芽を切除し、形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）を成木まで生育した。また、形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）をそれぞれ自家受粉させ、結実させた。次いでそれぞれ形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）から得られた種子を、無作為に７粒ずつ選び、上記（１）に記載した生育条件下で生育した。以下、それぞれ生育した植物体を形質転換植物体（Ｔ１）および非形質転換植物体（Ｔ１）と呼ぶ。
【００２９】
実施例２．ケナフ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現型の差異
形質転換から１年後の形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）の茎の写真を図２に示す。さらに上記の形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）の茎の太さを以下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
【００３１】
図２より、形質転換植物体（Ｔ０）の４個体のうち、３個体の茎が非形質転換植物体（Ｔ０）と比較して太くなったことが視覚的に分かる。また表１より、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）との茎の直径の差異は、統計的に有意なものであった。他の形質及び外観上の違いは、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）の間で見られなかった。
【００３２】
また、種子を播種して２ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）および非形質転換植物体（Ｔ１）の写真を図３に示す。さらに種子を播種して３ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）および非形質転換植物体（Ｔ１）の茎の太さを以下の表２に示す。
【００３３】
【表２】
【００３４】
図３より、形質転換植物体（Ｔ１）は、非形質転換植物体（Ｔ１）と比較して、背が高く大きく、かつ茎が太いように外観上顕著に異なることが分かる。また表２より、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）との茎の直径の差異は、約１．５倍であり、統計的に有意なものであった。このように形質転換植物体（Ｔ０）の表現型は、形質転換植物体（Ｔ１）に遺伝された。
【００３５】
実施例３．ケナフ形質転換植物体からのアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の遺伝子の検出
（１） ケナフ形質転換植物体からのゲノム ＤＮＡ の単離
Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造元のプロトコルに従い、上記の非形質転換植物体（Ｔ０）、形質転換植物体（Ｔ０）、非形質転換植物体（Ｔ１）および形質転換植物体（Ｔ１）の上部にある若い葉（０．０５ｇ）からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出した。次いで抽出されたゲノムＤＮＡを、ＲＮＡａｓｅで３７℃、４５分間、その後プロテイナーゼＫで５５℃、１６時間処理した。次にゲノムＤＮＡ溶液をフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）溶液およびクロロホルムで抽出した。最後にゲノムＤＮＡに対してエタノール沈澱を行い、水１００μｌに溶解した。このように調製されたゲノムＤＮＡサンプルをアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡの純度と量をチェックした。
【００３６】
（２） Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の遺伝子の検出
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子の１，０５５番目と１，０５６番目の塩基の間にＴｎ５が挿入されている（図１）。従って、図４に示されるように、トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子とＴｎ５にまたがるＤＮＡ断片（１，４８８ｂｐ）を増幅するために、以下のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲプライマーを設計した。
１回目のＰＣＲ用プライマー：
フォワードプライマー：５’−ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＡＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＴＴ ＴＣ−３’（配列番号１）
リバースプライマー：５’−ＴＧＡ ＧＣＧ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＧＴ−３’（配列番号２）
２回目のＰＣＲ用プライマー：
フォワードプライマー：５’−ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＧ−３’（配列番号３）
リバースプライマー：５’−ＡＧＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＡ−３’（配列番号４）
【００３７】
１回目のＰＣＲでは、上記のように調製したゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ）を、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、それぞれ０．２μＭの１回目のＰＣＲ用プライマーおよび０．６３ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）からなる最終容量２５μｌの反応混合物に加えた。ＰＣＲは、最初９４℃で１分間の変性を行い、次いで９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で１分間（アニーリング）、および７２℃で１分間（伸長）からなるサイクルを４０回繰り返し、その後７２℃で７分間の伸長を行った。
【００３８】
２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ反応液２μｌを鋳型とし、２回目のＰＣＲ用プライマー用いたこと以外は、１回目の条件と同様にしてＰＣＲを行った。２回目のＰＣＲ反応液１０μｌをアガロースゲル（１％）電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲ産物を確認した。また、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡを鋳型とし、上記の２回目のＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を陽性対照とした。
【００３９】
非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図５に示す。図５のパネル（ａ）および（ｂ）の各レーンは、以下の通りであった：パネル（ａ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜８：それぞれ異なる非形質転換植物体（Ｔ０）に由来するゲノムＤＮＡ、およびパネル（ｂ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜８：それぞれ異なる形質転換植物体（Ｔ０）に由来するゲノムＤＮＡ。
【００４０】
図５に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異型のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５とトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子にまたがる約１．５ｋｂＤＮＡ断片が、形質転換植物体（Ｔ０）の４個体全てから検出された。一方、非形質転換植物体（Ｔ０）から該ＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００４１】
また非形質転換植物体（Ｔ１）と形質転換植物体（Ｔ１）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図６に示す。図６のパネル（ａ）および（ｂ）の各レーンは、以下の通りであった：パネル（ａ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜１１：それぞれ異なる非形質転換植物体（Ｔ１）に由来するゲノムＤＮＡ、およびパネル（ｂ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜１１：それぞれ異なる形質転換植物体（Ｔ１）に由来するゲノムＤＮＡ。
【００４２】
図６に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異型のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５とトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子にまたがる約１．５ｋｂＤＮＡ断片が、形質転換植物体（Ｔ１）の７個体の内、６個体から検出された。一方、非形質転換植物体（Ｔ１）から該ＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００４３】
これらの結果により、実施例２で示した形質転換植物体（Ｔ０）の表現型が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株に由来するＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域に起因することが示された。また、形質転換植物体（Ｔ０）の遺伝子型が形質転換植物体（Ｔ１）に高い頻度で伝わることが示された。
【００４４】
実施例４．ケナフ形質転換植物体におけるアグロバクテリウム・ツメファシエンスの存在の検証
形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）において、生存するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株が存在するか否かを検証した。
まず対照実験を行った。非形質転換植物体（Ｔ０）の上部にある若い葉を用いて、以下の処理を供した４サンプルを調製した。
サンプル１：非滅菌。
サンプル２：７０％エタノールに３分間浸漬した後、水で３回洗浄。
サンプル３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の懸濁液（１．０ ｘ １０３ 菌体／ｍｌ）で減圧浸潤した後、水で１回洗浄。
サンプル４：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の懸濁液（１．０ ｘ １０３ 菌体／ｍｌ）で減圧浸潤した後、水で１回洗浄し、さらに７０％エタノールに３分間浸漬した後、水で３回洗浄。
【００４５】
ここで「減圧湿潤」とは、植物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液に浸して弱い陰圧下に起き、懸濁液の植物の内部への浸透を図ることによる形質転換法である。
【００４６】
上記の全てのサンプルを、滅菌水中で無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で３日間培養した。なおこの条件下でアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は増殖できる。
【００４７】
結果として、サンプル３および４のプレートには、多数のコロニーが現れた。また、サンプル１のプレートには、数個のコロニーが出現した。しかしながら、サンプル２のプレートには、コロニーは全く見られなかった。この結果より、７０％エタノールによる葉表面の滅菌では、葉組織中のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は死滅しないことが判明した。
【００４８】
次に、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）の上部にある若い葉を、それぞれ上記のサンプル２と同様の処理に供した。次いで、処理に供した葉を滅菌水中で無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で３日間培養した。
その結果、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）に由来する双方のサンプルのプレートには、コロニーが全く見られなかった。
【００４９】
また、形質転換植物体（Ｔ０）から得られた種子を、１．７％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で２０分間滅菌し、その後無菌状態で発芽させた。生育した幼植物を、無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で３日間培養した。その結果、プレート上には全くコロニーは見れなかった。
【００５０】
以上から、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）において、生存するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は存在しなかった。また実施例３で検出されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株由来のＴ−ＤＮＡ領域は、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）のゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡ領域に由来するものであることが判明した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、ケナフ植物の形質転換体をより簡便でかつ効率的に得られるケナフ植物のインプランタ形質転換法が提供される。従って、本発明により、経済上及び農業上付加価値を有するケナフ植物が得られる。
【００５２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５の挿入部位の構造を示す。
【図２】図２は、形質転換から１年後の形質転換植物体（Ｔ０）と非形質転換植物体（Ｔ０）の茎の写真を示す。
【図３】図３は、種子を播種して２ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）と非形質転換植物体（Ｔ１）の写真を示す。
【図４】図４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域にあるトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子とＴｎ５にまたがるＤＮＡ断片（１，４８８ｂｐ）、および該ＤＮＡ断片を増幅するｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。図中、ｉａａＨはインドールアセトアミドヒドロラーゼを意味し、ｉａａＭはトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子を意味する。
【図５】図５は、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
【図６】図６は、非形質転換植物体（Ｔ１）と形質転換植物体（Ｔ１）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ（Ｉｎ ｐｌａｎｔａ）形質転換法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、以下の点からケナフ植物は、多くの注目を集めている（非特許文献１）。まず第一に、ケナフ植物は非常に早いスピードで成長するという点である。第二に、ケナフ植物から高品質の繊維質が生産されるという点である。このような理由から、ケナフ植物を生育することで、空気中の多量のＣＯ２を吸収することでき、あるいはパルプ生産において森林にとって代わることができる。このようにケナフ植物は、地球温暖化の抑止に貢献できる植物の一つである。
【０００３】
一方、一般的な植物の形質転換法としては、外来遺伝子をカルスまたは組織培養細胞に導入し、次いで植物体へと再生する方法が知られている（非特許文献２および非特許文献３）。しかしながら、このような形質転換法には以下の問題点がある。まず第一に、滅菌条件下での作業が必要であり、困難な点である。第二に、長期にわたり時間がかかる点である。第三に、組織培養中に、体細胞突然変異またはソマクローナル変異が頻繁に生じる点である。さらに、ある植物では再生させることが困難である点である。このような問題点を解決するために、インプランタ形質転換法が開発された（非特許文献４）。「インプランタ形質転換法」とは、上記のような組織培養を経ることなく、生育する植物の細胞を形質転換させる方法である。
【０００４】
以前、本発明者らは、簡便でかつ効率的なアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いたソバ植物（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）のインプランタ形質転換法を開発した（非特許文献５）。この方法においては、ソバ植物の幼植物の頂点分裂組織に針で孔を穿設し、次いでアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。ここで「頂点分裂組織」とは、植物において成長軸の先端に存在し、細胞が増殖している組織を意味する。
【０００５】
一方、ケナフ植物の形質転換法として、葉の組織片に外来遺伝子を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種するか、または葉の組織片に外来遺伝子を表面に担持するタングステンもしくは金の微粒子を撃ち込む方法が開示されている（特許文献１）。該方法は、上記で説明した一般的な植物の形質転換法であり、作業性が悪いという問題がある。またケナフ植物に対して非特許文献５の方法を適用しても、効率良く形質転換することはできなかった。従って、ケナフ植物のインプランタ形質転換法はこれまで確立されていなかった。
【０００６】
【特許文献１】
米国特許第５，９９８，２０７号
【非特許文献１】
Ｓｅｌｌｅｒｓ ＴおよびＲｅｉｃｈｅｒｔ Ｎ， 「ケナフ：特性、プロセシングおよび産物（Ｋｅｎａｆ：ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」， （米国）， ミシシッピー大学プレス（Ｍｉｓｓｉｓｓｉｐｐｉ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ）， １９９９年
【非特許文献２】
Ｈｏｏｙｋａａｓ ＰＪＪおよびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ ＲＡ， アグロバクテリウムおよび植物遺伝子工学（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）， 「プラントモレキュラーバイオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， （米国）， １９９２年， 第１９巻， ｐ．１５−３８
【非特許文献３】
Ｚｕｐａｎ ＪＲおよびＺａｍｂｒｙｓｋｉ Ｐ， アグロバクテリウムから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの転移（Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｔ−ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｏ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ）， 「プラントフィジオロジー（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）」， （米国）， １９９５年， 第１０７巻， ｐ．１０４１−１０４７
【非特許文献４】
Ｂｉｒｃｈ Ｒ．Ｇ．， 植物形質転換‐実際の適用における問題とストラテジー（Ｐｌａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ − ｐｒｏｂｌｅｍｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ）， 「アニュアルレビューオブプラントフィジオロジーアンドプラントモレキュラーバイオロジー（Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，（米国）， １９９７年， 第４８巻， ｐ．２９７−３２６
【非特許文献５】
Ｋｏｊｉｍａ Ｍら， アグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いたソバ植物（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）の簡便でかつ効率的な形質転換法の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ ａ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｃｋｗｈｅａｔ ｐｌａｎｔｓ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ） ｕｓｉｎｇ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）， 「バイオサイエンス、バイオテクノロジーおよびバイオケミストリー（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」， ２０００年， 第６４巻， ｐ．８４５−８４７
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
そこで本発明は、より簡便でかつ効率的に行うことのできるケナフ植物のインプランタ形質転換法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することで、ケナフ植物が効率良く形質転換されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は、ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することを特徴とする、ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
【００１０】
さらに本発明は、ケナフ植物の茎の上部を切除し、腋芽を突出させる工程を含む、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
さらに本発明は、前記腋芽に傷をつける工程を含む、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
さらに本発明は、前記傷が穿孔である、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
【００１１】
さらに本発明は、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスがアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株である、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
さらに本発明は、前記接種がアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を塗布することである、上記ケナフ植物のインプランタ形質転換法である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係るインプランタ形質転換法においては、ケナフ植物の腋芽を突出させる工程、次に突出した腋芽に傷をつける工程、傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する工程、生育後に一つの腋芽を残して全ての腋芽を切除する工程が含まれる。
【００１３】
本発明に係るインプランタ形質転換法の対象植物はケナフ植物である。ケナフ植物は、いずれの種類であってもよいが、例えばＨｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ ｖａｒ．青皮３号が挙げられる。本発明に係るインプランタ形質転換法においては、例えば約７０ｃｍに生育した若いケナフ植物を使用することが好ましい。播種から成木までのケナフ植物の生育条件は、例えば照度３０，０００ ｌｕｘ、温度２０〜２５℃、および光周期：１０時間明期／１４時間暗期である。
【００１４】
本発明に係るインプランタ形質転換法では、まずケナフ植物の腋芽を突出させる。好ましくは１個体のケナフ植物に対して、複数の腋芽を突出させる。「腋芽」とは、植物の茎軸の側方へ発生する側芽の１種であり、葉液から形成されるものを意味する。ケナフ植物の茎の上部を切除し、６〜７枚の葉が付いた基部の植物を残す。次いで該植物を生育することで、茎と葉柄の付け根に腋芽を突出させることができる。なお、人為的ではなくケナフ植物の生育過程で自然に突出した腋芽に本発明に係るインプランタ形質転換法を適用する場合には、本工程を必要としない。
【００１５】
次いで、上記で得られたケナフ植物の腋芽に傷をつける。傷は、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、腋芽に穿設された穿孔または腋芽に切りつけられた切り口が挙げられる。穿設するための器具としては、例えばφ０．７１ｍｍの針が挙げられる。また穿孔の個数は、１腋芽あたり２〜３個であることが好ましい。一方、切りつけるための器具としては、例えばメスおよびカッターなどの切断器具が挙げられる。傷の位置としては、腋芽の葉柄の付け根が好ましい。なお、人為的な傷ではなく、自然による傷に本発明に係るインプランタ形質転換法を適用する場合には、本工程を必要としない。
【００１６】
次いで、上記で得られた腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種する。一般に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、植物に感染してクラウンゴールと呼ばれる腫瘍を形成する。これは、感染の際に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス中のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域と呼ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込まれることに起因するものである。例えば、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域中にケナフ植物ゲノム中に組み込みたい外来遺伝子を挿入する。次いでこのＴ−ＤＮＡ領域を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスをケナフ植物に感染させると、ケナフ植物ゲノム中に該外来遺伝子を組込むことができる。外来遺伝子としては、いかなるタンパク質またはペプチドをコードする遺伝子であっても良い。
【００１７】
本発明に係るインプランタ形質転換法において、接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスとしては、ケナフ植物に感染できる株であればいずれのものでよいが、非病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株が好ましい。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、病原性のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡ２０８株（Ｃ５８染色体， ノパリン型 Ｔ３７ｐＴｉ）をトランスポゾン５（Ｔｎ５）変異によって突然変異させることで得られる（Ｍａｊｕｍｄｅｒ Ｐら， Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ ９０：３２８−３３１， ２０００）。図１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５の挿入部位の構造を示す。図１に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域にあるインドール酢酸（ＩＡＡ）生合成に関与するトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子（以下、「ｉａａＭ遺伝子」と呼ぶ）にＴｎ５が挿入されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、それ自身のＴ−ＤＮＡ領域を宿主染色体に組み込む能力を保持しているが、クラウンゴールを形成しない。
【００１８】
一方、腋芽の傷へのアグロバクテリウム・ツメファシエンスの接種方法は、腋芽の傷を通して分裂組織にアグロバクテリウム・ツメファシエンスが感染できるものであればいずれのものでよいが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を浸した綿棒を用いて腋芽の傷に塗布する方法、ピペットまたは注射器などを用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を腋芽の傷に直接注入する方法、または噴霧器を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を腋芽の傷に噴霧する方法が挙げられる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液の調製方法は、以下の通りである。まずアグロバクテリウム・ツメファシエンスをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ液体培地中で２８℃で１８時間振とう培養する。次いで培養物を遠心分離することでアグロバクテリウム・ツメファシエンスを回収し、水で洗浄する。さらに１．０ ｘ １０８菌体／ｍｌ以上の濃度となるようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを水に懸濁し、これをアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液とする。
【００１９】
次いで、上記のようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種したケナフ植物（以下、「ケナフ形質転換植物体」と呼ぶ）を例えば３〜４日間生育させる。ケナフ形質転換植物体を３〜４日間生育させることで、腋芽を約３ｃｍの長さに伸長させることができる。
【００２０】
さらに、ケナフ形質転換植物体を３〜４日間生育した後に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種した腋芽の中から１つを選択し、残り全ての腋芽を切除し、そして成木まで生育する。選択する腋芽は、複数の腋芽のうちでケナフ形質転換植物体の最上部にある腋芽であることが好ましい。
【００２１】
一方、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等によって、ケナフ形質転換植物体のゲノムにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたか否かの確認を行うことができる。例えば、ケナフ形質転換植物体からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。次いで、ＰＣＲ産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして１本のバンドとしてＰＣＲ産物を検出することにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡ領域が組み込まれたことを確認する。また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相にＰＣＲ産物を結合させ、蛍光または酵素反応等によりＰＣＲ産物を確認する方法を採用してもよい。
【００２２】
以上で説明した本発明に係るインプランタ形質転換法により、上記で説明した一般的な形質転換法の問題点を解決することできる。また、本発明に係るインプランタ形質転換法により所望の外来遺伝子を発現するケナフ形質転換植物体をより簡便でかつ効率的に得ることができる。
【００２３】
本発明に係るインプランタ形質転換法において、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を用いた場合、ケナフ形質転換植物体は、茎が太くなるという表現型を示す。アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は、唯一ｉａａＭ遺伝子だけが変異しており、Ｔ−ＤＮＡ領域に存在するサイトカイニン生合成に関わる遺伝子を含む全ての他の遺伝子はそのままである。従って、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって誘導されたケナフ形質転換植物体は、高レベルのサイトカイニンを合成することが考えられる。これによりホルモンバランスに支障をきたし、形質転換されたケナフ植物は茎が太くなるという表現型を示すと考えられる。上記で説明したようにアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株によって誘導されたケナフ形質転換植物体は、茎が太くなるという表現型を示すことから、産業的には１個体から大量の材料を得ることができる。このような理由から、例えばパルフ生産において上記ケナフ形質転換植物体はより良い材料となる。あるいは、上記ケナフ形質転換植物体は茎が太いことから頑丈で、天災に強い樹木となることができる。このことから、上記ケナフ形質転換植物体を植林することで、森林にとって代わることができると考えられる。
一方、ケナフ形質転換植物体を自家受粉させ、結実させる。このようにして、ケナフ形質転換植物体の遺伝子型を継いだ次の世代の種子を得ることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例にその技術的範囲が限定されるものではない。
【００２５】
実施例１．アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換
（１） ケナフ植物の生育
ケナフ植物（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｃａｎｎａｂｉｎｕｓ ｖａｒ． ａｏｋａｗａ ｎｏ．３）の種子を４粒ずつ２つの植木鉢（φ２３ｃｍ， 赤玉土：バーミキュライト（１：１））に播種し、照度３０，０００ ｌｕｘ、温度２０〜２５℃、および光周期：１０時間明期／１４時間暗期の条件下で生育した。播種後３ヶ月で約７０ｃｍに成長したケナフ植物を形質転換に使用した。
【００２６】
（２） アグロバクテリウム・ツメファシエンスの調製
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で１８時間培養した。次いで菌体を遠心分離により回収し、水で洗浄した。洗浄後、１．０ ｘ １０８ 菌体／ｍｌの濃度に菌体を水で懸濁し、これを接種懸濁液とした。
【００２７】
（３） アグロバクテリウム・ツメファシエンスによるケナフ植物のインプランタ形質転換
上記のケナフ植物の茎の上部３５ｃｍを切除し、６〜７枚の葉が付いた基部約３５ｃｍの植物を残した。この時点では葉柄と茎の連結部には腋芽は全く見られなかった。腋芽が茎と葉柄の付け根に観察されるまで、該植物を３日間生育した。茎の上部に現れた２〜３個の腋芽を、針（φ０．７１ｍｍ）で各腋芽あたり２〜３点穿設し、穿孔を穿設した。一方の植木鉢の植物においては、上記接種菌懸濁液を浸した綿棒によって、腋芽の穿孔にアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株を接種した（以下、「形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
一方、比較のため、異なるケナフ植物に対しては、水で浸した綿棒によって、腋芽の穿孔に水を接種した（以下、「非形質転換植物体（Ｔ０）」と呼ぶ）。
【００２８】
次いで、腋芽が約３ｃｍの長さになるまで、形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）を３〜４日間生育した。３〜４日間の生育後、最上部の１つの腋芽を残し、残り全ての腋芽を切除し、形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）を成木まで生育した。また、形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）をそれぞれ自家受粉させ、結実させた。次いでそれぞれ形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）から得られた種子を、無作為に７粒ずつ選び、上記（１）に記載した生育条件下で生育した。以下、それぞれ生育した植物体を形質転換植物体（Ｔ１）および非形質転換植物体（Ｔ１）と呼ぶ。
【００２９】
実施例２．ケナフ形質転換植物体と非形質転換植物体との表現型の差異
形質転換から１年後の形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）の茎の写真を図２に示す。さらに上記の形質転換植物体（Ｔ０）および非形質転換植物体（Ｔ０）の茎の太さを以下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
図２より、形質転換植物体（Ｔ０）の４個体のうち、３個体の茎が非形質転換植物体（Ｔ０）と比較して太くなったことが視覚的に分かる。また表１より、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）との茎の直径の差異は、統計的に有意なものであった。他の形質及び外観上の違いは、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）の間で見られなかった。
【００３２】
また、種子を播種して２ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）および非形質転換植物体（Ｔ１）の写真を図３に示す。さらに種子を播種して３ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）および非形質転換植物体（Ｔ１）の茎の太さを以下の表２に示す。
【００３３】
【表２】
図３より、形質転換植物体（Ｔ１）は、非形質転換植物体（Ｔ１）と比較して、背が高く大きく、かつ茎が太いように外観上顕著に異なることが分かる。また表２より、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）との茎の直径の差異は、約１．５倍であり、統計的に有意なものであった。このように形質転換植物体（Ｔ０）の表現型は、形質転換植物体（Ｔ１）に遺伝された。
【００３５】
実施例３．ケナフ形質転換植物体からのアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の遺伝子の検出
（１） ケナフ形質転換植物体からのゲノム ＤＮＡ の単離
Ｎｕｃｌｅｏｎ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造元のプロトコルに従い、上記の非形質転換植物体（Ｔ０）、形質転換植物体（Ｔ０）、非形質転換植物体（Ｔ１）および形質転換植物体（Ｔ１）の上部にある若い葉（０．０５ｇ）からそれぞれゲノムＤＮＡを抽出した。次いで抽出されたゲノムＤＮＡを、ＲＮＡａｓｅで３７℃、４５分間、その後プロテイナーゼＫで５５℃、１６時間処理した。次にゲノムＤＮＡ溶液をフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）溶液およびクロロホルムで抽出した。最後にゲノムＤＮＡに対してエタノール沈澱を行い、水１００μｌに溶解した。このように調製されたゲノムＤＮＡサンプルをアガロースゲルで電気泳動し、ＤＮＡの純度と量をチェックした。
【００３６】
（２） Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ によるアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の遺伝子の検出
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株においては、Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子の１，０５５番目と１，０５６番目の塩基の間にＴｎ５が挿入されている（図１）。従って、図４に示されるように、トリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子とＴｎ５にまたがるＤＮＡ断片（１，４８８ｂｐ）を増幅するために、以下のｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲプライマーを設計した。
１回目のＰＣＲ用プライマー：
フォワードプライマー：５’−ＡＡＧ ＡＣＣ ＴＡＡ ＴＣＣ ＧＧＣ ＧＴＴ ＴＣ−３’（配列番号１）
リバースプライマー：５’−ＴＧＡ ＧＣＧ ＴＧＡ ＴＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＧＴ−３’（配列番号２）
２回目のＰＣＲ用プライマー：
フォワードプライマー：５’−ＧＡＧ ＴＡＧ ＴＣＴ ＴＴＣ ＣＧＴ ＣＴＣ ＡＧ−３’（配列番号３）
リバースプライマー：５’−ＡＧＧ ＴＴＣ ＣＧＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＣＧＣ ＴＡ−３’（配列番号４）
【００３７】
１回目のＰＣＲでは、上記のように調製したゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ）を、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭ ｄＮＴＰ、それぞれ０．２μＭの１回目のＰＣＲ用プライマーおよび０．６３ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造）からなる最終容量２５μｌの反応混合物に加えた。ＰＣＲは、最初９４℃で１分間の変性を行い、次いで９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で１分間（アニーリング）、および７２℃で１分間（伸長）からなるサイクルを４０回繰り返し、その後７２℃で７分間の伸長を行った。
【００３８】
２回目のＰＣＲでは、１回目のＰＣＲ反応液２μｌを鋳型とし、２回目のＰＣＲ用プライマー用いたこと以外は、１回目の条件と同様にしてＰＣＲを行った。２回目のＰＣＲ反応液１０μｌをアガロースゲル（１％）電気泳動に供し、臭化エチジウムで染色し、ＰＣＲ産物を確認した。また、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡを鋳型とし、上記の２回目のＰＣＲ条件でＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を陽性対照とした。
【００３９】
非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図５に示す。図５のパネル（ａ）および（ｂ）の各レーンは、以下の通りであった：パネル（ａ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜８：それぞれ異なる非形質転換植物体（Ｔ０）に由来するゲノムＤＮＡ、およびパネル（ｂ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜８：それぞれ異なる形質転換植物体（Ｔ０）に由来するゲノムＤＮＡ。
【００４０】
図５に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異型のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５とトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子にまたがる約１．５ｋｂＤＮＡ断片が、形質転換植物体（Ｔ０）の４個体全てから検出された。一方、非形質転換植物体（Ｔ０）から該ＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００４１】
また非形質転換植物体（Ｔ１）と形質転換植物体（Ｔ１）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図６に示す。図６のパネル（ａ）および（ｂ）の各レーンは、以下の通りであった：パネル（ａ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜１１：それぞれ異なる非形質転換植物体（Ｔ１）に由来するゲノムＤＮＡ、およびパネル（ｂ）、レーン１：ＤＮＡサイズマーカー、レーン２：鋳型なし、レーン３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の全ＤＮＡ（陽性対照）、レーン４：鋳型なし、レーン５〜１１：それぞれ異なる形質転換植物体（Ｔ１）に由来するゲノムＤＮＡ。
【００４２】
図６に示されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異型のＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５とトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子にまたがる約１．５ｋｂＤＮＡ断片が、形質転換植物体（Ｔ１）の７個体の内、６個体から検出された。一方、非形質転換植物体（Ｔ１）から該ＤＮＡ断片は検出されなかった。
【００４３】
これらの結果により、実施例２で示した形質転換植物体（Ｔ０）の表現型が、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株に由来するＴｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域に起因することが示された。また、形質転換植物体（Ｔ０）の遺伝子型が形質転換植物体（Ｔ１）に高い頻度で伝わることが示された。
【００４４】
実施例４．ケナフ形質転換植物体におけるアグロバクテリウム・ツメファシエンスの存在の検証
形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）において、生存するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株が存在するか否かを検証した。
まず対照実験を行った。非形質転換植物体（Ｔ０）の上部にある若い葉を用いて、以下の処理を供した４サンプルを調製した。
サンプル１：非滅菌。
サンプル２：７０％エタノールに３分間浸漬した後、水で３回洗浄。
サンプル３：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の懸濁液（１．０ ｘ １０３ 菌体／ｍｌ）で減圧浸潤した後、水で１回洗浄。
サンプル４：アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株の懸濁液（１．０ ｘ １０３ 菌体／ｍｌ）で減圧浸潤した後、水で１回洗浄し、さらに７０％エタノールに３分間浸漬した後、水で３回洗浄。
【００４５】
ここで「減圧湿潤」とは、植物をアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液に浸して弱い陰圧下に起き、懸濁液の植物の内部への浸透を図ることによる形質転換法である。
【００４６】
上記の全てのサンプルを、滅菌水中で無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で３日間培養した。なおこの条件下でアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は増殖できる。
【００４７】
結果として、サンプル３および４のプレートには、多数のコロニーが現れた。また、サンプル１のプレートには、数個のコロニーが出現した。しかしながら、サンプル２のプレートには、コロニーは全く見られなかった。この結果より、７０％エタノールによる葉表面の滅菌では、葉組織中のアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は死滅しないことが判明した。
【００４８】
次に、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）の上部にある若い葉を、それぞれ上記のサンプル２と同様の処理に供した。次いで、処理に供した葉を滅菌水中で無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で３日間培養した。
その結果、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）に由来する双方のサンプルのプレートには、コロニーが全く見られなかった。
【００４９】
また、形質転換植物体（Ｔ０）から得られた種子を、１．７％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で２０分間滅菌し、その後無菌状態で発芽させた。生育した幼植物を、無菌状態でホモジナイズし、次いでホモジネートをカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）とリファンピシン（１０μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地中で２８℃で３日間培養した。その結果、プレート上には全くコロニーは見れなかった。
【００５０】
以上から、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）において、生存するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株は存在しなかった。また実施例３で検出されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株由来のＴ−ＤＮＡ領域は、形質転換植物体（Ｔ０）および形質転換植物体（Ｔ１）のゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡ領域に由来するものであることが判明した。
【００５１】
【発明の効果】
本発明により、ケナフ植物の形質転換体をより簡便でかつ効率的に得られるケナフ植物のインプランタ形質転換法が提供される。従って、本発明により、経済上及び農業上付加価値を有するケナフ植物が得られる。
【００５２】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株のＴ−ＤＮＡ領域におけるＴｎ５の挿入部位の構造を示す。
【図２】図２は、形質転換から１年後の形質転換植物体（Ｔ０）と非形質転換植物体（Ｔ０）の茎の写真を示す。
【図３】図３は、種子を播種して２ヶ月後の形質転換植物体（Ｔ１）と非形質転換植物体（Ｔ１）の写真を示す。
【図４】図４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株Ｔｉプラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域にあるトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子とＴｎ５にまたがるＤＮＡ断片（１，４８８ｂｐ）、および該ＤＮＡ断片を増幅するｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ用のプライマーの対応する位置を示す。図中、ｉａａＨはインドールアセトアミドヒドロラーゼを意味し、ｉａａＭはトリプトファンモノオキシゲナーゼ遺伝子を意味する。
【図５】図５は、非形質転換植物体（Ｔ０）と形質転換植物体（Ｔ０）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
【図６】図６は、非形質転換植物体（Ｔ１）と形質転換植物体（Ｔ１）に由来するＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を示す。
Claims (6)
- ケナフ植物の腋芽の傷にアグロバクテリウム・ツメファシエンスを接種することを特徴とする、ケナフ植物のインプランタ形質転換法。
- ケナフ植物の茎の上部を切除し、腋芽を突出させる工程を含む、請求項１に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。
- 前記腋芽に傷をつける工程を含む、請求項１または２に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。
- 前記傷が穿孔である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。
- 接種するアグロバクテリウム・ツメファシエンスがアグロバクテリウム・ツメファシエンスＭ２１変異株である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。
- 前記接種がアグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を塗布することである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のケナフ植物のインプランタ形質転換法。
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