WO2004038012A1 - Couche de cellules nourricieres pour la culture in vitro de cellules souches embryonnaires humaines et methode de culture de cellules souches embryonnaires - Google Patents

Couche de cellules nourricieres pour la culture in vitro de cellules souches embryonnaires humaines et methode de culture de cellules souches embryonnaires Download PDF

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WO2004038012A1
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embryonic stem
culture
cell layer
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Changqing Xie
Ge Lin
Guangxiu Lu
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Hunan Hui-Lin Life Technology Co. Ltd
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
    • C12N2502/1323—Adult fibroblasts

Definitions

  • the present invention relates to a feeder cell layer for in vitro culture of human embryonic stem cells, and a method for culturing human embryonic stem cells in vitro using the feeder cell layer.
  • Human ES cells are a type of stem cells isolated from human early embryos and able to remain undifferentiated under appropriate conditions in vitro. It has the potential to differentiate into all cellular tissues of the body (totipotency of differentiation), and can be used as "seed cells".
  • seed cells One can obtain a large number of different types of cells from induced ES cells to differentiate into cells for cell transplantation, tissue replacement, and Organ cloned cell donors provide an unlimited source of cells for future treatment of many refractory diseases in humans. Therefore, it has broad prospects in future clinical applications, which is the main future use of human ES cells.
  • Other uses of human ES cells include:
  • Human ES cells can provide normal human cells of any tissue type, provide a large number of specimens for the development of new drugs, and can be used to screen drugs, identify target gene sites for new drug effects, and select genes for tissue regeneration gene therapy.
  • mice embryonic fibroblasts have basically used mouse embryonic fibroblasts (mEFs) as the feeder cell layer.
  • mEFs mouse embryonic fibroblasts
  • the latter can be secreted by cytokines and ES cells come into direct contact to act on ES cells, keeping cultured ES cells in an undifferentiated state. Therefore, in culture, human ES cells are in direct contact with mEFs, and mEFs have possible unknown pathogens. This factor will be a major obstacle in the future application of human ES cells, especially in clinical applications. Therefore, people are gradually trying to use feeder-free culture systems to replace mouse feeder culture systems. Human embryonic stem cells have been used as a word feeder to isolate human embryonic stem cells without success (Reference 11).
  • the technical scheme of the present invention is: using human fibroblasts as feeder cells for human embryonic fetal stem cells cultured in vitro.
  • the above-mentioned human fibroblasts are preferably obtained from human aborted fetuses or adult foreskins.
  • One of the extraction methods is:
  • the total irradiation dose when irradiating fibroblasts with Y-rays was 32-35G.
  • the conditions for treating cells with mitomycin C are: mitomycin C concentration is 1 mg / ml, ( 02 concentration is 5%, 37 ° C, 2.5 hours.
  • human fibroblasts need to be subcultured.
  • the culture method is-after 3-5 days of cell confluence, the old medium is removed and washed with PBS to eliminate the effect of serum on trypsin in the waste medium.
  • shaking the culture dish may cause the cells to clump and be digested. Under normal circumstances, these cells are unbreakable, which is not conducive to cell passage. If the digestion is slightly worse, shaking the culture dish will help digestion. If the digestion effect is too poor, you need to add another amount of enzyme to digest. It becomes round at the edges of most cells and can be added to fresh media to neutralize the effects of digestive juices. Passage 1: 3--5. Generally, the solution needs to be changed once before passage or freezing.
  • the resulting human fibroblasts need to be cryopreserved.
  • the freezing of fibroblasts without irradiation or drug treatment should not be too thin. Due to the toxic effect of DMS0 on cells, Immediately afterwards, transfer to a 70 ⁇ deep-freeze refrigerator. It needs to be transferred to liquid nitrogen for long-term storage within one week.
  • Human fibroblasts are long and fibrous, arranged in a fence, spiral, or intersect (see Figure 1). The generation number of human-derived fibroblasts can be higher, and we reached the eighth generation in use. And mouse fibroblasts can only be used in passages 2-3. Generally speaking, human-derived feeder cells can grow for a longer period of time, generally reaching about 14 days. This is longer than when mouse embryonic fibroblasts are used as a feeder layer, the latter gradually shed and died after about 7 days in culture. If this time cannot be reached, the quality of the feeder cells should be suspected.
  • fibroblasts When preparing to feed cells, fibroblasts must grow well: the cell growth density is 70%-90% of the confluence of growth, and most of the cells are strip-shaped or cord-shaped, and no special or abnormal cells appear. We have observed that human fibroblasts have a distinct long cord-like shape and that the cells proliferate faster.
  • the invention provides a new method for in vitro culture of human embryonic stem cells, that is, ES cells are transplanted and cultured on the feeder cell layer obtained according to the above method.
  • the culture method and conditions can be according to the methods provided in the prior art.
  • the culture medium can be selected from KNOCK-OUT DMEM + KN0CK-0UT SR and DMEM + fetal bovine serum
  • KNOCK-OUT DMEM + KN0CK-0UT SR is more suitable for human ES cells to grow on human-derived word culture cells than DMEM + fetal bovine serum.
  • human fibroblasts have been successfully used as word feeder cells, and human ES cells have been successfully passed on for 14 generations.
  • the undifferentiated state markers of human ES cells, SSEA-4, TRA-1-60 and The positive detection of AKP expression proves that human ES cells can maintain an undifferentiated state in this culture system, which fully solves the disadvantageous factors of mouse cells in the original culture system.
  • Human fibroblasts are elongated fibrous, arranged in a fence, spiral, or cross each other;
  • Figure 2 Human ES cells (40X) growing on the human fibroblast word feeder layer;
  • Figure 3 Alkaline phosphatase detection (100 X) of human ES cells: positive result is that the cell clones are stained red, and the fibroblasts are not colored;
  • Figure 6 The embryoid body (40X) formed by human ES cells
  • FIG. 7 OCT-4 expression detection of human ES cells: Linel: internal control with ⁇ -actin; Line2: internal control without RT; Line3: HES-1; Line4: HES-2. Examples
  • Human ES cells The 19th-generation cells isolated and cultured from human blastocysts in this laboratory;
  • ES cell culture medium 80% N0CK-0UT DMEM, 20% KNOCK-OUT serum substitute (SR, GIBC0-BRL company), ImM L-glutamine, ⁇ -mercaptoethanol, 1% non-essential amino acid (GIBC0-BRL) and human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, GIBC0-BRL); or 80% DMEM (high sugar), 20% fetal bovine serum (provided by GIBC0-BRL), ImM L-Valley Aminoamide, 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% non-essential amino acids (GIBC0-BRL) and human recombinant leukemia growth inhibitory factor (hLIF, Sigma);
  • Embryoid body culture medium 80% DMEM, 20% fetal bovine serum, ImM L-glutamine, 0.1 mM ⁇ -mercaptoethanol, 1% non-essential amino acids (GIBC0-BRL company);
  • Fibroblast culture medium 85% DMEM, 15% fetal bovine serum;
  • DMSO cryoprotective solution Set frozen n-tube fibroblasts (the amount of liquid in each frozen tube is 1ml), the total liquid volume is n ml, the required DMS0 amount is n / 10 ml, Likou Add 4n / 10ml fetal bovine serum, mix it, that is, the content of DMS0 is 20%. Resuspend the frozen cells with n / 2 ml of 10% fetal bovine serum DMEM, and then add the above 20% DMS0 solution.
  • Mitomycin C Use PBS solution to make a concentration of lmg / ml, and store at 4 ° C for later use.
  • Fetal tissues except visceral and head tissues obtained by artificial abortion, and the remaining tissues are immersed in a penicillin / streptomycin solution at a concentration of 20 times for 30 minutes. Rinse the residual tissue repeatedly with sterile saline or PBS. Transfer the residual tissue to a sterile Petri dish and add 0.25% trypsin / EDTA liquid (cover the dish Noodles), and cut the tissue pieces with sterile scissors; add digestion solution and digest at 37 ° C, 5% CO 2 environment for 5-10 minutes. Repeatedly blow the tissue block with a pipette to disperse the cells; add 5-10 ml of fibroblast culture medium to neutralize the digestive effect of the digestive juice.
  • the screw is long, and the lid of the freezer tube is unscrewed under the alcohol lamp. When the empty cells are cleared and the fine pieces are bubbled, the bacteria will be recorded to batch the large cell wall. In addition, add fibrillated spinner strips,% water-gas-liquid de-cultivation, cold cell six-rolling and suction, make sure that the mixture is small and small. Hours, four. Centrifuge at 800 rpm for 5-10 minutes.
  • the box will be thinner and thinner. , 3D or long-distance, the number of cultures or flasks. Add medium-thick tubule cells, multiple 3 ⁇ 4 thin and thin confluent 5% ⁇ C 00 2 culture
  • Cells are densely seeded when they are fine. After the application, the cell type is frozen and high, according to the cell preparation.
  • most of the E cells are bar-shaped or cable-shaped.
  • the cold cell entry states are as follows:,: ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ., Observe that human fibroblasts present ⁇
  • the colonization speed box is thin, and the two-hole frozen passage of pseudoporous cells is fast.
  • the preparation of the feeders and the feeders, the feeders, the feeders, and the feeders can be used as ES cells to culture cells.
  • ES cells undifferentiated detection Indirect immunofluorescence cytochemical method to detect. Separately lj uses anti-SSEA-1, anti-SSEA-4
  • FITC-labeled rabbit anti-mouse IgG (1:50) was used as secondary antibodies to detect cultured ES cell.
  • SSEA-1 and TRA-1-60 were fixed with 100% ethanol, and SSEA-4 was fixed with distilled water containing 90% acetone. After fixation, the non-specific antigen was blocked with normal goat serum, washed twice with PBS for 5 minutes each, added with primary antibody, incubated for 30 minutes, and washed twice with PBS for 5 minutes each. Add secondary antibody, incubate for 30 minutes, and wash twice in PBS. Observe the detection results of cell clones under a fluorescence microscope (450nm). SSEA-4 and TRA-1-60 (positive clones showed apple green under 450nm emission) were positive (see Figure 4-5), and SSEA-1 was negative. This indicates that ES cells grown on human feeder cell layers can remain undifferentiated.
  • GGAAAGGCTTCCCCCTCAGGGAAAGG (3 ') and AAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCC (5') are bows, annealed at 60 ° C, and detected by RT-PCR (see Figure 7). It is shown that human ES cells can maintain undifferentiated state when grown on human fibroblast feeder layer.
  • Embryonic stem cell lines from human blastocysts somatic differentiation in vitro. Nature Biotech 2000, 18 (4): 399-404.

Description

用于人类胚胎干细胞体外培养的饲养细胞层
以及培养胚胎干细胞的方法
技术领域
本发明涉及用于人类胚胎干细胞体外培养的饲养 细胞层，以及用该饲养细胞层体外培养人类胚胎干细胞 的方法。 背景技术：
人类胚胎干细胞 ( Embryonic stem cell, ES细胞） 的成功分离培养建系是当今生命科学的重要进展。 人 ES 细胞是从人类早期胚胎中分离而来的、 能在体外适 当条件下保持未分化状态的一种干细胞。它具有分化成 机体所有细胞组织的潜能 （分化的全能性）， 可以被用 来作为 "种子细胞 "， 人们可以从诱导 ES细胞定向分化 获得大量的不同类型的细胞来作为细胞移植、组织替代 和器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多的难治性 疾病提供了无限的细胞来源。因此在将来的临床应用中 前景广泛， 这是人 ES细胞将来的主要用途。 人 ES细胞 的其他用途包括：
1、 作为基因治疗的载体， 从而可以减少原先病 毒载体的潜在危害和提高基因治疗的安全性； 2、 可以作为研究哺乳动物发育生物学的模型。 ES 细胞体外分化过程中， 必然先经过一定的前体 细胞阶段。这为研究某些前体细胞的起源和特性提 供较为理想的实验体系，能定性甚至定量地研究某 些细胞因子、细胞外基质等因素对细胞生长和分化 的影响，避免和减少了整体胚胎研究中各种内源性 因素干扰的复杂性。
3、 药理研究： 人 ES 细胞可提供任何组织类型 的正常人类细胞， 为开发新药提供大量标本， 而且 可用于筛选药物、 鉴定新药作用的靶基因位点、 筛 选用于组织再生基因治疗的基因。
关于人类 ES细胞建系参见参考文献 1-11。
在目前公开的和体外常规培养的文献中， 研究者基 本上采用 了小 鼠早期胚胎分离的成纤维细胞 （ mouse embryonic fibroblast, 简称 mEFs) 作为伺养细胞层， 后者可以通过分泌细胞因子和与 ES细胞直接接触来作 用于 ES细胞， 保持培养的 ES细胞处于不分化的状态。 因此由于在培养中， 人 ES 细胞直接和 mEFs 接触， 而 mEFs存在着可能的未知病原体， 这种因素将是人类 ES 细胞的将来应用中， 特别是临床应用上的一大障碍。 因 此人们正在逐渐地试图采用无饲养层培养系统来取代 小鼠饲养层培养系统。曾经有采用人类输卵管上皮细胞 作为词养层来分离人类胚胎干细胞， 未能最终成功 （文 献 11)。 目前已经有研究釆用 mEFs 培养的条件化培养 基来培养人 ES 细胞 （文献 7)， 从而人 ES 细胞和 mEFs 不直接接触来满足将来的应用要求。但是正由于研究者 在培养过程中运用了 mEFs 培养过的培养基， 培养基和 mEFs 也直接接触过， 同样也会产生对其将来临床应用 安全性的疑问。因此还是有必要建立人源性的伺养细胞 的人 ES细胞培养体系。
另一方面， 人类成纤维细胞已经被人们广泛地用来 作为研究皮肤烧伤的愈合机理、 细胞膜的转运机理、 分 离细胞因子的实验材料，也被用来作为皮肤疤痕修复的 替代物，以及其他细胞如黑色素细胞等体外培养的饲养 细胞来提高所需细胞的体外生存率 （文献 12 19)。 发明内容
本发明的技术方案是： 采用人成纤维细胞作为人胚 胎干细胞体外培养的饲养细胞。
考虑到人组织的来源， 上述人成纤维细胞最好从人 类流产胎儿或成体包皮中获得。
分离提取方法之一是：
( 1 ) 将人残余组织浸泡在高浓度的抗生素液体 中；
( 2) '清洗后加入胰蛋白酶 /EDTA 液体， 在 5%C02 环境中消化；
( 3) 再加成纤维细胞培养液中和消化液的消化 作用 ；
( 4) 吸出上 细胞悬液， 在 5%C02环境中培养。 在分离得到的人成纤维细胞后， 最好用 Y -射线照 射成纤维细胞， 或者用丝裂霉素 C处理成纤维细胞。 其 目的是使增生活跃的成纤维细胞丧失有丝分裂能力。
Y -射线照射成纤维细胞时总照射剂量为 32- 35G。 用丝裂霉素 C 处理细胞的条件是： 丝裂霉素 C浓度 为 lmg/ml， （02浓度为 5%， 37°C , 2. 5小时。
为了得到大量的人成纤维细胞， 需要将人成纤维细 胞进行传代培养。 培养方法是- 培养 3- 5天后细胞生长汇合后， 去除旧培养基， 用 PBS洗涤以消除废旧培养基中血清对胰蛋白酶的影响。 用 0.25%胰蛋白酶 /EDTA, 37Ό下消化。 在消化的过程 中， 如果消化液的效果好， 摇动培养皿， 细胞有可能成 团成块被消化下来， 在一般情况下， 这些细胞是打不散 的， 不利于细胞的传代。 如果消化的稍差， 可摇动培养 皿， 将有助于消化。 如果消化的效果太差， 需另加入一 定量的酶来消化。 在大多数细胞边缘变得圆， 就可以加 入新鲜培养基中和消化液的作用。 以 1： 3- 5传代。 一般 在传代或冷冻前需换液一次。
在有些时候， 需要将所得到的人成纤维细胞冷冻保 存。 未经照射或药物处理的成纤维细胞的冷冻不宜过 稀。 由于 DMS0对细胞具有毒性作用， 在分装入冷冻管 后应立即转移到一 70 Ό深低温冰箱中 。在一周之内需将 之转移至液氮中长期保存。
不论是刚分离得到的人成纤维细胞还是经冷冻后 解冻的成纤维细胞， 最好通过捡测其状态， 来鉴别是否 适合作为饲养细胞层。
人类成纤维细胞形态为长条纤维状， 排列成栅栏 状、 螺旋状， 或互相交叉 （见图 1 )。 人源性的成纤维 细胞的使用代数可以较高， 我们在使用时达到了第八 代。 而小鼠的成纤维细胞仅能用第 2- 3 代。 一般来说， 人源性的饲养细胞生长时间较长， 一般可以达到 14 天 左右。这比小鼠胚胎成纤维细胞作为伺养层时的生长时 间更长， 后者大约在培养 7 天后， 细胞逐渐脱落死亡。 如果不能达到这种时间 ， 应该怀疑饲养细胞的质量。 准 备伺养细胞时， 成纤维细胞必须生长状态良好： 细胞生 长密度 70% — 90%的生长汇合度， 细胞大部分呈条形 或者索形， 未出现特殊或异形细胞。 我们观察到人成纤 维细胞呈明显的长条索状， 细胞增殖速度较快。
最好在进行处理前一天换液一次， 让细胞达到最好 的营养状态。在准备进行处理前的每批细胞需要排除细 菌和支原体污染 （细菌培养和支原体培养）。
本发明提供了 一种新的人胚胎干细胞体外培养方 法， 即将 ES 细胞移植在按上述方法得到的饲养细胞层 上迸行培养。其培养方法和条件可以依照现有技术中提 供的方法。培养液可以选自 KNOCK - OUT DMEM + KN0CK-0UT SR和 DMEM +胎牛血清
申 请 人 发 现 KNOCK-OUT DMEM+KN0CK-0UT SR 比 DMEM +胎牛血清更适合人 ES 细胞在人源性的词养细胞 层上生长
本发明 °成功采用人成纤维细胞作为词养细胞， 成功 地把人 ES 细胞在原来基础上继续传 14代， 人 ES 细胞 的未分化状态的标志性抗原 SSEA- 4、 TRA-1-60 和 AKP 的表达检测阳性， 证明在这培养系统中人 ES 细胞能够 保持不分化的状态，充分解决了原有培养系统中有小 鼠 细胞参与的不利因素。
附图说明 - 图 1 培养的人成纤维细胞 （ 100 X ) ：人类成纤维细 胞形态为长条纤维状， 排列成栅栏状、 螺旋状， 或互相 交叉；
图 2 生长在人成纤维细胞词养层上的人 ES 细胞 ( 40X )；
图 3 人 ES 细胞的碱性磷酸酶检测 （ 100 X ) ： 阳性 结果是细胞克隆被染成红色， 成纤维细胞词养层不着 色；
图 4 人 ES 细胞的 SSEA-4 抗原检测 （ 200 X ): 阳 性克隆在 450nm 的激发光下显现苹果绿色；
图 5 人 ES 细胞的 TRA- 1- 60 检测 （ 200 X )： 阳性克 隆在 450nm 的激发光下显现苹果绿色；
图 6 人 ES 细胞形成的拟胚体 （ 40X );
图 7 人 ES 细胞的 OCT- 4表达检测： Linel： β - actin 内 对 照 ； Line2： 无 RT 内 对 照 ； Line3 :HES-1 ； Line4:HES - 2。 实施例
材料
1、 人 ES 细胞： 本实验室从人类囊胚中分离培养并经 过鉴定的第 19代细胞；
2、 ES 细 胞 培 养 基 ： 80% N0CK-0UT DMEM， 20%KNOCK-OUT 血清替代品 ( SR, GIBC0 - BRL 公 司提供）， ImM 左旋谷氨酰胺， Ο. ΙπιΜβ -巯基乙醇， 1%非必需氨基酸 （ GIBC0- BRL公司 ） 和人类重组碱性 成纤维细胞生长因子 （ bFGF， GIBC0-BRL 公司 ）； 或 者 80%DMEM (高糖） ， 20%胎牛血清 ( GIBC0-BRL 公司 提供）， ImM 左旋谷氨酰胺， 0. ImM β -巯基乙醇， 1% 非必需氨基酸 （ GIBC0-BRL公司） 和人类重组白血病 生长抑制因子 （ hLIF， Sigma公司 ）；
3、 拟胚体培养基： 80%DMEM, 20%胎牛血清， ImM左旋 谷氨酰胺 ， 0. ImM β -巯基 乙醇 ， 1%非必 需氨基酸 ( GIBC0-BRL公司）；
4、 成纤维细胞培养基： 85%DMEM， 15%胎牛血清；
5、 . 10% DMSO冷冻保护液： 设定冷冻 n 管成纤维细胞 (每冷冻管所装的液体量为 1ml )， 总液体量为 n ml， 所需 DMS0量为 n / 10 ml, 力口入 4n/10ml 的胎牛血清， 混匀即 DMS0 的含量为 20% 。 用 n/2 ml 10%胎牛血 清的 DMEM重悬所需冷冻的细胞， 再加入上述含 20 % DMS0 的配液即可。
6、 配制 0.1%明胶： 称取一定明胶， 将明胶倒入清洗 干净带有盖子的玻璃瓶内 。 高压蒸气灭菌。 置 4°C温 度冰箱保存备用。
7、 丝裂霉素 C: 用 PBS 液体配成 lmg/ml 浓度， 4 °C 保存备用。
8、 Anti - SSEA - 1 单克隆抗体。
9、 Anti-SSEA-4 和 An t i -TRA- 1 -60 单 克 隆 抗 体 ( Sheffield大学的 Peter Andrews 教授惠赠）。
10、 FITC标记的兔抗小鼠 IgG。 方法
1、 人成纤维细胞分离：
1 ) 人工流产获取的胎儿组织 （除去内脏和头部组 织）， 残余组织浸泡在 20倍浓度的青霉素 /链霉素 液体中 30 分钟。 采用无菌生理盐水或者 P B S 反 复冲洗残余组织。 把残余组织转移到无菌培养皿 中， 加入 0.25%胰蛋白酶 /EDTA液体 （盖满皿的表 面）， 并用无菌剪将组织块剪碎； 再加消化液在 37 Ό， 5%C02环境中消化 5-10 分钟。 用吸管反复吹 打组织块， 分散细胞； 再加 5_10ml 成纤维细胞培 养液中和消化液的消化作用。 用吸管吹打均匀后， 将液体移到无菌离心管中静置 3-10分钟。 吸出上 层细胞悬液， 种植在无菌培养瓶或培养皿中。 37 °C， 5°/。C02环境中培养。 3- 4 天换液一次， 一般换 1/2-2/3液体。
2) 手术切除的成体包皮组织先浸泡在 20 倍浓度 的青霉素 /链霉素液体中 30 分钟。 采用无菌生理盐水 或者 P B S 反复冲洗。 把包皮组织转移到无菌培养皿 中， 加入 0.25%胰蛋白酶 / 0.53MEDTA液体， 存放在 4 °C冰箱中 15-24 小时。 把包皮组织移到培养皿中， 小 心分离表皮层并弃之。 再 PBS 清洗包皮的真皮片。 在 胶原酶中充分剪碎组织并在 37°C中消化 0.5-1.5 小 时。 用吸管反复吹打组织块， 分散细胞。 移细胞悬液 到无菌离心管中，静置 3- 10分钟，吸出上层细胞悬液， 移到无菌离心管中， 800 转 /分离心 5-10 分钟， 去上 清， 加入新鲜培养基， 用巴氏管吹打均匀后， 种植在 无菌培养瓶或培养皿中。 37°C， 5%C02环境中培养。 3 - 4 天换液一次， 一般换 1/2- 2/3液体。
2、 人成纤维细胞传代和冷冻复苏
1 ) 培养 3- 5天后细胞生长汇合后，去除旧培养基， 用 PBS 洗涤以消除废旧培养基中血清对胰蛋白酶的影 响。 加入 0.25%胰蛋白酶 /EDTA, 摇匀， 使消化液盖满 培养皿或培养瓶表面， 37°C消化。 在消化的过程中， 如果消化液的效果好， 摇动培养皿， 细胞有可能成团 成块被消化下来， 在一般情况下， 这些细胞是打不散 的， 不利于细胞的传代。 如果消化的稍差， 可摇动培 养皿， 将有助于消化。 如果消化的效果太差， 需另加 入一定量的酶来消化。 在大多数细胞边缘变得圆， 就 可以加入新鲜培养基 5-10ml 中和消化液的作用。用无 菌吸管吹打瓶壁或皿底细胞并混匀。 以 1 :3- 5 传代。 一般在传代或冷冻前需换液一次。
2) 如果需要冷冻， 消化的细胞悬液就移到无菌离 心管中， 以 800 转 /分离心 5- 10 分钟。 去上清液体， 加入新鲜培养基， 吹打均匀， 在加入等量的冷冻保护 液， 再混勾， 以 1ml 细胞悬液冷冻于一个无菌冷冻管 中 （ 2Ι 1)。 未经照射或药物处理的成纤维细胞的冷冻 不宜过稀。 由于 DMS0对细胞具有毒性作用， 在分装入 冷冻管后应立即转移到一 70 °C深低温冰箱中。 在一周 之内需将之转移至液氮中长期保存。 同时需做好标记： 细胞类型， 细胞代数， 细胞批号及冷冻时间等。
3) 纤维细胞的解冻： 加热水浴箱， 使水温恒定为 37-40 °C。 从液氮罐中迅速取出需解冻的细胞， 拧紧盖
显状换未％ 冻， 快速摇动 以加速解冻。 在 1 - 2 足子外养密量胶好分用维去去量细胶之胞贴需天化细细时的 X日 解冻后， 用 酒精抹洗冷冻管的 液、一的出 ^钟表上上培无细一度胞浸打加标扩期胞壁胞多细贴的· ,，内 1 3Λ
螺现一 S长 、 酒精灯下操 旋开冷冻管盖子， 入空养胞清清面细块增泡匀均会记菌来批大层胞壁时，内， 2 / 悬液吸入到 管内 ， 另加入成纤 类旋特条％水气液解培冷胞六匀卷吸 Λ确按混后小上 ，号细，。时，四。， 匀， 800 转 离心 5 - 10 分钟。
U成状殊索的。再加入成纤维
较浴养冻冻超起孔孔自置度管匀胞定常时生，，即 细胞培养; 匀， 再次离心 加 i纤，或状生入成纤维细胞培养液 充分混匀， 依冻存
^箱多然液总板板净将较细规可细。，3维或长异， 植的培养 或者培养瓶数。 加 中细管细胞胞，多台 ¾细细互汇形 5% ^C 002培养
高 ^燥，数接六胞类好冷地冻分察细根，
^胞相胞合细时密种孔。贴后铺胞型细冻高，据 细胞的准备
<
^增交形度胞态 长条纤维状， 排列成栅栏 用约度上板壁密则养胞过的，，当叉. 见图 1 )。 细胞生长密度 70 需 0培过加在状密2
度细此管时 E 胞大部分呈条形或者索形， 我须要 S温冻养少t
冷胞入态们细四，：、： ί观 明 ί .、 察到人成纤维细胞呈 ·
殖速度箱细 2孔冻传拟孔胞，，较快。 在进行处理前一天 作离包 ^、 集于离
养液，
总照射
( 2 y -射线照射后， ：； 4 /格边液贴冻细，培小细
分离心 61胞
于细胞 管小，液
种密度 离吸吸能时，，
冷其需冻管细条后除 养数数将求冻后胞几件作细明的
6
Figure imgf000008_0001
基此备饲离天交显饲代隆落养离细 S需分吹内 可以作为 ES 细胞大 培胞 o打要铺液心 ，
2 素 C 处理 细胞制备伺养
Figure imgf000009_0001
细胞 Ϊ均上酶分的四铺的满 80% 时， 可以 六孔板 60mm 培养
)
别
3 2打六 7部取作细，.5 小时 除处理液、' 加入 20 ml P 散孔 o一分用胞六
EDTA 消化细胞
3 消化情况， 当 形用密需。，的
时 .
纤 ，
细胞
贴壁
Figure imgf000009_0002
P
。 胞 培
37
胞
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5、 E S 的 性 ΑΚΡ) 检 |¾ 冷 80%乙醇 定 2-： 8 后 水 2 用新 配制的染料 染色， 在染色较满意时， 用蒸馏水洗 2遍， 再用 D- PBS 浸泡观察染色结果。 AKP 检测染色液： 25mg Fast Red TR+5mg α -萘酚 +44.6ml 蒸馏水 +0.3ml 10%MgCl2+5ml 4.5%硼酸钠。 大多数克隆在 AKP 阳性（阳性结果是细胞 克隆被染成红色， 成纤维细胞词养层不着色， 分化细胞 克隆亦不着色） （见图 3)。
6、 ES细胞未分化性检测： 采用间接免疫荧光细胞 化学方法来检测。分另 lj采用 anti—SSEA—l、 anti-SSEA-4
( 1:3-4) 和 anti- TRA- 1- 60,(1 :3- 4)做为一抗， 采用 FITC 标记的兔抗小鼠 IgG(l:50)作为二抗来检测培养 的 ES细胞。 其中 SSEA-1 和 TRA-1-60检测采用 100%乙 醇固定， 而 SSEA- 4检测采用含 90%丙酮的二蒸水固定。 固定后， 用正常山羊血清封闭非特异性抗原， 用 PBS 洗两遍， 每遍 5 分钟， 加入一抗， 孵育 30 分钟， PBS 洗两遍， 每遍 5 分钟。 加入二抗， 孵育 30 分钟， PBS 洗两遍。 在荧光显微镜下 （ 450nm) 观察细胞克隆的检 测结果。 SSEA- 4和 TRA-1-60 (阳性克隆在 450nm的激 发光下显现苹果绿色） 的检测上为阳性（见图 4-5)， SSEA- 1 检测为阴性。 说明在人饲养细胞层上生长的 ES 细胞能够保持不分化的状态。
7、 拟胚体制备：如常规传代人 ES细胞方法消化细 胞， 将人 ES细胞培养在无饲养细胞的细菌培养皿中。 培养基为拟胚体培养基。 我们发现： 人 ES细胞在脱离 饲养层后悬浮培养可以形成拟胚体 （见图 6)。
8、 OCT- 4 检 测 ： 采 用
GGAAAGGCTTCCCCCTCAGGGAAAGG ( 3' ) 和 AAGAACATGTGTAAGCTGCGGCCC ( 5' ) 为弓 ί ， 60°C退火， RT - PCR检测 （见图 7)。 表明在人的成纤维细胞饲养层 上生长，人 ES细胞能够保持未分化状态。
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Claims

权 利 要 求 、 用于人类胚胎干细胞体外培养的饲养细胞层是由 人成纤维细胞构成的。 、 根据权利要求 1 所述的用于人类胚胎干细胞体外 培养的词养细胞层， 其特征在于该人成纤维细胞是 从人类流产胎儿或成体包皮中分离的。 、 根据权利要求 1 或 2 所述的用于人类胚胎干细胞 体外培养的饲养细胞层， 其特征在于该人成纤维细 胞是通过如下步骤得到的：
( 1 ) 将人残余组织浸泡在高浓度的抗生素液体 中，·
( 2) 清洗后加入胰蛋白酶 /EDTA 液体， 在 5%C02 环境中消化；
( 3) 再加成纤维细胞培养液中和消化液的消化 作用；
( 4) 吸出上 细胞悬液， 在 5%C02环境中培养。 、 根据权利要求 1 至 3 之一所述的用于人类胚胎干 细胞体外培养的词养细胞层， 其特征在于用做词养 细胞层的人成纤维细胞的细胞生长密度 70% — 90% 的生长汇合度。
、 根据权利要求 1 至 3 之一所述的用于人类胚胎干 细胞体外培养的饲养细胞层， 其特征在于该人成纤 维细胞在用做饲养细胞前一天更换培养液一次。
、 根据权利要求 1 至 3 之一所述的用于人类胚胎干 细胞体外培养的饲养细胞层， 其特征在于该人成纤 维细胞是经过 Y -射线照射的。 7
、 根据权利要求 6 所述的用于人类胚胎干细胞体外 培养的饲养细胞层， 其特征在于 Y -射线总照射剂量 为 32 - 35G。
、 根据权利要求 1 至 3 之一所述的用于人类胚胎干 细胞体外培养的词养细胞层， 其特征在于该人成纤 维细胞是经过丝裂霉素 C处理的。
、 根据权利要求 8 所述的用于人类胚胎干细胞体外 培养的伺养细胞层， 其特征在于用丝裂霉素 C 处理 细胞的条件是： 丝裂霉素 C浓度为 lmg/ml， C02浓 度为 5%, 37°C， 2.5小时。
0、 人胚胎干细胞体外培养方法， 其特征在于选用权 利要求 1至 9之一所述的词养细胞层
1、 根据权利要求 10 所述的人胚胎干细胞体外培养 方 法 ， 其 特 征 在 于 培 养 液 选 自 KN0CK-0UT DMEM + KNOC -OUT SR和 DMEM +胎牛血清
2、 根据权利要求 11 所述的饲养细胞层体外培养人胚 胎干细胞的方法， 其特征在于培养液为 KN0CK-0UT DMEM+KNOCK-OUT SR。
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