WO2004036285A1 - 一細胞長期観察装置 - Google Patents

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WO2004036285A1
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observation
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Akihiro Hattori
Kenji Yasuda
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Sigma Koki Co., Ltd.
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    • G01N15/10—Investigating individual particles
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    • G02B21/24—Base structure
    • G02B21/26—Stages; Adjusting means therefor

Definitions

  • the invention of this application relates to a single-cell long-term observation device. More specifically, the invention of this application can be used in the field of biotechnology using microorganisms and cells, in which cells can be cultured on a cell-by-cell basis in a specific cell state, and this can be continuously observed and measured. It relates to a cell observation device. Background art
  • the average value of a cell population is determined as if it is a characteristic of one cell. I have observed it like this.
  • cells are rarely synchronized in the cell cycle in a population, and each cell expresses a protein at a different cycle.
  • techniques such as synchronized culture have been devised.However, since the origin of the cultured cells is not exactly the same, the gene Differences can create differences in protein expression, and when actually analyzing the results of a response to a stimulus / whether the fluctuations are due to the response fluctuations that the cell's reaction mechanism itself has in general.
  • the entire microscope was enclosed in a plastic container to control the temperature, and a small separate container was used to control the carbon dioxide concentration and humidity, while observing the microscope.
  • the circulating pump adjusts the level of the culture medium with respect to the substrate surface to a level higher than the upper edge height of the substrate and a level lower than the lower edge height of the substrate.
  • the nutrient status is maintained by the mechanism of raising and lowering the medium, supplying the medium when the level falls to the low level, and raising the level to the high level.
  • the culture vessel contains an introduction pipe for introducing a new medium into the culture vessel, a discharge pipe for discharging the culture medium from the culture vessel to the outside, and a Each end of the trachea communicating with the gas part and the pump is inserted, and a filter is provided in each of the introduction pipe, the discharge pipe and the trachea to prevent bacteria from entering the culture vessel.
  • the nutritional status is kept constant.
  • the inventors of the present application have solved these problems, selected a new specific cell, and cultured the cell as a cell line. Invented a technology to control environmental conditions and to maintain a constant cell concentration in a vessel, and a technology to culture and observe cells while identifying interacting cells.
  • the invention filed by the inventors is a step forward for solving the problems of the prior art, but continuously observes and measures a large number of microphone opening champers constructed on a substrate.
  • the means for Not enough consideration has been made. For example, this is not a problem if only one microchamber is continuously observed.
  • the focus is on. Since the observation position must be moved while performing high-magnification observations with a narrow range, a number of problems arise. For example,
  • the micro-chamber array may be lost due to the stage movement.
  • the substrate may be slightly distorted. Due to the slight change in the height of the substrate surface caused by the slight tilt of the substrate fixed on the microscope stage, the observation position should have been at the focal plane of the microscope when the observation position was moved by moving the stage. Problems such as the position of the micro-champer being out of focus and blurring depending on the observation position, and (iii) biological samples being damaged if white light is continuously applied for a long time for observation. Occurs.
  • the invention of this application solves the above-mentioned problems, and enables continuous observation and measurement of a plurality of micro-chamber arrays arranged in an arbitrary direction on a micro-chamber array substrate. It is an object of the present invention to provide an improved new one-cell long-term observation device that does not damage a sample.
  • a plurality of microphone opening champers arranged in an arbitrary direction on a microchamber array substrate are periodically moved in accordance with the arrangement direction.
  • the two axes of the XY stage are adjusted to match this angle.
  • a single-cell long-term observation apparatus having means for moving the apparatus in conjunction with each other, and means for tilting a camera for observation according to the angle.
  • the invention of this application is based on a phase difference method in which a microchamber is used to correct the shift of the focal position caused by the unevenness of the substrate.
  • Means for measuring the microscope using differential interference spectroscopy means for measuring the luminance distribution of the measured micro-chamber shape, and moving the focal point of the objective lens to the position where the gradient of the luminance distribution becomes the steepest Means for causing the
  • a long-term observation device for cells is provided.Third, the device has a means for limiting the wavelength of a light source for optical observation to a specific wavelength band in order to prevent a biological sample from being damaged by observation light, Provided is a one-cell long-term observation device having means for irradiating light only for a minimum time necessary for measurement.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a system configuration of the one-cell long-term observation device of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an arrangement of a microchamber array that can be actually used in the invention of this application.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of the micro-champer observation procedure of the invention of this application.
  • Figure 4 shows (1) a phase-contrast microscope image of the microchamber, (2) a sectional view taken along the line AA, and (3) a luminance distribution diagram along the line AA.
  • FIG. 5 is a diagram illustrating the luminance distribution on the substrate in more detail.
  • FIG. 1 schematically shows an example of the system configuration of the one-cell long-term observation device of the present invention.
  • Reference numeral 101 in the figure denotes a light source of a phase contrast microscope or a differential interference microscope, and a halogen lamp is generally used.
  • Reference numeral 102 denotes a band-pass filter that transmits only light having a specific wavelength from light of a light source for observation with a stereo microscope such as a phase difference. For example, when a sample such as a cell is used, damage to the sample can be prevented by using a narrow band near a wavelength of 700 nm.
  • Reference numeral 103 denotes a shutter, which has a function of blocking light irradiation when image measurement is not being performed, such as when the XY stage 105 is moved.
  • Reference numeral 104 denotes a condenser lens.
  • a phase difference ring is introduced for phase difference observation, and a polarizer is used for differential interference observation. Is introduced.
  • the substrate 100 on which the microchamber array is processed is placed on the XY stage 105, and the XY stage is moved by the drive device 119 to move the substrate on the substrate. Observe and measure different microphone mouth champers. The state of the cells in the microphone champer is observed with the objective lens 106.
  • the focal position of the objective lens 106 can be moved by the driving device 107.
  • the light from the 108 light sources is transmitted only through the excitation light wavelength by the bandpass filter 109, and the excitation light is applied to the sample only when observation is performed by the shutter 110. It is controlled.
  • the excitation light having passed through the shutter 110 is applied to the sample by the dichroic mirror 111.
  • what is observed by the objective lens is a phase contrast image or a differential interference image of the sample due to the light transmitted from the light source 101, and a fluorescent image emitted from the sample by the excitation light from the light source 108. is there.
  • the dichroic mirror 111 and the bandpass filter 111 reflecting the light of the same wavelength as that transmitted through the bandpass filter 102, only the phase contrast microscope image or the differential interference microscope image in the flow path is obtained. Observed by force Mera 1 1 5.
  • the light-receiving surface of this camera can be rotated in accordance with the tilt of the micro-chamber fixed on the XY stage so that it matches the tilt of the micro-chamber.
  • the fluorescence image must be selectively transmitted only through the wavelength band of fluorescence observation by the mirror 113 and the band-pass filter 116 of the light that has passed through the objective lens, and observed with the camera 117. I can do it.
  • the light-receiving surface of this camera 117 can be rotated according to the inclination of the microchamber in the same manner as the camera 115, so that it can match the inclination of the micro-chamber.
  • the phase difference image or differential interference image taken by the camera 1 15 is analyzed by the image processing unit 1 18 to detect the tilt of the microchamber based on pattern matching, move the XY stage, control the amount, or use the camera 1 It is possible to control the amount of rotation of the light receiving surface of 15 and 117, the height of the objective lens 106, the focusing, and the like.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of an arrangement of a micro-chamber array that can be actually used. In the example of FIG.
  • micro-chambers 202 are periodically arranged on a substrate 201. Then, for actual observation, the inside of the cell culture vessel 203 in each microchamper is observed at a high magnification.
  • the thickness of the substrate in contact with the objective lens is 0.2 mni or less.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating an example of a microchamber observation procedure.
  • the procedure for measuring the micro-chambers on the substrate which are almost visually aligned at the same position and angle, will be described in order.
  • the two axes of movement of the XY stage, the X-axis 311 and the Y-axis 31, are explained.
  • the observation area 301 recorded on the light receiving surface of the camera by the high-magnification objective lens is rotated by 0 to maximize the field of view. All micro-champers of the size used for observation can be observed in the field of view.
  • the movement amount L is a value previously used as the arrangement period of the microchamber array at the time of fabrication. Then, the movement amount X 1 of the stage in the X direction and the movement amount Y 1 of the stage in the Y direction are respectively expressed by the following equations;
  • the movement in the X-axis and Y-axis directions is linked, while the observation direction is changed by 90 degrees, for example, moving from the field of view 303 to the field of view 304 to the direction of the field of 106
  • the movement amount X 2 of the stage in the X direction and the movement amount Y 2 of the Y-axis direction move in conjunction with each other while maintaining the relationship of the following equation.
  • Fig. 4 (1) shows a phase-contrast microscope image of the micro-champer, (2) a sectional view taken along the line A-A, and (3) a luminance distribution diagram taken along the line A-A.
  • a schematic diagram of the A—A cross section is as shown in FIG. 4 (2), and the structure 4003 is placed on the substrate 402.
  • the structure 4003 is placed on the substrate 402.
  • the line 404 is the luminance distribution in the A-A section
  • the line 405 is the maximum luminance
  • the line 406 is the minimum luminance
  • the line 407 is the luminance at the position of the midpoint.
  • the gradient of the brightness distribution becomes the steepest when the focus is the best, and becomes gentler as the focus shifts.
  • FIG. 5 is a diagram showing the luminance distribution on the substrate in more detail.
  • the spatial distribution of luminance is as shown by the line 501, and at the midline 504 of the highest luminance 503 and the lowest luminance 502, the width 505 or 506 of the luminance distribution is represented by a microscope image. Since the minimum value is taken when the object is in focus, for example, by measuring the widths 505 and 506 by image processing, you can select the point where the value that changes with the movement of the objective lens becomes the minimum. It is possible to focus on the steepest position of the luminance distribution described above. In this example, a phase contrast microscope was used. Although the focus adjustment method has been described focusing on the width of the luminance distribution at the middle line of the image luminance distribution, the differential interference image can also be focused. The focus position can also be adjusted by directly measuring the slope of the luminance curve. Industrial availability

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Description

明 細 書 一細胞長期観察装置 技術分野
この出願の発明は、 一細胞長期観察装置に関するものである。 さらに 詳しくは、 この出願の発明は、 微生物や細胞を用いるバイオテクノロジ —の研究分野において、 特定の細胞の状態で一細胞単位で培養し、 これ を連続して観察、 測定することのできる、 一細胞観察装置に関するもの である。 背景技術
従来の生物学、 医学、 薬学の分野では、 細胞の状態の変化、 あるいは 細胞の薬物等に対する応答を観察するのに、細胞集団の値の平均値をあ たかも一細胞の特性であるかの様に観察してきた。 しかし、 実際には細 胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、 各々の細胞 が異なった周期でタンパク質を発現している。 これらの問題を解決する ベく、 同調培養等の手法が編み出されているが、 培養された細胞の由来 が全く同一の一細胞からではないことから、培養前の由来細胞各々の遺 伝子の違いがタンパク質発現の違いを生み出す可能性があり、実際に刺 激に対する応答の結果を解析するときに/そのゆらぎが細胞の反応機構 自体が普遍的に持つ応答のゆらぎに由来するものなのか、 細胞の違い (すなわち遺伝情報の違い） に由来するゆらぎなのか明らかにすること は難しかった。 また、 同様の理由から細胞株についても、 一般には完全 に一細胞から培養したものではないため、刺激に対する応答の再現性が 細胞各々の遺伝子の違いによってゆらぐものか明らかにするのは難し かった。 また、 細胞に対する刺激 （シグナル） は、 細胞周辺の溶液に含 まれるシグナル物質、 栄養、 溶存気体の量によって与えられるものと、 他の細胞との物理的接触によるものの 2種類がある。 従来、 バイオテク ノロジ一の研究分野において細胞の観察を行う場合は、大型培養器にて 培養された細胞群の一部を一時的に培養器から取り出して顕微鏡にセ ットし、 観察を行っていた。 あるいは、 顕微鏡全体をプラスチックの容 器で囲い温度を管理し、その中に小さい別の容器を用い二酸化炭素濃度、 及び湿度を管理しつつ、 顕微鏡観察を行っていた。 このとき、 細胞を培 養しながら、古くなつた培養液と新鮮な培養液を交換することで溶液条 件を一定にする方法として多数の発明がある。例えば特開平 1 0— 1 9 1 9 6 1に開示されている方法では、 循環ポンプが、 基材表面に対する 培地のレベルを基材の上端縁高さより高いレベルと下端縁高さより低 いレベルとの間で上げ ·下げ操作し、 上記低レベルに下がると培地を供 給し、上記高レベルに上がる.と培地を排出する機構によって栄養状態を 一定に保っている。 また、 特許公開平 8 - 1 7 2 9 5 6では、 培養容器 内に、 新たな培地を培養容器に導入する導入管と、 培養容器の培地を外 部に排出する排出管と、培養容器の気体部分とポンプとを連通する気管 の各一端を挿入し、 前記導入管、 排出管及び気管の夫々の管路に培養容 内への菌の侵入を阻止するフィルターを設けており、 培養槽の栄養状態 を一定に保つ構成になっている。 しかし、 いずれの発明の場合も、 培養 細胞の溶液環境と、 細胞間の物理的接触を制御しながら培養する公知例 は無い。 そこでこの出願の発明者らは、 これらの問題点を解決し、 新た に特定の一細胞のみを選択し、その一細胞を細胞株として培養する技術 や、 細胞を観察する場合に、 細胞の溶液環境条件を制御し、 かつ、 容器 中での細胞濃度を一定に制御する技術、 さらには、 相互作用する細胞を 特定しながら培養観察する技術を発明し、特願 2 0 0 0— 3 5 6 8 2 7 として出願した。 発明の開示
しかしながら、 上 発明者らの出願した発明は、 従来技術の問題の解 決に向けて大きく前進するものであつたが、基板上に構築した多数のマ イク口チャンパを連続的に観察し測定するための手段に関しては、 まだ 充分な検討が為されていなかった。 たとえば、 1つのマイクロチャンバ のみを継続して観察し続ける場合には問題にはならないが、基板上に構 築した多数のマイクロチャンバアレイを連続して光学的に観察する場 合には、 合焦点範囲が狭い高倍率の観察を行いつつ観測位置を移動させ なければならないため、 幾つもの問題が生じることになる。 たとえば、
( i ) ステージ上にステージの X軸、 Y軸方向に完全に揃えて固定でき なかった場合には、 ステージ移動によってマイクロチャンバァレイを見 失ってしまうこと、 （i i) 基板の微小なゆがみや、 顕微鏡ステージ上に 固定した基板の微小な傾きのために生じた微小な基板面の高さの変化 によって、 ステージ移動によって観測する位置を移動させたときに顕微 鏡の焦点面にあったはずのマイクロチャンパの位置が焦点外にずれて しまい観察位置によってはピントがぼけてしまうこと、 （i i i)観察のた めに長時間白色光を当て続けていると生体試料が損傷を受ける、 などの 問題が生じる。
そこで、 この出願の発明は、 上記の問題点を解消し、 マイクロチャン パアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイクロチャンパァレ ィを連続的に観察、 計測することができ、 しかも、 生体試料に損傷を与 えることもない、 改良された新しい一細胞長期観察装置を提供すること を課題としている。
この出願の発明は、 上記の課題を解決するものとして、 第 1には、 マ ィクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマイク口 チャンパをその配列方向に合わせて周期的に移動させて連続計測する ために、 前記基板を固定する X Yステージの 2つの軸方向と基板上のマ イク口チャンパアレイのなす角度を計測する手段と、 この角度に合わせ て X Yステージの 2つの軸を連動させて動かす手段と、 この角度に合わ せて観察するカメラを傾ける手段とを有する一細胞長期観察装置を提 供 る。
また、 この出願の発明は、 第 2には、 前記の基板の凹凸によって生じ る焦点位置のずれを補正するために、 マイクロチャンバを位相差法ある いは微分干渉法を用いて顕微鏡計測する手段と、 計測したマイクロチヤ ンバの形状の輝度分布を測定する手段と、 この輝度分布の傾きが最も急 峻になる位置に対物レンズの焦点位置を移動させる手段とを有する。一 細胞長期観察装置を提供し、 第 3には、 観察光によって生体試料に損傷 を与えることを防ぐために、光学観察をするための光源の波長を特定の 波長帯域に制限する手段を有し、 計測するために必要な最小限の時間の み光を照射する手段を有する一細胞長期観察装置を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 この出願の発明の一細胞長期観察装置のシステム構成の 1例 を示した模式図である。
図 2は、 この出願の発明で実際に用いることのできるマイクロチャン バアレイの配置の 1例を示した図である。
図 3は、 この出願の発明のマイクロチャンパ観察手順の 1例を説明し た図である。
図 4は、 （ 1) マイクロチャンバの位相差顕微鏡像と （2) その A— A断面図および （3) A— A断面における輝度分布図である。
図 5は、 より詳細に基板上の輝度分布を例示した図である。
なお、 図中の符号は次のものを示す。
1 0 0、 20 1、 402 基板
1 0 1, 1 08 光源
1 0 2、 1 09、 1 14、 1 1 6 バンドパスフィルタ
1 0 3、 1 1 0 シャッター
1 04 コンデンサレンズ
1 0 5 XYステージ
1 0 6 対物レンズ
1 0 7、 1 1 9 駆動装置
1 1 1、 1 1 2 ダイクロイツクミラー
1 1 3 ミラー 1 1 5、 1 1 7 カメラ
1 1 8 画像処理解析部
20 2、 40 1 マイクロチヤンパ
2 0 3 細胞培養容器
30 1、 30 2、 30 3、 304 マイクロチャンバの観察領域 3 0 5、 30 6 XYステージの移動量
3 1 1、 3 1 2 XYステージの移動軸
403 構造物
404、 50 1 A - A断面の輝度分布曲線
40 5、 50 3 最大輝度
406、 50 2 最小輝度
407、 504 最大輝度と最小輝度の中間値
40 8 構造物の輝度
40 9 基板の輝度
50 5、 506 最大輝度と最小輝度の中間値の幅 発明を実施するための最良の形態
この出願の発明は上記のとおりの特徴をもつものであるが、 以下にそ の実施の形態について説明する。
まず、 図 1は、 この出願の発明の一細胞長期観察装置のシステム構成 の 1例を模式的に示したものである。 図中の符号 1 0 1は位相差顕微鏡 あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、 一般にハロゲン系のランプが用 いられる。 1 0 2は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波 長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。 たとえば細胞等 の試料を用いる場合には、 波長 7 0 0 nm近傍の狭帯域の用いることで 試料'の損傷を防ぐことができる。 1 0 3はシャッターで、 XYステージ 1 0 5を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮 断する機能を有する。 1 04はコンデンサレンズであり、 位相差観察を する場合は位相差リングを導入し、 微分干渉観察をする場合は、 偏光子 を導入する。 1 0 5の X Yステージ上に載っているのはマイクロチャン バアレイが加工されている基板 1 0 0であり、 1 1 9の駆動装置によつ て前記 X Yステージを移動させることで前記基板上の異なるマイク口 チャンパを観察し、 計測することができるようにしている。 前記マイク 口チャンパ内の細胞の存在状態は、 対物レンズ 1 0 6で観察される。 対 物レンズ 1 0 6の焦点位置は駆動装置 1 0 7によって移動させること ができる。 また、 蛍光観察のために、 1 0 8の光源からの光をバンドパ スフィルタ 1 0 9によって励起光波長のみ透過させ、 シャッター 1 1 0 によって観察するときのみ励起光が試料に照射されるように制御され ている。そしてシャッター 1 1 0を通過した励起光はダイクロイツクミ ラー 1 1 1によって試料に照射される。 このとき対物レンズで観察され るのは、光源 1 0 1から透過された光による試料の位相差像あるいは微 分干渉像と、 1 0 8の光源からの励起光によって試料が発した蛍光像で ある。前記パンドパスフィルタ 1 0 2を透過するのと同波長の光を反射 するダイクロイツクミラー 1 1 2およびバンドパスフィルタ一 1 1 4 によって、 流路内の位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみが力 メラ 1 1 5によって観察される。 このカメラの受光面は、 X Yステージ 上に固定されたマイクロチヤンバの傾きに応じて回転させ、 マイクロチ ヤンバの傾きに一致させることができる。 他方、 蛍光像は、 対物レンズ を通過した光のうちミラー 1 1 3およびバンドパスフィルタ一 1 1 6 によって、 蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、 カメラ 1 1 7 で観察することができるようにしている。 このカメラ 1 1 7の受光面も カメラ 1 1 5と同様にマイクロチャンバの傾きに応じて回転させ、 マイ クロチャンパの傾きに一致させることができる。 カメラ 1 1 5で撮った 位相差像あるいは微分干渉像は、 画像処理部 1 1 8において解析され、 たとえばパターンマッチングに基づくマイクロチャンバの傾きの検出、 X Yステージの移動.量の制御、 あるいはカメラ 1 1 5および 1 1 7の受 光面の回転量の制御、 あるいは対物レンズ 1 0 6の高さ制御、 ピント合 わせ等を行うことができるようにしている。 図 2は、実際に用いることのできるマイクロチヤンバアレイの配置の 1例を示した図である。 この図 2の例においては、 基板 2 0 1上にマイ クロチャンパ 2 0 2が周期的に配列されている。 そして、 実際の観察に は、高倍率で各マイクロチャンパ内の細胞培養容器 2 0 3の内部を観察 する。 ここで、 光学顕微鏡の最高倍率である 100倍 （開口数 1. 35) を用 いる場合には、対物レンズに接する基板の厚さは一般的に 0. 2mni以下で あることが望ましい。
図 3は、マイクロチャンバの観察手順の 1 例を説明した図である。一 般に、 基板を X Yステージ上に固定する場合、 治具を工夫しても薄い基 板を固定することから、 完全に位置と角度を制御することは難しい。 そ こで目視でほぼ位置と角度を合わせた基板上のマイクロチャンパァレ ィを順番に計測する手順を説明すると、 X Yステージの 2 つの移動軸、 X軸 3 1 1と Y軸 3 1 に対してなす角 Θでマイクロチヤンバが配列 している基板について、 まず、 高倍率の対物レンズによってカメラの受 光面に記録される観察領域 3 0 1は、 0だけ回転させることで、 視野を 最大に利用した大きさのマイクロチャンパをすベて視野内において観 察することができる。 マイクロチャンバの視野 3 0 1を観察した後は、 隣のマイクロチヤンパの視野 3 0 2に移動量 3 0 5で移動させる。 この とき移動量 L はあらかじめ製作時にマイクロチャンバアレイの配列周 期として用いられた値である。 すると、 ステージの X方向の移動量 X 1 と、 Y方向の移動量 Y 1とは、 それぞれ次式；
X 1 = L cos Θ
Y 1 = L s in 0
で定められ、 この関係を維持しながら X軸と Y軸方向の移動は連動する 他方、 観察方向を 9 0度変えて、 たとえば視野 3 0 3から視野 3 0 4 に 3 0 6の方向に移動して一段下の行のマイクロチャンパを観察する ためには、 ステージの X方向の移動量 X 2と Y軸方向の移動量 Y 2は次 式の関係を維持して連動して移動する。
X 2 = L s in 0 Y 2 = L cos θ
図 4 ( 1 ) に、 マイクロチャンパの位相差顕微鏡像と （2 ) その Α— A断面図および（3 ) A— A断面における輝度分布図を示す。 図 4 ( 1 ) のマイクロチャンバ 4 0 1の位相差顕微鏡写真において、 その A— A断 面の模式図は図 4 ( 2 ) のようになり、 基板 4 0 2上に、 構造物 4 0 3 がマイクロチャンバの形状になるように付加されている。 ここで、 水中 で構造物内の形状を観察する場合、実体顕微鏡を用いると構造物の厚さ および水との吸収の違いの大きさによつて観察が難しいことがある。 こ れは、 光の吸収が光の通過する物体の厚さに依存するためであり、 マイ クロ加工品のような厚さ 1マイクロメ一トル程度の光の波長程度の厚 さのものに対しては十分なコントラストが得られないことによる。 また、 ゼラチンゃァガロースといつた含水量の多い物質などは、 ほとんど水と 屈折率も吸収も同じため十分なコントラストを得るのは難しい。 したが つて従来の実体像の微分処理に基づいてコントラストを求める画像の ピント合わせの機構を用いるのは難しい。 図 4 ( 3 ) の位相差顕微鏡画 像の A— A断面の輝度分布図を見てもわかるように、構造の境界面にお いて輝度が大きく変化し、 構築物上の輝度 4 0 8と基板 （単独） 上の位 置の輝度 4 0 9の平均値はおおむね同じであることがわかる。 ただし。 ここで、 線 4 0 4は A— A断面の輝度分布、 線 4 0 5は最高輝度、 4 0 6は最低輝度、 4 0 7はこれらの中点の位置の輝度である。 輝度分布の 傾きはピントが最も合ったとき最も急峻な分布となり、 ピントがずれる にしたがってなだらかな傾きとなる。
図 5は、 より詳細に基板上の輝度分布を示した図である。 輝度の空間 分布は線 5 0 1のようになり、最高輝度 5 0 3と最低輝度 5 0 2の中線 5 0 4において、 その輝度分布の幅 5 0 5あるいは 5 0 6は、 顕微鏡画 像のピントが合ったときに極小値をとることから、 たとえば画像処理に よって幅 5 0 5、 5 0 6を計測し、 対物レンズの移動に伴って変化する 値が極小になるところを選べは、先に述べた輝度分布の最も急峻な位置 にピントを合わせることができる。 なお、 この実施例では位相差顕微鏡 像の輝度分布の輝度の中線における幅に着目してピントを合わせる手 法を示したが、 微分干渉像でも同様にピントを合わせることができる。 また、 直接輝度曲線の傾きを計測することでピント位置を合わせること もできる。 産業の利用可能性
以上詳述したように、 この出願の発明によって、 微小なマイクロチヤ ンバが配列した基板上の複数のマイクロチャンバを連続観察すること が可能となる。

Claims

請求の範囲
1 . マイクロチャンバアレイ基板上の任意の方向に配列した複数のマ ィクロチャンパをその配列方向に合わせて周期的に移動させて連続計 測するために、 前記基板を固定する X Yステージの 2つの軸方向と基板 上のマイクロチヤンバァレイのなす角度を計測する手段と、 この角度に 合わせて X Yステージの 2つの軸を連動させて動かす手段と、 この角度 に合わせて観察するカメラを傾ける手段とを有することを特徴とする 一細胞長期観察装置。 .
2 . 基板の凹凸によって生じる焦点位置のずれを補正するために、 マ ィクロチャンバを位相差法あるいは微分干渉法を用いて顕微鏡計測す る手段と、 計測したマイクロチヤンパの形状の輝度分布を測定する手段 と、 この輝度分布の傾きが最も急峻になる位置に対物レンズの焦点位置 を移動させる手段とを有することを特徴とする請求項 1の一細胞長期
3 . 観察光によって生体試料に損傷を与えることを防ぐために、 光学 観察をするための光源の波長を特定の波長帯域に制限する手段を有し、 計測するために必要な最小限の時間のみ光を照射する手段を有するこ とを特徴とする請求項 1または 2の一細胞長期観察装置。
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