CN107254406B - 生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置及筛选系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像及筛选系统，该成像装置包括样本台、光源组件、一级成像组件、二级成像组件和探测器，一级成像组件通过共光轴成像的方式对生物细胞芯片的细胞岛阵列区域在第一成像面整体完成第一次成像，第一成像面上的第一次成像图像包括以阵列形式隔开布置的第一孔有效区域；二级成像组件通过分光路成像的方式对各第一孔有效区域在探测器的探测面上分别完成第二次成像，探测器的探测面上的第二次成像图像包括以阵列形式隔开布置的第二孔有效区域，并且相邻两第二孔有效区域的间隙由二级预设放大倍率确定。发明可实现对生物细胞芯片各孔有效区域的无间隙成像，最大化相机像素的利用率，由此开展高通量、高内涵、并行成像和筛选。

Description

生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置及筛选系统

技术领域

本发明涉及成像技术领域，特别是涉及一种生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置及筛选系统。

背景技术

术语解释：“高通量”对应的是“大视场”，“高内涵”对应的是“高分辨率”，“并行”对应的是的“多孔同步”成像。

高通量高内涵筛选技术是指在保持细胞结构和功能完整性的前提下，同时检测样品对细胞形态、生长、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节的影响，确定其生物活性和潜在毒性。与蛋白等分子水平筛选相比，细胞水平的筛选免去了对靶标蛋白的纯化，使靶标蛋白的构象及所处的环境更接近天然的生理状态。因此，高内涵筛选技术已经是药物筛选、功能基因的筛选以及生命科学其它研究必不可少的研究工具。其中，近年来发展最快、最有应用前景的技术是细胞芯片。

细胞芯片中的细胞生长在具有微纳米结构的器件上，与此同时，各种化学、生物、机电等不同种类刺激可以按照某种时空可控方式作用于细胞，其效果可以通过观察细胞的形态或者内在信号变化来表征。细胞芯片发展得益于细胞生物学本身和微纳米技术的进步。一方面，细胞的种类、数目乃至甚至生长维度等培养技术不断地成熟，推动着多细胞芯片、3D培养芯片，甚至器官芯片的发展。更重要的是，细胞芯片可以充分发挥细胞这一生物体基本的结构和功能单位的特点，使得诸多细胞生物学成熟技术，如免疫荧光、RNAi技术、CRISPR/Cas9等靶向基因编辑技术等可以整合使用，极大地提高研究效率。另一方面，微纳米器件结构和功能的不断多样化，使得芯片上的细胞的生长微环境更像体内，与此同时，光机电等信号的刺激和检测也极大地丰富细胞的干预研究乃至表征效率。其中，最具有代表性的工作就是斯坦福大学的Steven Quake开发的微流控芯片技术。与其它高通量筛选技术一样，细胞芯片技术也有各自的优缺点。需要根据研究目的、细胞种类、转染效率等诸多因素做出最优选择，同时也需要在通量与准确性两个相互矛盾的参数中做出妥协选择。理想筛选情况当然是高通量及高准确性兼顾。筛选通量容易理解，准确性主要是指芯片上细胞相对于人体体内对应细胞的生理和病理状态差别。最后就是，与细胞芯片整合使用的干扰技术或者检测方法的兼容程度和方便程度。前面提到的多细胞芯片、器官芯片和微流控芯片等现有细胞芯片技术，甚至未来一段时间该方向的发展趋势，将无一不是围绕提高通量、准确性等这些要素展开。

由于化合物在分子量、亲水-憎水性等方面存在巨大差异，在评估它们药效的同时，又要控制点之间交叉污染是非常有挑战性的工作，因此，化合物芯片一直是细胞芯片领域的难点。早在2004年，MIT的David M.Sabatini教授和哥伦比亚大学Brent R.Stockwell实验室就开始尝试过利用可降解材料包被不同化合物来制备化合物芯片。2008年，加州大学伯克利分校Douglas S.Clark和伦斯勒理工学院Jonathan S.Dordick实验室，进一步将细胞和化合物混合点印在芯片上。由于这些芯片加工复杂、假阴性太高，很难大规模推广使用。

天然产物一直是新药研发的重要源泉。美国FDA的数据显示，1981-2010期间获得批准的小分子化合物药物有超过三分之一是天然产物或其衍生物；而基于组合化学技术虽然得到海量化合物，但是30年来获FDA批准的创新药物却只有一个。更为重要的是，天然产物比合成化合物具有更加广泛的类似药物的化学结构，它们生物相关化学空间(biologically relevant chemical space,as described by protein fold topology)远远优于合成化合物，而且80％以上的核心环状结构在合成化合物中是不存在的。化学小分子药物研发效率不断降低，从上个世纪60年84个/年，到2010年下降了60％。主要原因在天然产物成份复杂且绝大部分有效组分含量普遍偏低，导致现有高通量筛选评估技术效率低下。基于蛋白亲和力筛选的方法，需要先获得纯化的小分子文库，工作量大、效率低下、成本高；基于细胞表型筛选的方法，则有药物靶点不清楚、假阳性高等缺点。因此，合理、有效挖掘天然来源活性成分急切需要新的筛选评估策略和新的技术。

市场有大量的国外厂商提供高通量、高内涵、并行成像仪器，来满足大通量基于细胞成像的细胞筛选产品，但是还没有专门用于细胞芯片进行高分辨率成像的高内涵成像设备。现有商业化高内涵系统多采用单个普通显微物镜的小视场成像，通过视场扫描以及多视场图像拼接实现整个样品的全视场成像，主要适用于Society for BiomolecularScreening(SBS)标准商业化多孔板为样品进行成像和图片分析。这些仪器也不适合细胞芯片的成像，其主要问题在于：

(1)成像视场小，需要移动视场多次成像完成成像。

(2)动力学实验样品之间不具有平行可比性。通过每个孔内进行多次扫描和图像拼接，孔与孔之间有明显的时间差(十几分钟到数小时不等)，无法对样品的动力学变化(如细胞的钙离子信号的药物触发变化，线粒体膜电位的动力学改变)进行同步并行观察。

(3)分辨率和样品平行性不可兼顾，必须通过降低分辨率提高每个视场的成像速度来减少孔与孔之间的时间差，或牺牲孔间成像的可比性和时间差来提高分辨率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置来克服或至少减轻现有技术的上述缺陷中的至少一个。

为实现上述目的，本发明提供一种生物细胞芯片高通量高内涵成像装置，所述生物细胞芯片高通量高内涵成像装置包括样本台、光源组件、一级成像组件、二级成像组件和探测器，其中：所述样本台用于放置经荧光标记的生物细胞芯片，所述生物细胞芯片具有多个隔开布置的孔，各所述孔中的细胞岛在所述生物细胞芯片上形成细胞岛阵列区域；所述光源组件用于向所述生物细胞芯片上的一个细胞岛阵列区域投射环形照明光和同轴激发光；所述一级成像组件通过共光轴成像的方式对所述生物细胞芯片上的细胞岛阵列区域在第一成像面整体完成第一次成像，所述第一成像面上的第一次成像图像包括以阵列形式隔开布置的第一孔有效区域，每一个所述第一孔有效区域为所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域的相应所述孔被放大一级预设放大倍率后的图像区域；所述二级成像组件通过分光路成像的方式对各所述第一孔有效区域在所述探测器的探测面上分别完成第二次成像，所述探测器的探测面上的第二次成像图像包括以阵列形式隔开布置的第二孔有效区域，每一个所述第二孔有效区域为所述第一孔有效区域被放大二级预设放大倍率后的图像区域，并且相邻两所述第二孔有效区域的间隙由所述二级预设放大倍率确定。

进一步地，所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置还包括控制器，所述控制器包括图像接收模块、对焦模块和孔径对齐模块，其中：所述图像接收模块用于接收所述第二次成像图像，并输送给所述对焦模块和孔径对齐模块；所述对焦模块用于根据所述第二次成像图像判断所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，以控制所述样本台沿光轴平移运动；所述孔径对齐模块用于根据所述第二次成像图像上的第二孔有效区域的中心与所述探测器的探测面上标定的第二孔有效区域的中心是否对齐，当判定为未对齐时生成孔径对齐指令并输出，以控制所述样本台围绕光轴旋转和/或在垂直于光轴的平面内平移运动。

进一步地，所述控制器还包括扫描成像模块，所述扫描成像模块用于控制所述样本台平移运动，使所述光源组件发出的照明光和激发光投射到所述生物细胞芯片上的另一细胞岛阵列区域。

进一步地，所述控制器还包括扫描成像模块，所述扫描成像模块用于控制所述样本台平移运动，使所述光源组件发出的照明光和激发光投射到所述生物细胞芯片上的一个细胞岛阵列区域，并通过所述图像接收模块接收所述第二次成像图像，并根据所述第二次成像图像判断所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，以控制所述样本台沿光轴平移运动。

进一步地，所述二级预设放大倍率为所述生物细胞芯片的孔的占空比的倒数。

进一步地，所述一级成像组件包括大口径显微物镜和聚焦成像，其中：所述大口径显微物镜的放大倍率为所述一级预设放大倍率，且位于所述生物细胞芯片的下方，穿过所述生物细胞芯片的玻璃基底倒置成像所述生物细胞芯片上的各个细胞岛，所述光源组件中的照明光源位于所述大口径显微物镜和所述生物细胞芯片之间，所述光源组件中的激光光源发出的同轴激发光通过所述大口径显微物镜投射到所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域，所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域中的细胞小岛受激发后产生发射光并依次经由所述大口径显微物镜和聚焦成像，以所述一级预设放大倍率成像在所述第一成像面上。

进一步地，所述一级成像组件还包括二向色分光片和聚焦透镜，其中：所述光源组件发出的同轴激发光依次经由所述聚焦透镜和二向色分光片，所述二向色分光片的反射光通过所述大口径显微物镜投射到所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域，所述生物细胞芯片的细胞岛阵列区域中的细胞小岛受激发后产生发射光依次经由所述大口径显微物镜、二向色分光片和聚焦成像，在所述第一成像面上成像。

进一步地，所述二级成像组件包括小口径放大镜阵列，所述小口径放大镜阵列由以阵列形式布置的小口径放大镜构件组成，每一所述小口径放大镜构件的放大倍率为所述二级预设放大倍率，每一所述小口径放大镜构件的光轴与所述第一成像面上相应的所述第一孔有效区域的中心对齐，以对相应的所述第一孔有效区域以所述二级预设放大倍率成像在所述第二成像面上。

进一步地，所述小口径放大镜构件包括多片共轴镜片及其外部封装的圆柱形遮光套管，用于固定物方工作距离、像方工作距离、物方成像视场、像方成像视场、二级预设放大倍率以及工作波段的荧光成像。

进一步地，多组所述二级放大倍率各异的所述二级成像组件以转轮的方式安装在机架上。

本发明还提供一种生物细胞芯片筛选系统，所述生物细胞芯片筛选系统包括如上所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置。

由于本发明将生物细胞芯片的细胞岛阵列区域朝上放置在定制培养皿中用培养液浸没，采用同轴均匀光照明生物细胞芯片的各细胞岛，首先利用一级成像组件以共轴成像的方式完成第一次放大成像，整个生物细胞芯片等比例放大一级预设放大倍率，然后利用二级成像组件以分光路成像方式完成第二次放大成像，由此可实现对生物细胞芯片各孔有效区域的无间隙成像，最大化相机像素的利用率，由此开展高通量、高内涵、并行成像和筛选，这不仅有利于中国新药研发水平的整体提升，也将为肿瘤医学的大力发展提供强有力的技术支持。

附图说明

图1是本发明所提供的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置的一优选实施例的原理意图。

图2是图1中的控制器的结构示意图。

图3是本发明所提供的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置的另一优选实施例的结构意图。

图4是图3中的第一次成像面上的图像示意图。

图5是图3中的第二次成像面上的图像示意图。

图6为图3中的装载生物细胞芯片的培养皿与大口径显微物镜之间的布置关系示意图。

具体实施方式

在附图中，使用相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面结合附图对本发明的实施例进行详细说明。

在本发明的描述中，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明保护范围的限制。

如图1至图3所示，待成像的生物细胞芯片2正面具有多个隔开布置的孔21，即孔阵列。每一个孔21的直径大小为200至500微米，通过微加工工艺刻蚀得到。本实施例中的待研究的生物细胞芯片2是自组装细胞-化合物芯片，其细胞通过自组装方式在芯片表面上，即在孔21中形成细胞岛，各孔21中的细胞岛在生物细胞芯片2上形成细胞岛阵列区域。每一细胞岛下面的化合物将缓释到细胞岛中的细胞，从而影响细胞岛的细胞生长、凋亡等行为，利用本实施例所提供的生物细胞芯片高通量高内涵成像装置采集每个孔21中细胞的形态，进行数据分析。采集过程中的生物细胞芯片2被浸没在培养液5中。生物细胞芯片2可以是自组装细胞-化合物生物芯片，其制作方法为现有技术，在此不展开描述。

本实施例所提供的生物细胞芯片高通量高内涵成像装置包括样本台7、光源组件1、一级成像组件3、二级成像组件4和探测器6，其中：

样本台7能够进行多维度调节，用于放置经荧光标记的生物细胞芯片2。本实施例中，定义的样本台坐标系具体为：原点为样本台7放置样本的中心，Z轴为样本台7的放置样本的表面的法线，XY平面为放置在样本台7上的样本的正面所在的平面。多维度调节样本台7的目的是为了将样本台坐标系的Z轴位于一级成像组件3的光轴上，放置在样本台7上的样本的正面位于一级成像组件3的景深内。

光源组件1包括激光光源11和照明光源12，其中：激光光源11向经荧光标记的生物细胞芯片2的一个细胞岛阵列区域投射同轴照激发光，用于暗场荧光成像。激光光源11各参数可根据需要被激发的荧光标记物进行选用。照明光源12临近样本设置，呈环状，向经荧光标记的生物细胞芯片2的正面投射环形照明光，用于明场白光成像。“细胞岛阵列区域”指的是上文提到的“各孔21中的细胞岛在生物细胞芯片2上形成细胞岛阵列区域”，“一个细胞岛阵列区域”指的是下文提到的规格为N×M阵列的细胞岛构成的区域。生物细胞芯片2的尺寸各异，有的生物细胞芯片2仅包含一个细胞岛阵列区域，也有的生物细胞芯片2包含多个细胞岛阵列区域。生物细胞芯片2即下面所说的物方视场，包含多个细胞岛阵列区域的生物细胞芯片2可以视为较大的物方视场。

受探测器6的像素所限以及显微物镜(下文的大口径显微物镜32)的物方视场设计所限，在所需物方视场较大的情形下，采用探测器6仅能够获取物方大视场的部分区域的图像(比如下面提及具有N×M阵列的细胞岛阵列区域)，在需要获取更大物方视场所有区域的图像的时候，则需要采用扫描方式，在完成一个具有N×M阵列的细胞岛阵列区域成像之后，进行另一个具有N×M阵列的细胞岛阵列区域成像，该扫描成像的方法在后文将进行详细描述，在此首先选用具有N×M阵列的细胞岛阵列区域为物方视场，来说明本实施例高通量高内涵成像的工作原理。

一级成像组件3通过共光轴成像的方式对生物细胞芯片2上的细胞岛阵列区域在第一成像面31整体完成第一次成像，也就是说，一级成像组件3对生物细胞芯片2上的细胞岛阵列区域整体完成成像，获取的第一次成像图像为生物细胞芯片2上的细胞岛阵列区域的整体放大图。

具体地，如图4所示，第一成像面31上的第一次成像图像包括第一孔有效区域3a和第一孔无效区域3b，其中：

每一个第一孔有效区域3a为生物细胞芯片2的细胞岛阵列区域的相应孔21被放大一级预设放大倍率后的图像区域，也就是说，第一孔有效区域3a是用于成像观测的生物细胞芯片2上的各个细胞岛所在的区域。第一次成像图像上的各第一孔有效区域3a以N×M阵列形式在第一次成像图像上隔开布置，与生物细胞芯片2上的各个孔21的直径和间隔的比例相同。

第一孔无效区域3b指的是第一次成像图像除去第一孔有效区域3a之外的区域。

本实施例目的在于在探测器6的探测面上最大化去除第一孔无效区域3b，确保每个第一孔有效区域3a能够均分探测器6的探测面上的像素。

鉴于此，如图5所示，二级成像组件4通过分光路成像的方式对各第一孔有效区域3a在探测器6的探测面上分别完成第二次成像，通过二级成像组件4对第一次成像图像中的每一个第一孔有效区域3a分别进行放大成像。探测器6的探测面上的第二次成像图像包括第二孔有效区域4a和第二孔无效区域4b，每一个第二孔有效区域4a为第一孔有效区域3a被放大二级预设放大倍率后的图像区域。第二次成像图像上的各第二孔有效区域4a以N×M阵列形式在第二次成像图像上隔开布置，与生物细胞芯片2上的各个孔21的直径和间隔的比例不同，并且，相邻两第二孔有效区域4a的间隙由所述二级预设放大倍率确定。第二孔无效区域4b指的是第二次成像图像除去第二孔有效区域4a之外的区域。

优选地，在所述二级预设放大倍率为生物细胞芯片2的孔21的占空比的倒数的情形下，相邻两第二孔有效区域4a的间隙可以控制为0，那么此时能够将N×M阵列的孔21的生物细胞芯片2同时成像在一个探测器6的探测面上，并最大化去除了生物细胞芯片2上的无效成像区域，确保每个第二孔有效区域4a能够均分探测器6的探测面上的像素。

例如：生物细胞芯片2的孔21的大小为10×10mm，其上的孔21是按照10×10的阵列数进行排布，其上的各细胞岛的尺寸为250um，需要物方1um有效分辨率，采样分辨率需要0.5um。若仅采用共光轴显微成像，需要探测器6的像素为20000×20000像素，并且由于孔无效区域的存在，其中的有效像素仅为5000×5000像素，更不可能的是，现在市场上的像素为20000×20000探测器并不存在。但是，如果采用本实施例中提供的一级成像组件3和二级成像组件4两次放大处理，并且二级成像组件4采用但采用分光轴显微成像的方式分别各个第一孔有效区域3a进行放大成像处理，那么仅需要成像像素为5000×5000探测器即可。

在一个实施例中，所述生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置还包括控制器8，控制器8包括图像接收模块81、对焦模块82和孔径对齐模块83，其中：图像接收模块81用于接收所述第二次成像图像，并将所述第二次成像图像输送给对对焦模块82和孔径对齐模块83。

对焦模块82用于根据所述第二次成像图像判断生物细胞芯片2正面是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，以控制样本台7沿光轴平移运动，即沿样本台7的Z轴进行升降调节，将放置在样本台7上的生物细胞芯片2的物面位于一级成像组件3的景深内。

孔径对齐模块83用于根据所述第二次成像图像上的第二孔有效区域4a的中心与探测器6的探测面上标定的第二孔有效区域4a的中心是否对齐，当判定为未对齐时生成孔径对齐指令并输出，以控制样本台7围绕光轴旋转和/或在垂直于光轴的平面内平移运动。或者说，在第二次成像图像上的第二孔有效区域4a的中心与探测器6的探测面上标定的第二孔有效区域4a的中心未对齐的情形下，控制样本台7围绕Z轴在XY平面内旋转，也可以控制样本台7在在XY平面内平移。

孔径对齐模块83判定为未对齐时生成孔径对齐指令的方法具体包括：

通过拍摄生物细胞芯片2上的N×M阵列的细胞岛阵列区域的明场白光图像，计算各个孔21中的细胞岛的孔径中心，匹配探测器6上标定的各孔径中心位置，通过几何变换关系和目标函数优化方法，迭代计算出最优的样本台7的整体Z轴旋转量和x/y轴平移量，样本台7的整体Z轴旋转量和x/y轴平移量为相应的孔径对齐指令。

在一个实施例中，控制器8还包括扫描成像模块84，扫描成像模块84用于控制样本台7平移运动，使光源组件1发出的照明光和激发光投射到生物细胞芯片2上的另一N×M阵列的细胞岛阵列区域。

通过该实施例，在物方视场较大的情形，比如具有生物细胞芯片2具有两个并排的标准区域，每一个标准区域包含一个细胞岛阵列区域(N×M阵列的孔21)，那么需要控制样本台7在XY平面内平移，从一个标准区域切换到另一个标准区域，那么光源组件1发出的照明光和激发光从一个标准区域投射到另一个标准区域，以对另一个标准区域进行高通量高内涵成像。同样地，在样本台7沿X轴和/或Y轴发生倾斜的情形下，在将样本台7在XY平面内平移，即从一个标准区域切换到另一个标准区域的时候，需要重新启用对焦模块82进行对焦，以使得放置在样本台7上的生物细胞芯片2的物面位于一级成像组件3的景深内。

在一个实施例中，控制器8还包括扫描成像模块84，扫描成像模块84用于控制样本台7平移运动，使光源组件1发出的照明光和激发光投射到生物细胞芯片2上的另一N×M阵列的细胞岛阵列区域，并通过图像接收模块81接收所述第二次成像图像，并根据所述第二次成像图像判断生物细胞芯片2正面是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，以控制样本台7沿光轴平移运动。

在该实施例中，扫描成像模块84可以在将从一个标准区域切换到另一个标准区域的时候，光源组件1发出的照明光和激发光从一个标准区域投射到另一个标准区域，按照上述一样的方式接收所述第二次成像图像，并根据所述第二次成像图像判断生物细胞芯片2正面是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，扫描成像模块84根据预先标定的样本台7沿X轴和/或Y轴发生倾斜的倾斜角度以及样本台7在XY平面内实际平移量，计算得到样本台7沿Z轴的升降量，并依据该升降量调节样本台7。

上述的“预先标定的样本台7沿X轴和/或Y轴发生倾斜的倾斜角度”可以采用如下方法获得：

在样本台7的初始化自校准时，通过使用一块刻蚀有精细网格结构(线宽1μm，膜厚20nm)的参考玻片，在明场照明下完成预设的多轴运动并同时进行成像，通过图像处理和直线拟合精确标定出各运动轴的空间位置和误差，驱动各运动轴完成校正。上述校正中，Z轴旋转需要达到0.2毫弧，tip/tilt倾斜需要达到0.1毫弧的精度。

在生物细胞芯片2载入的初始化对准时，使用明场照明成像，通过所述第二次成像图像进行图像配准计算Z轴旋转量，通过依次对焦成像生物细胞芯片2四个角的刻蚀十字丝(线宽1μm，线长200um，膜厚20nm)可计算出生物细胞芯片2沿X轴和/或Y轴发生倾斜的倾斜角度。

当然，在该实施例中，样本台7沿Z轴的升降量也可以通过初始化标定参数计算直接给出校正量。

在一个实施例中，控制器8还包括时序控制模块85，时序控制模块85主要用于控制激光光源11、照明光源12以及样本台7的的工作时序。

在一个实施例中，如图3所示，一级成像组件3包括大口径显微物镜32和聚焦成像35，其中：大口径显微物镜32的放大倍率为所述一级预设放大倍率，且位于生物细胞芯片2的正面，光源组件1中的照明光源12位于大口径显微物镜32和生物细胞芯片2之间，光源组件1中的激光光源11发出的同轴激发光通过大口径显微物镜32投射到生物细胞芯片2上的细胞岛阵列区域，细胞小岛22受激发后产生发射光并依次经由大口径显微物镜32和聚焦成像35，以所述一级预设放大倍率成像在第一成像面31上。

聚焦成像35是Tube透镜，由于物面任意一点经过物镜之后成为平行光，再经由聚焦成像35会聚在第一成像面31上，聚焦成像35的焦距是固定预设值，用来确保大口径显微物镜32的放大倍率。

如图6所示，生物细胞芯片2浸没在培养皿中的培养液5中，生物细胞芯片2的细胞岛阵列区域朝上放置，大口径显微物镜32位于生物细胞芯片2的下方，使用时，光能够穿过生物细胞芯片2的玻璃基底，倒置成像生物细胞芯片2上的各个细胞岛。

大口径显微物镜32的放大倍率为所述一级预设放大倍率，该一级预设放大倍率与物方视场、数值孔径和放大倍率相关，其中，物方视场是成像需求直接决定的。数值孔径是由成像需求中物方分辨率决定的，关系式是分辨率＝0.61*波长/数值孔径。放大倍率为总放大率除以二级预设放大倍率后的值，其中的总放大率是由成像需求的物方分辨率和相机像元尺寸决定的，关系式是：总放大率＝2×像元/物方分辨率。二级预设放大倍率是根据生物细胞芯片2实际有效区域的占空比来设计的。比如：大口径显微物镜32设计加工为大口径(直径约70mm)宽视场2.5倍显微物镜，匹配聚焦成像35完成第一次放大成像，由于是共光轴成像，因此整个生物细胞芯片2的正面等比例放大2.5倍。

在一个实施例中，一级成像组件3还包括二向色分光片33和聚焦透镜34，其中：光源组件1中的照明光源12临近样本设置，向经荧光标记的生物细胞芯片2的细胞岛阵列区域投射环形照明光，在生物细胞芯片2的细胞岛阵列区域形成的漫反射光线依次经由大口径显微物镜32、二向色分光片33和聚焦成像35，以所述一级预设放大倍率成像在第一成像面31上。光源组件1中的激光光源11发出的同轴激发光依次经由聚焦透镜34和二向色分光片33。二向色分光片33采用的是二向色分光平片，按光谱段分光，即反射光源组件1发出的激发光，通过所述大口径显微物镜32投射到生物细胞芯片2的细胞岛阵列区域，同时使得生物细胞芯片2的细胞岛阵列区域的细胞小岛22受激发后产生发射光依次经由大口径显微物镜32、二向色分光片33和聚焦成像35，在第一成像面31上成像。聚焦透镜34是激光会聚透镜，将激发光尽可能会聚至显微物镜的出光口，从而在物面上构成大视场均匀激发光场。

在一个实施例中，二级成像组件4包括小口径放大镜阵列，所述小口径放大镜阵列由以N×M阵列形式布置的小口径放大镜构件42组成，每一小口径放大镜构件42的放大倍率为所述二级预设放大倍率，每一所述小口径放大镜构件42的光轴与第一成像面31上相应的所述第一孔有效区域3a的中心对齐，以对相应的第一孔有效区域3a以所述二级预设放大倍率成像在第二成像面41上。

所述二级预设放大倍率仅由生物细胞芯片2上的细胞岛的占空比决定。举例来说：若生物细胞芯片2上的细胞岛直径250um，相邻岛间隔1mm，水平/竖直方向占空比均为25％，此时所述二级预设放大倍率确定为4倍；若细胞岛直径500um，相邻岛间隔2mm，水平/竖直方向占空比仍为25％，此时所述二级预设放大倍率确定还是4倍；若细胞岛直径400um，相邻岛间隔1mm，水平/竖直方向占空比变为40％，此时所述二级预设放大倍率则可以确定为2.5倍。为了匹配生物细胞芯片2上的细胞岛的占空比的不同，可以设置多组二级放大倍率各异的二级成像组件4以转轮的方式安装在机架上，以提高本实施例成像装置的通用性。

比如图3中示出的10×10阵列形式布置的小口径放大镜构件42，即100个直径约2.5mm的4倍小口径放大镜构件42排布成10×10阵列分别对各孔有效区域进行第二次放大成像，由于是分光路成像，由此可实现各孔有效区域的无间隙排布，最大化相机像素的利用率。

在一个实施例中，每个小口径放大镜构件42包括多片共轴镜片及其外部封装的圆柱形遮光套管，用于固定物方工作距离、像方工作距离、物方成像视场、像方成像视场、二级预设放大倍率以及工作波段的荧光成像。

本发明解决了成像生物细胞芯片2时由于孔面稀疏排列造成的大量无效像素和扫描耗时长的问题，显著提高了筛选的时间分辨率和并行通量。本发明能够一次成像10×10mm区域，经10倍放大后成像在探测器6的探测面上，并能以80Hz的帧频连续拍摄记录。举例说明，相比于现有的细胞芯片筛选系统，若成像40×40mm区域，在同样的放大倍率和同款相机下，现有系统需要256次扫描成像，本发明只需16次扫描成像，单帧图像的有效通量高出16倍，共节省了240次扫描成像耗时。

本发明还提供一种生物细胞芯片筛选系统，所述生物细胞芯片筛选系统包括上述各实施例所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置。使用时，通过所述生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置并行成像各个细胞岛内细胞的荧光信号分布及其动力学变化，从而计算评估指标和完成筛选，该计算评估指标和完成筛选的方法为现有技术，在此不再展开描述。

最后需要指出的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。本领域的普通技术人员应当理解：可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，包括样本台(7)、光源组件(1)、一级成像组件(3)、二级成像组件(4)、探测器(6)和控制器(8)，其中：

所述样本台(7)用于放置经荧光标记的生物细胞芯片(2)，所述生物细胞芯片(2)具有多个隔开布置的孔(21)，各所述孔(21)中的细胞岛在所述生物细胞芯片(2)上形成细胞岛阵列区域；

所述光源组件(1)用于向所述生物细胞芯片(2)上的一个细胞岛阵列区域投射环形照明光和同轴激发光；

所述一级成像组件(3)通过共光轴成像的方式对所述生物细胞芯片(2)上的细胞岛阵列区域在第一成像面(31)整体完成第一次成像，所述第一成像面(31)上的第一次成像图像包括以阵列形式隔开布置的第一孔有效区域(3a)，每一个所述第一孔有效区域(3a)为所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域的相应所述孔(21)被放大一级预设放大倍率后的图像区域；

所述二级成像组件(4)通过分光路成像的方式对各所述第一孔有效区域(3a)在所述探测器(6)的探测面上分别完成第二次成像，所述探测器(6)的探测面上的第二次成像图像包括以阵列形式隔开布置的第二孔有效区域(4a)，每一个所述第二孔有效区域(4a)为所述第一孔有效区域(3a)被放大二级预设放大倍率后的图像区域，并且相邻两所述第二孔有效区域(4a)的间隙由所述二级预设放大倍率确定；

所述控制器(8)包括图像接收模块(81)、对焦模块(82)和孔径对齐模块(83)，其中：

所述图像接收模块(81)用于接收所述第二次成像图像，并输送给所述对焦模块(82)和孔径对齐模块(83)；

所述对焦模块(82)用于根据所述第二次成像图像判断所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，以控制所述样本台(7)沿光轴平移运动；

所述孔径对齐模块(83)用于根据所述第二次成像图像上的第二孔有效区域(4a)的中心与所述探测器(6)的探测面上标定的第二孔有效区域(4a)的中心是否对齐，当判定为未对齐时生成孔径对齐指令并输出，以控制所述样本台(7)围绕光轴旋转和/或在垂直于光轴的平面内平移运动。

2.如权利要求1所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述控制器(8)还包括扫描成像模块(84)，所述扫描成像模块(84)用于控制所述样本台(7)平移运动，使所述光源组件(1)发出的照明光和激发光投射到所述生物细胞芯片(2)上的另一细胞岛阵列区域。

3.如权利要求1所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述控制器(8)还包括扫描成像模块(84)，所述扫描成像模块(84)用于控制所述样本台(7)平移运动，使所述光源组件(1)发出的照明光和激发光投射到所述生物细胞芯片(2)上的一个细胞岛阵列区域，并通过所述图像接收模块(81)接收所述第二次成像图像，并根据所述第二次成像图像判断所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域是否处于焦平面内，当判定为未处于焦平面内时生成调焦指令并输出，以控制所述样本台(7)沿光轴平移运动。

4.如权利要求1至3中任一项所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述二级预设放大倍率为所述生物细胞芯片(2)的孔(21)的占空比的倒数。

5.如权利要求4所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述一级成像组件(3)包括大口径显微物镜(32)和聚焦成像(35)，其中：所述大口径显微物镜(32)的放大倍率为所述一级预设放大倍率，且位于所述生物细胞芯片(2)的下方，穿过所述生物细胞芯片(2)的玻璃基底倒置成像所述生物细胞芯片(2)上的各个细胞岛，所述光源组件(1)中的照明光源(12)位于所述大口径显微物镜(32)和所述生物细胞芯片(2)之间，所述光源组件(1)中的激光光源(11)发出的同轴激发光通过所述大口径显微物镜(32)投射到所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域，所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域中的细胞小岛(22)受激发后产生发射光并依次经由所述大口径显微物镜(32)和聚焦成像(35)，以所述一级预设放大倍率成像在所述第一成像面(31)上。

6.如权利要求5所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述一级成像组件(3)还包括二向色分光片(33)和聚焦透镜(34)，其中：所述光源组件(1)发出的同轴激发光依次经由所述聚焦透镜(34)和二向色分光片(33)，所述二向色分光片(33)的反射光通过所述大口径显微物镜(32)投射到所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域，所述生物细胞芯片(2)的细胞岛阵列区域中的细胞小岛(22)受激发后产生发射光依次经由所述大口径显微物镜(32)、二向色分光片(33)和聚焦成像(35)，在所述第一成像面(31)上成像。

7.如权利要求4所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述二级成像组件(4)包括小口径放大镜阵列，所述小口径放大镜阵列由以阵列形式布置的小口径放大镜构件(42)组成，每一所述小口径放大镜构件(42)的放大倍率为所述二级预设放大倍率，每一所述小口径放大镜构件(42)的光轴与所述第一成像面(31)上相应的所述第一孔有效区域(3a)的中心对齐，以对相应的所述第一孔有效区域(3a)以所述二级预设放大倍率成像在第二成像面(41)上。

8.如权利要求7所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置，其特征在于，所述小口径放大镜构件(42)包括多片共轴镜片及其外部封装的圆柱形遮光套管，用于固定物方工作距离、像方工作距离、物方成像视场、像方成像视场、二级预设放大倍率以及工作波段的荧光成像。

9.一种生物细胞芯片筛选系统，其特征在于，包括如权利要求1至8中任一项所述的生物细胞芯片高通量、高内涵、并行成像装置。