CN110951613B - 单细胞阵列芯片及离子通道药物的筛选方法 - Google Patents

单细胞阵列芯片及离子通道药物的筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单细胞阵列芯片及离子通道药物的筛选方法。本发明的单细胞阵列芯片包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有微坑，且相邻微坑的圆心距为30～90μm；所述的单细胞阵列芯片材质选自高分子聚合物、硅、玻璃、石英、纸质中的一种或多种。利用单细胞阵列芯片进行离子通道药物筛选的方法，可获得较高的单细胞捕获率，且充分考虑单细胞的异质性。本发明的筛选方法能够提高单细胞水平药物筛选结果的准确度、重现性、显著降低假阳性率/假阴性率，提高离子通道药物筛选效率。

Description

单细胞阵列芯片及离子通道药物的筛选方法
技术领域
本发明涉及一种单细胞阵列芯片，还涉及离子通道药物的筛选方法。
背景技术
离子通道是一类对离子具有选择通透性的跨膜生物大分子，调节机体多种生理活动。离子通道功能紊乱可诱发多种“离子通道病”，如癫痫、心率失调、糖尿病等。以离子通道为靶的药物研发是学术界和产业界关注的热点。
传统的离子通道药物筛选平台包括传统钙荧光高通量筛选技术(FlexStation 3)和全细胞膜片钳技术，但这两种技术均存在试剂消耗大、结果重现性不佳、技术门槛较高、仪器造价昂贵等问题。传统的钙荧光高通量筛选技术测量的是孔板(如96孔板)的单个孔中所有细胞的总荧光值，首先细胞的数目具有不确定性，另外细胞的贴壁效果不佳，在酶标仪中反复地加液步骤有可能会使细胞脱离板底，这些不确定因素也造成了FlexStation 3不准确、不易重复的结果。经过传统钙荧光高通量方法筛选出具有活性的化合物，通常在金指标膜片钳上难以得到有效验证，说明采用传统钙荧光技术筛选结果准确度不高，存在大量假阳性或假阴性结果。全细胞膜片钳技术则由于技术门槛高、通量低，不适于大规模筛选。
因此需要建立一种准确度高、能够有效降低假阳性/假阴性率的离子通道药物筛选工具及方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种单细胞阵列芯片，其适用于离子通道药物的筛选。
本发明的另一目的在于提供一种离子通道药物筛选的方法，该方法能够提高结果的准确度、重现性、显著降低假阳性率/假阴性率。进一步地，该方法可缩短检测时间。更进一步地，该方法还能够减少样品消耗量，实现对高表达离子通道细胞的可视化观察及重复给药的量效关系监测等传统荧光方法不具备的功能。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一方面，本发明提供一种单细胞阵列芯片，其包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有微坑，且相邻微坑的圆心距为30～90μm；所述的单细胞阵列芯片材质选自高分子聚合物、硅、玻璃、石英、纸质中的一种或多种。
根据本发明的单细胞阵列芯片，优选地，所述上层微通道芯片设有微流体通道、流入通孔和流出通孔，所述微流体通道位于所述上层微通道芯片的下表面，并与所述微坑连通，所述流入通孔和流出通孔分别位于所述微流体通道的两端，并将所述微流体通道与所述上层微通道芯片的上表面连通。
根据本发明的单细胞阵列芯片，优选地，通过优化微坑尺寸，获得较高的单细胞捕获效率；捕获原理选自尺寸效应，还包括流体力学、电渗流、磁学的任一种。
另一方面，本发明提供上述单细胞阵列芯片进行离子通道药物筛选的方法，其包括如下步骤：
(1)采用至少一个单细胞阵列芯片从细胞悬液中捕获单细胞；至少一个单细胞阵列芯片至少包括第一微流体通道和第二微流体通道；细胞悬液中的单细胞为经过荧光染色标记的表达离子通道的单细胞；
(2)将所述单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下观察或录像；首先，在所述单细胞阵列芯片的第一微流体通道和第二微流体通道的流出通孔处滴加缓冲液；然后，将阴性对照液注入所述第一微流体通道，将待筛选药物溶液注入所述第二微流体通道，从而对单细胞进行刺激，实时追踪单细胞的荧光强度，记录加入化合物后的荧光强度增幅；以所述第一微流体通道的单细胞的荧光强度增幅作为基准，若第二微流体通道的单细胞的荧光强度增幅增强，则所述待筛选药物为离子通道激动剂；若第二微流体通道的单细胞的荧光强度不变，则采用已知的离子通道阳性激动剂对所述第二微流体通道的单细胞进行刺激，若单细胞的荧光强度增幅小于对照组，则所述待筛选药物为离子通道抑制剂，若单细胞的荧光强度不变或增强，则所述待筛选药物对所述离子通道无作用。
根据本发明的筛选方法，优选地，步骤(1)中，所述细胞悬液的制备方法为：将细胞株用阳离子脂质体法进行转染；转染后加入染液在培养箱内孵育，消化离心，配成每毫升含2.5×106～2×107个细胞的细胞悬液，转染的时间为18～30h，孵育的时间为50～90min。
根据本发明的筛选方法，优选地，步骤(1)中，捕获单细胞的方法为：分多次将细胞悬液经由流入通孔通入所述单细胞阵列芯片的微流体通道中，第一次通入的细胞悬液的细胞密度为每毫升含0.8×107～1.2×107个细胞，第二次和第三次通入的细胞悬液的细胞密度均为每毫升含3×106～7×106个细胞。
根据本发明的筛选方法，优选地，步骤(1)中，所述单细胞阵列芯片的数量为1～500个，可实现同时对多个离子通道或多个药物的高通量筛选。
根据本发明的筛选方法，优选地，步骤(2)中，通过微流体控制和驱动技术将阴性对照液体或待筛选药物溶液分别注入第一微流体通道和第二微流体通道，且所述流体驱动技术选自移液枪、自动加样器、机械泵、蠕动泵、气动泵、电渗流、离心力中的任一种；微流体控制技术选自被动阀法、气动微阀法、电渗驱动法、离心力驱动法或机械阀法中的任一种；刺激的方法选自均相刺激、脉冲刺激或梯度刺激。
根据本发明的筛选方法，优选地，步骤(2)中，流体控制技术采用被动阀法，利用流入和流出通孔处的液体体积差，阴性对照液或待筛选药物溶液为小体积液体，缓冲液为大体积液体。在表面张力差作用下，小体积液体向大体积液移动。
根据本发明的筛选方法，优选地，步骤(2)中，所述的检测装置选自荧光显微镜、共聚焦显微镜、高内涵仪器中的任一种；检测指标选自荧光、吸光度、化学发光的任一种。
本发明的单细胞阵列芯片能够有效捕获并留住单细胞，既避免两个或多个单细胞被捕获并留在微坑中，同时避免已捕获的单细胞被后续的细胞悬液冲走，从而获得较高的单细胞捕获率。此外，相邻的微坑之间采用本发明的圆心距时，有利于提高筛选效率。
本发明的单细胞阵列芯片应用于离子通道药物筛选时，与传统钙荧光方法相比，本发明的单细胞阵列芯片可以显著提高结果重现性、缩短检测时间、提高结果准确度、降低假阳性率/假阴性率，从而大大降低后续膜片钳验证的工作量。此外，本发明的单细胞阵列芯片还可以减少样品消耗量，实现对高表达离子通道细胞的可视化观察及重复给药的量效关系监测等传统钙荧光方法不具备的功能。
附图说明
图1为实施例4中四种不同密度细胞悬液的单细胞捕获率。
图2为实施例4中多次注入细胞悬液后捕获1次、2次和3次的单细胞捕获率。
图3为实施例5中DMSO和2-APB对TRPV1cDNA转染细胞荧光强度影响的显微照片。
图4a为实施例5中DMSO对TRPV1cDNA转染细胞荧光强度的影响的统计曲线图。
图4b为实施例5中2-APB对TRPV1cDNA转染细胞荧光强度影响的曲线图。
图4c为实施例5中DMSO和2-APB对TRPV1cDNA转染细胞荧光强度增幅的对比图(平行三组实验)。
图5a为实施例6中依次加入DMSO和2-APB对TRPV1cDNA转染细胞荧光强度的影响的曲线图。
图5b为实施例6中依次加入RR和2-APB对TRPV1cDNA转染细胞荧光强度的影响的曲线图。
图5c为实施例6中细胞荧光强度增幅对比图(平行三组实验)。
图6为实施例7中CAP对TRPV1-4cDNA细胞荧光强度影响的对比图。
图7为实施例7中CAP对转染TRPV1cDNA的细胞的荧光强度的影响的对比图(平行三组实验的)。
图8为对比例2中平行三个孔的传统钙荧光FlexStation 3上CAP对转染TRPV1cDNA的细胞荧光强度的影响的曲线图。
图9为实施例7的单细胞阵列芯片法和对比例2的传统钙荧光FlexStation 3的荧光增强和标准差的对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
申请人认为，传统钙荧光技术采用批量实验，由于对结果作平均化处理，往往忽略细胞间的异质性，从而丢失来自单个细胞的关键信息；而单细胞分析有助于揭示细胞群体研究中经常被掩盖和忽略的细节和机理。微流控技术是20世纪90年代初中期在分析化学领域发展起来的一门新兴的分析学科，其主要特点和优势在于快速、微量、高通量，尤其在单细胞水平实时动态检测细胞内信号、细胞与微环境相互作用等方面具有独特优势。研究者已发展多种方法用于单细胞捕获，并利用流体精确操控单细胞所在微环境。但这些方法多应用于基因组扩增、单细胞的原位培养、增殖、诱导分化，内容物提取等方面，未见用于离子通道药物的高通量筛选的报道。
离子通道是细胞膜中的蛋白质分子，其结构是具有高度选择性的亲水性孔道，对特定离子选择性通透，其功能是细胞生物电活动的基础。药物通过改变离子通道对离子的通透作用，对细胞电生理活动产生影响，并进而产生相应的生理或药理效应。本发明中，所述离子通道药物是指针对钙离子通道、钠离子通道或钾通道离子的调控剂。离子通道激动剂是指能够激活该离子通道的药物。离子通道抑制剂是指能够抑制该离子通道的药物。
本发明将单细胞阵列芯片应用于离子通道药物筛选中，与传统钙荧光高通量筛选技术相比，假阳性率/假阴性率显著降低，准确度高。本发明的离子通道药物筛选方法，包括：(1)采用单细胞阵列芯片捕获单细胞的步骤；(2)离子通道激动剂和抑制剂筛选步骤。
＜单细胞阵列芯片＞
本发明的单细胞阵列芯片是用于捕获单细胞的装置。可采用多种方式实现单细胞捕获，例如捕获原理可以选自尺寸效应、流体力学、电渗流、磁学等单细胞捕获方式；并优选为尺寸效应，还包括流体力学、电渗流、磁学的任一种。经过荧光染色标记的细胞在显微镜的荧光模式下能够显现出荧光。
本发明中，单细胞阵列芯片包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有多个微坑，且相邻微坑的圆心距为30～90μm。本发明的单细胞阵列芯片具有较高的单细胞捕获率。
本发明中，相邻微坑的圆心距优选为55～90μm，更优选为60～80μm。微坑的直径可以为23～28μm，优选为25～28μm。微坑的深度可以为33～45μm，优选为38～42μm，更优选为40μm。采用所述优选的微坑尺寸，单细胞捕获率可高达80％，更优选超过85％。通过优化微坑尺寸，可以获得较高的单细胞捕获效率。
根据本发明的一个具体实施方式，单细胞阵列芯片包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有多个圆柱形的微坑，微坑的直径为23～28μm，所述微坑的深度为33～45μm，且相邻微坑的圆心距为30～90μm。
根据本发明的又一个具体实施方式，单细胞阵列芯片包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有多个圆柱形的微坑，微坑的直径为25～28μm，所述微坑的深度为38～42μm，且相邻微坑的圆心距为55～90μm。
根据本发明的再一个具体实施方式，单细胞阵列芯片包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有多个圆柱形的微坑，微坑的直径为25～28μm，所述微坑的深度为40μm，且相邻微坑的圆心距为60～80μm。
本发明中，优选地，上层微通道芯片设有微流体通道、流入通孔和流出通孔，所述微流体通道位于所述上层微通道芯片的下表面，并与所述微坑连通，所述流入通孔和流出通孔分别位于所述微流体通道的两端，并将所述微流体通道与所述上层微通道芯片的上表面连通。
本发明中，所述微流体通道优选为直形，长度可以为1～20mm，优选为5～15mm，更优选为8～12mm。所述微流体通道的数目可以为2～1000条，优选为2～20条，更优选为8～12条。
根据本发明一个实施方式，所述微坑的直径为23～28μm，所述微坑的深度为33～45μm，相邻微坑的圆心距为55～90μm；所述微流体通道为直形，长度为5～15mm；所述微流体通道的数目为2～1000条。根据本发明一个更优选的实施方式，所述微坑的直径为25～28μm，所述微坑的深度为38～42μm，相邻微坑的圆心距为60～80μm；所述微流体通道为直形，长度为8～12mm，所述微流体通道的数目为2～20条。根据本发明一个特别优选的实施方式，所述微坑的直径为25～28μm，所述微坑的深度为40～42μm，相邻微坑的圆心距为70～80μm；所述微流体通道为直形，长度为10～12mm，所述微流体通道的数目为8～12条。
本发明的单细胞阵列芯片，微坑的直径和高度是经过特殊设计的，微坑的直径和高度均明显大于单个细胞的直径。采用本发明的微坑尺寸，能够有效捕获并留住单细胞，既避免两个或多个单细胞被捕获并留在同一个微坑中，同时避免已捕获的单细胞被冲出微坑，从而获得较高的单细胞捕获率。此外，相邻的微坑之间具有本发明的圆心距时，能够在显微镜的10×物镜视野下实现同时检测数百个单细胞性质(如荧光强度)，利于单细胞的观察和记录，对后续的筛选步骤十分有利。
本发明的单细胞阵列芯片可以采用常规的材质。所述下层微孔芯片和上层微通道芯片的材质可以选自高分子聚合物、硅、玻璃、石英或纸质中的一种或多种，优选为高分子聚合物、硅、玻璃或石英。所述高分子聚合物优选为聚二甲基硅氧烷(PDMS)。根据本发明的一个实施方式，所述基体材质为聚二甲基硅氧烷。根据本发明的另一个实施方式，所述基体材质为硅。
本发明的单细胞阵列芯片可以通过多种方法制备。
根据本发明的一个优选的实施方式，所述单细胞阵列芯片采用软光刻PDMS注塑法制备，该方法包括如下步骤：
(1)分别绘制所述下层微孔芯片和上层微通道芯片的设计图，并分别制成具有微坑阵列图形的高分辨率透明掩膜和具有微流体通道图形的高分辨率透明掩膜；
(2)将负性光刻胶SU8 2007涂布于硅片上，涂布厚度为5～10μm，固化处理，得到粘附层；然后将SU8 2050涂布于所述粘附层的表面，涂布厚度为20～60μm，前烘，得到光刻胶；
(3)将所述具有微坑阵列图形的高分辨率透明掩膜的图形放置到前烘好的光刻胶上，曝光，后烘，然后用显影液洗涤，未曝光的光刻胶被洗掉，140～180℃下加热20～40min，得到下层微孔芯片模具；将所述具有微流体通道图形的高分辨率透明掩膜的图形放置到另一光刻胶上，曝光，后烘，然后用显影液洗涤，未曝光的光刻胶被洗掉，140～180℃下加热20～40min，得到上层微通道芯片模具；
(4)将所述下层微孔芯片模具和上层微通道芯片模具分别进行硅烷化处理；
(5)将质量比为7～14:1的PDMS预聚物单体和聚合引发剂的混合物分别浇注在所述下层微孔芯片模具和上层微通道芯片模具的表面，加热固化，将PDMS层与硅片分离，分别得到下层微孔芯片和上层微通道芯片；在上层微通道芯片的微流体通道两端打孔以形成流入通孔和流出通孔，清洗，烘干；
(6)将所述下层微孔芯片和上层微通道芯片不可逆的键合，得到所述单细胞阵列芯片。
根据本发明的制备方法，步骤(1)中，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片的设计图可以采用AutoCAD软件绘制。优选地，所述高分辨率透明掩膜的分辨率可以为25000dpi或以上，以保证本发明的图形的保真度。
根据本发明的制备方法，步骤(2)中，所述硅片依次用无水乙醇冲洗、用Piranha溶液煮沸、用超纯水冲洗至中性，干燥等预处理，然后应用于后续的涂布处理。所述的硅片预处理方法可以为：首先将硅片用无水乙醇冲洗，以除去粘附在硅片表面的杂质，吹干；然后将硅片置于Piranha溶液(浓硫酸:双氧水＝3:1)加热煮沸，加热时间为10～50min，优选为20～40min，更优选为25～35min；冷却后将硅片取出，用超纯水冲洗至中性，吹干，然后于150～250℃下烘干15～45min，优选于180～220℃下烘干20～40min。
根据本发明的制备方法，步骤(2)中，将SU8 2050涂布于所述粘附层的表面，涂布速率可以为3800～4300rpm，优选为3900～4200rpm，更优选为4000～4100rpm；涂布厚度可以为20～60μm，优选为30～55μm，更优选为35～45μm。
根据本发明的制备方法，步骤(3)中，可以采用紫外曝光机将所述具有微坑阵列图形的高分辨率透明掩膜的图形曝光到光刻胶上。所述后烘的方法可以为在65℃和95℃加热板上分别加热1～2min和6～8min。所述显影液可以采用成品配套显影液。再于140～180℃下加热20～40min，优选于150～170℃加热25～35min，更优选于160℃加热30～40min，从而得到下层微孔芯片模具。上层微通道芯片模具采用与上述的下层微孔芯片模具类似或相同的方法制备。
根据本发明的制备方法，步骤(4)中，优选地，所述硅烷化处理如下：将下层微孔芯片模具和上层微通道芯片模具置于1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷的气体环境中处理10～30h。经硅烷化处理后，模具与PDMS之间的粘附力减弱，PDMS芯片更容易从硅片上剥离。
根据本发明的制备方法，步骤(5)中，所述PDMS预聚物单体和聚合引发剂的质量比为7～14:1，优选为8～13:1，更优选为9～12:1，再优选为10～11:1。所述加热固化处理的加热温度可以为60～80℃，优选为65～75℃；加热时间可以为1～3小时，优选为1.5～2.5小时，更优选为2小时。根据本发明的一种实施方式，加热固化处理的加热温度为70～75℃，加热时间为1.5～2.5小时。所述清洗处理可以为采用乙醇超声清洗。
根据本发明的制备方法，步骤(6)中，在将所述下层微孔芯片和上层微通道芯片不可逆的键合之前，首先将所述下层微孔芯片和上层微通道芯片经等离子清洗仪处理芯片表面，从而实现良好的键合效果。
＜单细胞捕获步骤＞
本发明中，步骤(1)采用至少一个单细胞阵列芯片从细胞悬液中捕获单细胞；至少一个单细胞阵列芯片至少包括第一微流体通道和第二微流体通道；细胞悬液中的单细胞为经过荧光染色标记的表达离子通道的单细胞。
所述单细胞经过所述荧光染色标记后，其离子通道被离子通道激动剂激活后，在显微镜的荧光模式下显示荧光强度增强；其离子通道被离子通道抑制剂阻滞后，在显微镜的荧光模式下荧光无变化。本发明的细胞悬液中的细胞可以为适用于离子通道药物筛选的任何细胞，并优选为离子通道高表达的细胞。根据本发明的一个实施方式，所述细胞悬液中的细胞为HEK293细胞。本发明中，优选地，所述单细胞首先经过转染处理，再进行荧光染色标记，从而成为离子通道高表达的单细胞。所述转染处理是指细胞膜表面离子通道受体高表达。所述离子通道可以为钠离子通道、钾离子通道或钙离子通道中的任一种。根据本发明的一个实施方式，所述细胞悬液的细胞为HEK293细胞，所述离子通道药物为钙离子通道药物。
本发明中，所述细胞悬液的细胞密度可以为每毫升含2.5×106～2×107个细胞，优选为5×106～1.5×107个细胞。采用本发明优选的细胞悬液的细胞密度，能够获得较高的单细胞捕获率。
本发明中，所述细胞悬液的制备方法可以为：将细胞株用阳离子脂质体法进行转染；转染后加入染液在培养箱内孵育，消化离心，配成每毫升含2.5×106～2×107个细胞的细胞悬液，优选配成每毫升含5×106～1.2×107个细胞的细胞悬液。所述细胞株可以为适合表达外源基因的细胞株，例如HEK293细胞株。所述脂质体可以采用本领域常用的脂质体，例如上海博耀生物科技有限公司的产品Lipo-2000。所述染液可以采用本领域常用的染液，如cck、cal-520、ifluor488se、fluo-8am、jc-10等，并优选为Cal-520染液。本发明的细胞悬液的制备方法中，转染的时间可以为18～30h，优选为20～26h，更优选为22～24h；孵育的时间可以为50～90min，优选为60～80min，更优选为65～75min。
根据本发明的一个实施方式，所述细胞悬液的制备方法为：将HEK293细胞株用Lipo-2000和TRPV1-4cDNA进行转染；转染后加入Cal-520染液在培养箱内孵育，消化离心，配成每毫升含2.5×106～2×107个细胞的细胞悬液；转染的时间为18～30h，孵育的时间为50～90min。
本发明中，所述单细胞阵列芯片可进行一次或多次单细胞捕获，即，所述细胞悬液可以一次或多次通入所述单细胞阵列芯片，优选多次通入所述单细胞阵列芯片，每次通入所述单细胞阵列芯片的细胞悬液的细胞密度可以相同，也可以不同。根据本发明一个优选的实施方式，将所述细胞悬液四次通入所述单细胞阵列芯片，第一次通入的细胞悬液的细胞密度为每毫升含0.8×107～1.2×107个细胞，后三次通入的细胞悬液的细胞密度均为每毫升含3×106～7×106个细胞。采用上述优选的处理方法，可获得更高的微坑占有率和单细胞捕获率，可有效避免同一微坑捕获多个细胞的情况，且单细胞捕获率可达85％以上。
本发明中，步骤(1)中，可以采用一个或多个单细胞阵列芯片进行药物筛选，并优选采用多个，例如1-500个，优选为1-100个，更优选为2-50个，从而同时筛选多种药物或同一药物的多个浓度，实现离子通道药物高通量筛选。当采用多个单细胞阵列芯片时，至少一个单细胞阵列芯片至少包括第一微流体通道，用于注入阴性对照液体。另外，每个单细胞阵列芯片中，除了所述第一微流体通道和第二微流体通道，还可以包括更多的微流体通道，以实现离子通道药物高通量筛选。
＜筛选步骤＞
在离子通道药物的筛选中，药物对某种离子通道的作用是激动作用、抑制作用还是无作用，这是对药物作用的定性问题，也是离子通道药物筛选首先需要确定的问题。
本发明的筛选步骤(2)中，将捕获了单细胞的单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下进行实时观察或录像；
将阴性对照液注入所述第一微流体通道，将待筛选药物溶液注入所述第二微流体通道，从而对单细胞进行刺激，实时追踪单细胞的荧光强度，记录加入化合物后的荧光强度增幅；以所述第一微流体通道的单细胞的荧光强度作为基准，若第二微流体通道的单细胞的荧光强度增强，则所述待筛选药物为离子通道激动剂；若第二微流体通道的单细胞的荧光强度不变，则采用已知的离子通道阳性激动剂对所述第二微流体通道的单细胞进行刺激，若单细胞的荧光强度，则所述待筛选药物为离子通道抑制剂，若单细胞的荧光强度不变或增强，则所述待筛选药物对所述离子通道无作用。
采用本发明的方法，各个单细胞的信息(特别是荧光强度信息)能够被单独分析，从而有利于发掘在传统的细胞群体研究中被掩盖的细节和机理。
本发明中，通过微流体控制和驱动技术分别将阴性对照液体或待筛选药物溶液分别注入第一微流体通道和第二微流体通道。所述微流体控制和驱动技术能够使液体通过微流体通道流动至单细胞阵列芯片的微坑内，从而实现对单细胞的刺激。所述微流体控制和驱动技术可以为被动阀法、气动微阀法、电渗驱动法、离心力驱动法或机械阀法等。换液操作也可采用上述微流体控制和驱动技术来实现。根据本发明的一个优选的实施方式，所述微流体控制和驱动技术为被动阀法。
本发明中，所述阴性对照液体是指0.2vol％的二甲亚砜(DMSO)。
本发明中，刺激的具体方法可以为均相刺激、脉冲刺激、梯度刺激等。所述均相刺激是指采用同一种药物溶液进行一次给药刺激。所述脉冲刺激是指采用同一种药物溶液分多次给药刺激。所述梯度刺激是指采用不同浓度的药物溶液分多次给药刺激。
本发明中，除了所述第一微流体通道和第二微流体通道，所述单细胞阵列芯片还可以包括另外的微流体通道，从而可以同时筛选同一药物的多个浓度或者多种药物或者多种离子通道高表达受体，从而实现离子通道药物高通量和高内涵筛选。另外，还可以同时应用多个所述单细胞阵列芯片，从而进一步增大筛选通量，提高筛选效率。
根据本发明的一个实施方式，所述筛选步骤具体如下：
将单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下录像；分别在所述单细胞阵列芯片的第一微流体通道和第二微流体通道的流出通孔处滴加缓冲液，记为0s；第8-12s将阴性对照液体和待筛选药物溶液分别滴加在所述第一微流体通道和第二微流体通道的流入通孔处；记录第50-80s单细胞的荧光强度最高点，与第一微流体通道的单细胞的荧光强度相比，若第二微流体通道的单细胞的荧光强度增强，则所述待筛选药物为离子通道激动剂；若第二微流体通道的单细胞的荧光强度不变，则将离子通道阳性激动剂溶液滴加于第一和第二通道的流入通孔处，观察单细胞的荧光强度，与第一微流体通道的单细胞荧光强度相比，若第二微流体通道的单细胞的荧光强度减弱，则所述待筛选药物为离子通道抑制剂；若单细胞的荧光强度不变或增强，则所述待筛选药物对所述离子通道无作用。
本发明中，整个过程都将显微镜调至荧光模式下进行观察或录像，优选为录像，从而利于准确记录细胞的荧光强度和特征，以供观察和判断。本发明优选的单细胞阵列芯片的微坑密度，即相邻微坑的圆心距为55～90μm，优选为60～80μm，使10×显微镜视野下细胞的数目合适，更有利于细胞的荧光强度和特征的对比，减少误差。
本发明中，所述缓冲液可以为HBSS缓冲液、PBS缓冲液、DPBS缓冲液中的任一种，优选为HBSS缓冲液。所述缓冲液与所述阴性对照液体的体积比为4～8:1，优选为5～7:1，更优选为5～6:1；所述缓冲液与所述待筛选药物溶液的体积比为4～8:1，优选为5～7:1，更优选为5～6:1。根据本发明的一个实施方式，所述缓冲液的体积为25～35μL，优选为28～32μL，更优选为30～32μL；且所述待筛选药物溶液的体积为1～10μL，优选为4～7μL，更优选为5～6μL。
本发明中，首先将缓冲液滴加于所述空白通道或药物通道的流出通孔处，在微流体通道两端的压力差作用下，缓冲液被吸入微流体通道并注满微坑。本发明中，8～12s可完成这一过程。
本发明中，将阴性对照液体和待筛选药物溶液分别滴加于所述第一微流体通道和第二微流体通道的流入通孔处，并采用本发明的体积比或优选体积时，第一微流体通道和第二微流体通道两端的压力差能够使待筛选药物的溶液被吸入并完成换液，即微坑内的缓冲液分别被置换成阴性对照液体和待筛选药物的溶液，从而实现阴性对照液体和待筛选药物溶液对微坑内单细胞的刺激。本发明中，第50～80s、优选第60～70s完成换液，微坑内的缓冲液被置换成阴性对照液体和待筛选药物的溶液，且药物对单细胞的荧光强度的影响能够充分显现，利于观察、统计和判断。
与传统钙荧光方法筛选离子通道药物相比，本发明的离子通道药物筛选方法能够显著降低筛选结果的假阳性率/假阴性率，提高准确度，大大降低后续膜片钳验证的工作量。在本发明的一个实施方式中，本发明的离子通道药物筛选方法将传统方法的假阳性率由76.2％降低至4.8％。另外，本发明的离子通道药物筛选方法显著提高结果的重现性、缩短检测时间、提高结果准确度。再者，本发明的方法可以减少样品消耗量，实现对高表达离子通道细胞的可视化观察及重复给药的量效关系监测等传统钙荧光方法不具备的功能。
以下通过具体实施例对本发明的单细胞阵列芯片及其制备方法和用途进行具体描述，但这些实施例并不用于限制本发明的保护范围。
实施例1-单细胞阵列芯片的制备
单细胞阵列芯片的结构：下层微孔芯片的上表面设有若干圆柱形的微坑，微坑的直径为25μm，微坑的深度为40μm，且相邻微坑的圆心距为80μm，微坑形成直线形等距离均匀排列的微坑阵列。上层微通道芯片设有2条微流体通道，每条微流体通道的两端分别设有流入通孔和流出通孔。微流体通道位于所述上层微通道芯片的下表面，并与所述微坑连通；所述流入通孔和流出通孔将微流体通道与上层微通道芯片的上表面连通。微流体通道的截面为矩形，微流体通道的长度为10mm，宽度为1000μm，深度为100μm。
该单细胞阵列芯片的制备方法包括如下步骤：
(1)按照下层微孔芯片和上层微通道芯片的微坑和微流体通道尺寸，分别采用AutoCAD软件绘制下层微孔芯片和上层微通道芯片的设计图，分别制成分辨率为25000dpi的具有微坑阵列图形的高分辨率透明掩膜和具有微流体通道图形的高分辨率透明掩膜；
(2)将3英寸硅片用无水乙醇冲洗，吹干；然后将硅片置于Piranha溶液(浓硫酸:双氧水＝3:1)加热煮沸30min；冷却后将硅片取出，用超纯水冲洗至中性，吹干，然后于200℃下烘干30min。
将负性光刻胶SU8 2007以3300rpm的转速旋涂涂布于上述硅片上，涂布厚度为7μm，进行前烘、曝光及后烘，得到粘附层；然后将SU82050以4000rpm转速涂布于所述粘附层的表面，涂布厚度为40μm，前烘，得到光刻胶；
(3)采用紫外曝光机将具有微坑阵列图形的高分辨率透明掩膜的图形曝光到一光刻胶上，65℃和95℃加热板上分别加热1min和6min以完成后烘，用显影液洗掉未曝光的光刻胶，然后于160℃下加热30min，得到下层微孔芯片模具；将所述具有微流体通道图形的高分辨率透明掩膜的图形曝光到另一光刻胶上，65℃和95℃加热板上分别加热1min和6min以完成后烘，然后用显影液洗掉未曝光的光刻胶，然后于160℃下加热30min，得到下层微孔芯片模具；
(4)将所述下层微孔芯片模具和上层微通道芯片模具分别置于1H,1H,2H,2H-全氟辛基三氯硅烷的气体环境中进行硅烷化处理；
(5)将质量比为10:1的PDMS预聚物单体和聚合引发剂的混合物分别浇注在所述下层微孔芯片模具和上层微通道芯片模具的表面，80℃加热2小时进行固化，将PDMS层与硅片分离，切割，分别得到下层微孔芯片和上层微通道芯片；用19G打孔器在上层微通道芯片的微流体通道两端打孔以形成流入通孔和流出通孔，乙醇超声清洗，烘干；
(6)用等离子清洗仪处理所述下层微孔芯片和上层微通道芯片的表面，然后将下层微孔芯片和上层微通道芯片进行不可逆的键合，得到单细胞阵列芯片。
实施例2
除了微坑直径为28μm，其他参数与实施例1相同。
实施例3
除了相邻微坑的圆心距为60μm，其他参数与实施例1相同。
对比例1
除了微坑直径为30μm，其他参数与实施例1相同。
实施例4-芯片的单细胞捕获实验
1.实验方法
1.1细胞培养、转染与染色
HEK293细胞培养液为含10％的FBS，1％的100单位双抗的DMEM完全培养液，培养于含95％空气、5％CO2的气体的37℃培养箱中，每隔24小时传代一次。
消化细胞后将细胞接种于12孔板中，24小时后用Lipo-2000和TRPV1-4cDNA对细胞进行转染。转染24h后用Cal-520染液在培养箱内孵育细胞75min，随后消化离心并分别配制成密度为每毫升含1×107个细胞的细胞悬液，每毫升含2×107个细胞的细胞悬液，每毫升含5×106个细胞的细胞悬液，每毫升含2.5×106个细胞的细胞悬液，待用。
1.2单次注入细胞悬液后芯片的单细胞捕获和计数
1.2.1芯片设计参数对单细胞捕获率的影响
(1)实施例1-1
向实施例1的单细胞阵列芯片通入5μL的完全培养液，以保证单细胞阵列芯片的微流体通道及微坑的亲水性，并避免气泡产生。然后将5μL每毫升含1×107个细胞的细胞悬液从流入通孔注入单细胞阵列芯片，静置2min，从流入通孔注入培养基，洗去未被捕获的细胞，考察单次注入的微坑占有率，以及单细胞的荧光数据个数并计算单细胞率。微坑占有率与单细胞捕获率参见表1。
(2)实施例2-1
除了将实施例1-1中单细胞阵列芯片替换为实施例2的单细胞阵列芯片，其他条件与实施例1-1相同。微坑占有率与单细胞捕获率参见表1。
(3)实施例3-1
除了将实施例1-1中单细胞阵列芯片替换为实施例3的单细胞阵列芯片，其他条件与实施例1-1相同。微坑占有率与单细胞捕获率参见表1。
(4)对比例1-1
除了将实施例1-1中单细胞阵列芯片替换为对比例1的单细胞阵列芯片，其他条件与实施例1-1相同。微坑占有率与单细胞捕获率参见表1。
1.2.2细胞悬液的密度对单细胞捕获率的影响
细胞悬液的密度也对单细胞捕获率产生影响。我们选取了四种不同密度的细胞悬液进行单细胞捕获实验，四种不同密度的细胞悬液即每毫升含2.5×106、5×106、1×107和2×107个细胞的细胞悬液，除细胞悬液的密度之外，其余条件与实施例1-1相同。四种不同密度细胞悬液的单细胞捕获率如图1所示。
1.3多次注入细胞悬液后芯片的单细胞捕获和计数
向实施例1的单细胞阵列芯片通入5μL的完全培养液，以保证单细胞阵列芯片的微流体通道及微坑的亲水性，并避免气泡产生。然后将5μL每毫升含1×107个细胞的细胞悬液从流入通孔注入单细胞阵列芯片，静置2min；再将5μL每毫升含5×106个细胞的细胞悬液从流入通孔注入单细胞阵列芯片，静置2min；再次将5μL每毫升含5×106个细胞的细胞悬液从流入通孔注入单细胞阵列芯片，静置2min；然后从流入通孔注入培养基，洗去未被捕获的细胞，考察并计算单细胞率。多次注入细胞悬液后捕获1次、2次和3次的单细胞捕获率如图2所示。
2.实验结果
实施例1-1、实施例2-1、实施例3-1、对比例1-1的单次注入细胞悬液后的微坑占有率和单细胞捕获率实验数据见表1。
表1微坑占有率和单细胞率
Figure BDA0002344637870000171
由表1可见，相同圆心距下，单细胞捕获率随微坑直径增大而降低。此外，在相同微坑直径下，不同圆心距对单细胞捕获率没有显著影响，即组间不存在显著性差异。
四种不同密度细胞悬液的单细胞捕获率如图1所示。由图1可知，细胞悬液密度为2.5×106·mL-1时，单细胞捕获率最低；细胞悬液密度为1×107·mL-1时，单细胞捕获率最高，达到了64.7±2.2％。
多次注入细胞悬液后捕获1次、2次和3次的单细胞捕获率如图2所示。由图2可知，随着捕获次数增加，单细胞捕获率也升高；3次捕获后单细胞捕获率达到了85％以上。
实施例5-工具药2-APB活性评价方法学验证
二苯基硼酸-2-氨基乙酯(2-APB)是非选择性的可通透钙离子的TRP通道激动剂，对TRPV1、TRPV2、TRPV3等多个通道有明显的激动作用。因此2-APB可以作为阳性激动剂的工具药。
采用实施例1的单细胞阵列芯片，其包括两个微流体通道，分别为第一微流体通道和第二微流体通道。采用实施例4的方法获得转染、染色的单细胞，并采用单细胞阵列芯片捕获单细胞。将捕获了单细胞的单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下录像，分别在单细胞阵列芯片的第一微流体通道和第二微流体通道的流出通孔处滴加缓冲液，记为0s；第12s将阴性对照液体DMSO(0.2vol％)和工具药阳性激动剂2-APB(400μM)分别滴加在所述第一微流体通道和第二微流体通道的流入通孔处；第50s观察单细胞的荧光强度。平行进行三组试验。
结果显示，与阴性对照相比，加入阳性激动药2-APB后，高表达TRPV1的细胞荧光信号明显增强(图3)。阴性对照的上百个单细胞荧光增强平均值分别为1.26、1.05、1.22相对荧光单位，而阳性激动剂组上百个单细胞荧光增强平均值分别为16.85、18.45、15.02相对荧光单位，组间具有显著性差异，说明2-APB对TRPV1通道有明显的激动作用。利用IPP软件对每个单细胞的荧光强度进行追踪，从上百条荧光强度曲线中选取有代表性的六条，如图4a和图4b所示。从曲线可知，每个单细胞的初始荧光值、受药物刺激后的钙离子交换动力学以及可以达到的最高荧光值都有一定差别，充分体现了细胞的异质性。阴性对照组的单细胞荧光曲线，在加入DMSO后荧光强度(相对荧光单位即Relative Fluorescence Units，简称RFU)几乎无增幅(图4a)；而阳性激动剂组的单细胞荧光曲线，在加入2-APB后荧光强度明显增强(图4b)，说明2-APB对TRPV1有激动作用。图4c为平行三组实验散点图，加入DMSO与2-APB后荧光强度增幅对比，**表示P<0.01。
另外，三次平行实验组内无显著性差异，说明与传统的钙荧光方法相比，高通量单细胞微流控技术可以追踪上百个单细胞的荧光强度增幅，在体现细胞异质的同时也通过上百个数量高通量分析弥补了其可能造成的误差，从而提高结果的重现性、减小误差、增加准确性。因此，本实验验证了本发明的单细胞阵列芯片可以用来评价TRP通道激动剂活性，避免传统钙荧光群体细胞分析出现的各种问题。
实施例6-工具药RR活性评价方法学验证
钌红(RR)是非选择性的可通透钙离子的TRP通道抑制剂，对大部分的TRP通道均有抑制作用。因此RR可以作为TRP通道阳性抑制剂的工具药。
采用实施例1的单细胞阵列芯片，其包括两个微流体通道，分别为第一微流体通道和第二微流体通道。采用实施例4的方法获得转染、染色的单细胞，并采用单细胞阵列芯片捕获单细胞。将捕获了单细胞的单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下录像，分别在单细胞阵列芯片的第一微流体通道和第二微流体通道的流出通孔处滴加缓冲液，记为0s；第12s将阴性对照液体DMSO(0.2vol％)和工具药阳性抑制剂RR(20μM)分别滴加在所述第一微流体通道和第二微流体通道的流入通孔处；第60s时加入阳性激动剂2-APB(400μM)，观察单细胞的荧光强度。平行进行三组试验。
利用IPP软件对每个单细胞的荧光强度进行追踪，从上百条荧光强度曲线中选取有代表性的六条，结果如图5a、图5b所示。从曲线可知，激动剂2-APB在阴性对照DMSO存在的环境下可以有效激动TRPV1通道，而在阳性抑制剂RR存在的环境下对TRPV1通道的激动能力明显降低，验证了RR对TRPV1通道有明显的抑制作用。同样，每个细胞的荧光强度动力学被观测到有所不同，体现了细胞的异质性。我们通过分析曲线上加药前后荧光强度增幅可以评价化合物是否有抑制效果，三次平行试验结果如图5c所示，单细胞散点图再次说明了细胞的异质性。在作为阴性对照的DMSO存在下，加入2-APB后上百个单细胞荧光增强平均值分别为10.29、9.89、12.22相对荧光单位；而在阳性抑制剂RR存在下，加入2-APB后上百个单细胞荧光增强平均值分别下降为2.73、3.23、4.48相对荧光单位，说明2-APB对TRPV1通道的激动能力明显被RR降低。阴性对照组和RR组之间具有显著性差异，说明RR作为阳性抑制剂有效阻碍了2-APB对TRPV1通道的激动过程。根据统计学分析，20μM RR对TRPV1的抑制率为67.7±8.3％。
另外，三次平行实验组内无显著性差异，说明与传统的钙荧光方法相比，高通量单细胞微流控技术可以追踪上百个单细胞的荧光强度增幅，在体现细胞异质的同时也通过上百个数量高通量分析弥补了其可能造成的误差，从而提高结果的重现性、减小误差、增加准确性。因此，本实验验证了本发明的单细胞阵列芯片可以用来评价TRP通道抑制剂的活性，避免传统钙荧光群体细胞分析出现的各种问题。
实施例7-单细胞阵列芯片离子通道药物筛选方法
亚型选择性差一直是很多TRP通道调节剂的弱点，为成药后副作用埋下伏笔。寻找选择性好的TRP通道调节剂，对研究通道的功能及为相关疾病寻找新的治疗药物有重要意义。辣椒素(capsaicin，CAP)已被报道对TRPV1的特异性激动剂作用，本实验采用单细胞阵列芯片验证了辣椒素对TRPV1的选择性激动作用。
采用实施例1的单细胞阵列芯片，每个单细胞阵列芯片包括两个微流体通道。采用实施例4的方法获得分别转染TRPV1-4并染色的单细胞，并采用单细胞阵列芯片分别捕获转染TRPV1-4的单细胞。分别将捕获了转染TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4单细胞的单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下录像，分别在每块单细胞阵列芯片的第一微流体通道和第二微流体通道的流出通孔处滴加缓冲液，记为0s；第12s将阴性对照液体DMSO(0.2vol％)和CAP(5μM)分别滴加在所述第一微流体通道和第二微流体通道的流入通孔处，观察单细胞的荧光强度。TRPV1-4的每个通道平行进行三组试验。
结果如图6所示，在TRPV1-4四个通道中，加入5μM CAP后仅有高表达TRPV1通道的细胞荧光值有显著上升，荧光强度增幅与TRPV2-4三个通道具有显著性差异。因此，CAP在微流控芯片平台表现出特异性地激动TRPV1，与目前传统钙荧光和膜片钳方法得到的结果相符。
对比例2-传统离子通道药物筛选方法
采用传统钙荧光方法验证特异性激动剂CAP对TRPV1通道激动作用，并与实施例7的方法进行对比。
1.实验方法
1.1FlexStation 3钙荧光筛选实验方法：
首先将HEK293细胞由大皿中传至12孔板。将HEK293细胞在12孔板中进行瞬时转染TRPV1cDNA，四小时换液时，接种于预先经poly-D包被过的96孔板中，37℃、5％CO2孵箱中培养过夜。FlexStation 3钙流检测实验前，小心去除培养基，加入HBSS 40μL(pH调至7.4)，再加入60μL钙离子染液Cal-520，于37℃避光孵育1h。配置5×测试浓度的激动剂于透明96孔板中。
FlexStation 3多功能酶标仪上机设置如下表所示：
激发波长 485nm
发射波长 525nm
发射截止波长 515nm
读数间隔 1.6s
待测化合物加药时间点 17s
通道激动剂加药时间 100s
总时长 180s
根据实验设置，FlexStation 3钙流检测实验可以同时筛选待测通道的激动剂和拮抗剂。对于激动剂，当化合物在第17s时加入96孔板时应当可以观察到荧光信号的明显上升；浓度性依赖特征应表现为随着待测化合物浓度增高，17s后的荧光信号相应上升。对于抑制剂，其筛选试验的荧光特征应为第100s加入通道激动剂后荧光值没有明显上升或上升幅度降低；浓度性依赖特征应表现为随着化合物浓度的递减对通道的抑制作用减弱，即加入通道激动剂后，荧光信号随化合物孵育浓度下降而相应上升。
根据统计学对比分析，实施例7的基于本发明单细胞阵列芯片的方法的标准差要远远小于传统钙荧光FlexStation 3方法的标准差，说明本发明的高通量单细胞微流控芯片方法在结果重现性方面优于传统钙荧光方法(图7～9)。此外，相比于传统钙荧光FlexStation 3单次检测时间为180s，本发明的单细胞阵列芯片系统检测时间缩短为120s左右，缩短了检测时间，也能减少由于长时间荧光激发导致的荧光淬灭现象。因此，与传统钙荧光方法相比，本发明的高通量单细胞微流控芯片应用于药物筛选可以提高结果重现性、缩短检测时间、提高结果准确度。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

Claims (6)

1.采用单细胞阵列芯片进行离子通道药物筛选的方法，其特征在于：
所述单细胞阵列芯片包括下层微孔芯片和上层微通道芯片，所述下层微孔芯片和上层微通道芯片键合在一起；所述下层微孔芯片的上表面设有微坑，且相邻微坑的圆心距为30～90μm；所述的单细胞阵列芯片材质选自高分子聚合物、硅、玻璃、石英、纸质中的一种或多种；所述上层微通道芯片设有微流体通道、流入通孔和流出通孔，所述微流体通道位于所述上层微通道芯片的下表面，并与所述微坑连通，所述流入通孔和流出通孔分别位于所述微流体通道的两端，并将所述微流体通道与所述上层微通道芯片的上表面连通；
所述方法包括如下步骤：
(1)采用至少一个单细胞阵列芯片从细胞悬液中捕获单细胞；至少一个单细胞阵列芯片的微流体通道至少包括第一微流体通道和第二微流体通道；细胞悬液中的单细胞为经过荧光染色标记的表达离子通道的单细胞；
(2)将所述单细胞阵列芯片置于显微镜荧光模式下观察或录像；首先，在所述单细胞阵列芯片的第一微流体通道和第二微流体通道的流出通孔处滴加缓冲液；然后，将阴性对照液注入所述第一微流体通道，将待筛选药物溶液注入所述第二微流体通道，从而对单细胞进行刺激，实时追踪单细胞的荧光强度，记录加入待筛选药物溶液后的荧光强度增幅；以所述第一微流体通道的单细胞的荧光强度增幅作为基准，若第二微流体通道的单细胞的荧光强度增幅增强，则所述待筛选药物为离子通道激动剂；若第二微流体通道的单细胞的荧光强度不变，则采用已知的离子通道阳性激动剂对所述第二微流体通道的单细胞进行刺激，若单细胞的荧光强度增幅小于对照组，则所述待筛选药物为离子通道抑制剂，若单细胞的荧光强度不变或增强，则所述待筛选药物对所述离子通道无作用。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述细胞悬液的制备方法为：将细胞株用阳离子脂质体法进行转染；转染后加入染液在培养箱内孵育，消化离心，配成每毫升含2.5×106～2×107个细胞的细胞悬液，转染的时间为18～30h，孵育的时间为50～90min。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，捕获单细胞的方法为：分多次将细胞悬液经由流入通孔通入所述单细胞阵列芯片的微流体通道中，第一次通入的细胞悬液的细胞密度为每毫升含0.8×107～1.2×107个细胞，第二次和第三次通入的细胞悬液的细胞密度均为每毫升含3×106～7×106个细胞。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述单细胞阵列芯片的数量为1～500个，实现同时对多个离子通道或多个药物的高通量筛选。
5.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，通过微流体控制和驱动技术将阴性对照液或待筛选药物溶液分别注入第一微流体通道和第二微流体通道，且所述流体驱动技术选自移液枪、自动加样器、机械泵、蠕动泵、气动泵、电渗流、离心力中的任一种；微流体控制技术选自被动阀法、气动微阀法、电渗驱动法、离心力驱动法或机械阀法中的任一种；刺激的方法选自均相刺激、脉冲刺激或梯度刺激。
6.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，步骤(2)中，流体控制技术采用被动阀法，利用流入通孔处和流出通孔处的液体体积差，阴性对照液或待筛选药物溶液为小体积液体，缓冲液为大体积液体；在表面张力差作用下，小体积液体向大体积液移动。
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