WO2004027428A1 - Verfahren zum nachweis und zur isolierung von t-lymphozyten, die ein definiertes antigen erkennen - Google Patents

Verfahren zum nachweis und zur isolierung von t-lymphozyten, die ein definiertes antigen erkennen Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to the use of CD154 for
  • T lymphocytes that recognize a defined antigen, and a method for detection and isolation of T lymphocytes in
  • the immune system consists of cells and molecules that circulate in the body and whose homeostasis and cooperation are coordinated by cytokines and growth factors. Cells that are not required are eliminated by apoptosis. These mechanisms are influenced by external influences or genetic predispositions of various kinds.
  • the immune system plays a central role in the development of many diseases, especially allergies, inflammation and autoimmune diseases. It is responsible for increased immunity after vaccination, but fails to develop tumors.
  • DC Dendritic cells
  • T-lymphocytes are determined by costimulatory activation signals from antigen-presenting cells. Activation signals are ligands for receptors of the T-lymphocytes.
  • ligands are located on the surface of the APC, they are bound to the extracellular matrix or they are secreted by cells, so the Cytokines In addition to the antigen-specific activation by Si However, non-specific activation of T lymphocytes has also been described via the antigen receptor of the T lymphocytes and costimulating ligands; z. B. by cytokines or lectins.
  • T lymphocytes the totality of the molecular changes in the activation reaction and functional differentiation of T lymphocytes is currently only incompletely elucidated.
  • the detection of the activation and functional state of T lymphocytes that recognize a specific antigen is only inaccurately possible with the current state of the art.
  • DE 100 21 834 AI discloses mRNA molecules for use as indicators of the functional state of T-lymphocytes, the mRNA molecules being expressed or increased or reduced expressed in activated T-lymphocytes compared to the normal or resting state.
  • mRNA molecules for use as indicators of the functional state of T-lymphocytes, the mRNA molecules being expressed or increased or reduced expressed in activated T-lymphocytes compared to the normal or resting state.
  • this publication discloses the use of polypeptides which are encoded by the nucleotide sequences and antibodies directed against the polypeptides, and the use of these antibodies for the detection of the activation and functional state of T lymphocytes.
  • DE 37 37 703 AI discloses antibodies which are directed against a neutrophil-activating polypeptide and can be used as a diagnostic agent to activate Detect and characterize structures of the cellular immune response.
  • DE 42 26 974 C2 discloses a method and an apparatus for the preparation and separation of cell suspensions.
  • the separation device described and the method for the continuous preparation of a cell suspension can be used to separate different components, for example of human blood, it being possible to specifically purify cells which are related to the cellular immune response.
  • US Pat. No. 5,874,302 discloses a method with which T lymphocytes are cultivated and the T lymphocytes obtained in this way are used for clinical treatments of tumors. According to US Pat. No. 5,874,302, blood is used as the starting material for the preparation of the T cell culture suspension, the corresponding starting material being co-cultivated with certain tumor cells.
  • CA 1,296,622 discloses a method and an apparatus for determining the immunoregulatory status of leukocytes.
  • the leukocytes are with
  • the subclasses of the mononuclear cells to be determined include, for example, T lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes and helper T lymphocytes.
  • WO 99/58977 describes a method for the direct selection of antigen-specific T lymphocytes.
  • the T-lymphocytes are separated here based on the production of cytokines using flow cytometry or magnetic cell sorting.
  • Activated T-lymphocytes are selected here which, after stimulation with antigen, express one or more specific cytokines.
  • T-lymphocytes specific for an antigen and, moreover, enable their isolation. Both A wide variety of diseases is of the greatest diagnostic and therapeutic interest to directly detect the antigen-specific T-lymphocytes that control the immune responses and thus also the most varied of immunopathogenesis, or to isolate them for cell therapeutic approaches such as adoptive T-cell transfer. This applies to diseases such as allergies and autoimmune diseases, which are based on misguided immune reactions, as well as chronic infectious diseases, tu ore or leukaemias.
  • a disadvantage of the known methods of isolating living T-lymphocytes based on the production of cytokines is furthermore that the cells are removed from the culture at the time of their maximum secretion rate in order to attach a “capture matrix” specific to the respective cytokines the cells are cultured again for a short time increases the technical effort for obtaining specific T lymphocytes considerably.
  • various publications have repeatedly described regulatory T lymphocytes (Tr / Treg) to which no defined cytokine pattern can be assigned, ie the cells cannot be detected or isolated by cytokine secretion.
  • the expression of certain cytokines e.g. IL-10 is also crucially dependent on the type of in vitro activation chosen.
  • the detection and isolation of specific T lymphocytes to date has also been limited because a number of biomolecules are known which can be used as indicators or markers for certain activated T lymphocytes, but it is currently due to the limited number and quality of the available activation markers cannot be determined by determining one of these markers whether the T lymphocytes are in the desired state.
  • the activation marker CD69 is expressed by all T lymphocytes after activation. However, any stress effects also lead to expression of CD69, so that no determination of the antigen-specific T lymphocytes is possible by determining this marker.
  • CD154 on CD4 + Th cells is known as a marker for disease activity in patients with rheumatoid arthritis (RA) (Berner et al., 2000).
  • RA rheumatoid arthritis
  • CD154 as a special prognostic or diagnostic marker in a group of patients with RA is discussed.
  • antigen-specific T cells are characterized by a reactivity restricted to a defined antigen or a defined mixture of antigens.
  • Berner et al. For example, a possible long and increased expression of the CD154 molecule on many CD4 + Th cells is discussed (on average approx.
  • CD40L hl9ll + group / Figure 1 45% in the RA CD40L hl9ll + group / Figure 1).
  • these are not characterized by a restricted antigen specificity.
  • the expression of CD40L on activated T cells has been described by many other groups since 1998.
  • it is also well known that the CD40L molecule is no longer available after activation in vitro with specific antigens as a marker for specific CD4 + Th lymphocytes.
  • CD154 Various aspects of the biology of CD154 are known in the prior art, the structure of which Regulation of expression, biological functions and medical applications is described (Schönbeck et al., 2000).
  • CD154 expression is transient. Furthermore, various polyclonal stimuli are described which are able to induce CD154 expression on all T cells.
  • CD40 molecule The signal transmission pathways of the CD40 molecule in B lymphocytes are well analyzed in some cases. Studies on the duration of CD154 expression on T cells are also disclosed. These data were obtained in experimental systems in which, however, no antigen-specific T cells in cell mixtures can be analyzed or isolated after specific activation with antigens or mixtures of antigens. Fisher et al. on the other hand describe that the observed CD154 expression is partly transient and is only extended to pro-inflammatory Thl cells generated in vitro after polyclonal stimulation.
  • the object of the present invention is therefore to provide methods with which all antigen-specific T lymphocytes can be detected or isolated simply, inexpensively and reliably, regardless of their functional potential.
  • the present invention solves this technical problem by using CD154 to detect and / or isolate T lymphocytes that recognize a particular antigen.
  • CD154 is a member of the TNF gene family and is expressed by various cells, in particular T-lymphocytes. CD154 is downregulated from the stimulated T lymphocytes one to three hours after activation.
  • Lymphocytes are the specific carriers of the immune response, and two large populations are known: the B and T lymphocytes.
  • the T lymphocytes have numerous surface molecules, of which the CD4 and CD8 proteins are of particular importance.
  • the CD4 T lymphocytes are also called helper T cells (Th cells) because they help to activate other cells by producing soluble messenger substances.
  • CD154 can be used to detect T lymphocytes regardless of their • functional potential.
  • the surprising advantage of using CD154 for the detection and separation of T lymphocytes is that the T lymphocytes can be reliably detected or isolated, regardless of their function, ie all antigen-specific T lymphocytes in a sample can be determined and be separated.
  • the use according to the invention thus advantageously provides a new, practical candidate for the determination of antigen-specific T lymphocytes.
  • the teaching disclosed accordingly also includes the therapeutic use of antigen-specific T cells after isolation on the basis of their antigen-reactive CD154 expression which can be induced after in vitro stimulation with defined antigens or antigen mixtures.
  • the T lymphocytes are Th lymphocytes, in particular CD4 + and / or CD8 + Th lymphocytes.
  • T cell lymphocyte populations use a T cell receptor for antigen recognition
  • T lymphocytes which are a heterodimeric molecule that consists of different chain combinations.
  • the vast majority of all T lymphocytes carry an alpha / beta T Cell receptor.
  • T lymphocytes have other surface molecules, in particular the CD4 and CD8 proteins.
  • CD8 lymphocytes are stimulated by antigens presented by MHC class I molecules and, as cytolytic T lymphocytes, are critical for virus defense.
  • CD4-T lymphocytes recognize antigens that are presented by MHC class II molecules and play an important role in the defense against bacteria, fungi, protozones and other parasites.
  • inflammatory, anti-inflammatory, regulatory and / or suppressive T lymphocytes are detected and / or obtained.
  • the invention also relates to a method for the detection and / or isolation of antigen-specific T lymphocytes in a suspension after activation with an antigen, the suspension being brought into contact with a CD40 / CD154 system inibotor, CD154 intra- or and / or determined extracellularly and the CD154-containing cells are detected and / or isolated.
  • CD40 is a 45-50 kDa membrane-bound glycoprotein from the TNF receptor gene family (tumor necrosis factor receptor gene family). It is expressed by various hematopoietic cell types, but also by eptithelial and endothelial cells, carcinomas, fibroblasts and muscle cells. It can be bound by CD154, which is accordingly a member of the TNF gene family and can also be expressed by many cells with very different functions. CD40 is expressed on various cells, such as B-
  • Lymphocytes dendritic cells, monocytes / macrophages
  • Thymic epithelial cells mouse
  • endothelial cells fibroblasts
  • CD154 is, for example, on T lymphocytes, activated dendritic cells (human), monocytes, mast cells
  • Lymphocytes (mouse), fetal thymocytes (mouse) and / or B-
  • CD40 / CD154 interactions have been described in accordance with the very heterogeneous expression pattern on different cell types.
  • the CD40 / CD154 system is an example of various systems that are based on receptor-ligand interactions and as such are of great importance in reactions of the immune system.
  • the CD40 / CD154 interactions between T lymphocytes and dendritic cells (DC) are among others. of importance in the induction and regulation of the immune response.
  • CD40 / CD154 interactions play a special role in the development of humoral antibody reactions.
  • the clinic showed particular clinical importance so-called X-chromosomal hyper-IgM syndrome; an immune disease in which the expression of a non-functional CD154 leads to a greatly reduced antibody formation and pyogenic infections.
  • signal transmission via CD40 / CD154 also influences, for example, the formation of thrombi in vivo and increases the development of arteriosclerosis.
  • CD154 which is characterized by T lymphocytes
  • T lymphocytes can also interact with CD40 expressed by various antigen-presenting cells (APC).
  • APC antigen-presenting cells
  • CD40 / CD154 system inhibitors can all molecules in the sense of the invention or even physical influences that are able to block or inhibit the interaction between CD40 and CD154.
  • the inhibiting agent can be an antibody which is directed, for example, against CD40, a molecule, a cesium or a lithium ion which influences the interaction between CD40 and CD154 with one another.
  • it can also be a substance that inhibits secretion or endocytosis in the cell, such as Brefeldin-A (Bref-A).
  • Bref-A is an inhibitor of the Golgi apparatus and the secretion of a large number of cytokines. These substances ensure that either CD40, CD154, the interaction between the two or the CD40 / CD154 system is modified in such a way that CD154 is either no longer regulated down or degraded on the cell surface, or, if it is still there located within the cell, is no longer transported within it. The breakdown of transport within the cell prevents the degradation of CD154. CD154 is thus stabilized inside or outside the cell as an external receptor and can be detected using detection methods known to the person skilled in the art and subsequently isolated. Various methods and devices are known to the person skilled in the art with which detected cells of the immune system can be separated, purified, enriched or isolated, for example flow cytometry or magnetic cell sorting.
  • CD154 characterized and following based on this Characterization can be isolated.
  • the method according to the invention thus provides in particular the new candidate according to the invention, CD154, for the determination of antigen-specific T lymphocytes.
  • Th lymphocytes are detected and / or separated as T lymphocytes, in particular CD4 + and / or CD8 + Th lymphocytes.
  • the CD40 / CD154 system inhibitor is an antibody directed against CD40, an antibody directed against CD154, a secretion inhibitor and / or an endocytosis inhibitor.
  • Various secretion inhibitors and edocytosis inhibitors are known to the person skilled in the art.
  • the antibody can be a polyclonal, monoclonal or a specifically modified antibody or an antibody fragment, for example an antibody that is associated with a phage or a phage fragment. It can be directed against a single epitope on CD40 or against several structures of CD40.
  • An antibody in the sense of the invention is a molecule which influences CD40 in such a way that an interaction with CD154 is advantageously no longer possible.
  • antibody therefore means a polypeptide which is essentially encoded by immunoglobulin genes or fragments thereof and which specifically binds or recognizes CD40.
  • epitope used in the present invention means any antigenic determinant on an antigen to which the paratope of an antibody binds.
  • Epitope detectors consist in particular of chemically active surface groupings of molecules such as amino acids or sugar side chains and usually have both specific features of the three-dimensional structure and specific charge features.
  • brefeldin-A and / or monsensin are used as the secretion inhibitor and / or the endocytosis inhibitor.
  • Brefeidin A is a metabolite of the fungus Penicillium brefeldianum and, as a carboxylated ionophore, blocks the transport of newly synthesized proteins from the endoplasmic reticulum into the Golgi apparatus and hinders the exchange between endosomes and lysomes, while the circulation between the cell membrane and endosomes advantageously remains undisturbed.
  • CD154 is detected intracellularly in fixed cells. Since CD154 is rapidly downregulated or degraded extracellularly as soon as an antigen-specific activation of, in particular, Th lymphocytes has taken place, CD154 can advantageously be detected intracellularly with high accuracy in vitro. In particular, the addition of Brefeldin A blocks the transport of the CD154 protein to the cell surface.
  • the analysis of the entire CD154, which is located intracellularly is possible in a very specific way, which enables an almost complete detection of, in particular, all reactive CD4 + Th lymphocytes.
  • the intracellular determination of CD154 results in a very good signal-to-noise ratio, which enables a very safe and efficient determination of the antigen-specific Th lymphocytes. 20
  • inflammatory, anti-inflammatory, regulatory. and / or suppressive T-lymphocytes detected and / or isolated and used for cellular therapies for preventive or causal treatment of infectious, allergic, inflammatory, malignant and / or autoimmune diseases.
  • inflammatory, anti-inflammatory, regulatory and / or suppressive T lymphocytes are detected and / or isolated and used for cellular therapies for preventive or causal treatment of diseases, the diseases being selected from the group comprising rheumatoid arthritis, multiple sclerosis , systemic lupus erythematosus, scleroderma, vasculitis, reactive arthritis, antonysing spondylitis, uveitis, Crohn's disease and / or diabetes.
  • the method according to the invention for the detection and isolation of antigen-specific T lymphocytes makes it possible, in particular, to use antigen-specific Th lymphocytes for cell therapy against various diseases, such as cancer or viral infections. So far, for example, Th lymphocytes in the form of cell lines or cell clones have been used for adoptive Th lymphocyte therapy. However, the production of these cell lines or cell clones is very complex and takes a long time.
  • the method according to the invention allows, for the first time, antigen-specific Th lymphocytes to be detected in a short time in vivo and in vitro by means of the detection of CD154 19
  • CD154 is detected extracellularly on vital cells.
  • antigen-specific CD4 + and / or CD8 + Th lymphocytes in the therapeutic or clinical field, it is necessary to detect the cells in such a way that their functionality is not adversely affected, that is to say that detection is advantageously designed in this way is that the cells can be detected alive and vital, so that they can subsequently be used to manufacture a drug. It is possible, for example, to neutralize CD40 using anti-CD40 antibodies in order to prevent the degradation of CD154 on the cell surface, which allows detection and isolation of antigen-specific CD4 + and / or CD8 + Th lymphocytes.
  • the antigen-specific T lymphocytes in particular CD4 + and / or CD8 + from fresh blood, frozen cells, peripheral mononuclear blood cells (PBMC) and / or from other body fluids.
  • PBMC peripheral mononuclear blood cells
  • the isolated and / or separated T lymphocyte cells which produce cytokines or no ⁇ having no defined cytokine pattern. It is therefore advantageously possible to detect and / or isolate all antigen-specific T lymphocytes, ie the entirety of this cell population which is directed against a specific antigen, regardless of whether these T lymphocytes produce cytokines or not or whether the T lymphocytes cannot be assigned to a defined cytokine pattern. detect and isolate. This makes it possible for the first time to select Th lymphocytes based on their antigen reactivity regardless of their phenotype.
  • the teaching according to the invention describes analytical or therapeutic methods, the basis of which is CD154 expression on antigen-specific T cells after stimulation in the presence of a CD154-CD40 system inhibitor.
  • the expression of the CD154 after stimulation with antigens or mixtures of antigens is not induced polyclonally on all T cells, but selectively on T cells with uniform, defined antigen specificity.
  • Systems in which polyclonal as described by Sch ⁇ nbeck et al. " stimulated with lectins, concavalin A, phorbol esters, cytokines or various antibodies, allow the activation of T cells in the absence of antigen-presenting cells.
  • antigen-presenting MHC molecules are essential to express cells
  • the method according to the invention is used for the analysis and isolation of antigen-specific T cells, the magnetic cell sorting being one of the possible methods for separating, cleaning, enriching or detecting the detected cells of the immune system. isolate.
  • CD154 as a marker for antigen-specific T-lymphocytes, it is advantageously possible to use specific T-lymphocytes, in particular for, from body fluids or artificial cell suspensions against a selected antigen or antigens cell therapeutic applications. It is advantageously possible to isolate specific T lymphocytes for expansion or with subsequent or direct adoptive transfer, these specific T lymphocytes being inflammatory or anti-inflammatory and in particular regulatory or suppressive T lymphocytes.
  • the kinetics of intracellular CD154 expression in antigen-reactive Th cells after in vitro stimulation of whole human blood with the superantigen staphylococcus enterotoxin B (SEB) was determined. 1 ml of whole blood from a normal healthy donor was cultured with or without SEB (1 ⁇ g / ml) at 37 ° C. for the times indicated. The secretion inhibitor BrefA was added for the last 2 hours of the culture. Analyzes limited to CD4 + Th cells are shown. 1 shows the kinetics of intracellular CD154 expression.
  • TT tetanus toxoid
  • allergen-specific Th cells in human whole blood, regardless of the type of reactively produced cytokines after in vitro stimulation with TT and allergen.
  • TT tetanus toxoid
  • allergen-specific Th cells in human whole blood, regardless of the type of reactively produced cytokines after in vitro stimulation with TT and allergen.
  • TT 10 ⁇ g / ml / allergen: 20 ⁇ g / ml
  • BrefA was added for hours. Analyzes limited to CD4 + Th cells are shown.
  • FIG. 3 The isolation of living tetanus toxoid (TT) -specific Th cells on the basis of the reactive CD154 expression from human peripheral mononuclear cells after in vitro stimulation with TT is shown in FIG. 3.
  • Peripheral mononuclear cells were obtained from approximately 20 ml of whole blood. These were cultivated for 6 hours with 10 ⁇ g / ml TT in the presence of a monoclonal anti-CD40 antibody at 37 ° C. All samples were labeled with antibodies against CD4-FITC, CD69-APC and CD154-PE. Propidium iodide was used to exclude dead cells.
  • 3A shows analyzes of CD154 expression in relation to the expression of the activation marker CD69 before isolation. After magnetic enrichment with PE-specific MicroBeads (3B), living CD4 + , CD154 + Th cells were further purified using the FACS ( Figure 3C). In FIGS. 3A and 3B, the analyzes are limited to CD4 + Th cells.
  • the invention permits "screening" for T cell reactivities with antigens or antigen mixtures.
  • cells in body fluids can either directly or after working up to mononuclear cells with the antigens or antigen mixtures for a short time in vitro under suitable conditions in order to then carry out a cytometric analysis of the reactive expression of CD154 after fixation.
  • This procedure can be used on the one hand in accompanying studies in vaccination studies, or in basic research to define previously undefined immune-relevant antigens.
  • the application allows, on the one hand, a complete detection of the specific, antigen-reactive T cells (in particular the CD4 + Th cells) and, on the other hand, independently of previously defined immunodominant peptide epitopes of the antigen or in Test-specific reagents to be produced prior to such investigations.
  • the application allows the evaluation of antigen-specific T cells with the most varied
  • the procedure also detects T cells that are not affected by the
  • the method can be used in addition to applications Do basic research of a complete evaluation of immune responses in a wide variety of clinical situations, such as infections with viruses, bacteria or other pathogens, or the analysis of immune responses against tumor or leukemia antigens. T cells that are involved in allergic reactions or that play important roles in immunopathological situations such as GvHD or GvL can also be analyzed. Ultimately, the method allows for the first time the direct analysis of regulatory T cells and in particular of so-called natural T "regulatory" cells, which until now could only be characterized by the expression of the transcription factor foxp3 and partly by the increased expression of the CD25 molecule.
  • the application also allows antigen-specific T cells to be isolated live for further functional tests and also for clinical applications.
  • Clinical applications include adoptive therapies with specific T cells for causal specific therapy for infections with viruses, bacteria or other pathogens, for tumors, leukemia or other malignant diseases, for allergies, autoimmune diseases or other immune-mediated diseases such as e.g. B. GvHD or GvL.
  • the prerequisite for this is that the application allows isolation of all of the specific T cells against immunogenic peptides, antigens or mixtures of antigens.
  • the application fulfills the requirement to isolate autoantigen-specific T cells from complex cell mixtures.
  • Such cells could be isolated on the one hand in patients with already "established” autoimmune diseases from body fluids such as, for example, peripheral blood on the basis of their reactive CD154 expression after in vitro stimulation with autoantigens relevant to the respective autoimmune diseases.
  • body fluids such as, for example, peripheral blood
  • diseases that may be treatable include diseases such as rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, scleroderma, vasculitedes and reactive arthritis , accumulating spondylitis, uveitis, Crohn's disease.
  • the application can also be used for prophylactic therapy with specific regulatory T cells from patients from risk groups for diseases such as diabetes or the autoimmune diseases already mentioned above.
  • the application also makes it possible to analyze antigen-specific T cells in non-human species or to isolate such specific T cells from complex cell mixtures for further purposes or studies. It is therefore not limited to research with human cells, but can e.g. B. with suitable species specific reagents in animal models e.g. B. be used to research infectious diseases such as HIV in monkeys. Furthermore, the application can be used for the ex vivo evaluation of defined immune responses or for the isolation of specific T cells in animal experimental systems such as the mouse or the rat.

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Abstract

Es wird die Verwendung von CD154 zum Nachweis und/oder zur Isolierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten und ein Verfahren zum Nachweis und/oder Isolierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten vorgeschlagen, wobei die Suspension mit einem CD40/CD154 Systeminhibitor in Kontakt gebracht wird, CD154 intra- oder extrazellulär bestimmt und die CD154 aufweisenden Zellen nachgewiesen und/oder isoliert werden.

Description

Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von T- Lymphozyten, die ein definiertes A tigen erkennen
Die Erfindung betrifft die Verwendung von CD154 zum
Nachweis und zur Isolierung von T-Lymphozyten, die ein definiertes Antigen erkennen, und ein Verfahren zum Nachweis und zur Isolierung von T-Lymphozyten in
Zellsuspensionen oder Körperflüssigkeiten, die ein definiertes Antigen erkennen.
Das Immunsystem besteht aus Zellen und Molekülen, die im Körper zirkulieren und deren Homeostase und Kooperation durch Zytokine und Wachstumsfaktoren aufeinander abgestimmt werden. Nicht benötigte Zellen werden durch Apoptose eliminiert. Diese Mechanismen werden durch äußere Einflüsse oder genetische Prädispositionen verschiedenster Art beeinflusst. Das Immunsystem spielt eine zentrale Rolle bei der Entstehung vieler Erkrankungen, insbesondere Allergien, Entzündungen und Autoi munerkrankungen. Es ist verantwortlich für eine verstärkte Immunität nach Impfungen, versagt jedoch bei der Entstehung von Tumorerkrankungen.
Dendritische Zellen (DC) sind die Wächter des Immunsystems und im Körper dort lokalisiert, wo fremde und möglicherweise gefährliche Stoffe eindringen können. Sie sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die das Antigen aufnehmen, verdauen, Peptidfragmente des Antigens spezifischen T-Lymphozyten präsentieren und sie dabei aktivieren. Die unreifen Vorläufer der DC wandern kontinuierlich über das Blut in die Lymphorgane, wo" sie unter bestimmen Umständen zu reifen DC differenzieren können. Es gibt verschiedene Vorläuferzellen, die zu unterschiedlichen Typen von DC ausreifen können. Diese unterschiedlichen Typen von DC reagieren auch unterschiedlich auf Antigene durch die Expression bestimmter Membranmoleküle und Zytokine . Auf diese Weise kontrollieren sie die Aktivierung der T-Lymphozyten, die dann pro- (Thl) oder antiinflammatorisch (Th2) , regulatorisch (Tr) oder tolerant (Ta) werden können. Die Art der Aktivierung der T-Lymphozyten wird durch kostimulatorische Aktivierungssignale von Antigen- präsentierenden Zellen bestimmt . Aktivierungssignale sind Liganden für Rezeptoren der T-Lymphozyten. Diese Liganden befinden sich auf der Oberfläche der APC, sie sind an die extrazelluläre Matrix gebunden oder sie werden von Zellen sezerniert, so die Zytokine. Neben der Antigen-spezifischen Aktivierung durch Signale über den Antigenrezeptor der T- Lymphozyten und kostimulierende Liganden ist jedoch auch eine unspezifische Aktivierung von T-Lymphozyten beschrieben; z. B. durch Zytokine oder durch Lektine.
Die Gesamtheit der molekularen Veränderungen bei der Aktivierungsreaktion und funktionellen Differenzierung von T-Lymphozyten ist jedoch derzeit nur unvollständig aufgeklärt. So ist auch die Erfassung des Aktivierungs- und Funktionszustandes von T-Lymphozyten, die ein bestimmtes Antigen erkennen, beim gegenwärtigen Stand der Technik nur ungenau möglich. Für klinische Anwendungen bei der Diagnostik von Krankheiten und in der Forschung ist es essentiell, insbesondere solche spezifischen T-Lymphozyten erfassen zu können, die durch ein bestimmtes Antigen aktiviert werden können oder aktivierbar sind. Weiterhin ist es wünschenswert, solche Antigen-spezifischen T-Lymphozyten aus Zellgemischen insbesondere für zelltherapeutische Zwecke isolieren zu können.
Im Stand der Technik sind mehrere Verfahren offenbart, mit denen der Aktivierungs- und Funktionszustand von T- Lymphozyten bestimmt werden kann. So offenbart die DE 100 21 834 AI mRNA-Moleküle zur Verwendung als Indikatoren für den Funktionszustand von T-Lymphozyten, wobei die mRNA-Moleküle bei aktivierten T-Lymphozyten im Vergleich zum Normal- bzw. zum Ruhezustand vermehrt oder vermindert exprimiert sind. Durch Bestimmung der Interaktion zwischen den komplementären, hybridisierten Nucleinsäuresequenzen ist es möglich, Unterschiede in der Expressionsstärke der mRNA-Moleküle zu bestimmen, was Rückschlüsse auf den Aktivierungszustand der T-Lymphozyten zulässt. Weiterhin offenbart diese Druckschrift die Verwendung von Polypeptiden, die durch die Nucleotidsequenzen codiert werden und gegen die Polypeptide gerichtete Antikörper sowie die Verwendung dieser Antikörper zum Nachweis des Aktivierungs- und Funktionszustandes von T-Lymphozyten.
Die DE 37 37 703 AI offenbart Antikörper, die gegen ein neutrophil aktivierendes Polypeptid gerichtet sind und als Diagnostikum eingesetzt werden können, um aktivierte Strukturen der zellulären Immunantwort zu detektieren und zu charakterisieren.
Die DE 42 26 974 C2 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Aufbereitung und Separation von Zellsuspensionen. Die beschriebene Separationsvorrichtung und das Verfahren zur kontinuierlichen Aufbereitung einer Zellsuspension kann verwendet werden, um unterschiedliche Bestandteile, beispielsweise des menschlichen Blutes zu separieren, wobei Zellen, die im Zusammenhang mit der zellulären Immunantwort stehen, spezifisch aufgereinigt werden können.
In der US-PS 5,874,302 wird ein Verfahren offenbart, mit dem T-Lymphozyten kultiviert werden und die so gewonnenen T-Lymphozyten zu klinischen Behandlungen von Tumoren eingesetzt werden. Gemäß der US-PS 5,874,302 wird Blut als Ausgangsmaterial für die Herstellung der T-Zellkultur- Suspension verwendet, wobei das entsprechende Startmaterial mit bestimmten Tumorzellen cokultiviert wird.
Die CA 1,296,622 offenbart ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Bestimmen des immunregulatorisehen Status von Leukozyten. Die Leukozyten werden mit
Standardsubstanzen- stimuliert, um den immunregulatorisehen
Status, beispielsweise mit Hilfe von markierten Antikörpern zu bestimmen. Zunächst wird hierzu eine Probe aus peripheren mononukleären Zellen des Patienten, der ein
Immun-beeinflussendes Mittel erhalten hat, vermehrt und anschließend wird in einem Aliquot der vermehrten Probe der
Prozentsatz von mononukleären Zellen bestimmt, welche ein
Aktivierungs-Antigen in vitro exprimieren. Anschließend wird der Prozentsatz mit einem vorgegebenen Wert des Prozentsatzes als Anzeige des in vitro Effektes verglichen, wodurch der immunregulatorische Zustand des Patienten bzw. des Effektes der Immun-beeinflussenden Therapie auf den immunregulatorisehen Zustand bestimmt werden kann. Zu den Unterklassen der zu bestimmenden mononukleären Zellen gehören beispielsweise T-Lymphozyten, cytotoxische T- Lymphozyten und Helfer-T-Lymphozyten.
In der WO 99/58977 wird ein Verfahren zur direkten Selektion von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten beschrieben. Die T-Lymphozyten werden hier anhand der Produktion von Zytokinen mittels Durchfluss-Zytometrie oder der magnetischen Zellsortierung separiert. Es werden hier solche aktivierte T-Lymphozyten selektiert, die nach Stimulation mit Antigen ein bestimmtes oder mehrere bestimmte Zytokine exprimieren.
Weiterhin ist es mit den bekannten diagnostischen Verfahren nicht möglich, die Aktivierung durch eine virale oder bakterielle Infektion von einer Aktivierung durch eine Autoimmunreaktion oder durch eine Transplantatabstoßung zu unterscheiden, obwohl eine solche Unterscheidung aus diagnostischen und aus klinischen Gesichtspunkten heraus wünschenswert ist . Durch die unzureichende Detektion von aktivierten T-Lymphozyten in einer biologischen Probe ist es auch nicht möglich, diese entsprechenden Zellen gezielt zu separieren, da sie hierfür zunächst eindeutig bestimmt werden müssen.
Bisher sind keine immundiagnostischen Verfahren beschrieben, die einen schnellen und einfachen Nachweis der
Gesamtheit aller für ein Antigen spezifischen T-Lymphozyten und darüber hinaus deren Isolierung ermöglichen. Bei den verschiedensten Erkrankungen ist es von größtem diagnostischem und therapeutischen Interesse, die die Immunantworten zentral und somit auch verschiedenste Immunpathogenesen steuernden T-Lymphozyten direkt Antigen- spezifisch nachzuweisen oder sie für zelltherapeutische Ansätze, wie den adoptiven T-Zelltransfer, zu isolieren. Dies betrifft Erkrankungen wie Allergien und Autoimmunerkrankungen, denen fehlgesteuerte Immunreaktionen zu Grunde liegen wie auch chronische Infektionskrankheiten, Tu ore oder Leukämien.
Bisherigen Verfahren liegen zwei unterschiedliche Strategien zugrunde :
(i) Der „strukturelle" Nachweis Antigen- spezifischer T-Lymphozyten basiert auf der direkten Markierung der von den T-Lymphozyten ausgeprägten T- Zellrezeptoren mittels MHC-Multimeren, die zusammen mit den jeweiligen antigenen Peptiden komplexiert sind (US 5,635,363 / FR 9911133). Die Nachteile solcher Verfahren bestehen darin, dass sie zum einen abhängig von dem der zu untersuchenden Individuen ausgeprägten MHC-Genotyp sind und zum anderen dass die MHC-Moleküle nur mit einem immundominanten Peptidepitop des jeweiligen Antigens komplexiert werden. Jedes Agens muss somit individuell entsprechend des Genotyps und zu verwendenden immundominanten Peptidepitops, das zudem nur bei wenigen Antigenen und auch nur für wenige MHC-Allele bekannt ist, des Antigens hergestellt werden. Zudem konnten bisher die für den Nachweis und die Isolierung MHC-II restringierter Antigen-spezifischer CD4+ Th-Lymphozyten essentiellen MHC- II Multimere aufgrund besonderer struktureller Merkmale des MHC-II Moleküls nicht in für eine Anwendung ausreichender Qualität hergestellt werden.
(ii) Funktionale Nachweise Antigen-spezifischer T- Lymphozyten beruhen entweder auf der Antigen-reaktiven Proliferation nach Stimulation mit Antigen, die jedoch erst nach 3-5 Tagen detektierbar ist, oder auf Antigen-reaktiver Expression von Aktivierungsmolekülen oder Sekretion von Zytokinen. Während bisher beschriebene Aktivierungsmarker zum Teil auch von speziellen nicht aktivierten T- Lymphozyten ausgeprägt werden und daher nicht spezifisch genug sind, kann anhand der „reaktiven" Expression von Zytokinen nicht die Gesamtheit der spezifischen T- Lymphozyten nachgewiesen werden. Durch die unzureichende Detektion von spezifisch aktivierten T-Lymphozyten in einer biologischen Probe ist somit auch nicht möglich, diese entsprechenden Zellen gezielt zu separieren, da sie hierfür zunächst eindeutig bestimmt werden müssten.
Die bekannten Verfahren, bei denen spezifische T- Lyphozyten aufgrund ihrer Zytokin Sekretion detektiert und isoliert werden, beispielsweise nach der WO 99/58977, kann die Gesamtheit aller spezifischen T-Lymphozyten nicht bestimmt und isoliert werden, da sich oft jede aktivierte T-Zelle durch individuelle Zytokinprogramme auszeichnet.
Nachteilig bei den bekannten Verfahren der Isolierung von lebenden T-Lymphozyten anhand der Produktion von Zytokinen ist weiterhin, dass die Zellen zum Zeitpunkt ihrer maximalen Sekretionsleistung aus der Kultur herausgenommen werden, um an ihnen eine für die jeweiligen Zytokine spezifische „Fangmatrix" anzubringen. Danach müssen die Zellen für eine kurze Zeit wieder kultiviert werden. Dies erhöht den technischen Aufwand zur Gewinnung spezifischer T-Lymphozyten beträchtlich. Gerade in den letzten Jahren wurden in verschiedenen Veröffentlichungen immer wieder regulatorische T-Lymphozyten (Tr/Treg) beschrieben, denen sich keine definierten Zytokinuster zuordnen lassen, d.h. die Zellen sind anhand einer Zytokinsekretion nicht detektierbar oder isolierbar. Zudem ist die Expression bestimmter Zytokine (z. B. IL-10) auch entscheidend von der Art der gewählten in vitro Aktivierung abhängig.
Der bisherige Nachweis und die Isolierung von spezifischen T-Lymphozyten ist bisher auch deshalb limitiert, da zwar eine Reihe von Biomolekülen bekannt sind, die als Indikatoren bzw. Marker für bestimmte aktivierte T- Lymphozyten herangezogen werden können, jedoch ist es derzeit aufgrund der begrenzten Zahl und Qualität der verfügbaren Aktivierungsmarker nicht möglich, durch Bestimmung eines dieser Marker zu entscheiden, ob die T- Lymphozyten sich in dem gewünschten Zustand befinden. Beispielsweise wird der Aktivierungsmarker CD69 von allen T-Lymphozyten nach Aktivierung exprimiert. Jedoch führen auch jegliche Stresseinwirkungen zur Expression von CD69, so dass durch Bestimmung dieses Markers keine Aussage über die Antigen-spezifischen T-Lymphozyten möglich ist.
Im Stand der Technik ist die erhöhte Expression des CD154 auf CD4+ Th-Zellen als einen Marker für Krankheitsaktivität bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis (RA) bekannt (Berner et al . , 2000). In diesem Zusammenhang wird der Gebrauch von CD154 als spezieller prognostischer bzw. diagnostischer Marker bei einer Gruppe an RA erkrankter Patienten diskutiert. Es wird jedoch kein Verfahren zur Analyse und/oder Isolierung von Antigen-spezifischen T- Zellen offenbart oder nahegelegt . Solche Antigen- spezifischen T-Zellen sind durch eine auf ein definiertes Antigen oder ein definiertes Gemisch von Antigenen restringierte Reaktivität charakterisiert . In der Publikation von Berner et al . wird beispielsweise eine mögliche lange und erhöhte Expression des CD154 Moleküls auf vielen CD4+ Th-Zellen diskutiert (im Mittel ca. 45% in der RA CD40Lhl9ll+ Gruppe / Figure 1) . Diese sind aber nicht durch eine restringierte Antigenspezifität charakterisiert. Die Autoren selbst konstatieren, dass CD40L unter normalen Umständen „transient" auf aktivierten T-Zellen detektierbar ist. Bereits seit 1998 ist die Expression von CD40L auf aktivierten T-Zellen von vielen anderen Gruppen beschrieben. Jedoch ist auch hinlänglich bekannt, dass das CD40L Molekül nach Aktivierung in vitro mit spezifischen Antigenen als Marker für spezifische CD4+ Th-Lymphozyten nicht mehr zur Verfügung steht .
Im weiteren wird im Stand der Technik, z.B. in der Publikation von Berner et al . die therapeutische Anwendung von anti-CD40L Antikörpern bei RA-Patienten beschrieben.
Bei der „Antikörper-Therapie" mit anti-CD154 Antikörpern geht man ausgehend von tierexperimentellen Systemen davon aus, dass durch die Gabe des anti-CD154 Antikörpers T- Zellinteraktionen mit B-Zellen (Unterdrückung von humoraler
Immunität) und mit Antigen-präsentierenden Zellen
(Unterdrückung von chronischer Entzündung) beeinflusst werde .
Bekannt sind im Stand der Technik verschiedene Aspekte der Biologie von CD154, wobei im Detail die Struktur, die Regulierung der Expression, biologische Funktionen und medizinische Applikationen beschrieben ist (Schönbeck et al. , 2000) .
Schδnbeck et al . offenbaren, dass die Expression von CD154 transient ist. Ferner werden verschiedene polyklonale Stimuli beschrieben, die eine CD154 Expression auf allen T- Zellen zu induzieren vermögen.
Weiterhin sind Studien bekannt, in denen immunomagnetische Reagenzien zur Isolierung von Monozyten, oder T- Zellsubpopulationeneingesetzt werden und nachfolgend isolierte Fraktionen solcher Zellen elektronenmikroskopisch untersucht werden (Fisher et al . , 2002).
Die Signalübertragungswege des CD40 Moleküls in B- Lymphozyten sind teilweise gut analysiert. Auch Unter- suchungen zur Dauer der CD154 Expression auf T-Zellen sind offenbart. Diese Daten wurden in experimentellen Systemen gewonnen, in denen aber keine Antigen-spezifischen T-Zellen in Zellgemischen nach spezifischer Aktivierung mit Antigenen oder Gemischen von Antigenen analysiert oder isoliert werden können. Fisher et al . beschreiben hingegen, dass die beobachtete CD154 Expression zum Teil transient ist und nur auf in vitro nach polyklonaler Stimulation generierten proinflammatorischen Thl-Zellen verlängert ist.
Im Stand der Technik sind demgemäß keine Methoden offenbart, Antigen-spezifische T-Zellen aufgrund ihrer Antigen-reaktiven CD154 Expression therapeutisch verwenden zu können. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher Verfahren bereitzustellen, mit denen alle Antigen-spezifischen T- Lymphozyten unabhängig von ihrem funktionalen Potential einfach, kostengünstig und sicher detektiert bzw. isoliert werden können.
Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch eine Verwendung von CD154 zum Nachweis und/oder zur Isolierung von T-Lymphozyten, die ein bestimmtes Antigen erkennen.
CD154 ist ein Mitglied der TNF-Gen-Familie und wird unter anderem von verschiedenen Zellen, insbesondere T- Lymphozyten exprimiert. CD154 wird ein bis drei Stunden nach der Aktivierung von den stimulierten T-Lymphozyten herunterreguliert .
Lymphozyten stellen die spezifischen Träger der Immunantwort dar, wobei zwei große Populationen bekannt sind: Die B- und die T-Lymphozyten. Die T-Lymphozyten besitzen zahlreiche Oberflächenmoleküle, von denen das CD4- und das CD8-Protein von besonderer Bedeutung sind. Die CD4 T-Lymphozyten werden auch als Helfer-T- ellen (Th-Zellen) bezeichnet, da sie über die Produktion löslicher Botenstoffe bei der Aktivierung anderer Zellen mithelfen.
Lymphozyten und andere Leukozyten exprimieren viele verschiedene Moleküle auf ihrer Zelloberfläche . Einige erscheinen nur kurzzeitig während bestimmter Phasen der Differenzierung oder nach Aktivierung des Zellen. Andere Moleküle sind konstant und typisch für die jeweilige Zellreihe. Solche konstant exprimierenden Antigene können als Marker für bestimmte Zellpopulationen genutzt werden. Es gibt eine einheitliche Nomenklatur für Zelloberflächenmarker, das CD-System (CD = cluster of differentiation) , in welchem die Marker fortlaufend nummeriert sind. So kommen beispielsweise auf NK- und T- Lymphozyten CD 154 wie auch CD 165 oder andere Moleküle vor.
Überraschend war, dass CD154 verwendet werden kann, um T- Lymphozyten unabhängig von • ihrem funktionalen Potential nachzuweisen. Der überraschende Vorteil der Verwendung von CD154 zum Nachweis und zur Separation von T-Lymphozyten liegt darin, dass die T-Lymphozyten unabhängig von ihrer Funktion sicher detektiert bzw. isoliert werden können, d.h. alle Antigen-spezifischen T-Lymphozyten in einer Probe können bestimmt und separiert werden. Somit wird durch die erfindungsgemäße Verwendung vorteilhafterweise ein neuer praktikabler Kandidat für die Bestimmung von Antigen- spezifischen T-Lymphozyten bereitgestellt.
Die offenbarte Lehre beinhaltet demgemäss auch die therapeutische Anwendung von Antigen-spezifischen T-Zellen nach Isolierung anhand ihrer nach in vitro Stimulation mit definierten Antigenen oder Antigen-Gemischen induzierbaren Antigen-reaktiven CD154 Expression.
Nach einer besonderen Ausfuhrungsform der Erfindung sind die T-Lymphozyten Th-Lymphozyten, insbesondere CD4+ und/oder CD8+ Th-Lymphozyten. Für die Antigenerkennung benutzen T-Zell-Lymphozytenpopulationen eine T-Zellrezeptor
(TZR) , der ein heterodimeres Molekül darstellt, das aus verschiedenen Kettenkombinationen besteht . Der weitaus größte Teil aller T-Lymphozyten trägt einen alpha-/beta-T- Zellrezeptor. Diese T-Lymphozyten besitzen weitere Oberflächenmoleküle, insbesondere das CD4- und das CD8- Protein. CD8-Lymphozyten werden von Antigenen stimuliert, die von Klasse-I-Molekülen des MHC präsentiert werden und sind als zytolytische T-Lymphozyten für die Virusabwehr von entscheidender Bedeutung. CD4-T-Lymphozyten erkennen Antigene, welche von MHC-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden und haben einen wesentlichen Anteil an der Abwehr von Bakterien, Pilzen, Protozonen und anderen Parasiten.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden inflammatorische, antiinflammatorische, regulatorische und/oder suppressive T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder gewonnen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Nachweis und/oder Isolierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten in einer Suspension nach Aktivierung mit einem Antigen, wobei die Suspension mit einem CD40/CD154-System-Inibotor in Kontakt gebracht wird, CD154 intra- oder und/oder extrazellulär bestimmt und die CD154 aufweisenden Zellen nachgewiesen und/oder isoliert werden.
Es ist überraschend, dass durch das „Inkontakt" bringen der zu untersuchenden Suspension oder Probe mit einem CD40/CD154 System-Inhibitor CD154 intra- und/oder extrazellulär bestimmbar und somit die Zellen, die CD154 aufweisen, nachgewiesen und isoliert oder separiert werden können, wobei es sich bei diesen Zellen insbesondere um die Gesamtheit der Antigen-spezifischen CD4+ Th-Lymphozyten handelt . CD40 ist ein 45-50 kDa großes membranständiges Glycoprotein aus der TNF-Rezeptor-Genfamilie (Tumor-Nekrose-Faktor- Rezeptor-Genfamilie) . Es wird von verschiedenen hämatopoetischen Zelltypen aber auch von Eptithel- und Endothelzellen, Karzinomen, Fibroblasten und Muskelzellen ausgeprägt. Es kann von CD154 gebunden werden, das dementsprechend Mitglied der TNF-Gen-Familie ist und ebenfalls von vielen Zellen mit sehr unterschiedlichen Funktionen exprimiert werden kann. CD40 wird auf verschiedenen Zellen exprimiert, wie zum Beispiel B-
Lymphozyten, dendritische Zellen, Monozyten/Makrophagen,
Mastzellen, hämatopoetische Stamm-/Vorläuferzellen (human) ,
Thymusepithelzellen (Maus) , Endothelzellen, Fibroblasten
(Maus) , Muskelzellen (human) und/oder Karzinome (human) . CD154 wird beispielsweise auf T-Lymphozyten, aktivierte dendritischen Zellen (human) , Monozyten, Mastzellen
(human) , basophilen/eosinophilen Granulozyten (human) , NK-
Lymphozyten (Maus) , fetale Thymozyten (Maus) und/oder B-
Zellen (human) exprimiert .
Entsprechend der sehr heterogenen Expressionsmuster auf verschiedenen Zelltypen sind zahlreiche CD40/CD154 Wechselwirkungen beschrieben. Das CD40/CD154 System ist ein Beispiel für verschiedene Systeme, die auf Rezeptor- Liganden-Interaktionen basieren und als solche eine große Bedeutung bei Reaktionen des Immunsystems haben. Die CD40/CD154-Interaktionen zwischen T-Lymphozyten und dendritischen Zellen (DC) sind u.a.. von Bedeutung bei der Induktion und Regulation der Immunantwort von Bedeutung. Eine spezielle Stellung nehmen CD40/CD154 Interaktionen bei Entwicklung von humoralen Antikörperreaktionen ein. Eine besondere klinische Bedeutung zeigte sich bei dem sogenannten X-chromosomalen Hyper-IgM-Syndrόm; einer Immunerkrankung, bei der die Expression eines nicht- funktioneilen CD154 zu einer stark verminderten Antikörperbildung und pyogenen Infektionen führt . In anderen Zellen beeinflusst die Signalweiterleitung über CD40/CD154 aber auch beispielsweise die Entstehung von Thromben in vivo und verstärkt die Entwicklung von Arteriosklerose .
Die Bedeutung des von T-Lymphozyten ausgeprägten CD154 ist somit vor allem während der Interaktion mit B-Lymphozyten für die Entwicklung von humoralen Antikörperantworten essentiell. Anscheinend kann das von T-Lymphozyten ausgeprägte CD154 auch mit von verschiedenen Antigen- präsentierenden Zellen (APC) exprimiertem CD40 in Interaktion treten. Dies wird deutlich, da während der in vitro Stimulation mit spezifischen Antigenen CD154 auf aktivierte T-Lymphozyten sehr schnell herunter reguliert wird. Als für dieses Phänomen verantwortlich angesehen wird die Interaktion von CD154 auf den aktivierten T-Lymphozyten mit von in solchen Systemen auch von APC wie Monozyten stark exprimierten CD40. Die spezifisch von aktivierten T- Lymphozyten ausgeprägten CD154 Moleküle werden danach in den Zellen degradiert . Es steht dann in einem nicht durch das erfindungsgemäße Verfahren beeinflussten System als Marker für spezifische CD4+ Th-Lymphozyten nicht mehr zur Verfügung.
Durch die Zugabe eines CD40/CD154 System-Inhibitors wird die Wechsel- und Signalwirkung sowie Interaktion von CD40 und CD154 gestört bzw. inhibiert. CD40/CD154 System- Inhibitoren können im Sinne der Erfindung alle Moleküle oder auch physikalische Einwirkungen sein, die in der Lage sind, die Interaktion zwischen CD40 und CD154 zu blockieren oder zu inhibieren. Demgemäss kann das inhibierende Mittel ein Antikörper, der beispielsweise gegen CD40 gerichtet ist, sein, ein Molekül, ein Cäsium- oder ein Lithiumion, welches die Wechselwirkung zwischen CD40 und CD154 untereinander beeinflusst. Es kann selbstverständlich aber auch eine Substanz sein, die die Sekretion oder Endozytose in der Zelle inhibiert, wie z.B. Brefeldin-A (Bref-A). Bref-A ist ein Inhibitor des Golgi-Apparates und der Sekretion einer Vielzahl an Zytokinen. Durch diese Stoffe wird gewährleistet, dass entweder CD40, CD154, die Wechselwirkung zwischen den beiden bzw. das CD40/CD154 System so modifiziert wird, dass CD154 entweder auf der Zellober läche nicht mehr herunter reguliert bzw. abgebaut wird, oder, sofern es sich noch innerhalb der Zelle befindet, nicht mehr innerhalb dieser transportiert wird. Durch die Unterbrechung des Transportes innerhalb der Zelle wird der Abbau von CD154 verhindert. Somit wird CD154 innerhalb oder außerhalb der Zelle als außenstehender Rezeptor stabilisiert und kann mit dem Fachmann bekannten Nachweisverfahren detektiert und folgend isoliert werden. Dem Fachmann sind verschiedene Verfahren und Vorrichtungen bekannt, mit denen detektierte Zellen des Immunsystems separiert, aufgereinigt, angereichert bzw. isoliert werden können, z.B. die Durchflusszytometrie oder die magnetische ZeilSortierung.
Durch die Zugabe des CD40/CD154 System-Inhibitors wird der
Abbau oder die Degradation von CD154 innerhalb und/oder außerhalb der Zelle unterbunden, so dass die Zellen, die
CD154 aufweisen, charakterisiert und folgend anhand dieser Charakterisierung isoliert werden können. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird somit insbesondere der neue erfindungsgemäße Kandidat, CD154, für die Bestimmung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten bereitgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als T-Lymphozyten Th-Lymphozyten detektiert und/oder separiert, insbesondere CD4+ und/oder CD8+ Th-Lymphozyten.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung ist der CD40/CD154 System-Inhibitor ein gegen CD40 gerichteter Antikörper, ein gegen CD154 gerichteter Antikörper, ein Sekretionsinhibitor und/oder ein Endozytoseinhibitor. Dem Fachmann sind verschiedene Sekretionsinhibitoren und Edozytoseinhibitoren bekannt . Der Antikörper kann hierbei ein polyklonaler, monoklonaler bzw. ein spezifisch modifizierter Antikörper oder ein Antikörperfragment, beispielsweise ein Antikörper sein, der mit einem Phagen oder einem Phagenfragment assoziiert ist. Er kann sowohl gegen ein einzelnes Epitop auf CD40 bzw. gegen mehrere Strukturen von CD40 gerichtet sein. Ein Antikörper im Sinne der Erfindung ist ein Molekül, welches CD40 so beeinflusst, dass eine Wechselwirkung mit CD154 vorteilhafterweise nicht mehr möglich ist . Antikörper bedeutet daher im Zusammenhang mit der Erfindung ein Polypeptid, das im Wesentlichen von Immunoglobulin-Genen oder Fragmenten davon codiert wird, das CD40 spezifisch bindet bzw. erkennt. Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Epitop bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante auf einem Antigen, an das das Paratop eines Antikörpers bindet . Epitop- Deter inaten bestehen insbesondere aus chemisch aktiven Oberflächengruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zuckerseitenketten und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen Struktur als auch spezifische Ladungsmerkmale.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung werden als der Sekretionsinhibitor und/oder der Endozytoseinhibitor Brefeldin-A und/oder Monsensin verwendet. Brefeidin A ist ein Metabolit des Pilzes Penicillium brefeldianum und blockiert als carboxyliertes Ionophor den Transport neu synthetisierter Proteine vom endoplasmatischen Retikulum in den Golgi-Apparat und behindert den Austausch zwischen Endosomen und Lysomen während der Kreislauf zwischen Zellmembran und Endosomen vorteilhafterweise ungestört bleibt.
In einer weiteren, besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird CD154 intrazellulär in fixierten Zellen detektiert. Da CD154 extrazellulär schnell herunterreguliert bzw. abgebaut wird, sobald eine Antigen- spezifische Aktivierung von insbesondere Th-Lymphozyten stattgefunden hat, kann CD154 mit Vorteil intrazellulär mit hoher Genauigkeit in-vitro detektiert werden. Insbesondere durch die Zugabe von Brefeldin A wird der Transport des Proteins CD154 an die Zelloberfläche blockiert. Vorteilhafterweise ist hierdurch die Analyse des gesamten CD154, welches sich intrazellulär befindet, auf sehr spezifische Weise möglich, was eine nahezu vollständige Detektion von insbesondere allen reaktiven CD4+ Th- Lymphozyten ermöglicht. Durch die intrazelluläre Bestimmung von CD154 wird ein sehr gutes Signal-Rausch-Verhältnis erreicht, was eine sehr sichere und effiziente Bestimmung der Antigen-spezifischen Th-Lymphozyten ermöglicht. 20
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in inflammatorische, antiflammatorische, regulatorische. und/oder suppressive T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert und für zelluläre Therapien zur präventiven oder kausalen Behandlung von infektiösen, allergischen, inflammatorischen, malignen und/oder autoimmunen Erkrankungen eingesetzt.
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform werden inflammatorische, antiinflammatorische, regulatorische und/oder suppressive T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert und für zelluläre Therapien zur präventiven oder kausalen Behandlung von Erkrankungen eingesetzt, wobei die Erkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe umfassend rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus, Sklerodermie, Vaskuliteden, reaktiver Arthritis, ankolysierender Spondylitis, Uveitis, Morbus Crohn und/oder Diabetes .
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion und zur Isolierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten, beispielsweise CD4+ Th-Lymphozyten, erlaubt es, insbesondere Antigen-spezifische Th-Lymphozyten für die Zelltherapie gegen verschiedene Krankheiten, wie beispielsweise Krebs oder virale Infektionen einzusetzen. Bisher wurden z.B. Th-Lymphozyten in Form von Zelllinien oder Zellklonen für die adoptive Th-Lymphozytentherapie verwandt. Die Herstellung dieser Zelllinien bzw. Zellklonen ist jedoch sehr aufwendig und benötigt einen langen Zeitraum. Das er indungsgemäße Verfahren erlaubt es erstmalig, Antigen-spezifische Th-Lymphozyten mittels der Detektion von CD154 in kurzer Zeit in vivo wie in vitro zu 19
In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird CD154 extrazellulär auf vitalen Zellen detektiert. Um insbesondere Antigen-spezifische CD4+ und/oder CD8+ Th- Lymphozyten im therapeutischen oder klinischen Bereich einzusetzen, ist es erforderlich, die Zellen so zu detektieren, dass sie in ihrer Funktionalität nicht negativ beeinflusst werden, d.h., dass ein Nachweis vorteilhafterweise so gestaltet ist, dass die Zellen lebend und vital detektiert werden können, um sie folgend zur Herstellung eines Arzneimittels verwenden zu können. Es ist beispielsweise möglich, mittels anti-CD40-Antikörper CD40 zu neutralisieren, um den Abbau von CD154 auf der Zelloberfläche zu verhindern, was eine Detektion und Isolierung von Antigen-spezifischen CD4+ und/oder CD8+ Th- Lymphozyten erlaubt.
Es ist bevorzugt, die Antigen-spezifischen T-Lymphozyten, insbesondere CD4+ und/oder CD8+ aus Frischblut, gefrorenen Zellen, periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und/oder aus anderen Körperflüssigkeiten zu gewinnen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die isolierten und/oder separierten T-Lymphozytenzellen, die keine Cytokine produzieren bzw. ~ die kein definiertes Zytokinmuster aufweisen. Mit Vorteil ist es also möglich, alle Antigen-spezifischen T-Lymphozyten, d. h. die Gesamtheit dieser Zellpopulation, die gegen ein bestimmtes Antigen gerichtet ist, zu detektieren und/oder zu isolieren, und zwar unabhängig davon, ob diese T- Lymphozyten Cytokine produzieren oder nicht oder ob die T- Lymphozyten sich keinen definiertem Zytokinmuster zuordnen lassen. detektieren und zu isolieren. Somit ist es erstmals möglich, Th-Lymphozyten aufgrund ihrer Antigenreaktivität unabhängig von ihren Phänotyp zu selektieren.
Die erfindungsgemäße Lehre beschreibt analytische oder therapeutische Verfahren, deren Grundlage die CD154 Expression auf Antigen-spezifischen T-Zellen nach Stimulation in Gegenwart von einem CD154-CD40 Systeminhibitor ist . In der beanspruchten Lehre wird die Expression des CD154 nach Stimulation mit Antigenen oder Gemischen von Antigenen nicht polyklonal auf allen T-Zellen sondern selektive auf T-Zellen mit einheitlicher, definierter Antigenspezifität induziert. Systeme in denen polyklonal wie von Schδnbeck et al ." beschrieben mit Lektinen, Concavalin A, Phorbolestern, Zytokinen oder verschiedenen Antikörpern stimuliert wird, erlauben die Aktivierung von T-Zellen in der Abwesenheit von Antigen- präsentierenden Zellen. Im erfindungsgemäßen. Verfahren sind Antigen-präsentierende MHC-Moleküle expri ierende Zellen essentiell, um eine physiologische Stimulation ausschließlich der spezifischen T-Zellen zu induzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren dient der Analyse und Isolierung Antigen-spezifischer T-Zellen, wobei die magnetische Zellsortierung eines der möglichen Verfahren ist, die detektierten Zellen des Immunsystems zu separieren, aufzureinigen, anzureichern bzw. zu isolieren.
Mit Vorteil ist es durch die Verwendung von CD154 als Marker für Antigen-spezifische T-Lymphozyten möglich, beispielsweise aus Körperflüssigkeiten oder künstlichen Zellsuspensionen gegen ein gewähltes Antigen oder gewählte Antigene spezifische T-Lymphozyten, insbesondere für zelltherapeutische Anwendungen, zu gewinnen. Vorteilhafterweise ist es möglich, spezifische T- Lymphozyten zur Expansion oder mit nachfolgendem oder direktem adoptiven Transfer zu isolieren, wobei diese spezifischen T-Lymphozyten inflammatorische oder antiinflammatorische und insbesondere regulatorische oder suppressive T-Lymphozyten darstellen.
Im folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen veranschaulicht werden, ohne die Erfindung darauf zu beschränken.
Beispiel 1
Die Kinetik der intrazellulären CD154 Expression in Antigen-reaktiven Th-Zellen nach in vitro Stimulation von humanen Vollblut mit dem Superantigen Staphylocokkus Enterotoxin B (SEB) wurde bestimmt. Jeweils 1ml Vollblut eines normalen gesunden Spenders wurde für die angegebenen Zeiten mit oder ohne SEB (lμg/ml) bei 37°C kultiviert. Für die letzten 2 Stunden der Kultur wurde der Sekretionsinhibitor BrefA zugegeben. Es sind auf CD4+ Th- Zellen begrenzte Analysen gezeigt. In Fig. 1 ist die Kinetik der intrazellulären CD154 Expression gezeigt.
Beispiel 2
Fig. 2 zeigt den Nachweis Tetanus-Toxoid- (TT) -spezischer Th-Zellen und Allergen-spezischer Th-Zellen in humanem Vollblut unabhängig von der Art der reaktiv produzierten Zytokine nach in vitro Stimulation mit TT und Allergen. Jeweils 1ml Vollblut gesunder Spender wurde mit oder ohne die angegebenen Antigene (TT: lOμg/ml / Allergen: 20μg/ml) für 6 Stunden bei bei 37°C kultiviert. Für die letzten 4 Stunden wurde der Sekretionsinhibitor BrefA zugegeben. Es sind auf CD4+ Th-Zellen begrenzte Analysen gezeigt.
Beispiel 3
Die Isolierung von lebenden Tetanus-Toxoid- (TT) - spezifischen Th-Zellen anhand der reaktiven CD154 Expression aus humanen peripheren mononukleären Zellen nach in vitro Stimulation mit TT ist in Fig. 3 dargestellt. Aus ca. 20ml Vollblut wurden periphere mononukleäre Zellen gewonnen. Diese wurden für 6 Stunden mit lOμg/ml TT in Gegenwart eines monoklonalen anti-CD40 Antikörpers bei 37°C kultiviert. Alle Proben wurden mit Antikörpern gegen CD4- FITC, CD69-APC und CD154-PE markiert. Zum Ausschluss von toten Zellen wurden Propidiumjodid verwendet. In 3A sind Analysen der CD154 Expression im Verhältnis zur Expression des Aktivierungsmarkers CD69 vor Isolierung gezeigt. Nach einer magnetischen Anreicherung mit PE-spezifische MicroBeads (3B) wurden lebende CD4+, CD154+ Th-Zellen weiter mit dem FACS aufgereinigt (Figure 3C) . In den Figuren 3A und 3B sind die Analysen auf CD4+ Th-Zellen begrenzt .
Im folgenden sollen die potentiellen Anwendungs- möglichkeiten der Erfindung anhand von weiteren Beispielen hervorgehoben werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Beispiel 4
Die Erfindung erlaubt ein „Screening" nach T- Zellreaktivitäten mit Antigenen oder Antigenmischungen. Hierzu können Zellen in Körperflüssigkeiten entweder direkt oder nach Aufarbeitung zu mononukleären Zellen mit den Antigenen oder Antigenmischungen für kurze Zeit in vitro unter geeigneten Bedingungen inkubiert werden, um dann nach Fixierung eine zytometrische Analyse der reaktiven Expression von CD154 vorzunehmen. Diese Vorgehensweise kann zum einen in Begleituntersuchungen bei Impfstudien Anwendung finden, oder auch in der Grundlagenforschung, um bisher nicht definierte immunrelevante Antigene zu definieren. Bei beiden Anwendungen ist es von großer Bedeutung, dass die Anwendung zum einen eine komplette Erfassung der spezifischen, Antigen-reaktiven T-Zellen erlaubt (insbesondere der CD4+ Th-Zellen) und zum anderen unabhängig von zuvor definierten immundominanten Peptid- Epitopen des Antigens oder im Vorfeld solcher Untersuchungen herzustellenden Probanden-spezifischen Reagenzien ist.
Beispiel 5
Die Anwendung erlaubt die Evaluation von Antigen- spezifischen T-Zellen mit den unterschiedlichsten
Funktionen. Hierbei können es sich um inflammatorische T-
Zellen, charakterisiert durch die reaktive Expression von z. B. IFNg, TNFa oder IL-2, antiinflammatorische T-Zellen, charakterisiert durch die reaktive Expression von z. B. IL- 4, IL-5 oder IL-13, aber auch regulatorische T-Zellen handeln, die durch die Antigen-reaktive Expression von IL-
10 oder TGFb charakterisiert sind. Ferner werden mit dem
Verfahren auch T-Zellen erfasst, die sich nicht durch die
Expression spezifischer Zytokine. charakterisieren lassen. Somit kann das Verfahren neben Anwendungen- in der Grundlagenforschung einer kompletten Evaluation von Immunantworten in den verschiedensten klinischen Situationen leisten, wie- bei Infektionen mit Viren, Bakterien oder anderen Pathogenen oder der Analyse von Immunantworten gegen Tumor- oder Leukämieantigene. Ferner können auch T-Zellen analysiert werden, die an allergischen Reaktionen beteiligt sind oder die in immunpathologischen Situationen wie GvHD oder GvL tragende Rollen spielen. Letztlich erlaubt das Verfahren erstmals die direkte Analyse von regulatorischen T-Zellen und insbesondere von sogenannten natürlichen T „regulatorischen" Zellen, die bisher nur durch die Expression des Transkriptionsfaktors foxp3 und zum Teil durch die erhöhte Expression des CD25 Moleküls charakterisierbar waren.
Beispiel 6
Die Anwendung erlaubt es ferner Antigen-spezifische T- Zellen für die weitere funktionale Untersuchungen und auch für klinische Anwendungen lebend zu isolieren. Zu den klinischen Anwendungen gehören unter anderem adoptive Therapien mit spezifischen T-Zellen zur kausalen spezifischen Therapie bei Infektionen mit Viren, Bakterien oder anderen Pathogenen, bei Tumor, Leukämie oder anderen malignen Erkrankungen, bei Allergien, Autoimmunerkrankungen oder anderen immun-vermittelten Erkrankungen wie z. B. GvHD oder GvL. Die Voraussetzung bietet sich hierzu, da die Anwendung eine Isolierung der Gesamtheit aller spezifischen T-Zellen gegen immunogene Peptide, Antigene oder Gemische von Antigenen erlaubt . Beispiel 7
Die Anwendung erfüllt im Besonderen die Voraussetzung, dass Autoantigen-spezifische T-Zellen aus komplexen Zellgemischen zu isolieren. Solche Zellen könnten zum einen bei Patienten mit bereits „etablierten" Autoimmunerkrankungen aus Körperflüssigkeiten wie z. B. peripherem Blut anhand ihrer reaktiven CD154 Expression nach in vitro Stimulation mit bei den jeweiligen Autoimmunerkrankungen relevanten Autoantigenen isoliert werden. Danach könnten die gewonnenen Zellen nach Expansion in die Patienten reinfundiert werden. So wäre erstmals eine spezifische Unterdrückung der Autoimmunreaktionen und damit eine kausale Therapie möglich. Zu den möglicherweise so therapierbaren Erkrankungen gehören unter anderem Krankheiten wie die rheumatoide Arthritis, die multiple Sklerose, der systemische Lupus erythematosus, die Sklerodermie, Vaskuliteden, reaktive Arthritis, ankolysierende Spondylitis, Uveitis, Morbus Crohn.
Die Anwendung kann auch zur prophylaktischen Therapie mit spezifischen regulatorischen T-Zellen von Patienten aus Risikogruppen bei Erkrankungen wie Diabetes oder den oben bereits genannten Autoimmunerkrankungen genutzt werden.
Beispiel 8
Die Anwendung erlaubt es ferner Antigen-spezifische T- Zellen auch in nicht-humanen Spezies zu analysieren bzw. für weitere Zwecke oder Untersuchungen solche spezifischen T-Zellen aus komplexen Zellgemischen zu isolieren. Sie ist somit nicht auf Erforschungen mit humanen Zellen beschränkt, sondern kann z. B. mit geeigneten Spezies- spezifischen Reagenzien in Tiermodellen z. B. zur Erforschung von infektiösen Erkrankungen wie HIV in Affen eingesetzt werden. Weiter kann die Anwendung zur ex vivo Evaluation von definierten Immunantworten oder zur Isolierung spezifischer T-Zellen in tierexperimentellen Systemen wie der Maus oder der Ratte eingesetzt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von CD154 zum Nachweis und/oder zur Isolierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als T-Lymphozyten CD4+ und/oder CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert werden.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass inflammatorische, antiflammatorische, regulatorische und/oder suppressive T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert werden.
4. Verfahren zum Nachweis und/oder Isolierung von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten in einer Suspension nach Aktivierung mit einem Antigen, wobei die Suspension mit einem CD40/CD154 Systeminhibitor in Kontakt gebracht wird, CD154 intra- oder extrazellulär bestimmt und die CD154 aufweisenden Zellen detektiert und/oder separiert werden.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als T-Lymphozyten CD4+ und/oder CD8+ T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert werden. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass als CD40/CD154 Systeminhibitor ein anti-CD40-
Antikörper, ein anti-CD154-Antikörper, CD40 oder CD154 blockierende Substanzen, ein Sekretionsinhibitor und/oder Endozytoseinhibitor verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als Sekretionsinhibitor und/oder Endozytoseinhibitor Brefeidin A und/oder Monsensin verwendet werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, dass
CD154 intrazellulär oder extrazellulär in fixierten Zellen detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass
CD154 intrazellulär oder extrazellulär auf vitalen
Zellen detektiert wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die T-Lymphozyten isoliert und/oder separiert werden, die kein definiertes Zytokinmuster aufweisen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass inflammatorische, antiflammatorische, regulatorische und/oder suppressive T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert werden und für zelluläre Therapien zur präventiven oder kausalen Behandlung von infektiösen, allergischen, inflammatorisehen, malignen und/oder autoimmunen Erkrankungen eingesetzt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass inflammatorische, antiflammatorische, regulatorische und/oder suppressive T-Lymphozyten nachgewiesen und/oder isoliert werden und für zelluläre Therapien zur präventiven oder kausalen Behandlung von Erkrankungen ausgewählt aus der Gruppe umfassend rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, systemischen Lupus erythematosus, Sklerodermie, Vaskuliteden, reaktive Arthritis, ankolysierende Spondylitis, Uveitis, Morbus Crohn und/oder Diabetes eingesetzt werden.
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005045009A1 (en) * 2003-07-23 2005-05-19 President And Fellows Of Harvard College Methods for isolating t cells and uses thereof
US20100189728A1 (en) * 2005-08-05 2010-07-29 Dolores Schendel Generation of Antigen Specific T Cells
EP2518504A1 (de) 2011-04-29 2012-10-31 Miltenyi Biotec GmbH Verfahren zur quantitativen und qualitativen Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen, die ein spezifischen Antigen erkennen
US8697854B2 (en) 2008-11-24 2014-04-15 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt Gmbh High affinity T cell receptor and use thereof
US9238063B2 (en) 2001-03-16 2016-01-19 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundlheit und Umwelt (GmbH) Semi-allogenic anti-tumour vaccine with HLA haplo-identical antigen-presenting cells
EP2985342A1 (de) 2014-08-15 2016-02-17 Miltenyi Biotec GmbH Immunogene Antigene aus Aspergillus fumigatus
WO2019028028A1 (en) * 2017-08-01 2019-02-07 Benaroya Research Institute At Virgina Mason METHODS OF IDENTIFICATION AND SEPARATION OF PRO-ALLERGIC SPECIFIC T LYMPHOCYTES

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1291231C (zh) * 2003-12-08 2006-12-20 胡军 活化淋巴细胞特异性的检测方法
US8790916B2 (en) 2009-05-14 2014-07-29 Genestream, Inc. Microfluidic method and system for isolating particles from biological fluid
DE102009040716B4 (de) 2009-09-10 2011-07-14 Miltenyi Biotec GmbH, 51429 Verwendung von CD154 zur Identifizierung und Abtrennung von nicht-regulatorischen T-Zellen aus einem Gemisch mit regulatorischen T-Zellen
EP2597463A1 (de) 2011-11-22 2013-05-29 Medizinische Hochschule Hannover Verfahren zur Anreicherung und Isolierung von regulierenden T-Zellen und Verwendung davon
US20240159740A1 (en) 2021-03-19 2024-05-16 Charité - Universitätsmedizin Berlin Method for direct analysis of functional avidity of t cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058977A1 (en) * 1998-05-11 1999-11-18 Miltenyi Biotec Gmbh Method of direct selection of antigen-specific t cells

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1299542A2 (de) * 2000-06-06 2003-04-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Nichtagonistische antikörper gegen humanes gp39, zusammensetzungen und deren verwendungen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999058977A1 (en) * 1998-05-11 1999-11-18 Miltenyi Biotec Gmbh Method of direct selection of antigen-specific t cells

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERNER B ET AL: "INCREASED EXPRESSION OF CD40 LIGAND (CD154) ON CD4+ T CELLS AS A MARKER OF DISEASE ACTIVITY IN RHEUMATOID ARTHRITIS", ANNALS OF THE RHEUMATIC DISEASES, BRITISH MEDICAL ASSOCIATION, LONDON, GB, vol. 59, 2000, pages 190 - 195, XP002937171, ISSN: 0003-4967 *
DATABASE BIOSIS [online] BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US; 20 March 2002 (2002-03-20), LEE BYUNG O ET AL: "The biological outcome of CD40 signaling in B lymphocytes is dependent on the duration of CD154 expression on T cells: Reciprocal regulation by IL-4 and IL-12.", XP002228655, Database accession no. PREV200200353975 *
FASEB JOURNAL, vol. 16, no. 4, 20 March 2002 (2002-03-20), Annual Meeting of the Professional Research Scientists on Experimental Biology;New Orleans, Louisiana, USA; April 20-24, 2002, March 20, 2002, pages A350, ISSN: 0892-6638 *
FISHER P J ET AL: "Immunomagnetic separation reagents as markers in electron microscopy", JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 262, no. 1-2, 1 April 2002 (2002-04-01), pages 95 - 101, XP004352178, ISSN: 0022-1759 *
SCHOENBECK U ET AL: "CD154 (CD40 LIGAND)", INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND CELL BIOLOGY, EXETER, GB, vol. 32, no. 7, July 2000 (2000-07-01), pages 687 - 693, XP001053568, ISSN: 1357-2725 *
VALMORI D ET AL: "ANTIGEN-TARGETED APPROACH TO ADOPTIVE TRANSFER THERAPY OF CANCER", CANCER RESEARCH, AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, BALTIMORE, MD, US, vol. 59, no. 9, 1999, pages 2167 - 2173, XP000887155, ISSN: 0008-5472 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9597384B2 (en) 2001-03-16 2017-03-21 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) Semi-allogenic anti-tumour vaccine with HLA haplo-identical antigen-presenting cells
US9238063B2 (en) 2001-03-16 2016-01-19 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum für Gesundlheit und Umwelt (GmbH) Semi-allogenic anti-tumour vaccine with HLA haplo-identical antigen-presenting cells
WO2005045009A1 (en) * 2003-07-23 2005-05-19 President And Fellows Of Harvard College Methods for isolating t cells and uses thereof
US20100189728A1 (en) * 2005-08-05 2010-07-29 Dolores Schendel Generation of Antigen Specific T Cells
US8486694B2 (en) * 2005-08-05 2013-07-16 Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungzentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH Generation of antigen specific T cells
US8697854B2 (en) 2008-11-24 2014-04-15 Helmholtz Zentrum München Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt Gmbh High affinity T cell receptor and use thereof
US9862755B2 (en) 2008-11-24 2018-01-09 Max-Delbrueck-Centrum Fuer Molekulare Medizin High affinity T cell receptor and use thereof
US10626159B2 (en) 2008-11-24 2020-04-21 Max-Delbrueck-Centrum Fuer Molekulare Medizin High affinity T cell receptor and use thereof
EP2518504A1 (de) 2011-04-29 2012-10-31 Miltenyi Biotec GmbH Verfahren zur quantitativen und qualitativen Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen, die ein spezifischen Antigen erkennen
EP2518505A1 (de) 2011-04-29 2012-10-31 Miltenyi Biotec GmbH Verfahren zur quantitativen und qualitativen Charakterisierung von antigenspezifischen T-Zellen, die ein spezifischen Antigen erkennen
EP2985342A1 (de) 2014-08-15 2016-02-17 Miltenyi Biotec GmbH Immunogene Antigene aus Aspergillus fumigatus
EP2993227A2 (de) 2014-08-15 2016-03-09 Miltenyi Biotec GmbH Immunogene antigene aus aspergillus fumigatus
WO2019028028A1 (en) * 2017-08-01 2019-02-07 Benaroya Research Institute At Virgina Mason METHODS OF IDENTIFICATION AND SEPARATION OF PRO-ALLERGIC SPECIFIC T LYMPHOCYTES

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