DE10238922A1

DE10238922A1 - Immunmarker zur Diagnostik und Therapie im Zusammenhang mit Transplantat-Reaktionen

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Publication number: DE10238922A1
Application number: DE10238922A
Authority: DE
Inventors: Birgit Dr. Summertown Sawitzki; Hans-Dieter Prof. Dr. Volk; Kathryn Prof. Dr. Headington Wood; Manfred Dr. Lehmann
Original assignee: Universitatsklinikum Charite Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2002-08-22
Filing date: 2002-08-22
Publication date: 2004-03-04
Also published as: WO2004018504A2; EP1532272A2; AU2003270097A8; WO2004018504A3; AU2003270097A1; US20080044403A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Immunmarker zur Detektion von Entzündungen, Immunreaktionen und insbesondere von Transplantattoleranzen bzw. Transplantat-Reaktionen, ein Verfahren zur Detektion von Transplantat-Reaktionen oder -toleranzen sowie die Verwendung von Immunmarkern zur medizinischen Prophylaxe, klinischen Verlaufskontrolle, Transplantat-Nachbehandlung, der klinischen Diagnostik und/oder der Therapie im Zusammenhang mit Zell-, Gewebe- bzw. Organtransplantationen.

Description

Die Erfindung betrifft Nucleinsäuremoleküle als Immunmarker zur Detektion von Transplantat-Reaktionen, ein Verfahren zur Detektion von Transplantat-Reaktionen sowie die Verwendung von Immunmarkern zur medizinischen Prophylaxe, klinischen Verlaufskontrolle, Transplantatnachbehandlung, der klinischen Diagnostik und/oder der Therapie im Zusammenhang mit Zell-, Gewebe- bzw. Organtransplantationen, wobei Transplantat-Reaktionen eine Toleranz, eine Rejektionskrise oder eine Abstoßung sein können.
Für eine erfolgreiche Organtransplantation ist es notwendig, dass das Spenderorgan histologisch möglichst weitgehend mit dem Empfängergewebe übereinstimmt. Diese Übereinstimmung wird unter anderem durch das HLA-System (Abk. für (engl.) human leucocyte antigen) bestimmt. Dabei handelt es sich um ein komplexes System von Gewebeantigenen, die auf fast allen Zellen vorkommen. Dieses System spielt eine wichtige physiologische Rolle bei immunologischen Abwehrreaktionen (Erkennung von „Selbst" und „Nichtselbst"). Vor jeder Transplantation wird deshalb eine so genannte Gewebetypisierung bei Organspender und – empfänger vorgenommen, um eine möglichst weitgehende HLA-Kompatibilität zu gewähren.
Aufgrund des extremen genetischen Polymorphismus existiert eine außerordentlich große Anzahl verschiedener HLA-Moleküle. Eine vollständige Übereinstimmung wird ausschließlich bei eineiigen Zwillingen beobachtet, ansonsten sind HLA-Moleküle für jeden Menschen einzigartig.
Problematisch ist jedoch, dass trotz einer weitgehenden HLA-Übereinstimmung zwischen Empfänger und Spender eine Abstoßungsreaktion gegen das transplantierte Organ nicht ausgeschlossen werden kann. Trotz dieser Schwierigkeiten stellt die Transplantation die Therapie der Wahl, bei irreversiblem Organversagen dar.
Der ansteigende Bedarf an Organtransplantationen zusammen mit dem verminderten Angebot an Organen sowie die oben beschriebenen Probleme erfordern eine Optimierung der bekannten Therapien. Durch die Einführung neuer verbesserter Immunsuppressiva konnte die 1-Jahrüberlebensrate auf 90% erhöht werden. Allerdings konnten die Langzeittransplantatüberlebensraten bisher nicht zufriedenstellend verbessert werden. Trotz moderner Immunsuppressiva kommt es immer noch bei der Mehrzahl der Patienten zur Entwicklung chronischer Transplantatdysfunktionen. Klinische und subklinische akute Reaktionen, auch wenn sie zunächst erfolgreich mit einer Rejektionstherapie behandelt werden, stellen dabei den größten unabhängigen Risikofaktor für die Entwicklung dieser späten Transplantatverluste dar. Eine effiziente Diagnostik und/oder Therapie derartiger – vor allem subklinisch verlaufender – Prozesse ist daher von großer Wichtigkeit.
Eine Induktion einer Langzeit- und vornehmlich medikamentenfreien Transplantatakzeptanz ohne Beeinträchtigung der Organ-, Gewebe- oder Zellfunktionen und der Immunkapazität des Transplantatempfängers ist daher von großer Bedeutung. Klinisch wird die Toleranz als permanentes Transplantatüberleben mit normaler Organfunktion bei Abwesenheit akuter und chronischer Abstoßungsreaktionen und dem Erhalt der antimikrobiellen Immunreaktivität definiert.
Neue Strategien zur Induktion einer Transplantattoleranz bestehen in der Applikation immunregulatorischer Proteine oder in einer Induktion eines Chimerismus. Bei den immunregulatorischen Proteinen kann es sich entweder um Antikörper handeln, die eine Depletion der donor-reaktiven T-Zellen bewirken, z.B. anti-CD3-Immunotoxin, oder um Antikörper und Proteine, die die Aktivierung der donorreaktiven T-Zellen beeinflussen, z.B. anti-CD4-Antikörper, anti-CD40L-Antikörper oder CTLA4-lg. Chimerismus bedeutet das parallele Vorhandensein von Blutleukozyten des Spenders und des Empfängers mit Hilfe nicht-myeloablativer Verfahren zur Transplantation von Stammzellen des Spenders.
Bisher erfolgte nach der Transplantation eine dauerhafte Kontrolle des Zustandes des Transplantates dadurch, dass die Funktion des Transplantates als Maß herangezogen wird; z.B. durch die Bestimmung des Serumkreatininspiegels im Falle eines Nierentransplantates. Außerdem werden Bioptate entnommen und nach dem „Banff Score" histologisch beurteilt. Damit kann beurteilt werden, ob Veränderungen assoziiert mit einer akuten Abstoßung – Infiltration mononukleärer Zellen – oder chronische Abstoßungen (Vaskulopathie) nachweisbar sind.
Klinisch manifeste Rejektionen werden durch Funktionsverschlechterung der Organe definiert, wie beispielsweise Herzfunktion, dem Serumkreatinin in dem der Lungenfunktion oder anderen. Leider stehen diese Funktionsverschlechterungen am Ende einer Effektorkette. Eine frühzeitige Diagnostik bereits subklinisch ablaufender Prozesse wäre sehr hilfreich. Auch ist eine Funktionsverschlechterung nicht immer durch eine Rejektion bedingt; es gibt auch andere Ursachen wie Toxizität und Infektionen, die differentialdiagnostisch abgegrenzt werden müssen, was gegenwärtig viel Zeit beansprucht und oft sehr schwierig ist. Subklinisch verlaufende Reaktionen können bisher nur durch Protokollbiopsien und konventionelle Histologie, zumindest innerhalb gewisser Grenzen, verlässlich beurteilt werden. Jedoch werden dabei auch Infiltrate als negativ beurteilt, die möglicherweise eine protektive Wirkung auf das Transplantat haben, wie in Tierexperimenten gezeigt werden konnte. Für Nierentransplantate wurde nachgewiesen, dass molekularbiologische Untersuchungen im Urin eine klinisch manifeste Rejektion reflektieren können, aber es fehlen Untersuchungen zum subklinischen Bereich der Rejektionen. Es besteht also ein großer Bedarf an Markern für das Monitoring von Transplantaten (Bioptate, Urin, Lavage, Blut etc), um unerwünschte Immunreaktionen gegen das Transplantat rechtzeitig – d.h. möglichst vor der Organschädigung – und differentialdiagnostisch sicher – als Abgrenzung gegen andere Prozesse, die die Organfunktion beeinträchtigen – zu erfassen.
Aufgrund der Nebenwirkungen der chronischen Applikation der derzeit üblichen Mehrfachimmunsuppressivaschemata wird immer wieder versucht, bei gut gehender Funktion einzelne oder mehrere der immunsuppressiven Komponenten abzusetzen – nachteilhafterweise ist dieser Ansatz immer durch das Auftreten von akzelerierten Abstoßungsprozessen, manchmal erst Jahre nach Absetzen, gefährdet. Es fehlt völlig an Parametern, die ein derartiges Vorgehen verlässlich individuell optimieren könnten. Eine Verbesserung der bisherigen Strategien durch Einführung toleranzinduzierter Protokolle würde die Therapie durch weniger Nebenwirkungen und weniger Kosten revolutionieren. Die Übertragung der oben erwähnten toleranzinduzierenden Therapien auf den Menschen birgt jedoch etliche Gefahren, da nach Absetzen der Toleranzinduktionstherapie rechtzeitig Therapieversager identifiziert werden müssen, um eine irreversible Schädigung des Transplantates durch Rejektion zu verhindern. Selbst in Tiermodellen werden niemals 100% der Empfänger tolerant.
Nachteilhaft bei den bisherigen Methoden ist es, dass keine Entscheidungen über das sichere Absetzen einer immunsuppressiven Therapie getroffen werden können, ohne dabei das Auftreten von Rejektionskrisen zu riskieren.
Ein weiterer Nachteil ist, dass die bekannten Methoden es nicht ermöglichen, während oder nach der Behandlung, auch nach konventionellen Therapien, bevor eine Transplantatsfunktionsverschlechterung auftritt, eine Vorhersage von Rejektionskrisen zu ermöglichen. Die bisher zur Verfügung stehenden diagnostischen Mittel und Methoden sind nur begrenzt zur Beurteilung einer toleranzinduzierenden Therapie einsetzbar. Die Beurteilung der Therapie hinsichtlich der Funktion des Transplantates – z.B. des Serumkreatinins – kommt zu spät, da es bei einem nachweisbaren Anstieg des Serumkreatinins schon zu einer Schädigung des transplantierten Organs, beispielsweise der Niere, gekommen ist. Hinsichtlich der toleranzinduzierenden Therapien bedeutet ein signifikanter Anstieg des Serumkreatinins ein Fehlschlagen der Therapie und für den Patienten wahrscheinlich das Umsteigen auf konventionelle Immunsuppressiva mit den bekannten Nebenwirkungen. Auch die bekannte Analyse einer Biopsie ist in diesem Fall nur bedingt hilfreich, da viele toleranzinduzierenden Therapien, wie z.B. mit anti-CD4-Antikörpern nur bedingt die Infiltration mononukleärer Zellen in das Transplantat verhindern. Innerhalb der bisherigen Methoden und Verfahren würde dies als akute Abstoßungs- bzw. Rejektionskrise betrachtet werden, und der Patient würde mit hochdosierten konventionellen Immunsuppressiva behandelt werden. Eine hochdosierte Gabe konventioneller Immunsuppressiva kann sich jedoch zusätzlich negativ auf den Erfolg der toleranzinduzierten Therapie auswirken, was ebenfalls ein Fehlschlagen der Therapie bedeuten würde. Aber auch für die konventionellen Immunsuppressionen wären verbesserte diagnostische Mittel und Methoden hinsichtlich der Früherkennung klinischer und subklinischer akuter Abstoßungskrisen und beginnender chronischer Rejektionsprozesse hilfreich. Dies würde es unter anderem ermöglichen, die Therapie zu variieren bevor eine nachweisbare Schädigung des Transplantates – z.B. Anstieg des Serumkreatinins – vorliegt. Außerdem kann eine Verschlechterung der Organfunktion auch durch Nebenwirkung einer hochdosierten immunsuppressiven Therapie oder durch Infektionen im Transplantat hervorgerufen werden, was durch bekannte Methoden ebenfalls nicht detektiert werden kann.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, effiziente und zuverlässige Immunmarker bereitzustellen, welche eine sichere und schnelle Vorhersagbarkeit des Risikos einer Transplantatabstoßung bzw. des Fehlen selbiger – als Form einer Toleranz – in medizinischer Prophylaxe, klinischer Verlaufskontrolle oder der Transplantatnachbehandlung ermöglichen.

Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung eines isolierten Nucleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 – 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) – d), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist.

Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle mit Entzündungen, insbesondere chronischen Entzündungen, Autoimmunerkrankungen, Läsionen, allgemeinen Wunden und Transplantat-Reaktionen, insbesondere mit Transplantatrejektionen oder anderen Transplantatdysfunktionen sowie dem Ausbleiben dieser – als Form der Transplantattoleranz – assoziiert sind.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül, das eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1-8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40% homolog. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten Nucleotidsequenzen bzw. den mit diesen Nucleotidsequenzen hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die Homologen bei Transplantat-Reaktionen ein Verhalten zeigen, das Rückschlüsse auf das Transplantat und dessen Verhältnis zum Empfängerorganismus zulässt.

Funktionsanaloge Sequenzen sind im Sinne der Erfindung all jene Sequenzen, die der Fachmann als gleichwirkend identifizieren kann. Beispielsweise ist es möglich, dass der Fachmann in verschiedenen Versuchstieren, wie z.B. der Ratte oder dem Kaninchen, erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle identifiziert und so aufgrund von Homologie-Untersuchungen in der Lage ist, funktionsanaloge Strukturen in anderen Organismen, wie beispielsweise Schimpansen oder Hunden, zu identifizieren. Selbstverständlich ist es auch möglich, dass der Fachmann aufgrund seiner Kenntnis der in der Maus oder Ratte gefundenen Nucleinsäuremoleküle auch in humanen Patienten Analoge und Homologe aufgrund von Homologie- oder Analogie-Untersuchungen detektiert. Weiterhin ist es möglich, dass der Fachmann im humanen Bereich isolierte erfindungsgemäße Nucleinsäuremoleküle in spezifischen Versuchstieren detektiert, mit denen bestimmte Transplantationsreaktionen untersucht werden können, wie beispielsweise in Schweinen oder auch in wirbellosen Organismen, wie z.B. Nematoden bzw. anderen Organismen, die für spezifische Fragestellungen der Transplantationsbiologie herangezogen werden können.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist das Nucleinsäuremolekül mindestens 60%, vorzugsweise 70%, bevorzugt 80%, ganz besonders bevorzugt 90% Homologie zu einem Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1-8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen auf, wobei dieses Nucleinsäuremolekül eine biologische Aktivität wie die unter SEQ 2D Nr. 1-8 aufgezeigten Sequenzen oder deren komplementären Sequenzen aufweist.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nucleinsäuremolekül eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA. Besonders bevorzugt ist das Nucleinsäuremolekül eine mRNA.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der ein erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor im erfindungsgemäßen Vektor umfasst. Die Erfindung betrifft auch ein Polypeptid, was durch erfindungsgemäßes Nucleinsäuremolekül kodiert wird.

Die Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist. Erkennungssubstanzen im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen wie Nucleinsäuremolekülen oder -sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren Fragmenten wechselwirken können; insbesondere so wechselwirken, dass eine Detektion dieser Strukturen möglich ist. Die Erkennungssubstanzen können insbesondere spezifische Nucleinsäuren sein, die mit den genannten Nucleinsäuremolekülen binden, aber auch Antikörper, Floureszenzmarker, markierte Kohlenhydrate oder Lipide, Antisense-Konstrukte, cDNA oder mRNA-Moleküle bzw. deren Fragmente. Es ist selbstverständlich auch möglich, dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nucleinsäuren bzw. Antikörper sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper.

Die Erkennungssubstanzen können in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung sind die Erkennungsmoleküle ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisensekonstrukt, insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül.

Die Autoantikörper im Sinne der Erfindung binden die erfindungsgemäßen Polypeptide spezifisch. Die Antikörper können auch modifizierte Antikörper sein (z.B. oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper). Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Autoantikörper-Fragmente, wie Fab, F(ab')₂ und Fv, die bestimmte Epitop-Determinanten der Polypeptide binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:

(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigenbindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;
(2) das Fab'-Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab'-Fragmente erhalten;
(3) F(ab')₂, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')₂ ist eine Dimer von zwei Fab'-Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;
(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und
(5) Einzelketten-Antikörper („SCA"), definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.

Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff Epitop bedeutet eine beliebige Antigen-Determinante auf dem Polypeptid. Epitop-Determinanten bestehen normalerweise aus chemisch aktiven Oberflächen-Gruppierungen von Molekülen, wie Aminosäuren oder Zucker-Seitenketten, und besitzen normalerweise sowohl spezifische Merkmale der dreidimensionalen Struktur als auch spezifische Ladungsmerkmale.

Die Erfindung betrifft auch Vakzine, die das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid und/oder das Erkennungsmolekül gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Bei dem pharmazeutisch akzeptablen Träger handelt es sich um an sich bekannte pharmazeutische Hilfs- und/oder Zusatzstoffe. Bei diesen, dem Fachmann an sich bekannten Zusatz- und Trägerstoffen, kann es sich auch um Liposomen bzw. um in der Gentechnik bekannte Strukturen bzw. Lösungen und/oder Puffergemische oder um andere Substanzen aus dem Bereich der Galenik handeln.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Detektion von Tranplantat-Reaktionen in einer Probe von einem Patienten, wobei in der Probe ein Level von. mindestens einem Nucleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend:

a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 – 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) – d), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist

bestimmt und der Level mit einem Kontroll-Level einer Vergleichsprobe von einem gesunden Patienten verglichen wird, wobei durch einen modifizierten Level in der Probe im Vergleich zu dem Kotroll-Level die Transplantat-Reaktionen – was auch das Fehlen selbiger als Toleranz einschließt – detektiert wird.

Als Transplantat-Reaktion im Sinne der Erfindung wird demgemäß jede physiologische und pathophysiologische Wechselwirkung des Tranplantates mit dem Empfängerorganismus aber auch jede isolierte Reaktion innerhalb des Transplantates verstanden. Die Transplantat-Reaktion kann daher im Sinne der Erfindung eine Toleranz sein bzw. eine Abstoßung des Transplantates. Demgemäß ist eine Transplantat-Reaktion im Sinne der Erfindung auch ein nicht pathologischer, d.h. ein normaler oder gesunder, Zustand, in dem sich das Transplantat selbst und in Bezug auf den Empfängerorganismus befinden kann. Eine Probe im Sinne der Erfindung ist die Bezeichnung für ein durch Probenentnahme entnommenes biologisches Gut oder eines Teiles bzw. einer kleinen Menge eines solchen, dessen Beschaffenheit chemisch, biologisch, klinisch oder ähnlich geprüft werden soll. Die Probenentnahme aus dem Patienten bzw. aus gewonnenen humoralen oder zellulären Bestandteilen des Patienten erfolgt insbesondere so, dass die entnommene Teilmenge einem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Die durch Untersuchung der Probe ermittelten Merkmale dienen der Beurteilung der durch die Probe erfassten Menge, die Rückschlüsse auf die Gesamtmenge, z.B. ein gesamtes tranplantiertes Organ, wie Leber, Milz, Blut oder aber auch von nicht transplantierten Bestandteilen, wie z.B. dem Immunsystem, zulässt. Für die Untersuchung können die Proben durch Mischen, Zerteilen, Zerkleinern, Zugabe von Enzymen oder Markern bzw. anders vorbehandelt werden. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten der Vorbehandlung der Proben bekannt. Selbstverständlich kann es auch vorgesehen sein, dass die Probe so entnommen wird, dass sie keinem Durchschnitt der gesamten Menge entspricht. Eine Probe können alle biologischen und nichtbiologischen Materialien sein, wie biologische Gewebe und Flüssigkeiten, wie beispielsweise Blut, Lymphe, Urin, Gehirnflüssigkeit und andere.

Ein Transplantat im Sinne der Erfindung ist ein transplantiertes oder zu transplantierendes Organ, Gewebe oder eine Zelle bzw. eine Zellansammlung. Im Sinne der Erfindung können Transplantate jedoch auch bestimmte Implantate sein, die aus Stoffen bzw. Teilen bestehen, die zur Erfüllung bestimmter Ersatzfunktionen für einen begrenzten Zeitraum oder auf Lebenszeit in einen Körper eingebracht werden. Die Implantate können beispielsweise aus anorganischer Materie bestehen, die mit organischen Substanzen, wie beispielsweise Knorpel oder Knochenzellen, beschichtet ist.

Unter einer Transplantatabstoßung gemäß der Erfindung ist die Induktion einer Immunreaktion des Empfängers auf das Transplantat zu verstehen, wobei eine Immunreaktion des Empfängers eine spezifische Schutz- oder Abwehrreaktion des Körpers gegen die Antigene bzw. andere Strukturen des Transplantates ist.

Ein Patient im Sinne der Erfindung ist jeder Organismus, der ein Transplantat umfasst, insbesondere ein humaner Organismus. Ein gesunder Patient im Sinne der Erfindung ist ein Patient, dessen Zustand es erlaubt, als Referenz für das vorliegende Verfahren verwendet zu werden. Gesund im Sinne der Erfindung muss nicht die völlige Abwesenheit von Krankheiten, Transplantaten oder pathogenen Veränderungen bedeuten. Der gesunde Patient stellt entweder einen einzelnen Patienten oder eine Durchschnittsmenge von Patienten dar, die als Vergleichsgruppe dergestalt dienen können, dass eine Veränderung des Levels der genannten Nucleinsäuremoleküle oder der Struktureng für die sie kodieren bzw. den Erkennungssubstanzen bestimmt werden kann. Eine Modifikation des Levels im Vergleich zum Kontrolllevel heißt, dass die genannten Nucleinsäuremoleküle bzw. die oben genannten Immunmarker, wie insbesondere die Peptide oder die Erkennungssubstanzen, in ihrer Konzentration oder Aktivität als Protein, als Nucleinsäuremolekül oder als Antikörper detektierbare Veränderungen gegenüber dem Kontroll-Level aufweisen.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Transplantat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Milz, Herz, Leber, Pankreas und/oder von Geweben, insbesondere Inseln, Aorten, Knorpeln. Selbstverständlich ist es möglich, dass die jeweils aufgezeigten Organe bzw.

Gewebestrukturen allein oder in Kombination transplantiert werden können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Level als eine DNA-, eine RNA-Konzentration, eine Genexpression, eine Kopienanzahl einer Nucleinsäure, eine Peptidkonzentration, eine Peptidaktivität und/oder als eine Konzentration von Isoformen bestimmt. Mit Vorteil kann der Fachmann verschiedene Möglichkeiten wählen, um den Level von mindestens einem Nucleinsäuremolekül zu bestimmen. Eine Möglichkeit ist beispielsweise die Bestimmung der Peptidkonzentration, die durch das Nucleinsäuremolekül kodiert werden, mit spektrografischen. Methoden. Es ist jedoch auch möglich, den Level auf der RNA- bzw. DNA-, insbesondere mRNA- und/oder cDNA-Ebene zu bestimmen oder beispielsweise über die Aktivität der durch sie kodierten Proteine und/oder Peptide bzw. deren Fragmente. Es ist selbstverständlich möglich, dass der Level nur in dem Transplantat oder in Teilstücken desselben innerhalb oder außerhalb des Körpers bestimmt wird bzw. dass er in dem umgebenden Gewebe bzw. Körperflüssigkeiten bzw. in Biopsiematerialien oder in Flüssigkeiten, wie beispielsweise Urin, Lymphe oder Blut, detektiert wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Level als eine mRNA-Konzentration bestimmt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Transplantatreaktion eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf, der durch das erfindungsgemäße Verfahren detektiert wird. Der Abstoßungsverlauf und die Abstoßungsreaktion können beispielsweise klinisch bzw. subklinisch verlaufen. Eine Toleranz im Sinne der Erfindung ist beispielsweise eine lang anhaltende normale Funktion des transplantierten Organs ohne Serumkreatininanstieg bzw. Proteinurie über mehr als 100, bevorzugt 200, ganz besonders bevorzugt 300 Tage.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch einen verminderten Level eines Nucleinsäuremoleküls umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ 2D Nr. 3 und SEQ ID Nr. 7 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) – d), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist

die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert. Ein Abstoßungsverlauf kann beispielsweise der Verlauf einer Abstoßungsreaktion mit bzw. ohne Medikamentengabe sein, wobei diese Medikamente beispielsweise immunsuppressierende Substanzen sein können. Mit Vorteil kann durch den verminderten Level der Nucleotidsequenzen bzw. deren komplementären Nucleotidsequenzen bzw. Nucleinsäuremolekülen, welche mit diesen Nucleotidsequenzen unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder Nucleotidsäuremoleküle, die eine ausreichende Homolgie aufweisen, um zu den genannten Nucleotidsequenzen funktionsanalog zu sein, bestimmt werden, ob das Transplantat selbst oder in Bezug auf den Empfängerorganismus zu unphysiologischen bzw. pathologischen Prozessen neigt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch einen erhöhten Level eines Nucleinsäuremoleküls umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert ist und e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) – d), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist

die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert. Im Sinne der Erfindung gehören zu den genannten Nucleinsäuremolekülen insbesondere die Nucleinsäuremoleküle, die unter stringenten Bedingungen mit den genannten Nucleinsäuremolekülen hybridisieren als auch solche Nucleinsäuremolekülen, die eine ausreichende Homologie aufweisen, um zu den genannten Nucleinsäuremolekülen funtionsanalog zu sein sowie solche, die infolge des gentischen Codes degeneriert sind bzw. durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanlaog zu der genannten Nucleotidsequenz der Nucleinsäuremoleküle sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch einen erhöhten Level eines Nucleinsäuremoleküls ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ 2D Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen,
b) ein Nucleinsäuremolekül welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert ist und
e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) – d), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist

die Toleranzreaktion oder der Toleranzverlauf detektiert. Mit Vorteil ist es also möglich, durch die Detektion eines erhöhten Levels der genannten Nucleinsäuremoleküle zu bestimmen, ob das transplantierte Organ, das transplantierte Gewebe bzw. die einzelne Zelle von dem Empfängerorganismus in einer Art und Weise akzeptiert wird, dass pathologische Reaktionen weitestgehend ausbleiben.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Nucleinsäuremoleküls, des Vektors, der Wirtszelle, des Polypeptids, des Erkennungsmoleküls und/oder der Vakzine in der medizinischen Prophylaxe, der klinischen Verlaufskontrolle, der Transplantatnachbehandlung, der klinischen Diagnostik und/oder der Therapie. Der Fachmann kann die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle bzw. Vektoren, Wirtszellen, Polypeptide, Erkennungsmoleküle und/oder Vakzine im Bereich der Prophylaxe, Verlaufskontrolle, Diagnostik oder Therapie einsetzen. Beispielsweise ist es möglich, die biologischen Strukturen, die bei einer Abstoßungsreaktion bzw. einer Reaktionskrise in ihrem Level erhöht sind, in Form einer Therapie zu erniedrigen, um somit eine Toleranz bzw. Bedingungen für eine nachfolgende Toleranz des Transplantates zu ermöglichen, zu indizieren bzw. zu unterstützen. Dies kann beispielsweise durch die Gabe von Antisense-Konstrukten bzw. RNA-Molekülen erfolgen, die in der Lage sind, eine RNA-Interferenz zu erzeugen. Es ist jedoch auch möglich, die durch die Nucleinsäuremoleküle kodierten Peptide bzw. Proteine, deren Level auch erhöht sein kann, durch Antikörper funktional so zu beeinträchtigen, dass ein physiologischer Zustand im Transplantat bzw. zwischen Transplantat und Empfängerorganismus indiziert, erreicht oder unterstützt werden kann. Selbstverständlich ist es auch möglich, einen verminderten Level von Nucleinsäuremolekülen in Form einer therapeutischen Maßnahme zu erhöhen, wenn ein verminderter Level mit einer Abstoßungsreaktion bzw. einer Rejektionskrise assoziiert ist. Dem Fachmann sind verschiedene Möglichkeiten bekannt, den Level der genannten Substanzen oder Moleküle zu modifizieren, im vorliegenden Fall insbesondere zu erhöhen. Eine Erhöhung eines Proteinlevels ist beispielsweise dadurch möglich, dass der Nucleinsäure, die das entsprechende Protein kodiert, die natürlich im Organismus oder Transplantat vorliegen kann bzw. in das transplantierte Organ eingebracht wird, ein zusätzlicher Promoter vorgeschaltet bzw. der ursprüngliche Promoter in seiner Aktivität verstärkt wird. Weiterhin ist es möglich, die Kopienanzahl der Nucleinsäuren im entsprechenden Zielgewebe zu erhöhen, wodurch mehr Nucleinsäuremoleküle bereitgestellt werden und mehr Proteine exprimiert werden können. Dem Fachmann ist bekannt, dass derartige Maßnahmen nicht nur innerhalb der Therapie sondern auch in einem Protokoll zur Prophylaxe bzw. das zur Transplantatnachbehandlung durchgeführt werden können. Klinische Verlaufskontrollen bzw. diagnostische Maßnahmen können mit Vorteil so erfolgen, dass im Verlauf von bestimmten, durch den Fachmann festzulegenden Zeitabständen im Urin bzw. Biopsiematerial eine Quantifizierung der Expression der Nucleinsäuremoleküle bzw. der sie kodierenden Peptide oder Fragmente erfolgt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Nucleinsäuremoleküle und ihre Homologe bzw. die modifizierten Nucleinsäuremoleküle zur Detektion von T- Zell-vermittelten Immunprozessen, insbesondere von pathogenen T-Zell-vermittelten Immunprozessen verwendet. Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und auch ihre Abkömmlinge, ihre komplementären Strukturen sowie die Peptide, die sie kodieren, können beispielsweise genutzt werden, um Komplementreaktionen bzw. andere Prozesse zu detektieren, bei denen T-Zellen eine gewisse Bedeutung haben. Insbesondere können pathogene T-zell-vermittelte Immunprozesse wie z.B. Diabetes mellitus Typ 2, rheumatoide Arthritis, chronische Darmentzündung, Dermatosen und/oder Allergien detektiert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden als T-Zell-vermittelte Immunprozesse Autoimmunerkrankungen oder Entzündungen detektiert, insbesondere eine antiglomeruläre Basalmembrankrankheit, Autoimmunkrankheiten des Nervensystems, ein systemischer Lupus erythematodes, eine Addison-Krankheit, ein Antiphospholipid-Syndrom, eine IgA-Glomerulonephritis, ein Goodpasture-Syndrom, ein Lambert-Eaton-Myasthenie-Syndrom, ein bullöses Pemphigoid, eine thrombozytopenische, idiopathische Purpura, eine Autoimmun-Thyreoiditis, eine rheumatoide Arthritis, ein insulinabhängiger Diabetes mellitus, ein Pemphigus, eine autoimmunhämolytische Anämie, ein Dermatitis herpetiformis Duhring, eine membranöse Glomerulonephritis, eine Graves-Krankheit, eine sympathische Ophthalmie, Autoimmun-Polyendokrinopathien, multiple Sklerose und/oder Reiter-Krankheit.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die T-Zell-vermittelten Immunprozesse physiologische, pathologische und/oder klinische Transplantat-Reaktionen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Transplantat-Reaktionen eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der das Nucleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle, das Polypeptid, das Erkennungsmolekül und/oder die Vakzine umfasst.

Die Erfindung weist mehrere Vorteile auf. So ist es insbesondere möglich, nach Transplantationen eine dauerhafte Kontrolle des Zustandes des Transplantates durchzuführen, wobei es möglich ist, die als Marker verwendeten erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle oder Peptide bzw. Erkennungssubstanzen aus verschiedenen Proben des Patienten, beispielsweise Urin, zu gewinnen. Somit ist es insbesondere möglich, frühzeitig Funktionsverschlechterungen des Transplantates, sozusagen am Beginn der Effektorkette, festzustellen. Durch die erfindungsgemäßen Substanzen und das erfindungsgemäße Verfahren ist es also möglich, bereits subklinisch ablaufende Prozesse frühzeitig zu diagnostizieren. Somit müssen subklinisch verlaufende Reaktionen nicht mehr mit Kontrollbiopsien und konventioneller Histologie bestimmt werden. Weiterhin können die genannten Substanzen als Marker für das Monitoring von Transplantaten benutzt werden, um unerwünschte Immunreaktionen vor der Organschädigung und differentialdiagnostisch sicher zu erfassen. Das Monitoring kann beispielsweise als Verlaufskontrolle bei Mehrfachimmunsuppressivaschemata verwandt werden, wobei gutgehende Funktionen einzelne oder mehrere der immunsuppressiven Komponenten abgesetzt werden können, wobei das Auftreten von akzelerierten Abstoßungsprozessen frühzeitig erkannt werden kann. Das Verfahren lässt sich dadurch auch individuell von Patient zu Patient optimieren. Auch ist es durch die Marker mit Vorteil möglich, toleranzinduzierte Protokolle und toleranzinduzierende Therapien auf den Menschen zu übertragen, da nach Absetzen der Toleranzinduktionstherapie rechtzeitig Therapieversager identifiziert werden können, um eine irreversible Schädigung des Transplantates zu verhindern. Das heißt, die erfindungsgemäßen Substanzen, das erfindungsgemäße Verfahren und die Verwendungen stellen exakte Analysemethoden zur Verfügung, um die Induktion, den Erfolg und die Erhaltung einer Toleranz zu beurteilen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann unter anderem auch das Zusammenbrechen der Toleranz, beispielsweise durch vorliegen einer Infektion, vorhergesagt werden. Es ist daher möglich, Entscheidungen über das sichere Absetzen einer immunsuppressiven Therapie zu treffen, ohne dass vorteilhafterweise das Auftreten von Reaktionskrisen riskiert werden muss. Eine wichtige Anwendung der erfindungsgemäßen Nucleinsäure des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Vorhersage von Reaktionskrisen während oder nach der Behandlung, auch nach konventionellen Therapien, bevor eine Transplantatfunktionsverschlechterung auftritt. Weiterhin wird aber auch die konventionelle Immunsuppression durch die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und das erfindungsgemäße Verfahren hinsichtlich der Früherkennung klinischer und subklinischer akuter Abstoßungskrisen und beginnender chronischer Reaktionsprozesse verbessert. Es ist durch die Erfindung möglich, die Therapie zu variieren, bevor eine nachweisbare Schädigung des Transplantates vorliegt. Weiterhin ist es möglich, die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle und die durch sie kodierten Proteine bzw. Proteinfragmente zum Screening von Arzneimitteln zu verwenden, die bei der Diagnose und Therapie von Transplantat-Reaktionen eingesetzt werden können.

Die Erfindung soll im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne sie darauf einzuschränken.

Beispiel

Die erfindungsgemäßen Nucleinsäuremoleküle können in Labortieren identifiziert werden, so beispielsweise in dem anerkannten orthotropen Nierentransplantationsmodell: der Ratte, bei dem die Expression der erfindungsgemäßen Marker zur postoperativen Diagnostik verwendet werden kann. In dem verwendeten Transplantationsmodell (WF Spendernieren nach BDIX Rezipienten) kann durch mehrmalige Applikation eines anti-CD4-Antikörpers RIB5/2 eine Toleranz gegenüber Nierentransplantaten induziert werden, die im Kontrollantikörper behandelter Empfängertiere zwischen Tag 5 und 9 abgestoßen werden. Die Toleranz zeichnet sich durch eine lang anhaltende normale Nierenfunktion ohne Serumkreatininanstieg bzw. Proteinurie über mehr als 300 Tage aus. Die Infiltration donor-reaktiver T-Zellen ist nur zu 50% herabgesetzt, jedoch kommt es nicht zur Zerstörung des transplantierten Organs.

Im Rahmen der Erfindung wurden von mit Kontrollantikörpern bzw. RIB/2 behandelten Empfängertieren die in das Transplantat eingewanderten mononukleären Zellen am Tag 5 nach der Transplantation durch Kollagenaseverdau und Ficollgradient isoliert und deren mRNA Expression mit Hilfe der „PCR-Select" Methode verglichen. Dies führte zur Isolierung von cDNA Fragmenten, die verstärkt in Transplantaten rejizierender Empfängertiere exprimiert werden: 2A5 und 2A15 (entspricht SEQ 2D Nr. 1 und 2). Ebenso konnten cDNA Fragmente isoliert werden, deren Expression in Transplantaten toleranzentwickelnder Empfängertiere erhöht ist: 1A50, 3A29, T4, T5, T8 und T10 (entspricht SEQ ID Nr. 3, 4, 5, 6, 7 und 8). In 1 sind die cDNA Sequenzabschnitte der erwähnten Fragmente dargestellt.

Von den hier dargestellten Sequenzabschnitten wurden weiterhin erfindungsgemäß Oligonukleotidsequenzen für die Durchführung einer Real Time RT-PCR abgeleitet. Mit Hilfe dieser Oligonukleotidsequenzen ist eine relative Quantifizierung der Expression der korrespondierenden mRNA's in Bezug zum „house keeping gene" β-actin in Rattenzellen möglich. Ebenso wurden anhand der homologen Maussequenzen Oligonukleotidsequenzen zur relativen Quantifizierung der korrespondierenden mRNR's in Bezug zum „house keeping gene HPRT" in Mauszellen etabliert.

Mit Hilfe der so etablierten Oligonukleotidsequenzen wurden im Rahmen der Erfindung kinetische Expressionsstudien in mehreren Transplantationsmodellen durchgeführt. Neben dem bereits erwähnten Nierentransplantationsmodell in der Ratte wurde die Expression der Fragmente auch in einem Herztransplantationsmodell in der Maus analysiert. In diesem Modell wird den Empfängertieren (CBA) 4 Wochen vor der Transplantation eine donor-spezifisch Bluttransfusion (B10) in Kombination mit dem anti-CD4 Antikörper YTS177 verabreicht. Das führt zur Induktion einer donorspezifischen Toloranz zum Zeitpunkt der Transplantation. Kontrollherzen in unbehandelten Empfängertieren werden zwischen Tag 7 und Tag 8 abgestoßen.

In 2 sind die Ergebnisse der Expressionsanalyse für die Fragmente 1A50, 3A29, T4, T5, T8 und T10 im Nierentransplantationsmodell dargestellt. Abgebildet ist die mRNA Expression der Fragmente im Transplantat für Kontroll-Antikörper behandelte Empfängertiere (Co) am Tag 0 (naive Nieren), 2 und 5 nach der Transplantation, außerdem ist die Expression für RIBS/2-behandelte toleranzentwickelnde Empfängertiere (RIB5/2) am Tag 0, 2, 5, 10, 14 und 300 nach der Transplantation dargestellt. Alle cDNA Fragmente werden in permanent akzeptierten Transplantaten stark exprimiert, hingegen nimmt ihre Expression in Transplantaten Kontroll-Antikörper behandelter Empfängertiere zum Zeitpunkt der Rejektion drastisch ab.

Anschließend wurde die Expression der korrespondierenden mRNA's im Herztransplantationsmodell untersucht. In 3 ist die Expression der Fragmente 1A50 und T8 im transplantierten Organ dargestellt. Analysiert wurde die mRNA Expression in Transplantaten vorbehandelter toleranzentwickelnder Empfängertiere (DST+YTS177) am Tag 0 (naive Herzen), 2, 5, 7, 8, 10, 40 und 100 nach Transplantation. Verglichen wurden die Ergebnisse mit der mRNA Expression im Transplantat unbehandelter Kontrolltiere (Co) am Tag 0 (naive Herzen), 2, 5, 7 und 8. Auch im Herztransplantationsmodell weisen permanent akzeptierte Transplantate eine hohe mRNA Expression an 1A50 und T8 auf. In Transplantaten rejizierender Empfängertiere ist die Expression wiederum stark vermindert.

Die unterschiedliche Expression an 1A50 und T8 widerspiegelt sich auch im peripheren Blut. Nur in Blutzellen von unbehandelten Empfängertieren (Co) kommt es kurz vor der Rejektion (Tag 5) zum Abfall der Expression von 1A50 und T8 (4).

Weiterhin wurde die Expression der cDNA Fragmente 2A5 und 2A15 im Nierentransplantationsmodell (5) und im Herztransplantationsmodell (6) untersucht. Dargestellt ist jeweils die Expression dieser cDNA Fragmente im Transplantat rejizierender Empfängertiere. In beiden Modellen kommt es zur Hochregulation der mRNA Expression kurz vor der Rejektion.

Mit Hilfe der Identifizierung und Quantifizierung von solchen Genmarkern, deren Expression im Transplantat, in Flüssigkeiten aus dem Transplantat (Urin, Lavage) oder peripherem Blut entweder mit einer lang anhaltenden guten Transplantatfunktion oder dem Auftreten von Rejektionen korreliert, wäre eine Beurteilung der toleranzinduzierenden Therapie besser möglich.

Die Expression von 2A5 und 2A15 kann in der Biopsie zur Beurteilung von akuten subklinischen Rejektionskrisen und beginnender chronischer Rejektionen verwendet werden. Dabei wäre eine starke, lang anhaltende Expression mit einer Rejektion des Organs assoziiert. Dies ist nur bedingt abhängig vom Ausmaß der Infiltration mononukleärer Zellen in das Transplantat, da in anti-CD4 behandelten toleranzentwickelnden Empfängertieren im Nierentransplantationsmodell die Infiltration der mononukleären Zellen nur zu 50% reduziert ist. Dies würde die Auswertung einer Biopsie erheblich verbessern, da nicht nur die Infiltration in das Organ als Kriterium für eine akute Abstoßung herangezogen wird, sondern auch qualitative Veränderungen der infiltrierenden Zellen. Die Expression von T4, T5, T10, 3A29, T8 und 1A50 in der Biopsie kann z.B. zur Beurteilung des Therapieerfolges herangezogen werden. Dies würde eine Entscheidung über die sichere Beendigung der toleranzinduzierenden Therapie ermöglichen.

Der starke Expressionsabfall von 1A50 und T8 in der Peripherie in rejizierenden Empfängertieren mehr als 2 Tage vor klinischer Manifestation der Rejektion ermöglicht eine non-invasive Diagnostik im Blut des Patienten bevor eine Organverschlechterung (z.B. Anstieg des Serumkreatinins) nachweisbar ist.

Die Expression von 2A5 und 2A15 in der Biopsie kann zur Beurteilung von akuten klinischen und subklinischen Rejektionskrisen und beginnender chronischer Rejektionen verwendet werden. Dabei ist eine starke lang anhaltende Expression mit einer immunologischen Rejektion des Organs assoziiert. Dies ist nur bedingt abhängig vom Ausmaß der Infiltration mononukleärer Zellen in das Transplantat, da in anti-CD4 behandelten toleranzentwicklenden Empfängertieren im Nierentransplantationsmodell die Infiltration der mononukleären Zellen nur zu 50% reduziert ist. Dies verbessert die Auswertung einer Biopsie erheblich, da nicht nur die Infiltration in das Organ als Kriterium für eine akute Abstoßung herangezogen wird, sondern auch die qualitative Veränderung der infiltrierenden Zellen. Die Expression von T4, T5, T10, 3A29, T8 und 1A50 in der Biopsie wird zur Beurteilung des Therapieerfolges herangezogen. Dies ermöglicht eine Entscheidung über die sichere Beendigung der toleranzinduzierenden Therapie. Der starke Expressionsabfa11 von 1A50 und T8 in der Peripherie in rejizierenden Empfängertieren mehr als 2 Tage vor der Rejektion ermöglicht eine non-invasive Diagnostik im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten, wie in dem Urin, der Patienten bevor eine Organverschlechterung, wie der Anstieg des Serumkreatinins, nachgewiesen werden kann. Somit ist folgendes Diagnostikmodell nach der Transplantation erfolgreich:

1. Nachweis von 1A50 und T8 im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten (z.B. Urin) des Patienten täglich kurz nach der Operation und wöchentlich/monatlich im weiteren Verlauf, um eine Rejektionskrise und damit Fehlschlagen der Therapie vorherzusagen bzw. bei Absetzversuchen eine Untersuppression zu detektieren, bevor eine Organverschlechterung nachweisbar ist.
2. Nachweis von 2A5 und 2A15 in Kontrollbiopsien oder transplantatrelevanten Körperflüssigkeiten (z.B. Urin bei Nierentransplantation), um ebenfalls Rejektionskrisen bzw. eine Untersuppression rechtzeitig zu detektieren und die Gefahr der Entwicklung einer chronischen Abstoflung vorherzusagen.
3. Nachweis von T4, T5, T8, T10, 1A50 und 3A29 in Kontrollbiopsien oder transplantatrelevanten Körperflüssigkeiten, um den Erfolg der toleranzinduzierenden oder konventionellen Therapie einzuschätzen, insbesondere, um das gefahrlose Absetzen/Reduzieren der Therapie zu ermöglichen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend: a) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1 – 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen, b) ein Nucleinsäuremolekül, welches mit einer Nucleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert, c) ein Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein, d) ein Nucleinsäuremolekül, das in Folge des genetisches Codes zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) – c) degeneriert ist und e) ein Nucleinsäuremolekül gemäß einer Nucleotidsequenz nach a) – d), welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nucleotidsequenz gemäß a) bis d) ist.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nucleotidsequenz mindestens 40% homolog zu einer der unter a) angegebenen Nucleotidsequenz ist.
Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nucleotidsequenz mindestens 60%, vorzugsweise 70%, bevorzugt 80%, ganz besonders bevorzugt 90% homolog zu einer der unter a) angegebenen Nucleotidsequenz ist.
Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA ist.
Vektor umfassend ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Wirtszelle umfassend den Vektor gemäß Anspruch 5.
Polypeptid, kodiert durch ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Erkennungsmolekül gerichtet gegen ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7.
Erkennungsmolekül nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisense-Konstrukt ist, insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül.
Vakzine, umfassend ein Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 7 und/oder ein Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 oder 9 gegebenenfalls mit einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verfahren zur Detektion von Transplantat-Reaktionen in einer Probe von einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass in der Probe ein Level von mindestens einem Nucleinsäuremolekül gemäß einem der Anspruch 1 bis 4 bestimmt und der Level mit einem Kontroll-Level einer Vergleichsprobe von einem gesunden Patienten verglichen wird, wobei durch einen modifizierten Level in der Probe im Vergleich zu dem Kotroll-Level die Transplantat-Reaktionen bzw. das Fehlen selbiger (Toleranz) detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Transplantat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lunge, Milz, Herz, Niere, Leber, Pankreas allein oder in Kombination und/oder von Geweben, insbesondere Inseln, Aorten, Knorpel.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass als der Level eine DNA-, eine RNA-Konzentration, eine Genexpression, eine Kopienanzahl einer Nucleinsäure, eine Peptidkonzentration, eine Peptidaktivität und/oder eine Konzentration von Isoformen, bestimmt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Level als eine mRNA-Konzentration bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass als die Transplantatreaktion eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf detektiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch einen verminderten Level eines Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3 und SEQ ID Nr. 7 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch einen erhöhter Level eines Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID 1 und Nr. SEQ 2 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen die Abstoßungsreaktion, der Abstoßungsverlauf und/oder die Rejektionskrise detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass durch einen erhöhter Level eines Nucleinsäuremolekül umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ 2D Nr. 3, SEQ ID Nr. 4, SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7 und SEQ ID Nr. 8 oder deren komplementären Nucleotidsequenzen die Toleranzreaktion oder der Toleranzverlauf detektiert wird.
Verwendung eines Nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, eines Vektor gemäß Anspruch 5, einer Wirtszelle gemäß Anspruch 6, eines Polypeptid gemäß Anspruch 7, eines Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 oder 9 und/oder einer Vakzine gemäß Anspruch 10 in der medizinischen Prophylaxe, klinischer Verlaufskontrolle, Transplantat-nachbehandlung, klinischer Diagnostik und/oder Therapie.
Verwendung nach Anspruch 19 zur Detektion von T-Zellvermittelten Immunprozessen, insbesondere pathogenen T-Zell-vermittelten Immunprozessen.
Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet dass die T-Zell-vermittelten Immunprozesse Autoimmunerkrankungen oder Entzündungen sind, insbesondere eine antiglomeruläre Basalmembrankrankheit, Autoimmunkrankheiten des Nervensystems, ein systemischer Lupus erythematodes, eine Rddison-Krankheit, ein Antiphospholipid-Syndrom, eine IgA-Glomerulonephritis, ein Goodpasture-Syndrom, ein Lambert-Eaton-Myasthenie-Syndrom, ein bullöses Pemphigoid, eine thrombozytopenische, idiopathische Purpura, eine Autoimmun-Thyreoiditis, eine rheumatoide Arthritis, ein insulinabhängiger Diabetes mellitus, ein Pemphigus, eine autoimmunhämolytische Anämie, ein Dermatitis herpetiformis Duhring, eine membranöse Glomerulonephritis, eine Graves-Krankheit, eine sympathische Ophthalmie, Autoimmun-Polyendokrinopathien, multiple Sklerose und/oder Reiter-Krankheit.
Verwendung nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet dass die T-Zell-vermittelten Immunprozesse physiologische, pathologische, klinische und/oder subklinische Transplantat-Reaktionen sind.
Verwendung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass die Transplantat-Reaktionen eine Rejektionskrise, eine Abstoßungsreaktion, ein Abstoßungsverlauf, eine Toleranzreaktion und/oder ein Toleranzverlauf.
Kit umfassend ein Nucleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 7; ein Erkennungsmolekül nach Anspruch 8 oder 9 und/oder eine Vakzine gemäß Anspruch 10.