WO2004026324A1

WO2004026324A1 - 抗アレルギー剤および抗炎症剤

Info

Publication number: WO2004026324A1
Application number: PCT/JP2003/011527
Authority: WO
Inventors: Hiroko Isoda; Shinichi Yokota; Yukuo Abe; Fumitake Seki
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2002-09-20
Filing date: 2003-09-09
Publication date: 2004-04-01
Also published as: AU2003262029A1

Abstract

本発明の課題は、食経験のある天然物の中から、安全性が高く容易に製造することができる抗アレルギー剤、抗炎症剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、およびこれらを配合する飲食品、化粧品、浴用剤を提供することである。本発明により、雪蓮花属（Saussurea）抽出物を含有する抗アレルギー剤、抗炎症剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、およびこれらを配合してなる飲食品、化粧品、浴用剤、さらに雪蓮花属（Saussurea）抽出物のヒアルロニダーゼ阻害活性を利用し、それを配合してなるヒアルロン酸含有化粧品を提供することが可能になった。

Description

明糸田書

抗ァレルギ一剤および抗炎症剤

¾^分野

本発明は、ヒトあるいは動物用の飲食品、医薬品、ィ匕粧品として利用できる抗アレルギー剤、抗炎症剤あるいはヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤に関する。背景漏

生体に〖鉢来、外部からの異質なものを排除し恒常性を保っための免疫機能が備わつている。ところが、この免疫機能が体を障害するように働く場合があり、この過度の免疫機能による障害反応の一種を特にアレルギーと呼ぶ。アレルギーは微生物、植物、動物、薬物、ィ匕学物質、食物等に由来する原因物質に対して免疫担当細胞が過剰反応し、活性化した好塩求、肥満細胞、 Tリンパ球、 Bリンパ球などから放出される生理活性物質により体内の組織が障害されるものである。アレルギーは反応してから発症するまでの時間により、数分〜数十分の比較的短時間で障害反応がれる即時型ァレルギ一と、数時間後から障害反応が見られその後数日にわたってゆっくり進行する遅延型アレルギ一に分けられる。血液中に存る好塩基球や、血管周辺や結合纏哉に存 ¾Tる肥満細胞はヒスタミン等を含む顆粒を持ち、これらの細胞が脱顆粒することによってヒス夕ミンや 0-へキソサミニダ一ゼ等の酵素を遊離し、喘息、枯草熱、アトピー性湿疹などの即時的アレルギー反応を誘起することが知られている。また、これら脱顆粒により放出される物質は炎症を起こす物質としてもよく知られている。肥満細胞や好塩求は即時型アレルギーへの関与が 3食く、これら細胞の脱顆粒を阻害することによってアレルギーを軽減することができるものと考えられている。したがって、効果的な好塩求細胞脱顆粒阻害剤あるいは肥満細胞脱顆粒阻害剤を開発して、有用な抗アレルギ一剤を提供することが ¾まれている。また、ヒアルロン酸は、個体発生 ·細哉の恒常維持、さらには炎症反応や創傷治癒の過程においてきわめて重要な役割をしている生体成分であり、へビ毒ゃ病原菌由来のヒアルロニダーゼは、哺乳動物の結合組織に多量に分布するヒアル口ン酸を加水军する酵素として知られている。ヒアルロニダーゼは炎症時に活性化され、結合組織を破壊して細胞および血管の透過性を高める働きをしており、ヒアル口ニダーゼの活性を阻 ¾ ることによってァレルギ一や炎症を軽減しうることが知られている（非特許文献 1を参照）。また、ヒアルロニダ一ゼ阻害活性は、肥満細胞からの脱顆粒阻害と関連していることも示されている（非特許 ¾1犬 2を参照）。そのため、ヒアルロニダーゼ阻害活性を測定することは抗アレルギ一ゃ抗炎症作用を諮面するのに有用である。したがって、ヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤の開発により、有用な抗アレルギ —剤ゃ抗炎症剤を提供することがまれている。また、ヒアルロン酸は保湿剤として乳液ゃクリ一ムなどの化粧品に含まれていることが多いため、ヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤により化粧品のヒアルロン酸の^?を防ぐことも望まれている。

雪蓮ィ匕 Λ¾ {Saussurea) ま十ク科の植物でめり、 Saussurea mvolucrata, Saussurea lappa, Saussurea medusa, Saussurea obvallata, Saussurea petrovii等の ¾ 力 S存在し、その分類について報告がされている（非特許文献 3を参照）。その中の雪蓮花 (Saussurea involucrata) は、中国天山山脈に自生し、健康食品として食用に供されるとともに、薬用成分としても広く用いられている。しかしながら、雪蓮花属の植物には多種多様の化合物成分が含まれているため、これまでに Sa s置 a lappaに含まれる化合物である cynaropicrinの TNF— α阻害作用による抗炎症作用（非特言午文献 4を参照）が報告されているが、その構成成分と含有量はいまだ完全に分析されるに至っていない。また、雪蓮花の熱水抽出物や食用アルコール抽出液については滋養強壮、冷え性への効能が伝承されているが、雪難抽出物に、抗アレルギー作用、好塩 »ϊ求細胞脱顆粒阻害作用、肥満細胞脱顆粒阻害作用、ヒアルロニダ一ゼ阻害作用があるか否かを検討した文献は存在しておらず、これらの作用のを示唆するも何らされていない。また、これらの作用活性を強化する方法についても、検討例はない。

〔非特許 1〕 Chem. Pharm. BuU(Tokyo), 40(6), 1439-1442, 1992

〔非特許文献 2〕 Chem. Pharm. Bull. 33(11), 5079-5082, 1985 〔非特許 3〕 Nat. Med., 51(4), 347-357, 1997

〔非特許文献 4〕 Eur. J. Pharmacol., 398(3), 399-407, 2000

本発明者らは、安全性が高く容易に S することができ、化粧品や飲食品にも配合可能な新しい抗アレルギー剤、抗炎症剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤を提供することを課題として検討を進めた。発明の開示

前記のように好塩基球あるいは肥満細胞からの脱顆粒を阻害することにより抗アレルギ一作用が期待され、それはヒスタミン量或いは )3—へキソサミニダーゼ活性を測定することによりすることができる。また、ヒアルロニダーゼ阻害活性からは抗アレルギ一作用、抗炎症作用、あるいはヒアルロン酸^?抑制作用が期待される。これらについて鋭意検討を行った結果、本発明者らは、雪蓮花抽出物を用いれば、これらの課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち本発明の第一は、雪 ¾¾属 (Saussurea) の抽出物を含有することを特徴とする抗アレルギー剤に関し、また、雪 ¾¾属の抽出物を好塩基球脱顆粒阻害活性あるいは肥満細胞脱顆粒阻害活性あるいはヒアルロニダ一ゼ阻害活性の有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤に関する。好ましい態様は上記雪蓮花属が雪 (Saussurea mvolucrata ) である。

本発明の第二は、雪 ¾¾属の抽出物をヒアルロニダーゼ阻害活性の有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ活性阻害剤に関し、好ましい態様は上記雪蓮花 Λ¾力 {Saussurea mvolucrataノである。

本発明の第三は、雪蓮花属の抽出物をヒアルロニダーゼ阻害活性の有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤に関し、好ましい態様は上記雪蓮花属が雪

Saussurea mvolucrata ) でめ。本発明の第四は、前述の抗アレルギー剤、ヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤、抗炎症剤の少なくとも 1つを配合することを特徴とする飲食品、化粧品、浴用剤に関する。図面の簡単な説明

図 1 ：雪皿「茎」抽出物

図 1は、雪の茎からの抽出物の、 ]3—へキソサミニダ一ゼ放出阻害アツセィおよびヒスタミン放出阻害アツセィを表したものである。図 1の横軸は雪蓮花 7 0 %ェタノール抽出物の尺倍率、縦軸は阻害率 (%) をあらわす。また、それぞれの希釈倍率における左側の白い棒グラフは 0—へキソサミニダーゼの遊離阻害率を、右側の黒い棒グラフはヒスタミンの遊離阻害率をあらわす。

図 2 ：雪蓮花「花」抽出物

図 2は、雪の花からの抽出物の、 /3—へキソサミニダ一ゼ放出アツセィおよびヒス夕ミン放出アツセィを表したものである。図 2の横軸は雪 ¾¾ 7 0 %エタノール抽出物の希釈倍率、縦軸は阻害率 (%) をあらわす。また、それぞれの辦尺倍率における左側の白レ棒グラフは jS—へキソサミニダーゼの遊離阻害率を、右側の黒い棒グラフはヒス夕ミンの遊離阻害率をあらわす。発明を «fるための最良の形態

本発明で使用する雪蓮花属 (Saussurea ) 植物の生産方法は特に限定されない。本発明で i^ffiする雪属は、自生したもののみならず、人工的に栽培したものであっても構わない。また、本発明で使用する雪属の採取時期や生育年数、栽培方法、栽培期間につレても特に制限されない。

本発明の雪蓮花属の抽出物はヒス夕ミン放出阻害活性および jS—へキソサミニダ一ゼ放出阻害活性を持つことから、好塩基球あるレ ^は肥満細胞からの脱顆粒阻害作用を有し、また、ヒアルロニダーゼ阻害活性をも有するため、抗アレルギー剤あるいは抗炎症剤として有用である。すなわち、ヒスタミンおよび i3—へキソサミニダーゼは、好塩基球あるいは肥満細胞から脱顆粒に伴い遊離する物質の一つであり、特にヒスタミンは鼻水を出す作用や毛細血管を拡張による皮膚や粘膜に炎症を起こす作用がある。したがつてヒスタミン放出アツセィまたは 3—へキソサミニダ一ゼ放出アツセィにより、細胞からの脱顆粒によって遊離したヒスタミンまたは ]3—へキソサミニダ一ゼを測^ ることで、抗アレルギ一作用およ 0¾¾炎症作用を言 W面することが可能である。また、ヒアルロニダ一ゼは結合糸 II哉に分布するヒアルロン酸をする加水^^酵素であり、炎症時に活性化され、結合編戠を破壊して細胞や血管の透過性を高める働きをしている。したがつてヒアル口ニダ一ゼ活性を測定することで抗炎症およ ϋ¾¾ァレルギ一作用をすることが可能である。さらに、本発明の雪 ¾¾属抽出物はヒアルロニダ一ゼ阻害活性を示すことからヒアルロニダーゼ阻害活性を禾翻したヒアルロン酸の^^を抑制するヒアル口ニダーゼ活性阻害剤としても有用である。

本発明において好塩講細胞臓粒阻害活性あるいは肥満細胞脱顆粒阻害活性は、脱顆粒により遊離したヒスタミン量あるいは ]3—へキソサミニダーゼ活性により測定する。ヒスタミンは、実施例 1に示した KU812のような好塩基球細胞を用い放出させたヒスタミンをキヤビラリ一電気泳動で測定する。また、好塩基球または肥満細胞を用い実施例 2のような方法により、マウス抗 DNP-IgE抗体で細胞を感作した後、抗原である DNP-BSAを使い、放出されたヒスタミンを測定してもよい。 i3—へキソサミニダーゼ活性は、実施例²に示した KU812のような好塩基球細胞を用いマウス抗 DNP-IgE 抗体で細胞を感作した後、抗原である DNP-BSAを使い放出された /3—へキソサミニダーゼ活性を測 ¾Tる。また、 ]3—へキソサミニダーゼ活性測定に肥満細胞を使用してもよい。ヒアルロニダーゼ阻害活性は沢辺らの方法（衛生化学, 34(4)， 314-319,1990) に準じた方法により測定する。

本発明で使用する雪蓮花属は、多種多様な生産方法によるものの中から一種類だけを選択して使用してもよいし、複数種を組み合わせて使用してもよい。好塩 »細胞脱顆粒阻害活性あるいは肥満細胞脱顆粒阻害活性、ヒアルロニダ一ゼ阻害活性が高い雪蓮花属を組み合わせて使用すれば、より強い抗アレルギー作用、抗炎症作用、ヒアルロン酸画乍用の効果が期待できる。

また、雪蓮花属の抽出物とは植物体の各種部分（全草、花、茎、葉など）をそのまま或い菱、抽出溶媒で抽出したものである。

抽出溶媒としては、 7]、有機溶媒又は植物油が使用できる。水としては通常の水、超臨界水が使用できる。有機溶媒としては、アルコール類（例えばエタノール、メタノールの低級アルコール、あるいはプロピレンアルコールなどの多価アルコール）、ァセトンなどのケトン類、ジェチルエーテル、ジォキサン、ァセ卜二トリル、酢酸ェチルなどのエステル類、キシレン、ベンゼン、クロ口ホルムなどが使用できる。植物油としては、ォリーブ油、ヤシ油、ベニバナ油などが使用できる。これらは単独であるいは 2種以上の液を任意に組み合わせて使用することが出来る。この中では、通常の水、低級アルコール、オリ一ブ油が抽出装置の点で好ましく、熱水、エタノールが抽出溶媒を摂取した時の安全上の点でより好ましい。これら溶媒抽出物は各々組み合わせても使用できるまた、製造方法は、常温.常圧下で抽出溶媒を用いて行えばよぐ抽出後は濃 ϋ¾固或いは油誇により溶液状、ペースト状、ゲル状、粉状としてもよい。場合によっては — 2 0。C〜1 0 0°C、好ましくは 1〜8 0° (：、より好ましくは 2 0〜6 Otの条件下で、 0. 1〜1ヶ月、好ましくは 0. 5時間から 7日間、攪拌または放置する。また、二酸化炭素等による超臨界条件での抽出も可能である。必要であれば、さらに活性炭カラムゃイオン交脂等により、任意の操作で精製することもできる。

本発明の一つの実施態様としては、雪 ¾¾属を熱水またはエタノールで抽出した抽出物を使用することができる。抽出に使用するエタノールは、必ずしも純エタノールである必要はない。例えば、 7jや不純物を含むものであっても構わないが、活性物質の抽出を妨げる成分を含むものであってはならず、例えば含水エタノールとして 5 0 %〜9 5 %エタノールが好ましく、 7 0 %エタノールがより好ましい。抽出に使用する熱水またはエタノ一ルの量は、雪 ¾¾属に含まれる活性成分を十分に溶解しうる量であることが好ましい。具体的には、用いる雪 ¾¾属植物重量の約 1〜1 0 0 0 0倍が好ましく、 1〜1 0 0倍が抽出物? li が高くなる点でより好ましい。さらに好ましくは 1〜2 0 倍である。

本発明における抽出は、採取した雪蓮花属を洗浄して表面に付着した汚れや生物を除去した後、裁断、ポールミル、超音波処理、ホモジェナイザーなどによってこれを破砕した後に抽出することができる。破碎に先立って風乾や凍結乾燥処理を行ってもよい。破碎した雪蓮花属は、しながら熱水またはエタノールなどの抽出溶媒で数回繰り返し抽出するのが好ましい。この抽出液は、そのまま抗アレルギー剤、ヒアルロニダーゼ活性阻害剤、抗炎症剤として使用することができる。

本発明の抽出物は、必要に応じて希釈あるいは濃縮、乾固により溶液状、ペースト状、ゲル状、粉状として使用することもできる。たとえば、本発明抽出物を水あるいはァルコ一ル類を添加することで希釈して水溶化物として利用したり、油脂等と混ぜてクリ —ムにすることも可能である。さらに、抽出液を噴燥することによって、粉末状の抗アレルギー剤、ヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤、抗炎症剤にすることもできる。このように、本発明の抽出物は濃度や形状は特に制限されず、その用途に応じて適宜決定することができる。

本発明の抽出物には雪蓮花属抽出物以外の成分を含ませてもよい。本発明の抽出物は、 «から食用に供されている雪 ¾ ^属の抽出物を活性成分としているため、生体に対する安全性が高い。このため、本発明の抽出物は、医薬品、機能性食品、飲食品、医薬部外品、化粧品、浴用剤などの広範な製品中に含有させることができる。その配合量に関しては特に規¾ "るものではないが、これらの製品における本発明の抽出物の ili は、所望の効果を奏する範囲内で択することができる。人体に投与する場合の投与量としては、例えば一日あたり 0. 2〜5 OmgZKg体重として、 1回から数回に分けて投与することができる。医薬品にする場合の剤形は、投与目的や投与経に応じて、猫 I』、カプセル剤、注射剤、点滴剤、散剤、座剤、顆粒剤軟葡 β剤、乳剤、シロッフ』、クリーム剤等にすることができる。また、この糸賊物中には、一般に製剤に使用される結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、安定剤、乳ィ匕剤、緩衝剤等の添加物を含有させること力 sできる。結合剤の ¾iな例としてはデンプン、トレノヽロース、デキストリン、アラビアゴム末などが挙げられる。滑沢剤の好適な例としてはステアリン酸、タルク、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤の好適な例としてはデンプン、カルポキシメチルセルロース、コ一ンスターチなどが挙げられる。安定剤の好適な例としては油脂、プロピレングリコ一ルなどが挙げられる。乳化剤の好適な例としては、ァニオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコールなどが挙げられる。緩衝剤の好適な例としてはリン酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの緩衝液が挙げられる。

さらに本発明の抽出物は飲食品、化粧品または浴用剤へ含有でき、その含有量としては特に規^ るものではないが、通常 0. 0 0 0 1重量％以上、好ましくは 0. 0 1〜 6 0重量％が良い。本発明の抽出物を化粧品に含有させ、抗アレルギー剤、抗炎症剤として用いる場合は 0. 0 1〜： L 0重量％、化粧品に含まれるヒアルロン酸分解抑制のためヒアル口ニダ一ゼ活性阻害剤として用いる場合は 1〜1 0 0 0 p pmにすることができる。浴用剤の場合では、浴槽の大きさに応じて同程度の濃度になるように処方すれば良い。また、同程度の濃度で、ウエットティッシュやマスク等に含ませることもできる本発明の抽出物は抗アレルギー作用を有することから、本発明の抽出物を 0. 0 1〜 1 0 0重量％、好ましくは 0. 1〜5 0重量％食品に含ませることによってその食品を抗アレルギー機能性食品にすることができる。対象となる食品の種類は、抽出物の抗ァレルギ一作用が阻害されないものであれば特に限定されない。例えば、ジュース、清涼飲料水、茶などの飲料、パンやもちなどの加工食品、あめなどの菓子類、カップラーメンなどのインスタント食品、バタ一、サラダ油などの油脂類、ドレッシング、マヨネ一ズ、ソース、醤油やみりんなどの調味料、ふりかけ、みそなどの広範な飲食品に含ませることができる。もちろん、抽出物の代わりに雪蓮花をそのまま粉碎し、直接食品等に加えて摂取することも可能である。〔実施例〕

以下に難例および実施例、処方例を記載して、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、これらの製造例および実施例、処方例によって、本発明の範囲は限定的に解釈されるものではない。

赚例 1 )

雪蓮花 (Saussurea involucrata ) の乾燥した花 '茎各 1 gを十分水洗いすることにより表面に付着している汚れを除去する。裁断、破砕した後、抽出溶媒として 1 8 m 1の 7 0 %エタノールに入れ、直射日光にあたらない暗所に 1週間放置後、 4°C 、 3 0 0 O r pmで 5分間遠心し、上清をフィルタ一滅菌した。さらに抽出物は細胞培養用培地で 1 0 0倍、 1 0 0 0倍、 1 0 0 0 0倍に希釈して使用した。

例 2 )

{Saussurea involucrata ) の乾燥した花 .茎計 2 gを十分水洗いすることにより表面に付着している汚れを除去する。裁断、破砕した後、 4倍量の 9 9. 5 % ェ夕ノールを添加、 1日攪拌することにより抽出を行い、遠心分離により上清を得て抽出物を得た。得られた液を濃縮乾固し、固形物約 1 0 O mgを得た。

(製造例 3 )

雪蓮花 (Saussurea involucrata ) の乾燥した花 '茎計 1 k gを十分水洗いすることにより表面に付着している汚れを除去する。裁断、破碎した後、 4倍量の 7 0 %ェ夕ノールを添加、 1日攪拌することにより抽出を行い、遠心分離により上清を得て抽出物を得た。得られた液を濃縮乾固し、固形物約 5 8 gを得た。

(実施例 1 ) ヒスタミン放出ァッセィ

1 0 % FBS、 1 %ストレプトマイシン添加 RPMI-1640培地にヒト幼若性好塩基球 (KU812) 細胞を播種し、 5 % C O ₂下、 3 7 で培養する。次に、培養した KU812 をフラスコから剥がし、上記培地と同じ培地を用い細胞濃度 1 0 ⁶ ceUs/mlに懸濁する。さらに、この細胞懸濁液を 1 . 5 m lのマイク口チューブへ 1 0 0 1ずつ分注し、製造例 1で作成した雪蓮花エタノール抽出物希釈サンプルを細胞に添加した後、氷浴で 30分ィンキュベー卜する。

次に、 4°C、 300 O r pmで 5分間遠心分離後上清を取り除き、ヒスタミン放出バッファ一（30 mM Tr i s -HC 1 pH 7.6, 120 mM N a C 1 , 5 mM KC 1 , 5 mM KC l, l mM CaC l ₂, l mM MgC l ₂, 0.03% BSA) を 20 Om 1添加した後 5%C〇₂下、 37°C炭酸ガスインキュベータ一内にて 30分インキュベートする。インキュベート後、 4°C、 3000 r pmで 5分間遠心分離し、上清のヒスタミン含有液をキヤビラリ一電気泳動する。ヒスタミンは塩基性ァミンで pH2. 5のバッファ一で（+) に荷電し隨に移動するので、ヒスタミン標準溶液及び式験溶液の移動時間と吸収スぺクトル（160 nm〜600 nm) から定性を行い、標準溶液のピーク面積から定量を行ラ。

ヒス夕ミン標準物質の標準溶液は、ヒスタミン標準物質 5 Omgを蒸留水で 5 Oml にしたものを用いる。キヤビラリ一電気泳動では、 18. 2 ΜΩ.αηの純水で 0· 05 Μリン酸にしたものを泳動液として用いる。キヤピラリ一電気?永動は、キヤピラリ一電気泳動装置（横河ヒュ一レッドパッカード社製）を用い、カラムはフェーズドシリカ、キヤビラリ一（横河アナリティカルシステム：内径 75 m、有効波長 56 cm、全長 64.5 cm) 、？永動緩衝液は 0. 05 Mリン酸バッファー pH7. 5、電圧（30 kV; positive) 、試料 ¾λ量（20000Pa . S (加 ¾)) 、分離モード（キヤピラリーゾーン電気泳動）、検出波長 (210 nm) 、キヤビラリ一のコンディショニングは試料 ¾λとともに泳動緩衝液で 5分間フラッシングすることにより実施する。結果を図 1に示す。本発明の雪^ Ε抽出物は抗ァレルギ一作用の指標である好塩 ¾ί求からのヒスタミン放出を有意に阻害した。

(実施例 2) /3—へキソサミニダーゼ放出アツセィ

10% FBS、 MEM 4.7 g I 500 ml、 200 mM L—グルタミン 5 ml / 500 ml、 10% NaHCO_s (pH 7.0〜 7.4 ) で調製した培地にヒト幼若性好塩基球 (KU812) 細胞を播種し、 5% C〇₂下、 37 °Cで培養する。次に、培養した KU812をフラスコから剥がし、上記培地と同じ培地を用い細胞濃度 5 X 1 0⁵ cells/mlになるよう調製し、 1 mg/mlマウス抗 DNP-IgE抗体を最終的に 0.3 ml/mlになるように力 Πえる。よくサスぺンドした後、 96穴プレートに 100 lwellづっ播き、 5% C0₂下、 37°C炭酸ガスィンキュベ一タ一内にてー晚インキュベートし、細胞を感作した。翌日、細胞を 200 H\ の PBSで 2回洗浄後、 β一へキソサミニダ一ゼ放出バッファ一（116.9 mM NaC 1 , 5.4 mM KC 1 , 0.8 mM MgS0₄ · 7H₂0, 5.6 mMグルコース， 25 mM HEPES , 2.0 mM C a C 1₂, 1.0 mg I ml BSAを 500 mlの水に溶かし、 10%N aHC〇₃で pH 7.7に調整し、フィルタ一滅菌したもの） 60 illと製造例 1で作成した雪抽出物爾尺サンプルあるいはコントロール（PBSあるいは 70%エタノールを PBSで 5倍辦尺したものの）を 5 lカロえ、 5% C0₂下、 37°C炭酸ガスインキュベータ一内にて 10分間インキュベートする。次に、 4 g / ml DNP-BSAを 5 lカロえ、 5% C0₂下、 37°C炭酸ガスインキュベーター内にて 1時間インキュベートした後、上清 20 \に基質溶液 (85.5 m の p-nitrophenyl-N-acetyl b-D-glucosaniideを 50 mlの 50 mMクェン酸バッファ一（pH 4.5；クェン酸で pH調製）に加え溶解したもの） 80 ΐを加え、 37 °Cで 30分間インキュベートする。その後、反応停止液 (100 mM炭酸バッファ一； Na₂C0₃ 1.06 g I 100 ml, NaHC〇₃ 0.84 g I 100 ml) 200 lを加えた後、マイクロプレートリ一ダ一にて 450 nmの吸光度を測定する。

このとき、 β—へキソサミニダ一ゼ放出の阻害率を次の式で算出する。

阻害率 ( % ) = [ l - ( S - B ) / ( C - b ) ] X 100

S：サンプルを細胞に加えた時の A450

B：細胞非存在下でサンプルを加えた時の A450

C：コント口一ル（PBSあるいは 70%エタノールを PBSで 5倍希釈したものを細胞に加えた時）の A450

b：細胞非存在下でコントロールを加えた時の A450

結果を図 1に示す。本発明の雪蓮花抽出物は抗ァレルギ一作用の指標である好塩基球からの )6—へキソサミニダーゼ放出を有意に阻害した。

(実施例 3 ) ヒアルロニダ一ゼ活性阻害

溶液 A {ゥシ睾丸由来ヒアルロニダーゼ（シグマ社製） 2.83 mgを 0.1M酢酸緩衝液 (pH 4.0)に溶解した溶液 } 0.025 mlを、溶翻 {0.1M酢薩衝液 (pH4.0)に溶解した 0.3 M塩化ナトリウム碰} 0.2 mlと混合して、 37°Cで 20分間保温する。雪 ¾ 抽出物は、 1個体の花と茎をあわせて製造例 1の方法で抽出した。この雪蓮花 70% エタノール抽出物を、 1/15 M リン薩衝液 (pH7; KH₂P0₄ · 12H₂0含有）で 700倍に希釈したサンプル 0.1 mlを添加して、 37°Cで 20分間保温する。さらに溶液 C は隹鶏トサカ由来ヒアルロン酸カリウム塩 (シグマ機) 1.83 mgを 0.1 M酢酸緩衝液 (pH 40) lmlに溶解した溶液 } 0.2 mlを加えて、 37°Cで 20分間保温する。その後、 0·4N NaOH水溶液 lmlぉょび0.8Mホゥ酸ナトリゥム（Na₂B₄〇₇) 溶液 0.1mlを添加して 3分間煮沸し、冷却後さらに溶 » {パラジメチルァミノべンズアルデヒド 10 gに、 10 N塩酸 12.5 mlおよび酸 87.5 mlを添カ卩して溶解した後、酢酸で 10倍に希釈した溶液 } 3.0 mlを添加する。その後、さらに 37°Cで 20分間保温してから 585 nmにおける吸光度を測定する。以下の式に従ってヒアルロニダ一ゼ活性阻害率を求め、活' I生を面する。

ヒアル口ニダ一ゼ活性阻害率二 [(C-A)-(B-A)]X(C-A) X 100

Α-ヒアル口ニダ一ゼとサンプル両者を含まない場合の吸光度

B=tアル口ニダ一ゼとサンプル両者を含む場合の度

C二ヒアルロニダ一ゼを含むがサンプルを含まない:^の醜度

結果を表 1に示す。表 1

サンプル阻害率 (%)

70%エタノール抽出物 (1) 41

雪難 70%エタノール抽出物 (2) 87

*サンプル（1) は製造例 1の方法により抽出日数が 3日の花'茎抽出液を

等量混合したもの、サンプル（2) は製造例 1の方法で抽出日数が 10日の花 ·茎抽出液を等量混合したものをサンプルとして使用。

本発明の雪蓮花抽出物は抗アレルギー作用およ m¾炎症作用の指標であるヒアルロニダ一ゼ活性を阻害した。また、抽出日数が長い方が高い阻害活性を示した。

(処方例 1) 雪讓由出物含有翻の製造

雪編由出物（製造例 3) 45重量部

乳糖 35重量部

結晶セルロース 15重量部

ショ糖脂肪酸エステル 5重量部

上記繊で常法により雪抽出物含有織 IJを製造した。

(処方例 2) 雪蓮花抽出物含有ソフトカプセルの製造

雪繩抽出物（製造例 3) 40重量部

オリ—ブ油 55重量部

グリセリン脂肪酸エステル 5重量部

上記繊で常法により雪舰抽出物含有ソフトカプセルを織した。 (処方例 3) 雪抽出物含有クラッカーの製造雪皿抽出物（S¾t例 3) 1重量部

薄力粉 1 2 0重量部

食塩 1重量部

ベ一キングハ。ウダ一 2重量部

バタ一 3 0重量部

水 4 0重量部

上記組成で常法により雪^ ¾抽出物含有クラッカ一を製造した。

(処方例 4) 雪抽出物含有ドレッシングの製造

雪抽出物（例 3) 1 0重量部

オリ、 8 0重量部

食酢 6 0重量部

3重量部

コショウ 1重量部

レモン水 5重量部

上記 «で常法により雪抽出物含有ドレッシングを製造した。 (処方例 5 ) 雪抽出物含有清涼飲料水の製造

雪難抽出物繊例 3) 1重量部

液糖 3 0重量部

クェン酸 0. 1重量部

香料 0. 5重量部

水 1 5 0重量部

上記組成で常法により雪蓮花抽出物含有清涼飲料水を製造した。 (処方例 6) 雪抽出物含有チューインガムの製造

雪難抽出物（製造例 3) 0.

ガムべ一ス 2

砂糖 7

香料 0.

水適量

上記組成で常法により雪 ¾^抽出物含有チューィンガムを製造した

(処方例 7 ) 雪魁抽出物含有乳液の製造

雪^ E抽出物（製造例 3)

グリセリン

1,3-ブチレングリコール

スクヮラン

ポリオキシエチレン

オリ—ブ油 5重量部

水 9 0重量部

上記«で常法により雪抽出物含有乳液を製造した

(処方例 8 ) 雪抽出物含有口一ションの製造

雪抽出物（$ ^例 3)

グリセリン

1,3-ブチレングリコール

エタノール ]

香料 0.

水 1 0 0重量部

上記組成で常法により雪抽出物含有ローションを製造した。 (処方例 9) 雪抽出物含有浴用剤の Mii

雪謹由出物例 3) 1重量部

炭酸水素ナトリウム 2 0重量部

無水硫酸ナトリウム 1 0重量部

ホウ砂 1重量部

上記糸賊で常法により雪抽出物含有浴用剤を製造した。鐘上の利用可纖

本明細書に示した雪の抽出物は、抗アレルギー剤、抗炎症剤あるいはヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤として有用である。本発明の雪蓮花の抽出物は、安全性が高いうえに簡単な方法で調製することができるため、医薬品、飲食品、ィ匕粧品、浴用剤などへの利用性が高くその応用範囲はきわめて広いものと期待される。

Claims

請求の範囲

1 . 雪蓮花属 (Saussurea ) の抽出物を含有することを特徴とする抗アレルギー剤。

2. 雪蓮花属の抽出物を好塩 ¾ϊ求細胞脱顆粒阻害活性あるいは肥満細胞脱顆粒阻害活性の有効成分として含有することを特徴とする抗ァレルギ一剤。

3. 雪 ¾¾属の抽出物をヒアルロニダーゼ阻害活性の有効成分として含有することを特徴とする抗アレルギー剤。

4. 雪蓮花属が、雪蓮花 Saussurea involucrata ) である請求の範囲第 1項〜第 3 項のいずれか一項に記載の抗ァレルギ一剤。

5. 雪属の抽出物をヒアル口ニダ一ゼ阻害活性の有効成分として含有することを特徴とするヒアルロニダーゼ活性阻害剤。

6 . 雪蓮花属が、雪蓮花 (Saussurea involucrata ) である請求の範囲第 5項記載のヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤。

7. 雪 ¾¾属の抽出物をヒアル口ニダ一ゼ阻害活性の有効成分として含有することを特徴とする抗炎症剤。

8 . 雪蓮花属が、雪蓮花 {Saussurea involucrata ) である請求の範囲第 7項記載の抗炎症剤。

9 . 請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか一項に記載の抗アレルギー剤、請求の範囲第 5項〜第 6項のいずれか一項に記載のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、及び請求の範囲第 Ί項〜第 8項のいずれか一項に記載の抗炎症剤からなる群より選択される少なくとも 1つを配合することを特徴とする飲食品。

1 0. 請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか一項に記載の抗アレルギー剤、請求の範囲第 5項〜第 6項のいずれか一項に記載のヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤、及び請求の範囲第 7項〜第 8項のいずれか一項に記載の抗炎症剤からなる群より選択される少なくとも 1つを配合することを特徴とする化粧品。

1 1 . 請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか一項に記載の抗アレルギ一剤、請求の範囲第 5項〜第 6項のいずれか一項に記載のヒアルロニダーゼ活性阻害剤、及び請求の範囲第 7項〜第 8項のいずれか一項に記載の抗炎症剤からなる群より選択される少なくとも 1つを配合することを特徴とする浴用剤。