WO2004016081A1

WO2004016081A1 - レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類での遺伝子発現法およびそれによって得られる遺伝子導入鳥類

Info

Publication number: WO2004016081A1
Application number: PCT/JP2003/010198
Authority: WO
Inventors: Shinji Iijima; Masamichi Kamihira; Kenichi Nishijima; Kenichiro Ono
Original assignee: Kaneka Corporation; Nagoya Industrial Science Research Institute
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2003-08-11
Publication date: 2004-02-26
Also published as: HRP20050237A2; JP5468719B2; CN1674779A; MXPA05001331A; JPWO2004016081A1; RU2005106867A; JP2013255521A; EP1548114B8; JP2011147447A; AU2003254929A1; KR20050067138A; ES2394792T3; IL166395A0; EP1548114A4; JP5473963B2; EP1548114A1; EP1548114B1; US20060143725A1; BR0313441A; JP5815631B2

Abstract

　本発明の目的は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって抗体遺伝子が導入され、導入遺伝子を発現することにより抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類、及び作製したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類が発現する抗体を回収することよりなる抗体生産法、及び鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始直後を除くそれ以降の受精卵にレトロウイルスベクターをインジェクションすることよりなるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法を提供することである。　即ち、本発明は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって抗体遺伝子が導入され、導入遺伝子を発現することにより抗体を産生するＧ０トランスジェニックキメラ鳥類である。

Description

明細書

レトロウイルスベクターによる遺伝子導入鳥類での遺伝子発現法おょぴそれによつて得られる遺伝子導入鳥類技術分野

本発明は、血液中ならぴに卵中に、抗体、例えば s c F V _ F c抗体を産生する G O トランスジエニックキメラ鳥類に関する。また本発明は、複製能欠失型レトロウィルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入された G Oトランスジェエックキメラ鳥類を作製し、血中、卵白中あるいは卵黄中に産生した抗体を回収することからなる抗体産生法に関する。更に本発明は、効率的に導入遺伝子を発現する G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法ならびに該作製法より得られる G O トランスジエニックキメラ鳥類に関する。背景技術

遺伝子機能の研究手段として、外来遺伝子を宿主に組み込んだ遺伝子導入（トランスジエニック) 動物の研究が盛んに行われているが、このトランスジェニック動物は、基礎研究だけでなく、品種改良や物質生産、移植用臓器のドナー等、産業応用にも有効である。ゥシ、ャギ、ヒッジ等の乳汁に生理活性物質を産生させる試みが実用に近づいており、その代表例として α 1—アンチトリプシンやァンチスロンビンは、医薬品への応用を目的として現在臨床段階にある。

ゥズラゃニヮトリに代表される家禽鳥類は、食肉用、採卵用家畜としての飼育実績が長く、トランスジエニック研究の目的としても耐病性や肉質向上等、品種改良に係るさまざまなアプローチが考えられる。また、鳥類は性成熟までの期間が短く、小さなスペースで飼育可能なことから、安価なコストで実施可能なタンパク質発現系と考えられ、抗体医薬品や希少タンパク質の産生手段としてのトランスジヱニック作製に期待が持たれている。鳥類の卵は多量のタンパク質を含有し、毎日連続的に生産されることから、導入遺伝子産物を組換えタンパク質として意図的に卵中に産生させることができれば、効率的な生産システムとなると考えられる。近年数多くの品目が上巿され、医薬品として注目されているモノクローナル抗体は、大腸菌などによる安価な発現システムでは生産できず、単価が高いことが普及の妨げとなっている。鳥類細胞は抗体タンパク質を構成する機能を備えており、トランスジェエック鳥類は、従来大量生産が困難であった医療用抗体等の生産手段として期待できる。更にこれらのタンパク質生産物には、鳥類細胞によつて糖鎖が付与されることにより血中での安定性が向上する等、医薬、検査薬としての応用上有利な性質を備える可能性が高いと考えられる。

このように、有用タンパク質の生産手段としての応用が待たれるトランスジェニック鳥類であるが、一方で現在までに様々な試みがあるにも係らず、鳥類の卵に実用レベルで目的とする組換えタンパク質を蓄積させた例はない。また、抗体のような複数のュニットからなる高次構造をもったタンパク質を、高濃度に発現するトランスジエニック鳥類を作製した例も、未だ報告されていない。

Ha r v e yら（Ha r v e y, A. Jら（2002) Na t u r e B i o t e c hn o l o g y. 19， 396) はェビアン ·ロイコシス · ウィルス由来のベクターを用い、 ]3—ラクタマーゼ遺伝子をニヮトリに導入し、 GOトランス 'ジエニックキメラ-ヮトリを作製したが、血清あるいは卵への酵素発現量は 50 〜25 O n g/m 1程度であった。この GO トランスジエニックキメラニヮトリの交配により作製された G 1〜G 3 トランスジエニックニヮトリは、全身の体細胞に遺伝子が導入されることにより、酵素の発現量が増加したが、それでも数 μ g/m 1のレベルに留まり、実用には遠い値であった。

一般的に遺伝子導入動物を作製するには、受精卵の前核へ DNAをマイクロインジェクシヨンする手法がとられるが、鳥類にはこの方法は応用できない。鳥類では 1細胞期の胚を取得するのが困難なこと、また取得できたとしても、卵内の核を見分ける手法がないことがその理由である。 1細胞期の胚を取得するには、雌性鳥類の輸卵管内から受精直後の卵を取得し、正常に発生させなければならない。近年 P e r r yによって鶏の卵割前細胞を取得し、体外で培養するシステムが確立された（P e r r y、 M. M (1 988) Na t u r e, 331) 力この手法によっても卵内の核を見分け、核内へ目的遺伝子を導入することは不可能である。従って、鳥類受精卵への遺伝子導入は、細胞質への DN A注入に限られ、 DN A封入脂質二重膜（リボソーム）の利用やリン酸カルシウム法、電気導入法（ェレクト口ポレーシヨン）の利用が試みられてきた。し力し、これらの手法では遺伝子の導入効率が悪く、また導入されたプラスミド DNAは、染色体に取り込まれる確率が低い。マイクロインジェクションによる遺伝子導入法は、効率的に目的 DN Aを受精卵に送り込むことができるが、導入されたプラスミド DNAは宿主染色体に組み込まれないため、宿主の体細胞分裂に伴って導入遺伝子プラスミドは脱落してしまい、安定な遺伝子導入効果は望めない。

1 986年に初めてレト口ウィルスベクターによるトランスジエニックニヮトリの作製例が報告されている（S a l t e r, D. Wら（1 986) P o u l t r y S c ， 65) 。レトロウイノレスベクターをマイク口インジェクション法で受精卵に注入する手法は、遺伝子の導入効率の高い手法であり、核内へ直接 DNAを注入できない鳥類において、染色体へ目的遺伝子が挿入された安定なトランスジックを作製する唯一の実用的方法である。

本発明者らは鋭意研究を重ね、遺伝子治療にも応用されている安全な自己複製能欠失型ウィルスベクターを使用し、効率的に目的遺伝子を導入するトランスジヱニック鳥類の作製法を見出した（特開 2002— 176880号公報）。これにより、安全かつ効率的に複数の導入遺伝子コピー数をもつトランスジエニック鳥類の作製が可能となった。またこの手法によれば、導入遺伝子は高い効率で次世代に伝達されることもわかり、物質生産システムとしての遺伝子導入鳥類の利用が実用に近づいた。

し力しながら、このとき導入された遺伝子の大部分は、発生初期に宿主によつて不活性化されるため（遺伝子のサイレンシングと呼ばれる）、遺伝子発現の結果としてのタンパク質産生はごく微量であった。導入遺伝子が不活性化される生物学的メカニズムは未だ解明されていないが、この不活性化を回避し、目的遺伝子を効率的に発現させる技術が、トランスジエニック鳥類の応用開発に必須である。発明の要約レトロウイルスベクターによって受精卵に導入された遺伝子が、発生後どの時期に不活性化されるのかを特定するため、本発明者らは ]3—ガラクトシダーゼ発現遺伝子を指標とし、受精後の様々な時期にベクターを導入して発現量がどう変化するかを検討した。その結果、導入遺伝子の発現量は該遺伝子が胚発生のどの時期に導入されたかによって大きく変化してくることを発見し、本発明に至った。すなわち、導入遺伝子の不活性化は、放卵直後に導入された遺伝子に対して顕著であり、放卵から一定時間経過後に導入された遺伝子は、発現頻度が高いというものである。

本発明者らはこの知見を利用し、鳥の種類によって決まる特定の時間が孵卵開始時より経過した後に、その初期胚へ外来遺伝子を導入すれば、宿主による不活性化の影響を受けず、目的遺伝子を効率的に発現させることが可能となることを見出した。

さらに、医薬品として有用なキメラ抗体、例えば s c F v - F c ( 1本鎖抗体 ) をコードした遺伝子を組み込んだベクターを作り、この方法によりゥズラに導入して、 G O トランスジエニックキメラ鳥類を作製したところ、血中、卵白、卵黄中に導入遺伝子に由来する抗体が高濃度に発現することが見出された。

すなわち第一の本発明は、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期（ステ一ジ X ) を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レト口ウィルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる G Oトランスジエニックキメラ鳥類の作製法、及び該方法により作製された G O トランスジエニックキメラ鳥類に関し、第二の本発明は、複製能欠失型レト口ウィルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入された G O トランスジヱニックキメラ鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を血中、卵白中及び卵黄中の少なくとも 1つに産生することを特徴とする G O トランスジエニックキメラ鳥類に関し、第三の本発明は、上記 G O トランスジエニックキメラ鳥類を作製し、該 G 0 トランスジエニックキメラ鳥類の血中及び/又は卵中から抗体を回収することよりなる抗体の生産法に関する。

本発明の G O トランスジエニックキメラ鳥類による導入遺伝子の発現は、誕生した G 0 トランスジエニックキメラ鳥類が成鳥になつても維持されることが確認された。したがって、本発明により特定の遺伝子を鳥類に導入し、目的タンパク質を成長後も産生する、実用的な生産システムを構築することができる。また、本発明によって作製された G O トランスジエニックキメラ鳥類の導入遺伝子は、交配により高い伝播効率で次世代に受け継がれる。導入遺伝子は、染色体に,組み込まれたかたちで次世代に受け継がれるため、このトランスジェニック鳥類による生産システムは、安定的な物質生産が可能である。

本発明により、トランスジエニック鳥類がその体細胞中に産生させた目的タンパク質は、血液中に分泌され、血清から分離することで利用可能となる。

更に本発明者らは、ヒト I g Gクラスの定常領域をもつ抗体や、ゥズラ I g G、ニヮトリ I g G又はマウス I g Gの定常領域をもつ抗体が、ゥズラ、ニヮトリにおいて血中から卵中に効率的に移行することを見出した。これらの定常領域をもつ抗体を本発明の方法により作製された G 0 トランスジエニックキメラ鳥類に発現させた場合、血中に分泌された抗体が卵中に高濃度に蓄積される。

トランスジニック動物に遺伝子を導入して目的タンパク質を取得する場合、哺乳類では乳汁中に分泌させて回収するのが一般的だが、鳥類のトランスジェニックでは卵に目的物を蓄積させ、その卵白、卵黄から回収、精製するのが実際的である。

鶏卵などでは全成分の 3 0 %がタンパク質であり、その主成分となるタンパク質はオボアルブミンである。従来トランスジエニック鳥類の卵中に組換えタンパク質を発現させる方法として、このオボアルブミン等の発現プロモーターを利用し、その下流に目的タンパク質をコードする遺伝子を組み込んで、卵白中にオボアルブミンに代えて目的物を発現させるという考え方がとられていた。

し力し、本発明の方法において、構成的なプロモーター、例えばニヮトリ β— ァクチンプロモーター等の制御のもとに、大量に発現した抗体、例えば前記 I g Gクラス抗体等を血中に分泌させ、卵中に蓄積させることが可能となる。なお本明細書において、構成的なプロモーターとは、全身性に発現するプロモーターのことを意味する。

更に抗体の構造のなかで、卵中への移行に必須な部分を特定するため、抗体を F a b , F cフラグメントとしたものを、ゥズラ、ニヮトリ血中に接種して卵への移行性を調べた。その結果、卵内には F cフラグメントが蓄積され、抗体の卵内への移行は F cレセプターを介して行われることが示唆された。

このことからトランスジエニック鳥類による抗体の卵内での生産法を、タンパク質全般の生産に汎用化する方法として、ヒト I g Gの定常領域（F c ) が融合した構造をもつタンパク質を生産するべクターを設計し、トランスジェニック鳥類を作製して卵から目的物を含むタンパク質を回収し、 F c部を切断して目的物を精製する生産法が考えられる。

また、従来哺乳類のトランスジヱニック動物を使って抗体を生産した場合、産生動物がもつ自己抗体と目的抗体を分離精製するのが困難との問題が指摘されていた。産生動物に鳥類を使う抗体生産法の利点として、鳥類の自己抗体がプロテイン A、プロテイン Gカラムに吸着されないため、目的とする組換え抗体との分離が容易な点も挙げられる。

前述のように、ヒトモノクローナル抗体は、医薬品として有用であるにも係らず、その生産には動物細胞培養やマウス腹水といった高価な生産手段しかなく、単価が高いことが普及に際して妨げとなっている。

近年遺伝子工学的手法を用いて、抗体の H鎖、 L鎖の V領域のみをリンカ一配列でつなげた s c F v ( 1本鎖抗体）が作製されているが、これは大腸菌でも生産されるという利点があり、コストの点から注目されている。しかし、低分子抗体と呼ばれるこれらのタンパク質は、血中での安定性が低いため、治療用、試験用としての実用性に難があった。

s c F vに F c領域をつなげた s c F v _ F cは、血中でも安定であり、より実用的と考えられるが、大腸菌では生産できず、動物細胞を使ったバイオリアクターでしか供給できない。ニヮトリなど他の動物に作らせた結合領域をもつ s C F vにヒトの F cを結合させたヒト化 s c F V— F cは治療用としても有望であり、このタンパク質を本発明による G O トランスジエニックキメラ鳥類により大量に生産できれば、その有用性は大きい。

本発明の G O トランスジエニックキメラ鳥類は、 s c F v— F cのような,袓換え抗体、キメラ抗体、ヒトモノクローナル抗体など、従来の方法では少量しか生産できなかった抗体タンパク質を安価に大量に生産し、実用的に回収、精製して利用することに応用できる。 . このように本発明ではレト口ウィルスベクターによる G 0トランスジエニックキメラ鳥類において、導入遺伝子を効率的に発現させる作製法を開示する。また本発明では、特定遺伝子を導入することにより、鳥類体細胞に有用な目的タンパクを産生させる G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法を開示する。更に従来大腸菌等で産生することが不可能だったモノクローナルヒト型抗体や、キメラ抗体、 s c F v— F c抗体、複雑な高次構造をもった機能性タンパク等、医薬、検査薬として有用な物質を鳥類細胞に産生させ、血清や卵中から回収して利用する、生産コストの低いタンパク生産システムを開示する。

また本発明の G O トランスジェエックキメラ鳥類の作製法を応用して、家禽鳥類を好ましい方向へ改質する手法おょぴ改質された鳥類を提供することも考えられる。家禽鳥類の好ましい性質としては、肉質改善、耐病性の向上、生育速度の向上等が挙げられる。鳥類はまた愛玩用途としても多種の需要をもっているが、本発明の作製法は、羽毛色の改善、攻撃性の低下等、愛玩用として好ましい形質へ短期間で品種改良するための手段としても応用しうる。

更に、現在哺乳類、両生類、魚類等のトランスジエニック作製は、核移植によつて行われるのが通常であるが、本発明はそれに代わる新たなトランスジェエツク動物作製の効率的手法としても応用できる。

即ち、本発明は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入された G O トランスジエニックキメラ鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を、血中、卵白中及び卵黄中の少なくとも 1つに産生する G Oトランスジエニックキメラ鳥類である。上記抗体の定常領域は、クラスがヒト I g Gであるか、サブクラスがヒト I g G 1であるか、ゥズラ I g G、ニヮトリ I g G、あるいはマウス I g Gであることが好ましい。上記抗体遺伝子は、構成的なプロモーターにより制御されていることが好ましく、上記構成的なプロモーターは、ニヮトリ β—ァクチンプロモーターであることが好ましい。上記レトロウイルスベクターは、モロニ一'ミューリン · ロイケミア · ウイノレス由来べクタ一であることが好ましく、 V S V— Gシユードタイプであることが好ましい。本発明の G 0 トランスジェユックキメラ鳥類は、 -ヮトリあるいはゥズラであることが好ましい。上記抗体は、キメラ抗体であることが好ましく、上記キメラ抗体の産生量は、血液中には、 0. 5 /X g/m 1以上であることが好ましく、より好ましくは 5 μ gZm 1以上であり、卵白中には、 0. 1 / gZm 1以上であることが好ましく、より好ましくは 1 μ g/ml以上であり、卵黄中には、 0. l z g/ml 以上であることが好ましく、より好ましくは 1 μ gZml以上である。また、上記抗体は、 s c F V — F c抗体であることが好ましく、上記 s c F V— F c抗体の産生量は、血液中には、 20 g/m 1以上であることが好ましく、より好ましくは 2000 g/m 1以上であり、卵白中には、 5 μ g/m 1以上であることが好ましく、より好ましくは 500 /X g/m 1以上であり、卵黄中には、 5 μ g/m 1以上であることが好ましく、より好ましくは 500 g/m 1以上である。本発明の GO トランスジエニックキメラ鳥類を作製し、上記 GO トランスジエニックキメラ鳥類の血中及び z又は卵中から抗体を回収する抗体の生産法もまた、本発明の 1つである。

鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウィルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる GO トランスジエニックキメラ鳥類の作製法もまた、本発明の 1つである。本発明の GO トランスジエニックキメラ鳥類の作製法において、複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる時期は、孵卵開始から 24時間以降であることが好ましい。上記複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させる方法は、初期胚に形成される心臓ないしは血管内へマイクロインジェクションすることであるのが好ましい。上記心臓ないしは血管は、孵卵開始から 24時間以降の初期胚に形成されるものであることが好ましい。マイクロインジェクションする複製能欠失型レトロウイ/レスベクターの活性は、 1 X 10⁷ c f u/m 1以上のタイターであることが好ましく、 1 X 10⁸ c f u/m 1以上のタイターであることがより好ましく、 1 X 10⁹ c f u/m 1以上のタイターであることが更に好ましい。上記レトロゥイノレスべクタ一は、モロニ一'ミューリン ' ロイケミア ' ゥイノレス由来ベクターであることが好ましく、 VSV— Gシユードタイプであることが好ましい。本発明で作製する G0 トランスジエニックキメラ鳥類は、 -ヮトリまたはゥズラであることが好ましい。上記複製能欠失型レトロウイルスベクターに組み込まれる導入遺伝子は、レトロウィルスに由来しない遺伝子配列を含有することが好ましい。上記レトロウイルスに由来しない遺伝子配列は、ニヮトリ —ァクチンプロモーターにより制御されている遺伝子配列であることが好ましく、抗体遺伝子又は融合タンパク遺伝子をコードする遺伝子配列であることが好ましい。上記抗体遺伝子は、キメラ抗体遺伝子であることが好ましく、 s c F v— F c抗体遺伝子であることが好ましい。

本発明の GO トランスジエニックキメラ鳥類の作製法で作製された GOトランスジエニックキメラ鳥類もまた、本発明の 1つである。図面の簡単な説明

図 1は、複製能欠失型レト口ウィルスベクターのベクターコンストラクト pM S C VN Δ A の構造を示す。 N e o ^rはネオマイシン耐性遺伝子を、 Am p ^r はアンピシリン耐性遺伝子を示す。 Ρ_{ΔΑ(; ΐ}は] 3—ァクチンプロモーター遺伝子を示す。 i3—G a 1は; 8—ガラクトシダーゼ発現遺伝子を示す。 Ψ +はパッケ一ジングシグナル配列を示す。 5' LTR及ぴ 3' LTRはそれぞれMoMLVのロングターミナルリピート配列を示す。

図 2は、 GO トランスジエニックキメラゥズラにおける、遺伝子の導入時期と jS—ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸は孵卵時間（h r) を、縦軸は mUn i tZmgで表される一ガラクトシダーゼ活性を示す。

図 3は、 G 0 トランスジェユックキメラニヮトリにおける、遺伝子の導入時期と ;3—ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸は孵卵時間（h r) を、縦軸は mUn i tZmgで表される ]3—ガラクトシダーゼ活性を示す。

図 4は、導入したレトロウイ/レスベクターのタイターと G 0 トランスジェニックキメラゥズラでの ]3—ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸は c f uZm 1で表されるウィルスタイターを、縦軸は mUn i t/mgで表される] 3 —ガラタトシダーゼ活性を示す。

図 5は、導入したレトロウイルスベクターのタイターと GO トランスジェニックキメラニヮトリでの j3—ガラクトシダーゼ活性発現との関係を示す。横軸は c f u/m 1で表されるウィルスタイターを、縦軸は mUn i tZmgで表される ]3—ガラタトシダーゼ活性を示す。図 6は、ゥズラ卵中に蓄積したヒト I gG抗体を示す。抗体値は 3羽のゥズラで行った同一の実験結果の平均値を示している。

図 7は、ニヮトリ卵中に蓄積したヒト I gG抗体を示す。抗体値は 3羽のニヮトリで行った同一の実験結果の平均値を示している。

図 8は、ゥズラ卵中に蓄積した F a bフラグメントを示す。抗体値は 3羽のゥズラで行った同一の実験結果の平均値を示している。

図 9は、ニヮトリ卵中に蓄積した F a bフラグメントを示す。抗体値は 3羽のエワトリで行った同一の実験結果の平均値を示している。

図 10は、ゥズラ卵中に蓄積した F cフラグメントを示す。抗体値は 3羽のゥズラで行った同一の実験結果の平均値を示している。

図 1 1は、ニヮトリ卵中に蓄積した F cフラグメントを示す。抗体値は 3羽の -ヮトリで行った同一の実験結果の平均値を示している。

図 1 2は、抗 CD 2抗体発現ベクターコンストラクト pMS C V/G Δ AL ( 図 1 2 (A) ) 、 MS CV/G Δ AH (図 1 2 (B) ) 及び pMSCV/GA AL I H (図 1 2 (C) ) の構造を示す。 Am p ^rはアンピシリン耐性遺伝子を示す。 P _{c t}は i3—ァクチンプロモーター遺伝子を示す。 Ψ +はパッケージングシグナル配列を示す。 GFPはグリーン ·フルォレツセント ·プロテイン遺伝子を示す。 Lは抗 CD 2抗体軽鎖遺伝子を示す。 Hは抗 CD 2抗体重鎖遺伝子を示す。 5' LTR及び 3' LTRはそれぞれ MoML Vのロングターミナルリピート配列を示す。

図 1 3は、 s c Fv— F c抗体発現ベクターコンストラクト pMSCV/GA A s c F v— F cの構造を示す。 Am p ^rはアンピシリン耐性遺伝子を示す。 P _{Ac t}は ]3—ァクチンプロモーター遺伝子を示す。 Ψ +はパッケージングシグナル配列を示す。 GFPはグリーン ·フルォレツセント ·プロテイン遺伝子を示す。 s c Fv— F cは s c Fv— F c抗体遺伝子を示す。 5 ' L T R及び 3， L TRはそれぞれ Mo ML Vのロングターミナルリピート配列を示す。

図 14は、 GO トランスジエニックキメラゥズラ血清中に発現した s c F V— F c量を示す。横軸は個体番号、縦軸は s c F V— F c抗体濃度（ g/m l ) を示す。図 1 5は、 GO トランスジエニックゥズラ卵中に発現した s c F v-F c量をしめす。横軸は産卵開始からの採卵日、縦軸は s c F V— F c抗体濃度 g/ m l) を示す。

図 1 6は、精製した s c Fv— F cの SDS— PAGEによる解析結果を示す。レーン 1は低分子量マーカー（LMW) を、レーン 4は高分子量マーカー（HM W) を示す。レーン 2は還元処理した s c F V— F cを、レーン 3は還元処理していない s c F V -F cを電気泳動した結果を示す。発明の詳細な開示

以下に本発明を詳述する。

本発明の GO トランスジエニックキメラ鳥類は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによつて外来性抗体遺伝子が導入された鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を、血中、卵白中あるいは卵黄中に産生することを特徴とする。本発明で使用する鳥類としては、特に限定されず、例えば-ヮトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ゥズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニヮトリやゥズラは入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましい。

本発明で使用されるレトロウィルスベクターとしては、モロニ一■ ミユーリン • ロイケミア . ウィルス (MoML V) 、ェビアン · ロイコシス · ウィルス (A LV) 等に由来するベクターが挙げられる。なかでも MoML Vに由来するものが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。

安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるウィルスは、通常ウイルス粒子の複製に必要な 3種の遺伝子 g a g、 p o l、 e n vのうちのいずれか又は全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したウィルスが用いられる。鳥類細胞にこのウィルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパク質を人工的に VSV— G (水疱性口内炎ウィルス由来）シユードタイプとしたウィルスべクターが好ましいが、本発明はこのウィルスタイプに限定されるものではない。パッケージング細胞またはヘルパーウイノレス等を利用することにより調製されたシユードタイプのウイレスベクターは、通常のマイクロインジェクション法 ( B o s s e l ma n, R. Aら（1 989) S c i e n c e 243、 533) により、初期胚、血管内、心臓内へ導入される。遺伝子導入法としては、この他にもリポフエクションゃエレクトロポレーション法等が考えられる。

本発明により鳥類に導入される遺伝子は特に限定されないが、マーカー遺伝子や目的タンパク質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコント口ールするプロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等により構成される。

上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、；8—ガラクトシターゼ遺伝子、 L a c Z遺伝子、蛍光タンパク質、例えば GFP (グリーン ·フ口才口レツセント，プロテイン）等をコードした遺伝子が挙げられる。

上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては特に制限されず、ヒトモノクローナル抗体など遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子などが挙げられる。また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での蓄積がよいことから、ヒト I gGクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子、ヒト I gG 1のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子、ゥズラ I g G、ニヮトリ I g Gやマウス I g Gの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。

また好ましい上記構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメラ抗体とは、 2種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。従来、マウスハイプリドーマによって作製された医療用抗体はマウス由来であるため、ヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。上記キメラ抗体としては、例えば、抗ヒト CD 2抗体、抗 CD 2 ◦受容体抗体、抗 TNF抗体など、当該欠点を改良し、マウス抗体のうち抗原タンパク質と結合する領域以外をヒト抗体で置き換え、拒絶反応をなくしたキメラ抗体が挙げられ、すでに医薬品として上巿されているものもある。

さらに好ましい上記構造遺伝子としては、 s c F V _ F c抗体の構造遺伝子が挙げられる。

医療用の組換え抗体には、低分子抗体と称される一群がある。免疫グロブリン I g Gには直接抗原と結合する可変領域（F V ： F r a gme n t o f v a r i a b l e r e g e o n) と呼ばれる VH、 V Lのへテロ二量体からなるドメインがあり、この Fv ドメインは I gGの約 5分の 1の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。 VH、 VLドメイン間を人工的にペプチドリンカーで結合したものが 1本鎖抗体（ s c F V ： s i n g 1 e c h a i n Fv ) と呼ばれる低分子抗体で、 VH、 VL単独よりも安定性が向上することが知られていた。

P owe r sら、 P owe r s, D. Bら (2000) J I mm u n o 丄 Me t h o d. 25 1, 123) は、この s c F vにヒト I gG lに由来する F c部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見出した。この s c Fv — F c抗体は医療用として有用と考えられるが、安価な大量生産システムである大腸菌では生産されない。

他の好ましい上記遺伝子配列として、融合タンパクの構造遺伝子が挙げられる。遺伝子組み換えにより 2種あるいはそれ以上のタンパクの一部を融合させた人ェ的な一群のタンパクは融合タンパクと称され、医薬品として実用化されているものに、 TNF受容体に免疫グロプリンの F cを融合させた TNFR— F cや L FA3に F cを融合させた LFA3—F cなどがある。これらは F cを融合させることで可溶化され、より強力な生理活性をもつように設計された人エタンパクである。

本発明の G0トランスジエニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子、 s c Fv — F c抗体遺伝子を使用することにより、従来生産が困難だった抗体医薬品を安価に大量生産できる。

例えば、キメラ抗体遺伝子を導入した GO トランスジエニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量は、好ましくは 0. 5 μ g/m 1以上、より好ましくは 5 /i g/m l以上である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは 0. 1 μ g /m 1以上、より好ましくは 1 μ g /m 1以上であり、卵黄中の抗体含有量は、好ましくは 0. 1 I g /m 1以上、より好ましくは 1 μ g/m 1以上である。また、 s c F v—F c抗体遺伝子を導入した G0 トランスジェックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量は、好ましくは 20 gZml以上、より好ましくは 2000 g/m 1以上である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは 5 /i g Zm l以上、より好ましくは 5 0 0 μ g Zm 1以上である。卵黄中の抗体含有量は、好ましくは 5 / g /m 1以上、より好ましくは 5 0 0 // g /m 1以上である。

上記プロモーター遺伝子としては、構成的なプロモーターが挙げられる。抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、ニヮトリ βーァクチンプロモーターが挙げられる。

本発明の抗体の生産法は、本発明の G O トランスジエニックキメラ鳥類を作成し、上記 G O トランスジエニックキメラ鳥類の血中及び/又は卵中から抗体を回収することを特徴とする。

次に本発明の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法について説明する。当該作製法の 1つとして、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる'作製法が挙げられる。また、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から 2 4時間以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も、本発明の作製法の 1つとして挙げられる。

より好ましくは、上記初期胚に形成される心臓ないしは血管内へ、複製能欠失型レトロウイノレスベクターをマイクロインジェクションする方法である。

つまり、本発明の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法は、放卵後特定の時間経過した受精卵に複製能欠失型レト口ウィルスベクターをマイクロインジェクシヨンすることよりなる。放卵後の受精卵の初期発生についてニヮトリを例にとると、まず輸卵管内で受精した卵は、受精後約 1 . 5時間で卵割を開始する。細胞質がつながったまま盤割が始まった卵は、 1日かけて体外に放出される間に分裂し、約 6万個の細胞からなる胚盤葉と呼ばれる胚になる（胚盤葉期）。この胚盤葉は、卵黄中央部の直径 3〜4 xnmの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成されるころに起こり、原条が形成され、胚盤葉は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経て、排卵から 2 2日目に孵化する。胚盤葉期は、ステージ Xとも呼ばれ、この時期の細胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の受精卵を使用している。本発明においては、放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件、例えば-ヮトリなば 37： 7〜 37. 8 °C、湿度 50〜 70 %程度の孵化に適した環境条件にいた時間を 0時間とし、これを孵卵開始時として、経時的に各種の処置を行つた。ゥズラでは孵卵開始から 36時間後、 -ヮトリでは孵卵開始後 50時間頃から、卵黄上に血管系の形成が観察され、心臓に分化する器官の脈動が観察できた。上述の遺伝子を導入した受精卵の孵化には、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Kam i h i r a, M. ら（1 998) D e v e l o . Gr ow t h D i f f e r. ， 40, 449) 等が応用できる。

本発明の作製法において使用する複製能欠失型レトロウイルスベクター、導入する遺伝子、遺伝子導入鳥類としては、上述した GO トランスジエニックキメラ鳥類と同様のものが挙げられる。

上記複製能欠失型レトロウイルスベクターに組み込まれる導入遺伝子は、レト口ウィルスに由来しない遺伝子配列を含有することが好ましい。なお本発明の作製法において、「レトロウイルスに由来しない遺伝子」としては、上述した構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等が挙げられる。上記レトロウィルスに由来しない遺伝子配列は、ニヮトリ j8—ァクチンプロモーターにより制御されている遺伝子配列であることが好ましく、抗体遺伝子又は融合タンパク遺伝子をコードする遺伝子配列であることが好ましい。

本発明の作製法では、 1 X 10⁷ c f uZm 1以上、好ましくは 1 X 10⁸ c f n/m 1以上、より好ましくは 1 X 1 0⁹ c f u /m 1以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウィルスベクターをマイクロインジェクションすることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ましい。

本発明の作製法で受精卵に遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザィク状に導入遺伝子をもったトランスジェエック鳥類として成長する。この一世代目の遺伝子導入鳥類を G 0 トランスジエニックキメラ鳥類と呼ぶ。

このような本発明の作製法によって得られる GO トランスジェエックキメラ鳥類も、本発明の 1つである。

GO トランスジエニックキメラ鳥類と非トランスジエニック鳥類、あるいは G 0 トランスジエニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する二世代目、三世代目が導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する個体として成長する。 GO トランスジエニックキメラ鳥類個体から導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、代々01〜02〜。3 トランスジエニック鳥類と称する。

本発明による GO トランスジエニックキメラ鳥類を同種の非トランスジェニック鳥類あるいは配偶型 GO トランスジエニックキメラ鳥類と交配させることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジエニック鳥類を作製できる。完全なトランスジェニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、 GO トランスジェエックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換えタンパク質の産生量が増加することが期待できる。更に、安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジヱエック鳥類の系統を確立することで、タンパク質産生システムとしての品質の安定化が可能である。発明を実施するための最良の形態

以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。 (実施例 1) ]3 _ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラクトの調製 β—ガラクトシダーゼ発現ベクターコンストラタト] MSCVNAA]3は、以下のように作製した。

1. プラスミド p LXRN (クロンテック社製) からラウス 'ザルコーマ■ ウイルス（RSV) プロモーター断片を制限酵素 Xh o I及び H i n d I I Iによつて切り出し、プラスミド p B 1 u e s c r i p t I I SK ( + ) (ストラタジーン社製）の Xh o I、 H i n d I I Iサイトへ揷入し、プラスミド p B 1 u e/ R S Vを作製した。 2. プラスミド p CMV/3 (クロンテック社製）から 3—ガラクトシダーゼ (β -G a l) 遺伝子断片を制限酵素 No t Iによって切り出し、プラスミド p Z e o S V2 ( + ) (インビトロジェン社製）の N o t Iサイトへ揷入した。 T 7プ口モーターと同方向に j3— G a 1遺伝子が揷入された構造のプラスミドを！ Z e o / 1 a c Zとした。

3. p B 1 u e/RS Vから R S Vプロモーター断片を制限酵素 Xh o I及び P s t Iによって切り出した。 p Z e oZl a c Zから —Ga 1遺伝子断片を制限酵素 P s t I及び Xh o Iによって切り出した。制限酵素 Xh o Iによって処理したプラスミド p LNHX (クロンテック社製）のベクター断片に上記切り出した 2断片を連結し、プラスミド p LNR i3を作製した。

4. p LNHXから一連のモロニ一 · ミューリン ·ザルコーマ · ウィルス (Mo Mu S V) 5 ' —ロング ' ターミナル . リピート（LTR) 、ウィルス .パッケ一ジング■シグナル及びネオマイシン耐性 (N e o ^r) 遣伝子を含む断片を、制限酵素 S a c I I及び Xh o Iによって切り出し、制限酵素 S a c I I及び Xh o Iによって処理した p LXRNのベクター断片に連結し、プラスミド p LXL を作製した。 5. p Z e oZ 1 a c Zから j3—G a 1遺伝子断片を制限酵素 H i n d I I I及び X h o Iによって切り出し、制限酵素 H i n d I I I及び X h o Iによつて処理した！） LXLのベクター断片に連結し、プラスミド p LZ Lを作製した。

6. 2つの化学合成ォリゴヌクレオチド 5， - c g g t c t a g a g g a a t t c a g t g g t t c g— 3 (配歹 (J番"？ Τ 1 ) 及び 5 一 c c a g g a t c c g a c g t t g t a a a a c g a c g-3' (配列番号 2 ；下線部は B a mH I制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94°CZl 5秒→55°C/30秒→7 S^Zl分 30秒： 35サイクル； KOD— P 1 u s— DNAポリメラーゼ（東洋紡社製））により、プラスミド pMi wZ (Su emo r i e t a 1. , 1990， C e l l D i f f . D e v. 29 : 18 1— 185) から R S Vプロモーターとニヮトリ βァクチン (A c t ) プロモーターのハイブリッドプロモーター（_{M i w}プロモーター）の 5' 領域断片を増幅後、制限酵素 B am H I及び Mu n Iによって切り出し、プラスミド pGREEN LANTERN 一 1 (ギブコ BR L社製）の B amH I、 Mu n Iサイトへ揷入し、プラスミド p Gm i w 5 ' を作製した。

7. pM i wZから M i wプロモーター 5 ' 側中央領域断片を制限酵素 M u n I 及ぴ C 1 a Iによって切り出し、 p Gm i w5' の Mu n I、 C 1 a Iサイトへ揷入し、プラスミド p Gm i w 5 ' — 2を作製した。

8. p Gm i w 5 ' — 2から M i wプロモーター 5，領域及び 5' 側中央領域を含む断片を制限酵素 B amH I及び E c o R Iによって切り出し、 p B 1 u e s c r i p t I I S K ( + ) の B amH I、 E c o R Iサイトへ揷入し、プラスミド p B l u e/M i w5' を作製した。

9. 2つのィ匕学合成オリゴヌクレオチド 5， - c c a a a g c t t g c c g c a g c c a t t g c c t t t t -3' (配列番号 3 ；下線部は H i n d I I I制限酵素サイ卜 )及ぴ o — a t a c c t a g g g g c t g g c t g c g g a g g a a c-3' (配列番号 4 ；下線部は B 1 n I制限酵素サイト）をプライマーとする PCR ( 98°C/1 5秒→ 60°C/30秒→ 72。0/30秒： 35サイクル) により pM i wZから M i wプロモーター 3，領域断片を増幅後、制限酵素 H i n d I I I及び B 1 n Iによって切り出し、制限酵素 H i n d I I I及び B 1 n Iによって処理した p L XLのベクター断片に連結し、プラスミド p LM i w 3 ' を作製した。

10. pM i wZから M i wプロモーター 3，側中央領域断片を制限酵素 E c o R I及び Mb o I Iによって切り出した。 p LM i w 3 ' から M i wプロモータ一 3，領域断片を制限酵素 Mb o I I及ぴ Kp n Iによって切り出した。 p B 1 u e /M i w 5 ' の E c oR I、 K p n Iサイトへ上記切り出した 2断片を揷入し、プラスミド p B 1 u e/M i wを作製した。

1 1. B 1 u e/M i wから M i wプロモーター全長を含む断片を制限酵素 B amH I及び B 1 n Iによって切り出し、制限酵素 B a mH I及び B 1 n Iによつて処理した p L XLのベクター断片に連結し、プラスミド p LMLを作製した。

1 2. p LMLから A c tプロモーター断片を制限酵素 S ma I及び X b a Iで切り出し、 p B l u e s c r i p t l l SK ( + ) の E c oRV、 Xb a lサイトへ揷入し、プラスミド p B 1 u eZA c tを作製した。

1 3. p LMLから M i wプロモーター断片を制限酵素 H i n d I I I及び B g 1 I Iによって切り出し、制限酵素 H i n d I I I及び B a mH Iによって処理した LZ Lのベクター断片に連結し、プラスミド p LM Lを作製した。

14. p B 1 u e/A c tから Ac tプロモーター断片を制限酵素 S a 1 I及び B 1 n Iによって切り出した。 p LM Lから； 3— Ga 1遺伝子断片を制限酵素 B 1 n I及び B g 1 I Iによって切り出した。制限酵素 Xh o I及び B g 1 I I によって処理した p LNR ]3のベクター断片に上記切り出した 2断片を連結し、プラスミド p LNAj3を作製した。

1 5. 2つのィ匕学合成ォリゴヌクレオチド 5 ' — t t t a g c t a g c t g c a g c t c a g t g c a t g c a c-3' (配列番号 5 ；下線部は N h e I制限酵茶サイ卜 ) 及び 5 ' — a t a a t c t a g a a a c g c a g c g a c t c c c g c一 3，（配列番号 6 ；下線部は Xb a I制限酵素サイト）をプライマーとする P CR (98 °C/ 15秒→ 60。じ/ 30秒→ 68 V/ 2分： 30サイクル）により pM i wZからイントロン欠失ァクチン（Δ A c t) プロモーター断片を増幅後、制限酵素 Xh o I (Xh o I制限酵素サイトは增幅断片中に存在）及び Xb a Iによって Δ Ac tプロモーターの一部を含む断片を切り出した。 AAc tプ口モーターの残りの部分と — G a 1遺伝子を含む断片を p LNAjSから制限酵素 B 1 n I及び B g 1 I Iによって切り出した。制限酵素 Xb a I及び B g 1 I Iによって処理した p LN A ]3のベクター断片に上記切り出した 2断片を連結し、プラスミド p LNAA を作製した。

1 6. p LN Δ A から一連の N e o ^r遺伝子、 Δ A c tプロモーター、及び ;3 -G a 1遺伝子を含む断片を制限酵素 B 1 n I及び B g 1 I Iによって切り出し、制限酵素 B 1 n I及び B g 1 I Iによって処理した; L XLのベクター断片に連結し、プラスミド p L N Δ A ]3— 2を作製した。

1 7. ： LNAA/3— 2から一連の N e o ^r遺伝子、 AAc tプロモーター、及び 0— Ga 1遺伝子を含む断片を制限酵素 B amH.I及び B g 1 I Iによって切り出し、制限酵素 B amH I及び B g 1 I Iによって処理したプラスミド; pMS CVn e o (クロンテック社製）のベクター断片に連結した。 8 & 171^11及び8 g 1 I Iサイトが消失したプラスミドを pMS CVNAA とした。

このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラタト！) MS C VN Δ A j3の構造を図 1に示した。

(実施例 2 ) β—ガラクトシダーゼ発現レトロウイルスベクターの調製実施例 1で作製したベクターコンストラクト pMSCVNAA]3よりレトロゥィルスベクターを調製するため、パッケージング細胞 GP 293 (クロンテック社製）を直径 10 Ommの培養ディッシュに 5 X 10⁶細胞植え、培養した。培地を新鮮な DMEM (ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、 p_VSV— G ベクター（クロンテック社製） 8 gと pMS CVNA Aj38 μ gをリボフエタション法により前記 GP 293細胞に導入した。 48時間後、ウィルス粒子を含む培養上清を回収し、 0. 45 ;zm酢酸セルロースフィルター (ァドバンテック社製）を通して、夾雑物を除去した。得られた溶液にポリプレン（シグマ社製）を 1 0 μ g/m 1 となるように加えウィルス液とした。

調製したウィルス液を別に培養した GP 293細胞に加え、 48時間培養後、 6 00 g /m 1の G4 1 8 (G I B CO BR L社製）を含む培養液で植え継ぎ、 G 4 1 8安定形質転換 GP 2 9 3株を取得した。

得られ;た安定形質転換株を 80 %コンフルェントとなるよう直径 100 mmディシュに培養し、 1 6 μ gの p VSV— Gベクターをリポフエクション法で導入/した。 4 8時間後ウィルス粒子を含む培養上清 1 2m lを回収した。

この培養上清を 5 0, O O O X g、 4°じで1. 5時間遠心を行い、ウィルスを沈殿させた。上清を除き、ウィルス粒子を含む沈殿物に 50 1の 5 OmM T r i s—HC l (p H 7. 8) 、 1 3 0 mM N a C 1、 1 mM E D T A溶液を加え、 4°Cで一晚放置後、よく懸濁してウィルス溶液を回収した。このようにして得られた高タイターウィルスベクターは、 1 0⁸〜 1 0⁹ c f u/m 1であつた。

ウィルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日に N I H3 T 3 細胞（ァメリカン 'タイプ 'カルチャー■ コレクシヨンより入手）を直径 3 5 m mのディッシュに 7 X 1 0⁴細胞植え、培養した。 1 0²〜1 0⁶倍に希釈したゥィルス溶液を各ディッシュに 1 m 1加え、 48時間後に蛍光顕微鏡により GF P (グリーン■フルォレツセント ■プロテイン）を発現している細胞の割合を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。

ウィルスタイター =細胞数 X希釈率 X発現割合（c f u/m 1 ) (実施例 3 ) ゥズラ胚へのレト口ウィルスベクタ一のィンジェクション

WE系統のゥズラ受精卵（日本生物科学研究所）を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製 P— 008型）内で 3 7. 9 °C、湿度 6 5%環境に置いた時刻を孵卵開始時刻（0時間）とし、以後 1 5分毎に 9 0度転卵しながら孵卵を行った。

孵卵開始時、受精卵の卵殻を 70 %エタノールで消毒し、銳端部を直径 2 cm の円形にダイヤモンドカッター（MI N IMO 7 C 7 1 0、ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（CD 一 1、ォリンパス社製）をマイクロピペット製作器（PC— 1 0、ォリンパス社製）で加工し、外径約 20 //inとなるよう先端を折って作製した針を刺し、マイク口インジェクター（T r a n s j e c t o r 5246、エツペンドルフ社製）を用いて、胚盤下腔の中央に実施例 2で調製したウィルス溶液約 2 μ 1を微量注入した。この卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、 1 5分毎に 9◦度転卵しながら孵卵を行った。

孵卵開始から 1 2時間後、 24時間後の受精卵に同様の方法でウィルスを注入した。孵卵後約 36時間目から卵黄表面に血管の発生が認められ、その一部が脈動して心臓の原基となることが実体顕微鏡で観察できる。孵卵後 36時間、 48 時間、 55時間の心臓内へ、実施例 2で調製したウイルス溶液 2 μ 1をマイク口インジェクターにより微量注入した。

(実施例 4) ニヮトリへのレト口ウイノレスベタターのインジエタションニヮトリ受精卵（日本生物科学研究所）を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製 Ρ— 008型）内で 37. 9°C、湿度 65 %環境に置いた時刻を孵卵開始時刻 ( 0時間）とし、以後 1 5分毎に 90度転卵しながら孵卵を行った。

孵卵開始時、受精卵の卵殻を 70 %エタノールで消毒し、鋭端部を直径 3. 5 cmの円形にダイヤモンドカッター (MI N I MO 7 C 71 0、ミニター社製) で切り取り、胚を露出させた。胚盤葉を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ C D— 1、オリンパス社製）をマイク口ピぺット製作器（ P C— 10、ォリンパス社製）で加工し、外径約 20 /xmとなるよう先端を折って作製した針を刺し、マイクロインジェクター（T r a n s j e c t o r 5246、エツペンドノレフ社製）を用いて胚盤下腔の中央に、実施例 2で調製したウィルス溶液約 2 μ 1を微量注入した。この卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビエリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、 1 5分毎に 90度転卵しながら孵卵を行った。

孵卵開始から 12時間後、 24時間後の受精卵を同様に処理した。孵卵後約 5 0時間目から卵黄表面に血管の発生が認められ、その一部が脈動して心臓の原基となることが実体顕微鏡で観察できる。孵卵後 50時間、 55時間、 60時間の心臓内へ、実施例 2で調製したウィルス溶液 2 1をマイクロインジェクターにより微量注入した。

(実施例 5 ) ]3—ガラタトシダーゼ活性測定

孵卵開始から 1 15時間後、胚を卵殻より取り出し PB S (リン酸緩衝液）にて洗浄し、胚をとり囲む膜を取り除いた。摘出した胚を細かくせん断し、 0. 8 m lの反応バッファー（1 0mM KC 1、 1 mM Mg C l ₂、 0. 1% T r i t o n X— 100 (和光純薬工業製）、 5 mM 2—メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、 2mM リン酸バッファー pH7. 5) を加えて超音波破砕し、細胞液を得た。

0. 6m lの細胞液を、 37 °Cで 10分間インキュベートし、あらかじめ暖めておいた 4mgZm 1の o—二トロフエ二ノレ一 ]3—D—ガラクトピラノシド (O NPG) (シグマ社製）を 0. 1Mリン酸バッファー（ρΗ·7. 5) に溶解した液 0. 1m lを添加した。反応後 0. 3m lの 1M N a ₂C0₃ (和光純薬ェ業製）を加え、吸光度計にて 420 nmの波長強度を計測した。

β一ガラクトシダーゼの活性は ON PG u n i tで表した（1 u n i t ： 1 μ mo 1の o—ュトロフエノールが 1分間に生成されるときの活性）。 3回実験を行い、その平均値をーガラタトシダーゼ活性とした。

ニヮトリおよびゥズラの、遺伝子導入時期と i3—ガラクトシダーゼ活性測定結果との関係を図 2、図 3に示した。ゥズラでは孵卵後 48時間後、ニヮトリでは孵卵後 55時間後に導入した ]3—ガラタトシダーゼ遺伝子は、それ以前の時期に導入されたものに比べ、強く発現した。これは鳥類受精卵が、レトロウイルスによる外来遺伝子を不活性化する（サイレンシング）メカニズムが受精直後に顕著であり、時間を経るごとに弱くなつていくことを示唆する。このことから、鳥類の種類によつて決まる特定の時間経過した受精卵に目的遺伝子を導入することで、不活性化されることなく効率的に導入遺伝子を発現する G0 トランスジュニックキメラ鳥類の作製が可能になる。

(実施例 6) ウィルスタイターによる遺伝子発現の効率実施例 2で調製した 1 X 10⁸ c f u Zm 1のウィルス液を、希釈溶媒（ 50 mM T r i s— HC 1 (p H 7. 8) 、 1 30 mM N a C 1、 1 mM ED T A溶液）で 10倍、 100倍、 1000倍に 3段階希釈し、 1 X 10⁷、 I X 10⁶、 1 X 10⁵ c f uZm 1のタイター ' ウィルス溶液とした。ゥズラ受精卵を孵卵し、 48時間後の発生初期心臓に、調製したウィルス液 2 μ 1をマイク口インジェクションした。同様にして 48時間後の発生初期心臓に希釈溶媒のみを 2 μ 1インジェクションしたものを対照とした。

孵卵開始から 1 1 5時間後、実施例 5に準じて ]3—ガラクトシダーゼ活性を測定した。ゥズラでのウィルスタイターと遺伝子発現結果との関係.を図 4に示した。同様にニヮトリ受精卵を孵卵し、 55時間後の発生初期心臓に、調製したウイルス液 2 μ 1をマイクロインジェクシヨンした。 55時間後の発生初期心臓に希釈溶媒のみを 2 μ \ ンジェクシヨンしたものを対照とした。

孵卵開始から 1 1 5時間後、実施例 5に準じて ]3—ガラクトシダーゼ活性を測定した。ニヮトリでのウィルスタイターと遺伝子発現結果との関係を図 5に示した。

1 X 10⁸ c f u/m 1のウィルスが注入されたゥズラおよびニヮトリで顕著な ]3—ガラクトシダーゼ活性が確認され、それ以下の濃度では発現量は低かった。導入遺伝子の発現にはウィルスタイタ一が大きく影響すること、すなわち本発明による GO トランスジェエックキメラ鳥類で、導入遺伝子を効率的に発現させるためには高タイタ一の複製能欠失型べクタ一を使用するのが有効であるということが示唆された。

(実施例 7) ヒト抗体のゥズラ、ニヮトリ卵内への移行性

3種のサブクラスをもつヒト抗体（I gG 1、 2、 3) (コスモバイオ社製）を混合したもの、および対応する 3種の抗体フラグメント（F a b— 1、 F a b —2、 F a b— 3、 F c— 1、 F c— 2、 F c— 3) (コスモバイオ社製）を 1 00 / g/m 1 となるよう P B Sで希釈し、希釈液 100 μ 1をゥズラ成鳥（3 羽）またはニヮトリ成鳥（3羽)'の翼下静脈に注射した。

抗体を静脈に注射した翌日から 20日目まで採卵を行い、卵中に移行した抗体を定量した。卵黄は 5 0% (W/V) 、卵白は 1 0% (V/V) となるよう PB Sを用いて希釈し、凍結保存して測定用サンプルとした。

(実施例 8) E L I SA法による卵黄中抗体の定量

P B Sで希釈した抗ヒト I g G抗体（コスモバイオ社製）を E L I SAプレートに 1 00 g/w e 1 1入れて、 4°Cで一晚静置した。 P B S— 0. 05%T w e e η 20溶液を 200 /ζ 1で各 w e 1 1を 3回洗浄した後、 P B S— 0. 0 5%Tw e e n 2 0溶液一 2 %スキムミルクを 1 5 0 1 /w e 1 1入れた。室温で 2時間静置後、 6 1 1を200 1の？：63— 0. 0 5 %Twe e n 20溶液で 3回洗浄し、採取した血液、卵白、卵黄サンプルを 1 20 μ 1入れ、 4°Cでー晚静置した。この E L I S Aプレートを室温に戻した後、 PB S— Tw e e n 20溶液で 3回各 w e 1 1を洗浄し、 PB S— 0. 0 5%Twe e n 20 溶液で希釈した P e r o X i d e (POD) 標識抗ヒト I g G抗体（コスモバイォ社製）を 1 0 0 μ 1 /w e 1 1入れて、室温で 1時間静置した。

PB S— 0. 0 5%Tw e e n 20溶液で w e 1 1を 4回洗浄し、発色液（ 1 Omgの o—フエ二レンジァミン（片山化学工業製）を lm lのメタノールに溶解し、蒸留水で 1 0 Om 1としたものに、 1 0 μ 1の過酸化水素水（和光純薬ェ業製）を加えて調製した） 1 00 1を w e 1 1に加えた。 8M硫酸を 50 μ 1 添加して反応を止め、 4 90 nmの蛍光強度をプレートリーダーで測定して、標準検量線から濃度を計算した。ゥズラ、エワトリ各々 3羽から得られたサンプノレの抗体濃度を平均したものを結果とした。

標準検量線作製のための標準抗体（コスモバイオ社製）は、 5 0%卵黄一 PB S (W/V) で希釈した。

ゥズラおよぴニヮトリの卵中に蓄積された抗体濃度を図 6、 7に示した。ゥズラおよびニヮトリの卵中に蓄積された F a b， F cフラグメント濃度を図 8、 9、 1 0、 1 1に示した。

ゥズラ、ニヮトリにおいて、ヒト I gG抗体、サブクラスではヒト I gG 2、ヒト I gG 1が効率よく卵中に蓄積されることが示された。また F cフラグメントが卵内への高い移行性を示したことから、ヒト I g Gの移行は F cレセプターを介したものであることが示唆された。

(実施例 9) 抗 CD 2抗体発現ベクターコンストラクトの作製

抗 CD 2抗体発現用ベクターコンストラクト pMS CVZG AAH、 pMS C V,G Δ AL及び pMS C V/G Δ AL I Hは、以下のように作製した。

1. ヒト抗体（ I gM) 産生ハイプリドーマ細胞 D 2 5 3— 1 5— 6 (アメリカン ' タイプ ' カルチャー ' コレクション HB— 8 7 8 9) から Q u i c k P r e M i c r o mRNA P u r i f i c a t i o n K i t (ファノレマシァ社製）を用いて mRNAを取得し、得られた mRNAから F i r s t— S t r a n d c DNA S y n t h e s i s K i t (フアルマシア社製）を用いて c DNAライブラリを調製した。 2つの化学合成ォリゴヌクレオチド 5， - a t c c t c g a g a g g c c a a a g t a c a g t g— 3 (酉己列 ¾·号 Ϊ ； f線部は X h o I制限酵素サイト）及び 5，一 c c c g g a t c c c t a a c a c t c t c c c c t g t t g a a g c t - 3 ' (配列番号 8 ；下線部は B a mH I制限酵素サイト）をプライマーとする P CR (9 4°C/1分→5 0°CZ l分→7 2 °C/ 1分 3 0秒： 2 5サイクノレ； T a q DNAポリメラーゼ (パーキンエルマ一社製） ) により上記 c DNAライブラリからヒト抗体 L鎮 κ定常領域（h C c ) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 Xh o I及び B a mH Iによって切り出し、プラスミ K B l u e s c r i p t l l S (_) (ストラタジーン社製) の X h o I、 B a mH Iサイトへ揷入し、プラスミド ρ Β 1 u e/h C κを作製した。

2. 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5， - a g c g g c c g c t a c a g g t g t c c a c t c c g a c a t c g t g a t g a c c c a g t c t c c - 3 ' (配列番号 9 ；下線部は N o t I制限酵素サイト）及び 5 ' — c c t c t c g a g g a t a g a a g t t a t t c a g c a g g c a c a c— 3 配列番号 1 0 ；下線部は X h o I制限酵素サイト）をプライマーとする P CRにより上記 c DNAライブラリからヒト抗体 L鎖可変領域（hVL) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 N o t I及び Xh o Iによって切り出し、 p B 1 u e s c r i p t I I KS (-) の No t I、 Xh o Iサイトへ揷入し、プラスミド p B 1 u eZh VLを作製した。

3. 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5 ' - a c c t c g a g c g t g g c c g t t g g c t g c c t c g c a c a— 3 (酉己歹¹潘 1 1 ；「部は Xh o I制限酵素サイト）及び 5 ' — a c t a a g c t t a c g t t g t a c a g g g t g g g t t t a c c - 3 ' (配列番号 1 2 ；下線部は H i n d I I I制限酵素サイト）をプライマーとする P CRにより上記 c DNAライブラリからヒト抗体 H鎖 μ定常領域（h C/z) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 Xh o I 及び H i n d I I Iによって切り出し、 p B l u e s c r i p t l l KS (—）の Xh o I、 H i n d i I Iサイトへ揷入し、プラスミド p B l u eZhC/zを作製した。

4. 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5' - a g c g g c c g c t a c a g g t g t c c a c t c c g a g g t g c a g c t g g t g g a g t c t g g— 3 ' (配列番号 1 3 ；下線部は N o t I制限酵素サイト）及び 5 ' — c a c g c t c _a_g_g t a t c c g a c g g g g a a t t c t c a c a g g a— 3' (配列番号 1 4 ；下線部は Xh o I制限酵素サイト）をプライマーとする P CRにより上記 c DNAライブラリからヒト抗体 H鎖可変領域（hVH) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 No t I及び Xh o Iによって切り出し、 p B l u e s c r i p t I I KS (-) の N o t I、 Xh o Iサイトへ揷入し、プラスミド p B 1 u eZh VHを作製した。

5. ； B 1 u e/hC /cから li C κ遺伝子断片を制限酵素 X h o I及び B a mH Iによって切り出し、プラスミド p CEP 4 (インビトロジェン社製）の Xh o

I、 B amH Iサイトへ揷入し、プラスミド p CE P 4/h Cにを作製した。

6. 2つのィ匕学合成オリゴヌクレオチド 5，一 c c c a a g c t t g a t c t c c a c t g g g a t g g t g g g g g c c c t c c t c t t g c t g c t g— 3 ' (配列番号 1 5 ；下線部は H i n d I I I制限酵素サイト）及び 5 ' — c c c g g a t c c t c a g t c a a g g c g c c t t c g c a t g a a g a g g c c g a t c c c c a g g g c c a c c a c c a g c a g c a a g a g g a g g g c c c c— 3，（配列番号 1 6 ；下線部は B a mH I制限酵素サイト）を 2 1 b p sにわたつて相補的な 3 ' 末端でァニールさせ、 T 4 DNAポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた DNA 2重鎖合成反応によって上皮増殖因子受容体膜貫通領域（TM) の遺伝子断片を調製した。得られた TM遺伝子断片を制限酵素 H i n d I I I及ぴ B a mH Iによって処理後、 p B l u e s c r i p t l l KS (- ) の H ί n d I I I、 B a mH Iサイトに揷入し、プラスミド p B 1 u e/TM を作製した。

7. p B 1 u 6 11。から11〇遺伝子断片を制限酵素 11 o I及び H i n d I I Iによって切り出し、 B 1 u e/TMの Xh o I、 H i n d I I Iサイトへ挿入し、プラスミド； B 1 u e/h C μ TMを作製した。

8. p B 1 u 6 11〇//丁1^からー連の11〇/ 遺伝子及び丁1 遺伝子を含む断片を制限酵素 X h o I及び B a mH Iによって切り出し、 p C E P 4の X h o I、 B a mH Iサイトへ揷入し、プラスミド p C E P 4/h C μ TMを作製した。 9. p CE P 4ZhC TMを制限酵素 B amH Iによって切断し、末端を T4 DNAポリメラーゼによって平滑処理後、セルフライゲーシヨンによりプラスミド; CE P 4Zh C /i ΤΜΔ Bを作製した。

1 0. ィ匕学合成ォリゴヌクレオチド 5， — t g a a g a c a g a t g g c g c c g c c a c a g t t c g t t t -3' (配列番号 1 Ί ；下線部は N a r I制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入により p B 1 u 6/1 しが保有する11 VLの 3 ' 末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素 N a r Iサイトを導入し、プラスミド p B 1 u eZh VLNを作製した。 1 1. ィ匕学合成ォリゴヌクレオチド 5， — t g g g g c g g a t g c g g a t c _g_t g a g g a g a c g g t— 3' (配列番号 1 8 ；下線部は B a mH I制限酵素サイト）を用いた部位特異的変異導入により p B 1 u e/hVHが保有する h VHの 3 ' 末端にアミノ酸暗号の変更を伴わずに制限酵素 B a mH Iサイトを導入し、プラスミド p B 1 u e/h VHBを作製した。

1 2. 抗ヒト CD 2マウス抗体産生ハイプリドーマ細胞 T S 2/1 8. 1. 1 ( アメリカン 'タイプ'力ノレチヤ一 ' コレクション HB— 1 9 5) から Qu i c k P r e M i c r o mRNA P u r i f i c a t i o n K i t 用いて mRNAを取得し、得られた mRNAから F i r s t— S t r a n d c D NA S y n t h e s i s K i tを用いて c DNAライブラリを調製した。 2 つのィ匕学合成ォリゴヌクレオチド 5，一 c g c g g c c g c c t c a g g g a a a g t t t g a a g a t g— 3 ' (配列番号 1 9 ；下線部は N o t I制限酵素サィ卜 ) 及び 5 ― c g_g_c g c c g c c a c a g t c c g t t t t a t t t c c a g c t t g g t— 3，（配列番号 20 ；下線部は N a r I制限酵素サイト）をプライマーとする PC Rにより上記 c DN Aライブラリからマウス抗体 L鎖可変領域（mVL) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 N o t I及び N a r Iによって切り出し、 p B 1 u e,h VLNの N o t I、 N a r Iサイトへ揷入し、プラスミド p B 1 u eZmVLを作製した。

1 3. 同様にして、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5， - c g c g g c c g c g a a c a c g g amc c c t c a c c a t g— 3 (酉己歹 (J番"^ 2 1 ； f線部は N o t I制限酵素サイト）及び 5 ' - c g g a t c c t g c a g a g a c a g t g a c c a g a g t - 3 ' (配列番号 22 ；下線部は B a mH I制限酵素サイト）をプライマーとする PCRにより上記 c DNAライブラリからマウス抗体 H 鎖可変領域（mVH) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 No t I及び B amH I によって切り出し、 p B l u e s c r i p t l l KS (—）の No t I、 B am H Iサイトへ揷入し、プラスミド p B 1 u eZmVHを作製した。 14. p B 1 u eZmVLから mVL遺伝子断片を制限酵素 No t I及び Xh o Iによって切り出し、 P CEP4Z11C Kの No t I、 Xh o lサイトへ揷入し、プラスミド p CEP 4Z l g L _κを作製した。 1 5. pB 1 u eZhVHBから hVH遺伝子断片を制限酵素 No t I及び Xh o lによって切り出し、 p CE P 4/h C μ ΤΜΔ Bの N o t I、 X h o Iサイトへ揷入し、プラスミド p CE P 4/h I gH/z TMを作製した。

16. p B 1 u eZmVHから mVH遺伝子断片を制限酵素 N o t I及び B am H Iによって切り出し、制限酵素 N o t I及び B a mH Iによって処理した p C

E P 4/h I gH/i TMのベクター断片に連結し、プラスミド; CEP4/l g Hju TMを作製した。

1 7. プラスミド pMSCVn e o (ク口ンテック社製) から一連のミューリン 'ホスホグリセレート 'キ? "一ゼ（PGK) プロモーター及び N e o ^r遺伝子を含む断片を制限酵素 B g 1 I I及び B amH Iによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーシヨンによりプラスミド pMS C Vを作製した。

18. プラスミド: GREEN LANTERN— 1 (ギブコ BR L社製）から GF P遺伝子断片を制限酵素 No t Iによって切り出し、 pZ e o SV2 ( + ) の No t Iサイトに揷入した。 T 7プロモーターと同方向に GF P遺伝子が揷入された構造のプラスミドを p Z e oZGF Pとした。

1 9. p Z e o/GF Pから GF P遺伝子断片を制限酵素 E c o R I及び Xh o Iによって切り出し、制限酵素 E c o R I及ぴ Xh o Iによって処理した pMS

CVのベクター断片に連結し、プラスミド: MS CVZGを作製した。

20. ヒト抗体（ I g G 1) 産生ミエローマ細胞 I M— 9 (ジャパニーズ ' コレクシヨン .ォプ · リサーチ■バイオリソーシズ 0024) から mRNA i s o 1 a t i o n K i t (ロッシュ社製）を用いて： mRNAを取得し、得られた mRNAから R e V e r T r a Ac e (東洋紡社製）を用いて c DNAライブラリを調製した。 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5 ' -c a a g c t t c a a g g g c c c a t— 3 (酉己歹!]番 23 ) 及び 5， — a t t t a c c c g g a g a c a g g g a-3⁵ (配列番号 24 ) をプライマーとする PCR ( 95 °C/ 2分→52°C/30秒→74°CZ3分： 30サイクル； P f u DNAポリメラーゼ（プロメガ社製））により上記 cDNAライブラリからヒト抗体 H鎖 γ 1定常領域（hCy l) の遺伝子断片を増幅した。さらに、 2つの化学合成オリゴヌクレオチ r 5 — a t a g g a_t_c_c_g c t a g c t t c a a g g g c c c a t c g— 3 ' (配列番号 25 ；下線部は B a mH I制限酵素サイト）及び 5 ' — a g c a a g c t_t_t c a t t t a c c c g g a g a c a g g g a— d (酉 G列番号 26 ；下線部は H i n d I I I制限酵素サイト）をプライマーとする PCR ( 94°C/1 5秒— 58°C/30秒→68 °CZ 1分： 30サイクル； KOD— p 1 u s一 DNAポリメラーゼ）により上記 PCR産物から hCy 1遺伝子断片を増幅後、制限酵素 B amH I及び H i n d I I Iによって切り出し、 p B 1 u e s c r i p t I I SK ( + ) の B amH I、 H i n d I I Iサイトへ揷入し、プラスミド p B l u e/h Cy lを作製した。

21. CEP 4/1 _§Ημ TMから mVH遺伝子断片を制限酵素 H i n d I I I及び B a mH Iによって切り出した。 8 1 116 11。7 1から11じ 1遺伝子断片を制限酵素 B amH I及ぴ H i n d I I Iによって切り出した。制限酵素 H i n d I I Iによって処理したプラスミド pETB l u e— 2 (ノバジェン社製）のベクター断片に上記切り出した 2断片を連結し、プラスミド p ETB l u e/l gHy 1を作製した。

22. p ETB 1 u eZl gHy 1から抗体 H鎖 γ 1 ( I gHy 1) の遺伝子断片を制限酵素 H i n d I I Iによって切り出し、 pMS C VZGの H i n d I I

Iサイトへ揷入した。 GFP遺伝子と同方向に I gHy 1遺伝子が揷入された構造のプラスミドを pMS C V/GHとした。 2 3. 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5， - a c g c g t c g a c g t g c a t g c a c g c t c a t t g- 3 ' (配列番号 27 ；下線部は S a i l制限酵素サイト J 及び 5 — a c g c _g_ t_c_g a c a a c g c a g c g a c t c c c g — 3，（配列番号 28 ；下線部は S a 1 I制限酵素サイト）をプライマーとする P CR (94。C/ 1 5秒→ 50 °C/ 30秒→ 6 8。じ/ 1分： 1 0サイクル； 94 °C/ 1 5秒→ 6 2 °C/ 3 0秒→ 68。C/ 1分： 30サイクル）により pM i wZ から Δ A c tプロモーター断片を増幅後、制限酵素 S a l Iによって AAc tプ口モーター断片を切り出し、 p ETB l u e— 2の S a i lサイトへ揷入し、プラスミド p ETB 1 u eノ AA c tを作製した。

24. p ETB l u e/AAc tから ΔΑ。 tプロモーター断片を制限酵素 S a 1 Iによって切り出し、 pMS CV/GHの Xh o Iサイトへ揷入した。 I gH γ 1遺伝子と同方向に Δ Ac tプロモーターが揷入された構造のプラスミドを p MS C V/G Δ AHとした。

2 5. 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5 ' - a a t g t c g a c a t g g t g t c c a c t t c t c a g c t c - 3 ' (配列番号 29 ；下線部は S a 1 I制 1¾酵素サイ及ぴ 5 — t t c g t c g a c c t a a c a c t c t c c c c t g t t g a a— 3 ' (配列番号 30 ；下線部は S a 1 I制限酵素サイト）をプラィマーとする P CR (9 5。 / 30秒→ 50 °C/ 30秒→ 74。じ/ 2分： 1 0サイクノレ； 9 5°C/30秒→60°C/3 0秒→74°CZ2分： 3 0サイクル； P f u DNAポリメラーゼ）により p CE P 4ノ I g L κから抗体 L鎖 κ ( I g L κ) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 S a 1 Iによって切り出し、 p ETB l u e— 2の S a i lサイトへ揷入し、プラスミド; ETB l u e/l g L /cを作製した。

2 6. p ETB 1 u e/Δ A c tから AAc tプロモーター断片を制限酵素 S a 1 Iによって切り出し、 pMS CVZGの Xh o Iサイトへ揷入した。 GF P遺伝子と同方向に AAc tプロモーターが揷入された構造のプラスミドを pMSC VZG Δ Aとした。

27. pETB l u eZl g L fcから I g L _K遺伝子断片を制限酵素 S a l Iによって切り出し、 pMS C VZG Δ Aの S a 1 Iサイトへ揷入した。 AAc tプ口モーターと同方向に I g L κ遺伝子断片が挿入された構造のプラスミドを pM S C V/G Δ ALとした。

28. 2つのィ匕学合成ォリゴヌクレオチド 5， - a c g c g t c g a c c g c c c c t c t c c c t c c c c c -3' (配列番号 3 1 ；下線部は S a 1 I制限酵素サイ卜) 及び 5 ' 一 c c g c t c_g_a g_ a t t a t c a t c g t g t t t t t c a a a g g a a a a c c a c g t c-3' (配列番号 32 ；下線部は X h o I 制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94°C/15秒→60°CZ30秒 →68。じ/ 1分： 30サイクル) によりプラスミド p LX I N (クロンテック社製）から I RES断片を増幅後、制限酵素 S a 1 I及び Xh o Iによって切り出し、 p ETB l u e— 2の S a l l、 Xh o lサイトへ揷入し、プラスミド： E ΤΒ 1 u e/I RESを作製した。

29. pETB l u eZl RE Sから I RE S断片を制限酵素 S a 1 I及び Xh o lによって切り出し、 pMS CV/GA AHの S a 1 Iサイトへ揷入した。 I gHy 1遺伝子と同方向に I RESが揷入された構造のプラスミドを pMSCV /G Δ A I Hとした。

30. pETB l u eZl g L fcから I g L K遺伝子断片を制限酵素 S a l Iによって切り出し、； MS C VZGA A I Hの S a 1 Iサイトへ揷入した。 AAc tプロモーターと同方向に I g L κ遺伝子断片が揷入された構造のプラスミドを pMS C V/G Δ AL I Hとした。

このように作製した複製能欠失型レトロウイルスべクターのベタターコンストラク I Hの構造を図 1 2に示した

(実施例 10) 抗 CD 2抗体発現 GO トランスジニックキメラゥズラの作製実施例 2に準じて、ベクターコンストラクト pMSCVZGAAH、 pMSC ZG Δ AL及び pMS C V/G Δ AL I Hより 3種類のレトロウイルスベクタ -を調製した。このレトロウイルスベクターのタイターを測定したところ、 10

8

C u m 1 ~ 1 0 c f u/m lたった

得られたレトロウイルスベクターを、実施例 3に準じて孵卵後 36時間のゥズラ受精卵心臓にマイクロインジェクションし、 37. 9°C，湿度 65%で 15分毎に 90度転卵させながら孵卵した。

軽鎖（L i g h t Ch a i n) , 重鎖（He a vy Ch a i n) からなる抗体をトランスジエニック動物で発現させるには、軽鎖、重鎖それぞれを発現させるベクターを各々単独で導入する方法と、軽鎖を発現する遺伝子と重鎖を発現する遺伝子を I RE Sのような配列で区切り、同一のベクターとして導入する方法が考えられる。そこでィンジェクションは、 pMS C V/G Δ AH、 pMS CVZGAALを同時に感染させた場合（実施例 1 1、実験例 1) と、 pMSC V/G AAL I Hより調製したベクターを単独で導入した場合（実施例 1 1、実験例 2) に分けて行った。

孵卵 48時間後、発生が正常に進行していることを確認し、ニヮトリの Sサイズの卵殻の鈍端部に直径 4 cmの穴を開けたものに、このウィルス導入胚を移した。胚を上にして空気に触れるようにし、濃度 5 Omg/m 1で卵白に懸濁した乳酸カルシウム（シグマ社製）溶液を 0. 5m l添加後、卵白を糊としてラップで密閉した。再度孵卵器に入れ、 37. 9°C、湿度 65%で 1時間毎に 60度転卵しながら 1 3日間培養した。転卵を止めて静置状態にし、胚が肺呼吸に移行したら、ラップに針で小さな穴を開け、呼吸を助けた。漿尿膜の血が引いたら培養器から雛を出し、孵化させた。

(実施例 1 1) 血清中、卵中の抗 CD 2抗体濃度の測定

実施例 10により孵化させた GOトランスジェエックキメラゥズラを 1ヶ月間飼育して雛を成長させた。 3 0日後および 6 0日後、成長した G 0 トランスジェエツクウズラの翼下静脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を 1 5， 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心し、上清として得られる血清から抗 CD 2抗体量の測定を行った。

孵化から 1. 5力月後、産卵を始めた雌性トランスジエニックゥズラより採卵を行い、実施例 7に準じて調製した卵白、卵黄中の抗 CD 2抗体量を、実施例 8 に準じて E L I S A法により定量した。

実験例 1、実験例 2の定量結果を示す。

(実験例 1 )

pMS CV/G A AH_S p M S C Vノ G Δ A Lから調製したベクター (3〜4 X 1 0⁸ c f u/m 1 ) を同時に感染させた G 0トランスジエニックキメラゥズラ（個体識別番号 # 1 1 1 3) は、卵黄中に 0. 6 g/m 1、卵白中に 0. 5 μ g/ \の抗 CD 2抗体を発現した。

(実験例 2)

pMS CVZG AAL I H り調製したベクター（5 X 1 0⁸ c f u/m 1 ) を単独で導入した G Oトランスジエニックキメラゥズラ（# 4 2 0 2) は、血清中に 5. 2 μ g/m 1の抗 CD 2抗体を発現した。

(実施例 1 2) s c F V -F c抗体発現ベクターコンストラクトの作製

S c F V - F c抗体発現ベクターコンストラクト MS C V/ s c F v— F c は、以下のように作製した。 1. 5，末端をリン酸化した 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5， - c t a g a c c a t g a g g t c t t t g c t a a t c t t g g t g c t t t g c t t c c t g c c c c t g g c t g c t c t g g g g— d (酉己歹 (J番号 3 3 ； c t a g iは X b a I認識部位末端、且且は Ha e I I I認識部位末端）及び 5 ' - c c c c a g a g c a g c c a g g g g c a g g a a g c a a a g c a c c a a g a t t a g c a a a g a c c t c a t g g_t_— 3， (酉己歹幡号 34 ； c cは X b a I認識部位末端、丄は Ha e I I I認識部位末端）をァニールさせ、リゾチーム分泌シグナルの遺伝子断片を調製した。 2つの化学合成ォリゴヌクレオチド 5 ' 一 g c g t t t a a a g t g a c g t t g g a c g t c c g— 3 (酉己列番 3 5 ； t t t a a aは D r a I制限酵素サイト）及び 5 ' — a t t a g g a t c c g c g c t t a a g g a c g g t c a g g— 3' (配歹 (1¾·号 36 ； g g a t c c は B a mH I制限酵素サイト）をプライマーとする PCR (94で/1 5秒→5 8°C/30秒→68°CZl分： 30サイクル； KOD— P 1 u s一 DNAポリメラーゼ）により、 HUC 2— 1 3細胞のニヮトリ抗体可変領域遺伝子から調製された一本鎖抗体（s c F v) の遺伝子を含んだプラスミド p PDS/s c F V ( Na k amu r a e t a 1. , 2000, Cy t o t e c hn o l o g y 32 : 19 1 - 1 98) から s c F v遺伝子断片を増幅後、制限酵素 D r a I及び B a mH Iによって切り出した。 pB l u e s c r i p t I I SK ( + ) の X b a I、 B amH Iサイトに上記調製した 2断片を揷入し、プラスミド: p B 1 u e/ s c F vを作製した。

2. p B l u e/s c F vから s c F v遺伝子断片を制限酵素 N o t I及び B a mH Iによって切り出し、 pCEP4の No t I、 B a mH Iサイトへ挿入し、プラスミド: CEP 4/s c F vを作製した。

3. ヒト I gG 1産生ミエローマ細胞 I M— 9から mRNA i s o 1 a t i o n K i tを用いて mRNAを取得し、得られた mRNAから R e v e r T r a

Ac eを用いて c DNAライブラリを調製した。 2つの化学合成オリゴヌタレォチド 5' — c a a g c t t c a a g g g c c c a t -3' (配列番号 23 ) 及ぴ 5' —a t t t a c c c g g a g a c a g g g a— 3' (酉己列番号 24) をプラィマーとする PCR (95 °0/ 2分→ 52 °C/ 30秒→ 74 °C/ 3分： 30サイタル； P i u DNAポリメラーゼ）により上記 c DNAライブラリから h C γ 1遺伝子断片を増幅した。さらに、 2つの化学合成オリゴヌクレオチド 5，一 a t t a_g e a_t_c_c g a g c c c a a a t c t t g t g a c a a a a c t c— 3 ' (配列番号 37 ； g g a t c cは B a mH I制限酵素サイト）及ぴ 5 ' — a g c a a g c t t t c a t t t a c c c g g a g a c a g g g a— 3 (酉己列番号 26 ： a a g c t tは H i n d I I I制限酵素サイト）をプライマーとする P CR (94°C/1 5秒→58°C/30秒→68で 1分： 30サイクル； KOD 一 p 1 u s— DNAポリメラーゼ）により上記 PC R産物からヒト抗体 H鎖 γ 1 の F c領域（F c ) の遺伝子断片を増幅後、制限酵素 B a mH I及び H i n d I I Iによって切り出し、 p B l u e s c r i p t l l SK ( + ) の B a mH I、 H i n d i I Iサイトへ揷入し、プラスミド: B 1 u e/F cを作製した。 4. p CE P 4Z s c F vから s c F v遺伝子断片を制限酵素 H i n d I I I及び B amH Iによって切り出した。 p B 1 u e/F cから F c遺伝子断片を制限酵素 B amH I及び H i n d I I Iによって切り出した。： B l u e s c r i p t I I SK ( + ) の H i n d I I Iサイトへ上記切り出した 2断片を挿入し、プラスミド p B 1 u e/ s c F V— F cを作製した。

5.. p B 1 u e/ s c F v— F cからニヮトリー本鎖抗体可変領域にヒト抗体 H 鎖 γ 1 · F cが連結した構造（ s c F V _F c ) の遺伝子断片を制限酵素 H i n d I I Iによって切り出し、制限酵素 H i n d. I I Iによって処理した p MS C VZG Δ AHのベクター断片に連結した。 AAc tプロモーターと同方向に s c F v—F c遺伝子が連結された構造のプラスミドを pMS CV/GA A s c F v _F cとした。

このように作製した複製能欠失型レトロウィルスベクターのベクターコンストラクト pMS C V/G Δ A s c F v -F cの構造を図 1 3に示した。 (実施例 1 3) s c F v— F c抗体発現 GO トランスジエニックキメラゥズラの作製

実施例 2に準じて、ベクターコンストラタト pMSCV/GAAs c F v— F cよりレトロウイノレスベクターを調製した。このレトロウイ/レスべクタ一のタイターを測定したところ、 10⁸ c f u/m 1〜； L 0⁹ c f u/m 1だった。得られたウィルスベクター溶液を、実施例 3に準じて孵卵後 36時間のゥズラ受精卵心臓にマイクロインジュクシヨンし、実施例 10に準じて孵化させることにより GO トランスジエスジエニックキメラゥズラを誕生させた。 (実施例 14) 血清中、卵中の s c F V— F c濃度の測定

実施例 1 3により誕生した GO トランスジエニックキメラゥズラを 1ヶ月間飼育して雛を成長させた。 30 後および 60日後、成長した GOトランスジェニックキメラゥズラ（個体識別番号 # 3303、 # 3306、 # 3310、 # 33 1 1、 # 331 3) の翼下静脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を 15, O O O r pmで 10分間遠心し、上清として得られる血清から s c F v -F c抗体量の測定を行った。

孵化から 1. 5力月後、産卵を始めた雌性トランスジエニックゥズラ（個体識別番号 # 3310) より採卵を行い、実施例 7に準じて調製した卵白、卵黄中の s c F V— F c抗体量を、実施例 8に準じて E L I S A法により定量した。標準検量線は精製した s c F V— F cを用いて作製した。実施例 1 2で作製したベクターコンストラタト pMSCVZs c F V -F cをリポフエクシヨン法により G P 293細胞に導入し、その培養上清を 4 °C、 10分間、 3000 r p m で遠心して固形物を除去した。この上清を冷却しながら攪拌し、 50%飽和となるよう細かく碎いた硫酸アンモニゥムを徐々に加え（3 1 3 g硫安 Zl 000m 1水）、タンパク質を沈殿させた。これを 4°Cでー晚静置した後、 4°Cで 10分間、 15, 000 r で遠心して沈殿を完全に沈降させ、少量の PBSで溶解した。 2 Lの P B Sで 3回透析して硫安を除去した。

精製用のプロテイン Gカラム（パーゼプティブバイオシステムズ社製）の初期洗浄を B i n d i n g B u f f e r (N a HP0₄ - 2H₂0 1. 56 g/ 1、 N a HP〇₄ · 1 2H₂0 7. 1 6 g/ 1 ) 1 OmL Wa s h B u f f e r (酢酸 20%、蒸留水 80%) 10m l、 B i n d i n g Bu f f e r 10 m 1の順で行つた（流速 2 m 1 /分）。 P B Sに溶解したタンパク質液を 1 m l Z分で流し、 s c F V— F cをカラムに吸着させた。 B i n d i n g B u f i e r 20m lを 1. 7m l Z分で流して、不要なタンパク質を除去し、 E l u t i o n Bu f f e r (グリシン 7. 507 g / 1 , 2 N HC 1にて p H 2. 5〜3. 0に調製）を 1. 5 m l Z分で流して、 s c F v_F cを溶出した。

溶出分画を PB S (2 L) で 3回透析し、精製 s c F v— F cとし、波長 28 0 nmの吸光度よりタンパク質濃度を定量した。

実施例 14で作製した GO トランスジエニックキメラゥズラの 30日後、 60 日後採血血清中の s c F V -F c量を図 14に示した。 s c F V— F c抗体の発現遺伝子を導入された GO トランスジエニックキメラゥズラは、 30日目に約 2 mg m 1〜4mg/m 1の抗体を血清中に発現し、 5羽のうち 3羽が 60日後も同程度の発現量を示した。

GO トランスジエニックキメラゥズラ (# 3310) が産卵を始めた日から、卵黄、卵白中の s c F V— F c量を図 1 5に示した。抗体は卵白、卵黄中に約 5 00 /z g/m l〜； LmgZm l発現し、産卵開始から 1 7日目まで若干の変動はあるものの安定した発現量を維持した。

(実施例 1 5) s c F V -F c構造の確認

実施例 1 3で作製した G0 トランスジヱニックキメラゥズラ血清 lm 1から実施例 10に準じて、硫安沈殿とプロテイン Gカラムにより s c F V— F cを精製した。精製した s c F V— F cを SDS— PAGEで解析し、その結果を図 16 に示した。未処理のレーンより、 s c F v— F cの分子量約 1 20 kD aが示された。還元処理した s c F V— F cの分子量は未処理の場合のほぼ半分（約 60 kD a) になっていることから、 GOトランスジエニックキメラゥズラにより産生された s c F v-F cは S— S結合による 2量体を形成していることがわかつた。これらは、 S— S結合に関与するシスティン残基を F c部に有する s c F V 一 F cの構造的特徴に符合し、 GO トランスジエニックキメラゥズラにより産生された s c F V— F cは正しい構造を保持していることが示唆された。

(実施例 1 6) TNFR-F c融合タンパク発現 GO トランスジエニックキメラニヮトリの作製実施例 9に準じて TNFR— F c発現ベクターコンストラクトを作製し、実施例 2に準じてレトロウィルスベクターを作製した。このレトロウィルスベクターのタイターは、 1. 7 X 1 0⁷ c f u/m 1だった。

得られたウィルスべクタ一溶液を、実施例 4に準じて孵卵後 55時間の二ヮトリ受精卵心臓にマイクロインジヱクシヨンし、実施例 1 0に準じて孵化させることにより G 0 トランスジュニックキメラニヮトリを誕生させた。

8個の受精卵にインジェクションしたところ 4羽が孵化し、実施例 14に準じてその血清中の TNFR— F cを定量したところ、最高で 5 0 μ g/m 1の TN FR-F cが発現していた。産業上利用の可能性

本発明の GO トランスジエニックキメラ鳥類は、複製能欠失型レトロウイルスベクターで導入された遺伝子を不活性化することなく効率的に発現することができる。また、本発明の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類の作製法は、キメラ抗体、例えば s c F V— F c抗体の遺伝子を導入し、血中、卵中に抗体を効率的に発現することができる鳥類の作製を可能にする。更に、本発明の抗体生産法は、キメラ抗体、例えば s c F V -F c抗体を産生する GO トランスジエニックキメラ鳥類を作製し、抗体を鳥類の血清、卵中から回収、精製することからなるので、効率よい抗体生産を可能にする。

Claims

請求の範囲

1. 複製能欠失型レト口ウィルスベクターによって外来性抗体遺伝子が導入された GO トランスジエニックキメラ鳥類であって、導入遺伝子に由来する抗体を、血中、卵白中及び卵黄中の少なくとも 1つに産生することを特徴とする GO トランスジエニックキメラ鳥類。

2. 抗体の定常領域のクラスがヒト I g Gである請求の範囲第 1項記載の GO トランスジエニックキメラ鳥類。

3. 抗体の定常領域のサブクラスがヒト I gG 1である請求の範囲第 1項記載の GO トランスジエニックキメラ鳥類。

4. 抗体の定常領域がゥズラ I gG、ニヮトリ I g G、あるいはマウス I gG である請求の範囲第 1項記載の GO トランスジヱエックキメラ鳥類。

5. 抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている請求の範囲第 1 〜 4項のいずれか 1項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

6. 構成的なプロモーターがエワトリ 13—ァクチンプロモーターである請求の範囲第 5項記載の GO トランスジエニックキメラ鳥類。 -

7. レトロウイ/レスベクタ一がモロニ一'ミューリン ' ロイケミア ■ 由来ベクターである請求の範囲第 1〜 6項のいずれか 1項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

8. レトロウイルスベクターが VSV— Gシユードタイプである請求の範囲第 1〜 7項のいずれか 1項記載の GO トランスジエニックキメラ鳥類。

9. 鳥類が-ヮトリあるいはゥズラである請求の範囲第 1〜 8項のいずれか 1 項記載の G O トランスジエニックキメラ鳥類。

1 0. 抗体がキメラ抗体である請求の範囲第 1〜 9項のいずれか 1項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

1 1. 血液中に抗体を 0. 5 μ gZm 1以上含む請求の範囲第 1 0項記載の G 0 トランスジェユックキメラ鳥類。

1 2. 血液中に抗体を 5 μ g/m 1以上含む請求の範囲第 1 1項記載の G Oトランスジエニックキメラ鳥類。

1 3. 卵白中に抗体を 0. 1 μ g/m 1以上含む請求の範囲第 1 0項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

1 4. 卵白中に抗体を 1 g/m 1以上含む請求の範囲第 1 3項記載の G Oトランスジエニックキメラ鳥類。

1 5. 卵黄中に抗体を 0. 1 g/m 1以上含む請求の範囲第 1 0項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

1 6. 卵黄中に抗体を 1 μ g /m l以上含む請求の範囲第 1 5項記載の G Oトランスジエニックキメラ鳥類。

1 7. 抗体が s c F V— F c抗体である請求の範囲第 1〜9項のいずれか 1項記載の G O トランスジェエックキメラ鳥類。

1 8. 血液中に抗体を 2 0 μ g/m \以上含む請求の範囲第 1 7項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

19. 血液中に抗体を 2000 μ g/m 1以上含む請求の範囲第 18項載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

20. 卵白中に抗体を 5 / gZm 1以上含む請求の範囲第 1 7項記載の GOトランスジエニックキメラ鳥類。

21. 卵白中に抗体を 500 // g/m 1以上含む請求の範囲第 20項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

22. 卵黄中に抗体を 5 μ g/m 1以上含む請求の範囲第 17項記載の GOトランスジエニックキメラ鳥類。

23. 卵黄中に抗体を 500 t g/m 1以上含む請求の範囲第 22項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類。

24. 請求の範囲第 1〜23項のいずれか 1項記載の GO トランスジヱニックキメラ鳥類を作製し、前記 GOトランスジエニックキメラ鳥類の血中及び Z又は卵中から抗体を回収することを特徴とする抗体の生産法。

25. 鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる G 0トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

26. 鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から 24時間以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させることからなる請求の範囲第 25項記載の GO トランスジユックキメラ鳥類の作製法。

27. 鳥類受精卵を孵卵し、その初期胚に形成される心臓ないしは血管内へ複製能欠失型レト口ウイスベクターをマイクロインジヱクションすることを特徴とする請求の範囲第 2 5又は 2 6項記載の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

2 8 . 鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から 2 4時間以降の初期胚に形成される心臓ないしは血管内へ複製能欠失型レト口ウィルスベクターをマイクロインジェクションすることを特徴とする請求の範囲第 2 5又は 2 6項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

2 9 . 1 X 1 0 ⁷ c f u /m 1以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることを特徴とする請求の範囲第 2 5〜2 8項のいずれか 1項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 0 . 1 X 1 0 ⁸ c f u /m 1以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることを特徴とする請求の範囲第 2 9項記載の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 1 . 1 X 1 0 ⁹ c f u /m 1以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることを特徴とする請求の範囲第 3 0項記載の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 2 . レトロウイゾレスべクタ一がモロエ一'ミューリン ' ロイケミア■ ウイノレス由来べクタ一であることを特徴とする請求の範囲第 2 5〜3 1項のいずれか 1 項記載の G O トランスジェユックキメラ鳥類の作製法。

3 3 . レトロウィルスベクターが V S V— Gシユードタイプであることを特徴とする請求の範囲第 2 5〜3 2項のいずれか 1項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 4 . 鳥類がニヮトリまたはゥズラである請求の範囲第 2 5〜3 3項のいずれか 1項記載の G Oトランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 5 . レトロウイルスに由来しない遺伝子配列が、複製能欠失型レトロウィルスベクターに組み込まれる導入遺伝子に含有される請求の範囲第 2 5〜3 4項のいずれか 1項記載の G O トランスジェエックキメラ鳥類の作製法。

3 6 . レトロウイルスに由来しない遺伝子配列は、 -ヮトリ！ S—ァクチンプロモーターにより制御されている遺伝子配列である請求の範囲第 3 5項記載の G 0 トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 7 . レトロウィルスに由来しない遺伝子配列は、抗体遺伝子をコードする遺伝子配列である請求の範囲第 3 5又は 3 6項記載の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

3 8 . 抗体遺伝子がキメラ抗体遺伝子である請求の範囲第 3 7項記載の G 0トランスジ工ユックキメラ鳥類の作製法。

3 9 . 抗体遺伝子が s c F v— F c抗体遺伝子である請求の範囲第 3 7項記載の G O トランスジエニックキメラ鳥類の作製法。

4 0 . レトロウイルスに由来しない遺伝子配列は、融合タンパク遺伝子をコードする遺伝子配列である請求の範囲第 3 5又は 3 6項記載の G O トランスジェニックキメラ鳥類の作製法。

4 1 . 請求の範囲第 2 5〜4 0項のいずれか 1項記載の方法で作製された G O トランスジエニックキメラ鳥類。