WO2004015416A2 - Methode zum identifizieren von substanzen mit anti-mikrobieller wirkung - Google Patents

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WO2004015416A2
WO2004015416A2 PCT/EP2003/008145 EP0308145W WO2004015416A2 WO 2004015416 A2 WO2004015416 A2 WO 2004015416A2 EP 0308145 W EP0308145 W EP 0308145W WO 2004015416 A2 WO2004015416 A2 WO 2004015416A2
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Gerald Kleymann
Hans-Otto Werling
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Bayer Healthcare Ag
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity

Definitions

  • a goal of inventions in the pharmaceutical industry is to provide the healthcare system with compatible medication and therapy options for treating patients.
  • This invention describes a method for the identification of anti-infectively active substances for the treatment of intra- or extracellular, non-viral microbial infections.
  • the method is based on a combined analysis of the anti-microbial effect and the tolerance of the agent in viti-o.
  • this assay allows the characterization of an anti-microbial agent with respect to the anti-microbial effect, the inhibition of the cytopatic effect which the pathogen exerts on the infected culture, a possible cytotoxicity and protective effects on the infected cell culture.
  • Targets for drug discovery have skyrocketed, but even though these targets and assay systems are well characterized, the identified compounds must continue to meet the criteria listed above that are essential for successful medication.
  • the NCCLS committee (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA) publishes standardized guidelines for the MIC test (minimum inhibitory concentration, or MIC test, minimum inhibitory concentration), which is based on solid or liquid media.
  • the aim of this invention is to provide a method which makes it possible to find alternative or more active non-viral, anti-microbial compounds which have a better selectivity index and / or tolerance and / or protective effects on the infected eukaryotic cell culture.
  • Another object of this invention is to provide a robust, inexpensive, sensitive and efficient method by which alternative, new or more potent anti-microbial substances can be identified.
  • Another object of this invention is to provide a method that is compatible with high throughput test methods.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method by which substances can be identified which have a broad-spectrum activity or an activity against therapy-resistant pathogens.
  • the present invention solves the problems listed above by providing a method for finding active substances against non-viral microbes, characterized in that, in a test batch, potential active substances are simultaneously incubated together with eukaryotic cells and with non-viral microbes, the vitality of the eukaryotic cells are determined and then those active substances are selected in which the signal of the corresponding test batch is significantly larger than the mean value of the infection control at at least one concentration of the active substance.
  • this method allows a combined assessment of both the antimicrobial activity of the compound and, at the same time, its tolerance (selectivity index) and its cytoprotective effects on an infected cell culture. From a different perspective, it is precisely this in vitro assay
  • the infectiological assay according to the invention allows an efficient screening of substance libraries and the subsequent optimization of the identified anti-microbial active substances, because a reproducible and
  • Dose-effect-dependent test which identifies anti-microbial activities of substances with predominantly suitable tolerability, ultimately represents the simplest stage in vitro of a sensible evaluation of substances in relation to their anti-microbial potential.
  • a further advantage of this invention is that this infectiological in vitro method not only simultaneously tests all of the pathogen's targets that are essential for microbial growth and infection, but also the targets of the eukaryotic host cells that are relevant for possible therapeutic intervention in the almost natural infection process without, for example like with
  • the infectiological assay therefore provides answers to the question of whether there are structures that can be optimized, are tolerable and that are anti-microbial and that inhibit the occurrence of infection.
  • Once a suitable substance has been identified the underlying mechanism of action or the target can be quickly clarified using the available methods. With this procedure, the previously necessary identification, evaluation and testing of numerous individual targets can become redundant sequentially or in parallel.
  • the assay clearly differs from all publications published to date. Numerous assays have been described in various modifications to identify bacteriostatic or bactericidal compounds, but these test systems are basically all based on the growth inhibition of the pathogen in the presence of the active ingredient or the test substance.
  • these tests identify not only the desired anti-microbial compounds with respect to the development of a drug, but to a large extent cytotoxic and cytostatic active substances, which require numerous downstream test systems in order to filter out compatible active substances from the undesired cell-toxic substances.
  • microbe is a collective term and stands for a wide variety of microorganisms including bacteria, viruses, protozoa and fungi etc.
  • the term signal describes any form of tapping information from the test batch which is suitable for evaluating the anti-microbial activity and tolerance of the potential active compounds, e.g. a signal can be referred to as a signal, which corresponds to the vitality of the cells and thus indicates the anti-microbial activity of the test substance and its tolerance.
  • prokaryote describes an organism that, unlike eukaryotic cells, has no nucleus. In this context, it also includes genetically engineered prokaryotes, such as those that produce a reporter gene product.
  • eukaryotic cell describes an organism that, unlike prokaryotes, has a nucleus. In this context, it also includes genetically engineered eukaryotes, such as those that produce a reporter gene product.
  • the abbreviation MIC is a synonym for the German name MHK (Minimum Inhibitory Concentration) stands for “Minimum Inhibition Concentration” and describes the lowest concentration of a compound that is still able to completely inhibit bacterial growth, for example, with reference to visual turbidity the
  • Gram-positive and Gram-negative describe the result of the so-called Gram staining, which is only one of a large number of published staining methods for microorganisms to examine samples from organisms. (Principles and Practice of Infectious Diseases, GL Mandall, RG Douglas, JE Bennett ed., Churchill Livingstone Inc., 1995)
  • SI selectivity index
  • simultaneous with reference to the infectious assay refers to a situation in which the active substance, microbe and eukaryotic cells are simultaneously incubated in one solution at a time; however, the sequence of adding the components is variable.
  • TI therapeutic index
  • LD lethal dose
  • ED effective dose
  • vital dyes refers to dyes that allow a distinction to be made between vital and non-vital cells, e.g. by only penetrate into non-vital cells (tryp blue) or are only converted by intact cells (e.g. fluorescein diacetate). Fluorescent dyes are preferred.
  • the method is characterized in that
  • Active substances are selected for which the signal of the corresponding test rate is greater than 2 times, particularly greater than 4 times, very particularly greater than 10 times the mean value of the infection control and in particular greater than 50% of the cell control.
  • the method is characterized in that the non-viral microbes are prokaryotic cells.
  • the prokaryotic cells are preferably bacteria, in particular intracellular and or therapy-resistant microbes.
  • Fluorescent dyes in particular fluorescein diacetate, fluorescein dibutyrate, 5-carboxyfluorescein diacetate, acetoxymethyl ester (5-CFDA, AM) and 4,5,6,7-tetrafluorofluorescein diacetate (TFFDA) are preferred.
  • a preferred embodiment of the invention is characterized in that eukaryotic cells are used which have a so-called reporter gene for generating the test signal.
  • a preferred embodiment of the invention is characterized in that the non-viral microbes, such as genetically engineered organisms, have non-naturally occurring properties.
  • the non-viral microbes such as genetically engineered organisms
  • microbes can be used which have a changed adhesion behavior on cell surfaces or which produce special toxins.
  • a preferred embodiment of the invention is characterized in that the eukaryotic cells are Vero (african green monkey kidney cells) or CHO cells (chinese hamster ovary cells).
  • Another preferred embodiment of the invention is characterized in that a mixture of different microbial strains is used. So can Test substances are tested directly for possible anti-microbial broadband activity.
  • the method is characterized in that a mixture of various eukaryotic cell lines is used.
  • the invention relates to compounds or active ingredients which have been identified by means of the above-mentioned method, to pharmaceutical compositions which contain a compound found in this way, which
  • the method is carried out as high-throughput screening (HTS) at a concentration of the active substance in the concentration range from 100 nM to 100 ⁇ M.
  • HTS high-throughput screening
  • compounds are preferred which have a so-called broad-spectrum spectrum anti-microbial effect.
  • active substances whose mechanism of action is based on a target of the pathogen or pathogen.
  • the method is characterized in that those active substances are selected which have the property of inhibiting microbial growth in cell culture at a concentration of approximately 100 ⁇ M and less by at least 50%.
  • the present invention therefore relates to a method for identifying active substances, characterized in that
  • test substances or control antibiotics are presented at a suitable substance concentration; b) appropriate eukaryotic cells are added; c) microbes are added; d) the assay is incubated; e) a read out or a so-called test signal is generated.
  • any concentration is suitable at which there is anti-microbial activity and a certain tolerance to the eukaryotic cells.
  • concentrations of 250 ⁇ M to less than 1/10 (one tenth) of the MIC concentration or less are usually used.
  • Eukaryotic cells which optionally carry a reporter gene or mixtures of the corresponding cells or cell lines can be used. Any one
  • the number of cells per area can be sown provided that a reasonable quotient of the signals from the cell control and the infection control is achieved.
  • the number of cells sown should not exceed an amount which leads to so-called contact inhibition of the cells during the incubation period; furthermore, cell vitality should not be impaired by the resulting cell metabolism products or nutrient deficiency. Suitable cell numbers allow a clear differentiation between possible cytostatic or cytotoxic effects of the test substances and the contact inhibition or nutrient deficiency as described above.
  • 20,000 eukaryotic cells per well of a 96-well MTP are preferred.
  • Microbes that may have been genetically manipulated, as well as intracellularly or extra-cellularly growing microbial cells or mixtures thereof, are added to the test in the desired multiplicity of infection (moi). It is necessary to have a microbial cell count that exerts a cytopathic effect on the eukaryotic cells directly or indirectly during the incubation period, so that a suitable measurement signal is generated after the corresponding incubation period. A moi of 10 to 0.001 is preferred. Step d)
  • a microtiter plate which consists of a mixture of the assay components, namely the test substance, the eukaryotic cells and the microbes, is incubated under the optimal conditions for the growth of eukaryotic cells for a corresponding period of time in order to generate a suitable measurement signal.
  • the cell culture supernatant is optionally removed, the remaining eukaryotic
  • cells are washed and a suitable dye or the appropriate reagent for generating the signal in the case of the reporter gene-expressing eukaryotic cells is added to generate the measurement signal, which is recorded with the aid of a suitable measuring device or camera system at the corresponding wavelengths.
  • step e) without first removing the cell culture supernatant and or carrying out additional washing steps, for example this is possible if defined cell culture media are used which do not interfere with the generation of the measurement signal.
  • this can also be achieved by using reporter gene-expressing, eukaryotic cells that allow a suitable measurement signal to be recorded after the corresponding incubation time.
  • the vitality of the cells can be measured continuously (on-line) from the time of incubation by providing the cells with a suitable reporter system (eg GFP).
  • a suitable reporter system eg GFP
  • any eukaryotic cell including those that express a so-called reporter gene
  • a mixture of the named eukaryotic cells that are able to generate a suitable test signal and the measurement. of the corresponding selectivity index allow to be used in this assay.
  • the eukaryotic cells can be sown long before the test incubation; preference is given to adding the eukaryotic cells to a microtiter plate suitable for cell culture, which already contains an active ingredient or test substance of a suitable concentration.
  • these eukaryotic cells are then infected with the corresponding inoculum (these are microbes, including those that carry a so-called reporter gene, or hybrids of the microbes that have a cytophatic effect on the infected eukaryotic cells), with a suitable ratio of the multiplicity of infection (moi) allows a significant difference in the test signal (read out) between the eukaryotic cell control or the therapy control (antibiotic control) compared to the infection control.
  • moi multiplicity of infection
  • the test substances can be present in any concentration, ideally in an area that is not toxic to the eukaryotic cells, so that an anti-microbial effect as a result generates a positive test signal.
  • the microbes whether they are Gram-positive or Gram-negative bacteria or intra- or extracellularly growing microbes, are added in an infection dose of (moi about 0.001 to 10). It is possible to vary the moi over a wide range and yet a reasonable test signal can be generated, but a change in the infection dose or the moi can also affect the IC 50 and or the maximum test Increase signal accordingly or shift to lower values.
  • the assay is then incubated for a suitable period of time under the conditions necessary for cell culture, such as temperature, atmosphere, etc.
  • test signal or read out is generated.
  • a large number of fluorescent dyes can be used for various cell lines, while cell lines with reporter genes such as luciferase, green fluorescent protein (GFP), alkaline phosphatase etc. have to be generated or acquired in individual cases; However, such embodiments can provide better test signal / background ratios or make various steps such as washing steps superfluous.
  • the assay is for Vero cells (growth in medium 199 with Earle's salts supplemented with 5% fetal calf serum (FCS) and 2 mM L-glutamine) and CHO cells (growth in RPMI-1640 medium supplemented with 2 mM L-glutamine and 10%
  • FCS FCS
  • the cells are available from ATCC (American Tissue Cell Culture) or the DSMZ (German Collection for Microorganisms and Cell Cultures). The cells constitutively expressing the reporter gene were produced using standard methods.
  • the reporter-bearing plasmids for luciferase, aequorin and eGFP (green fluorescent protein) as well as the transfection and detection reagents of the reporter genes are available from various commercial suppliers (e.g. Clontech).
  • test substance is placed in an MTP, so that the final concentration for a high-throughput test is 10 ⁇ M or for a gradient
  • the gradient test is particularly suitable for determining the selectivity index. If the substances are dissolved in dimethyl sulfoxide, the solvent should not exceed final concentrations of 1% or better than 0.5%. Then the eukaryotic cells in the corresponding
  • Medium was added (e.g. 20,000 cells per well of a 96 well MTP, or 5,000 cells per well of a 384 well MTP and so on and so on for 1,536 well MTP or other cell culture vessels).
  • the microbes are added at a moi of 0.025.
  • the assay with a total volume of 200 ⁇ l is then carried out for 2 to 3 days, in the case of Vero or CHO cells at 37 ° C. and 5%
  • the MTPs are washed once with 200 ⁇ l PBS (phosphate buffer saline) and the read out or test signal is generated by adding 200 ⁇ l 10 ⁇ g / ml fluorescein diacetate in PBS or the corresponding detection reagents for luciferase or aequorin.
  • the MTP are incubated for 15-45 min at room temperature until a visually visible discoloration of the cell control and the resulting fluorescence signal is measured at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 538 nm in a suitable measuring device (eg Fluoroskan Ascent from Labsystems).
  • the other test signals are generated according to the manufacturer's instructions for the detection reagents.
  • Table 1 shows typical standardized data of the test described above.
  • Table 2 shows the evaluation of the standardized data of a 96-well microtiter plate from a high-throughput screening. Two hits are marked in bold (B8 and C4), the connections of which meet the selection criteria and are examined further.
  • the percentage value of the test batch is significantly larger than the mean value of the infection control. It is preferred if the significance value is at least 99.95%.
  • Tables 3 and 4 are examples of a simultaneous dose effect and tolerance test over a broad concentration gradient for determining the IC 50 values and the SI.
  • Normalized data of cell control 100%, bacterial control, infection control, and therapy control are listed above.
  • the percentage signal (signal of the therapy or drug test approach) / ' (signal of the cell control) * 100

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren und seine Verwendung zum Auffinden neuer anti-mikrobieller Wirkstoffe, dadurch gekennzeichnet dass in einem Testansatz gleichzeitig potentielle Wirkstoffe zusammen mit eukaryontischen Zellen und mit nicht viralen Mikroben inkubiert werden, die Vitalität der eukaryontischen Zellen bestimmt wird und anschließend solche Wirkstoffe ausgewählt werden, bei denen das Signal des entsprechenden Testansatzes signifikant größer ist als der Mittelwert der Infektionskontrolle bei mindestens einer Konzentration des Wirkstoffes.

Description

Methode zum Identifizieren von Substanzen mit anti-mikrobieller Wirkung
Ein Ziel von Erfindungen in der pharmazeutischen Industrie ist es, dem Gesundheitssystem verträgliche Medikamente und Therapiemöglichkeiten zur Behandlung von Patienten zur Verfügung zu stellen.
Diese Erfindung beschreibt eine Methode zur Identifizierung von anti-infektiv wirksamen Substanzen zur Behandlung von intra- oder extrazellulären, nicht-viralen mikrobiellen Infektionen. Die Methode basiert auf einer kombinierten Analyse der anti-mikrobiellen Wirkung und der Verträglichkeit des Agens in viti-o. Im besonderen erlaubt dieser Assay die Charakterisierung eines anti-mikrobiellen Agens mit Bezug auf die anti-mikrobielle Wirkung, die Inhibition des zytopatischen Effektes, den das Pathogen auf die infizierte Kultur ausübt, eine mögliche Zytotoxizität und protektive Effekte auf die infizierte Zellkultur.
Im Bereich der Antiinfektiva-Forschung wurden viele anti-mikrobielle Agenzien mittels eines Sensitivitätstestes identifiziert, bei dem potentiell aktive Verbindungen auf Wachstumsinhibition gegenüber Pathogenen getestet werden (Principles and Practice of Infectious Diseases, GL Mandall, RG Douglas, JE Bennett ed., Churchill Livingstone Inc., 1995). Historisch betrachtet waren Naturstoffe häufig die Basis für zahlreiche Entwicklungen auf dem Gebiet der anti-mikrobiellen Agenzien. Die identifizierten Verbindungen werden in der Regel chemisch optimiert und in sekundären Testsystemen im Hinblick auf Verträglichkeit, den sogenannten Selektivitätsindex in vitro, geprüft. Die Verbindungen werden dann in Tiermodellen getestet und wirksame Substanzen mit geeigneten pharmakokinetischen und pharmakodyna- mischen Profil, die darüber hinaus noch über einen entsprechenden therapeutischen Index verfügen, werden für klinische Studien am Menschen ausgewählt, sofern in toxikologischen Studien keine prohibitiven Ergebnisse festgestellt werden.
Mit der Veröffentlichung zahlreicher bakterieller Genomsequenzen wurden neue
Wege zur Entdeckung anti-mikrobieller Medikamente beschritten, es begann die sogenannte Ära der Genomforschung. (Novel approaches to the discovery of anti- microbial agents, Schmid MB, Current Opinion In Chemical Biology, 2, 4, 529-534, 1998). Es wurden Strategien zur effizienten Nutzung der genomischen Information entwickelt, um Targets zu identifizieren und charakterisieren, Testsysteme zu ent- wickeln und Substanzen zu bewerten. Theoretisch ist die Zahl antibakterieller
Targets zur Wirkstofffindung sprunghaft angestiegen, aber auch wenn diese Targets und Assaysysteme gut charakterisiert sind, müssen die identifizierten Verbindungen auch weiterhin die oben aufgeführten, für erfolgreiche Medikamente essentiellen Kriterien erfüllen.
Das NCCLS Komitee (National Committee for Clinical Laboratory Standards, USA) veröffentlicht standardisierte Richtlinien für den MHK-Test (Minimale Hemmkonzentration, bzw. MIC-Test, minimum inhibitory concentration), der auf Festoder Flüssigmedien basiert.
Dieser Standardsensitivitätstest ist genau in „NCCLS, Villanova, PA, 1997. Methods for dilution anti-microbial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically 5 ' ed. Approved Standard. NCCLS Document M7-A5 (Vol. 20 No.2), M11-A4 (Vol 17 No 22)" beschrieben. Im Prinzip wird die Vermehrung des Pathogens, in diesem Falle handelt es sich hierbei um Bakterien, auf Festmedien (Wachstum der Kultur) oder in Flüssigmedien (Trübung im Medium) in Gegenwart oder Abwesenheit von potentiellen Wirkstoffen nach einer definierten Zeit untersucht und die Empfindlichkeit der Erregers gegenüber potentiellen Wirkstoffen bestimmt. Der MHK Wert ist die Wirkstoffkonzentration, bei der keine Bakterienvermehrung mehr nach- weisbar ist. Man muss an dieser Stelle jedoch feststellen, dass nur ein Bruchteil der so identifizierten Verbindungen den gewünschten Selektivitätsindex bzw. die notwendige Verträglichkeit in nachgeschalteten, zusätzlichen Testsystemen aufweisen.
Bedard J et al. (Antiviral Research; 41; 1; 35-43; 1999 Feb; 9910) beschreibt einen colorimetrischen Zellproliferationstest zur Identifizierung von Verbindungen mit Aktivität gegen das humane Cytomegahevirus (HCMV), bei dem Zelle, Virus und Verbindung gleichzeitig inkubiert werden. Dieses Verfahren ist nicht ohne weiteres auf nicht virale Systeme übertragbar, weil andere Mikroben gegebenenfalls Mitochondrien oder Enzymkomplexe aufweisen, durch die der verwendete Farbstoff WST (Tetrazoliumsalz WST-1) umgesetzt werden kann.
Ziel dieser Erfindung ist es, eine Methode bereitzustellen, die es erlaubt, alternative oder aktivere nicht virale, anti-mikrobielle Verbindungen, die einen besseren Selekti- vitätsindex und/oder Verträglichkeit und/oder protektive Effekte auf die infizierte eukaryontische Zellkultur aufweisen, aufzufinden.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es weiterhin, eine robuste, kostengünstige, empfindliche und effiziente Methode zur Verfügung zu stellen, mit der alternative, neue oder stärker wirksame anti-mikrobielle Substanzen identifiziert werden können.
Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es weiterhin, eine Methode zur Verfügung zu stellen, die mit Hochdurchsatz-Testverfahren kompatibel ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist es, eine Methode zur Verfügung zu stellen, mit der Substanzen identifiziert werden können, die eine Breitbandspektrum-Wirkung oder eine Aktivität gegen Therapie-resistente Pathogene aufweisen.
Die vorliegende Erfindung löst die oben aufgeführten Probleme, indem ein Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen gegen nicht virale Mikroben zur Verfügung gestellt wird, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Testansatz gleichzeitig potentielle Wirkstoffe zusammen mit eukaryontischen Zellen und mit nicht viralen Mikroben inkubiert werden, die Vitalität der eukaryontischen Zellen bestimmt wird und anschließend solche Wirkstoffe ausgewählt werden, bei denen das Signal des ent- sprechenden Testansatzes signifikant größer ist als der Mittelwert der Infektionskontrolle bei mindestens einer Konzentration des Wirkstoffes. Erstmalig erlaubt diese Methode die kombinierte Beurteilung sowohl der anti- mikrobiellen Aktivität der Verbindung als auch gleichzeitig ihrer Verträglichkeit (Selektivitätsindex) und ihrer zytoprotektiven Effekte auf eine infizierte Zellkultur. Aus einer anderen Perspektive betrachtet ist es gerade diese in vitro Assay
Konfiguration, die das natürliche Infektionsgeschehen sehr gut simuliert, während der verbreitete MHK-Test ausschließlich die Sensitivität der Mikroben gegenüber Substanzen prüft. Folglich erlaubt der erfindungsgemäße infektiologische Assay ein effizientes Durchmustern von Substanzbibliotheken und die nachfolgende Optimie- rung der identifizierten anti-mikrobiellen Wirkstoffe, weil ein reproduzierbarer und
Dosis-wirkungsabhängiger Test, der anti-mikrobielle Aktivitäten von Substanzen mit überwiegend geeigneter Verträglichkeit identifiziert, letztendlich in vitro die einfachste Stufe einer vernünftigen Bewertung von Substanzen mit Bezug zu ihrem anti- mikrobiellen Potential darstellt.
Ein weiterer Vorteil dieser Erfindung ist es, dass mit dieser infektiologischen in vitro Methode nicht nur alle für das mikrobielle Wachstum und Infektion essentiellen Targets des Pathogens, sondern darüber hinaus auch die für eine mögliche therapeutische Intervention relevanten Targets der eukaryontischen Wirtszellen im nahezu natürlichen Infektionsgeschehen simultan geprüft werden, ohne dass z.B. wie beim
Genomansatz individuelle Targets basierend auf dem gegenwärtigen Wissensstand nach mehr oder weniger wissenschaftlich korrekten Kriterien vorselektiert werden. Der infektiologische Assay liefert demnach Antworten auf die Frage, ob optimierbare, verträgliche und das Infektionsgeschehen inhibierende anti-mikrobiell wirk- sa e Strukturen vorliegen. Ist erst einmal eine geeignete Substanz identifiziert, so kann der zugrundliegende Wirkmechanismus bzw. das Target zügig mit den zur Verfügung stehenden Methoden aufgeklärt werden. Bei dieser Vorgehensweise kann die vorher notwendige Identifizierung, Evaluierung und Testung zahlreicher individueller Targets sequenziell oder parallel überflüssig werden. Der Assay unterscheidet sich klar von allen bis heute veröffentlichten Publikationen. Zahlreiche Assays wurden in diversen Modifikationen beschrieben, um bakterio- statische oder bakterizide Verbindungen zu identifizieren, aber diese Testsysteme basieren im Grunde alle auf der Wachstumsinhibition des Erregers in Gegenwart des Wirkstoffs oder der Testsubstanz. Andere Tests prüfen die Inhibition oder Aktivierung eines einzelnen Targets des betreffenden Erregers, das gegebenenfalls aufgrund theoretischer Überlegungen der Genomforschung ausgewählt, Moniert und expri- miert, eventuell im Falle eines Proteins aufgereinigt und in. einem Enzymtest oder Bindungstest analysiert wird. Aber diese Strategien liefern nicht simultan den Selektivitätsindex bzw. bewerten nicht die Verträglichkeit der Wirkstoffe in vitro.
Gerade weil diese Tests nur die Reduktion des Bakterienwachstums oder die Veränderung des Bindungsverhaltens bzw. der enzymatischen Aktivität eines einzelnen Targets im Assaysystem überprüfen, identifizieren diese Tests nicht nur gewünschte anti-mikrobiell wirksame Verbindungen mit Bezug zur Entwicklung eines Medika- mentes, sondern zum überwiegenden Teil zytotoxische und zytostatische Wirkstoffe, die zahlreiche nachgeschaltete Testsysteme erfordern, um dann verträgliche Wirkstoffe aus den unerwünschten zelltoxischen Substanzen herauszufiltern.
Der Begriff Mikrobe ist ein kollektiver Begriff und steht für eine große Vielfalt von Mikroorganismen inklusive der Bakterien, Viren, Protozoen und Pilze etc.
Der Begriff Signal beschreibt jegliche Form des Abgreifens von Information aus dem Testansatz, die zur Bewertung der anti-mikrobiellen Aktivität und Verträglichkeit der potentiellen Wirkstoffe geeignet ist, z.B. kann als Signal ein Messwert bezeichnet werden, der der Vitalität der Zellen entspricht und damit die anti-mikrobielle Aktivität der Testsubstanz und dessen Verträglichkeit anzeigt.
Der Begriff Prokaryont beschreibt einen Organismus, der im Gegensatz zu eukaryontischen Zellen keinen Nucleus besitzt. In diesem Kontext schließt er darüber hinaus auch gentechnologisch manipulierte Prokaryonten ein, z.B. solche, die ein Reportergenprodukt produzieren. Der Begriff eukaryontische Zelle beschreibt einen Organismus, der im Gegesatz zu Prokaryonten einen Nucleus besitzt. In diesem Kontext schließt er darüber hinaus auch gentechnologisch manipulierte Eukaryonten ein, z.B solche, die ein Reporter- genprodukt produzieren.
Die Abkürzung MIC ist ein Synonym für die deutsche Bezeichnung MHK (Minimale Hemmkonzentration) steht für „Minimum Inhibition Concentration" und beschreibt die niedrigste Konzentration einer Verbindung, die noch in der Lage ist z.B. bakte- rielles Wachstum vollständig zu inhibieren mit Bezug auf eine visuelle Trübung der
Inkubationsmedien (described in National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, PA, 1997. Methods for dilution anti-microbial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically 4 ed. Approved Standard. NCCLS Document M7-A4).
Die Begriffe Gram-positiv und Gram-negativ beschreiben das Ergebnis der sogenannten Gram-Färbung, die nur eine von einer Vielzahl veröffentlichten Anfärbemethoden für Mikroorganismen ist, um Proben von Organismen zu untersuchen. (Principles and Practice of Infectious Diseases, GL Mandall, RG Douglas, JE Bennett ed., Churchill Livingstone Inc., 1995)
Die Abkürzung moi steht für „multiplicity of infection" und ist der Quotient der Zellzahl des Pathogens dividiert durch die Zellzahl der zu infizierenden Zellen. (MOI = Zellzahl des Erregers / Zahl der Zellen, die infiziert werden).
Der Begriff Selektivitätsindex (SI) bezieht sich auf den Quotient der Konzentrationen, bei der die Zellvitalität auf 50 % gegenüber der Zellkontrolle reduziert ist, dividiert durch die Konzentration, bei der die anti-mikrobielle Wirkung mindestens 50 % einer maximal möglichen Inhibition der Erregervermehrung erreicht, d.h. SI = (CC50/IC50). Je größer diese Zahl ist, um so größer ist die Verträglichkeit der Verbindung. Bevorzugt werden Verbindungen mit SI- Werten größer 10. Der Begriff IC50 oder EC50 beschreibt die Konzentration oder die Menge an Wirkstoff, die benötigt wird um eine 50%ige Inhibition in einem gegebenen Testsystem zu erreichen oder die effektive Konzentration, die benötigt wird um ein halbmaximales Signal in einem Assay zu erreichen.
Der Begriff simultan mit Bezug zum infektiologischen Assay bezieht sich auf eine Situation, bei der zu einem Zeitpunkt gleichzeitig Wirkstoff, Mikrobe und eukaryontische Zellen in einer Lösung inkubiert werden; die Sequenz der Zugabe der Kompo- nenten ist jedoch variabel.
Der Begriff therapeutischer Index (TI; Verträglichkeit) bezieht sich auf einen Quotient der lethalen Dosis (LD; lethal dose) bei der 50 % der Versuchstiere aufgrund der Substanzwirkungen sterben und der effektiven Dosis (ED; effective dose) bei der 50 % der Versuchtiere die Infektion überleben TI = (LDso/ED5o).
Der Begriff inhibieren beschreibt, wenn er im Zusammenhang mit dem infektiologischen Assay gebraucht wird, generell die Inhibition des Mikrobenwachstums um ca. 50 % bei einer Konzentration von IC50 = 100 μM oder geringer und bevorzugt eine Konzentration, die so niedrig ist wie möglich, um den MHK- Wert zu erreichen.
Der Begriff Vitalfarbstoffe bezeichnet Farbstoffe, die eine Unterscheidung zwischen vitalen und nicht vitalen Zellen erlauben, indem sie z.B. nur in nicht vitale Zellen eindringen (Tryp anblau) oder nur von intakten Zellen umgesetzt werden (z.B. Fluoresceindiacetat). Bevorzugt sind Fluoreszenzfarbstoffe.
Der Begriff Signifikanz drückt die Wahrscheinlichkeit aus, mit der man sich sicher sein kann, dass das positive Testergebnis nicht durch Zufall entstanden ist.
In einer Ausfuhrungsform ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass solche
Wirkstoffe ausgewählt werden, bei deneri das Signal des entsprechenden Testan- satzes größer ist als der 2-fache, besonders größer als der 4-fache, ganz besonders größer als der 10-fache Wert des Mittelwertes der Infektionskontrolle und insbesondere größer als 50 % der Zellkontrolle.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den nicht-viralen Mikroben um prokaryontische Zellen handelt. Bevorzugt handelt es sich bei den prokaryontischen Zellen um Bakterien, insbesondere um intrazelluläre und oder therapieresistente Mikroben.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass Vitalfarbstoffe eingesetzt werden. Bevorzugt sind Fluoreszenzfarbstoffe, insbesondere Fluorescein-diacetat, Fluorescein-dibutyrat, 5-Carboxyfluorescein-diacetat, Acetoxymethylester (5-CFDA, AM) und 4,5,6,7-Tetrafluorofluorescein-diacetat (TFFDA).
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eukaryontische Zellen benutzt werden, die zur Generierung des Testsignals ein sogenanntes Reportergen aufweisen.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die nicht viralen Mikroben, wie zum Beispiel gentechnisch manipulierte Organismen, nicht natürlich vorkommende Eigenschaften aufweisen. Z.B. können Mikroben verwendet werden, die ein verändertes Adhäsionsverhalten an Zelloberflächen aufweisen oder spezielle Toxine produzieren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den eukaryontischen Zellen um Vero (african green monkey kidney cells) oder CHO Zellen (chinese hamster ovary cells) handelt.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung verschiedener Mikrobenstämme eingesetzt wird. So können Testsubstanzen direkt auf eine mögliche anti-mikrobielle Breitband- Aktivität geprüft werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekenn- zeichnet, dass eine Mischung diverser eukaryontischer Zelllinien eingesetzt wird.
Hierdurch kann neben der anti-mikrobiellen Aktivität von Wirkstoffen deren Verträglichkeit simultan gegen verschiedene eukaryontische Zellen geprüft werden. Es ist darüber hinaus möglich verschiedene eukaryontische Zellen einzusetzen, die gleiche oder verschiedene sogenannte Reportergene tragen, um neben dem Verträg- lichkeitsaspekt noch gegebenenfalls Rückschlüsse auf das getroffene Target selbst zu ziehen.
In einer weiteren Aus-Rihruhgsform betrifft die Erfindung Verbindungen oder Wirkstoffe, die mittels der oben aufgeführten Methode identifiziert wurden, pharmazeu- tische Zusammensetzungen, die eine derart aufgefundene Verbindung enthalten, die
Verwendung dieser Substanzen für die Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prävention von mikrobiellen Infektionen sowie die Behandlung von mikrobiellen Infektionen von Säugern, indem man dem Säuger, der eine derartige Therapie benötigt, eine therapeutisch wirksame Dosis der pharmazeutischen Zusammen- setzung verabreicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Methode dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindungen ausgewählt werden, die einen Selektivitätsindex von größer gleich 10 aufweisen (Selektivitätsindex = CC50/IC5Q >= 10).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren als Hochdurch- satzscreening (HTS) bei einer Konzentration des Wirkstoffes im Konzentrationsbereich von 100 nM bis 100 μM durchgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform sind Verbindungen bevorzugt, die eine sogenannte Breitbandspektrum anti-mikrobielle Wirkung aufweisen. Besonders bevorzugt sind Wirkstoffe, deren Wirkmechanismus auf einem Target des Pathogens oder Erregers beruht.
In einer weiteren bevorzugten Ausfül rungsform ist die Methode dadurch gekenn- zeichnet, dass diejenigen Wirkstoffe ausgewählt werden, die die Eigenschaft haben, mikrobielles Wachstum in Zellkultur bei einer Konzentration von ca. 100 μM und weniger um mindestens 50% zu inhibieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher eine Methode zur Identifizierung von Wirkstoffen, dadurch gekennzeichnet, dass
a) Testsubstanzen oder Kontrollantibiotika bei einer geeigneten Substanzkonzentration vorgelegt werden; b) geeignete eukaryontische Zellen hinzugefügt werden; c) Mikroben hinzugefügt werden; d) der Assay inkubiert wird; e) ein read out oder ein sogenanntes Testsignal generiert wird.
Dies soll im folgenden genauer erläutert werden, ohne die Erfindung dadurch ein- zuschrähken:
Schritt a)
Wird nur eine Konzentration der Testsubstanz bei der Assaydurchführung eingesetzt wie z.B. bei einem Hochdurchsatztest, ist jede Konzentration geeignet, bei der eine anti-mikrobielle Aktivität und eine gewisse Verträglichkeit gegenüber den eukaryo- tischen Zellen vorliegt. Eine Konzentration von etwa 100 μM oder weniger oder zumindest im Bereich der MHK Konzentration kann eingesetzt werden, bevorzugt ist eine Konzentration von etwa 10 μM. Wird ein Konzentrationsgradient eingesetzt um eine Dosisabhängigkeit der anti- mikrobiellen Wirkung und eine Verträglichkeit gegenüber eukaryontischen Zellen über einen breiten Konzentrationsbereich zu zeigen, werden gewöhnlich Konzentrationen von 250 μM bis weniger als 1/10 (ein zehntel) der MHK Konzentration oder weniger eingesetzt.
Schritt b)
Eukaryontische Zellen, die optional ein Reportergen tragen, oder Mischungen der entsprechenden Zellen oder Zellinien können eingesetzt werden. Eine beliebige
Zellzahl pro Fläche kann eingesät werden, sofern ein vernünftiger Quotient der Signale der Zellkontrolle und der Infektionskontrolle erreicht wird. Die eingesäte Zellzahl sollte nicht eine Menge überschreiten, bei der es während der Inkubationszeit zur sogenannten Kontaktinhibition der Zellen kommt; weiterhin sollte die Zell- Vitalität nicht durch entstehende Zellstoffwechselprodukte oder Nährstoffmangel beeinträchtigt werden. Geeignete Zellzahlen erlauben eine klare Unterscheidung zwischen möglichen zytostatischen oder zytotoxischen Effekten der Testsubstanzen und der Kontaktinhibition bzw. Nährstoffmangel wie oben beschrieben.
Bespielsweise sind 20 000 eukaryontische Zellen je Vertiefung einer 96 well MTP bevorzugt.
Schritt c)
Mikroben, die gegebenenfalls gentechnologisch manipuliert wurden, als auch intra- oder extra-zellulär wachsende mikrobielle Zellen oder Mischungen derselben werden dem Test in der gewünschten Infektionsdosis (multiplicity of infection (moi)) zugefügt. Notwendig ist eine mikrobielle Zellzahl, die direkt oder indirekt während der Inkubationsdauer einen zytopathischen Effekt auf die eukaryontischen Zellen ausübt, so dass ein geeignetes Messsignal nach der entsprechenden Inkubationsdauer generiert wird. Eine moi von 10 bis 0,001 ist bevorzugt. Schritt d)
Eine Mikrotiterplatte, die mit einer Mischung der Assaykomponenten, nämlich der Testsubstanz, den eukaryontischen Zellen und den Mikroben besteht, wird unter den für das Wachstum eukaryontischer Zellen optimalen Bedingungen für einen entsprechenden Zeitraum inkubiert, um ein geeignetes Meß signal zu generieren.
Schritt e)
Der Zellkulturüberstand wird optional entfernt, die verbleibenden eukaryontischen
Zellen werden gegebenenfalls gewaschen und ein geeigneter Farbstoff oder das entsprechende Reagenz zum Generieren des Signals im Falle der reportergenexpri- mierenden eukaryontischen Zellen wird hinzugefügt, um das Messsignal zu generieren, das mit Hilfe eines geeigneten Messgerätes oder Kamerasystems bei den entsprechenden Wellenlängen aufgezeichnet wird.
Es muss betont werden, dass die Arbeitsschritte a) b) und c) austauschbar sind und gegebenenfalls sogar simultan ausgeführt werden können. Idealerweise werden geeignete Farbstoffe beim Schritt e) zugesetzt, ohne vorher den Zellkulturüberstand zu entfernen und oder zusätzliche Waschschritte durchzuführen, zum Beispiel ist dieses möglich, sofern definierte Zellkulturmedien eingesetzt werden, die nicht mit dem Generieren des Messsignals interferieren. Dies kann auch in einer Ausführungs- form dadurch erreicht werden, dass beim Test reportergenexprimierende, eukaryontische Zellen eingesetzt werden, die es erlauben, nach der entsprechenden Inkuba- tionszeit ein geeignetes Messsignal aufzunehmen. Die Vitalität der Zellen kann prinzipiell vom Zeitpunkt des Inkubierens an kontinuierlich (on-line) gemessen werden, indem die Zellen mit einem geeigneten Reportersystem (z.B. GFP) versehen werden. Der infektiologische Assay
Im Prinzip kann jede eukaryontische Zelle (inklusive derjenigen, die ein sogenanntes Reportergen exprimieren) oder eine Mischung der genannten eukaryontischen Zellen, die in der Lage sind ein geeignetes Testsignal zu generieren und die Messung. des entsprechenden Selektivitätsindex erlauben, in diesem Assay eingesetzt werden. Die eukaryontischen Zellen können lange vor der Testinkubation eingesät werden; bevorzugt ist die Zugabe der eukaryontischen Zellen zu einer für Zellkultur geeigneten Mikrotiterplatte, die bereits einen Wirkstoff bzw. Testsubstanz geeigneter Konzen- tration enthält. Anschließend infiziert man diese eukaryontischen Zellen dann mit dem entsprechendem Inoculum (es handelt sich hierbei um Mikroben, inklusive derjenigen die ein sogenanntes Reportergen tragen, oder Mischlingen der Mikroben die einen zytophatischen Effekt auf die infizierten eukaryontischen Zellen ausüben) wobei ein geeignetes Verhältnis der multiplicity of infection (moi) einen signifi- kanten Unterschied des Testsignals (read out) zwischen der eukaryontischen Zellkontrolle oder auch der Therapiekontrolle (Antibiotikakontrolle) im Vergleich zur Infektionskontrolle erlaubt. Es ist klar, dass alle drei Komponenten gemischt und auf Mikrotiterplatten dispensiert werden können, aber eine kurze Vorinkubationszeit der eukaryontischen Zellen vor der Infektion kann ggf. das Identifizieren von Verbin- düngen erlauben, die die Adhäsion oder die Kolonisation der Mikroben an der Oberfläche der eukaryontischen Zellen und oder die Invasion der Mikroben in die eukaryontischen Zellen unterbinden.
Die Testsubstanzen können in jeder Konzentration vorliegen, idealerweise in einem Bereich, der für die eukaryontischen Zellen nicht toxisch ist, so dass eine anti-mikrobielle Wirkung als Folge ein positives Testsignal generiert. Die Mikroben, mag es sich um Gram-positive oder Gram-negative Bakterien oder intra- or extrazellulär wachsende Mikroben handeln, werden in einer Infektionsdosis von (moi etwa 0,001 bis 10) hinzugefügt. Es ist möglich die moi über einen weiten Bereich zu variieren und doch kann ein vernünftiges Testsignal generiert werden, aber eine Veränderung der Infektionsdosis oder der moi kann auch den IC50 und oder das maximale Test- signal entsprechend erhöhen oder zu niedrigeren Werten verschieben. Der Assay wird dann für einen geeigneten Zeitraum unter den für die Zellkultur notwendigen Bedingungen wie Temperatur, Atmosphäre etc. irikubiert. Im Anschluss an die Inkubation werden die Mikrotiterplatten gewaschen und das Testsignal oder das read out wird generiert. Eine Vielzahl von Fluoreszenzfarb Stoffen kann für diverse Zelllinien eingesetzt werden, während Zelllinien mit Reportergen wie z.B. Luciferase, Green Fluorescent Protein (GFP), Alkaline Phosphatase etc. im individuellen Fall erst generiert oder erworben werden müssen; derartige Ausführungsformen können jedoch bessere Testsignal/Hintergrund- Verhältnisse liefern bzw. diverse Schritte wie z.B. Waschschritte überflüssig machen.
Ausftihrungsbeispiel
Der Assay wird für Vero Zellen (Wachstum in Medium 199 mit Earle's Salzen ergänzt mit 5 % foetalem Kälberserum (FCS) und 2 mM L-Glutamin) und CHO Zellen (Wachstum in RPMI-1640 Medium ergänzt mit 2 mM L-Glutamin und 10 %
FCS) und außerdem für die entsprechenden Zellen mit Reportergen gezeigt. Die Zellen sind bei ATCC (American Tissue Cell Culture) oder der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen) erhältlich. Die konstitutiv das Reportergen exprimierenden Zellen wurden mit Standardmethoden hergestellt. Die reportergentragenden Plasmide für Luciferase, Aequorin und eGFP (Grünes fluores- zierendes Protein) sind ebenso wie die Transfektions- und Nachweisreagenzien der Reportergene bei diversen kommerziellen Anbietern erhältlich (z.B. Clontech).
Es wird eine entsprechende Menge an Testsubstanz in einer MTP vorgelegt, so dass die Endkonzentration für einen Hochdurchsatztest 10 μM oder für einen Gradienten
(beispielsweise 250 μM in der höchsten Konzentration und dann 1:2 verdünnt bis 1/10 des IC50 der Testsubstanz) beträgt. Der Gradiententest eignet sich insbesondere zur Bestimmung des Selektivitätsindexes. Sind die Substanzen in Dimefhylsulfoxid gelöst, so sollte das Lösungsmittel nicht Endkonzentrationen von 1 % oder besser 0,5 % überschreiten. Dann werden die eukaryontischen Zellen im entsprechenden
Medium hinzugegeben (z.B. 20000 Zellen pro Vertiefung einer 96 well MTP, oder 5000 Zellen je Vertiefung einer 384 well MTP und so weiter und so fort für 1536 well MTP oder andere Zellkulturgefäße). Zur Infektion werden die Mikroben bei einer moi von 0,025 hinzugefügt. Der Assay bei einem Gesamtvolumen von 200 μl wird dann für 2 bis 3 Tage, im Falle der Vero oder CHO Zellen bei 37°C und 5 %
CO2, inkubiert. Nach der Inkubationszeit werden die MTP's ein mal mit 200 μl PBS (phosphate buffer saline) gewaschen und das read out oder Testsignal durch Zugäbe von 200 μl 10 μg/ml Fluoreszeindiacetat in PBS oder den entsprechenden Nachweisreagenzien für Luciferase oder Aequorin generiert. Die MTP werden im Falle von Fluorescein-diacetat für 15-45 min bei Raumtemperatur bis zu einer visuell sichtbaren Verfärbung der Zellkontrolle inkubiert und das entstehende Fluoreszenzsignal wird bei einer Anregungswellenlänge von (excitation wavelength) 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 538 nm in einem geeigneten Messgerät vermessen (z.B. Fluoroskan Ascent der Firma Labsystems). Die anderen Testsignale werden entsprechend den Herstellerangaben der Nachweisreagenzien generiert.
Die Tabelle 1 zeigt typische normierte Daten des oben beschriebenen Testes.
Die Tabelle 2 zeigt die Auswertung der normierten Daten einer 96-well-Mikrotiter- platte aus einem Hochdurchsatzscreening. Fett gekennzeichnet sind 2 Hits (B8 und C4), deren Verbindungen die Auswahlkriterien erfüllen und weiter untersucht werden.
Auswahlkriterien : Der Prozentwert des Testansatzes ist signifikant größer als der Mittelwert der Infektionskontrolle. Bevorzugt ist, wenn der Signifikanzwert mindestens 99,95 % beträgt.
Die Tabellen 3 und 4 sind Beispiele für einen simultanen Dosiswirkungs- und Verträglichkeitstest über einen breiten Konzentrationsgradienten zur Bestimmung der IC50 Werte und des SI.
Tabelle 1
Normierte Daten der Zellkontrolle = 100 %, der Bakterienkontrolle, der Infektionskontrolle, und der Therapiekontrolle sind oben aufgeführt.
Das prozentuale Signal = (Signal der Therapie- oder des Wirkstofftestansatzes) /' (Signal der Zellkontrolle) * 100
Figure imgf000019_0002
Figure imgf000019_0001
Tabelle 3 Bestimmung des SI für verschiedene Antibiotika
Assayparameter
Keim : E.coli- Neumann; moi = 0,00125
Zellen : 40 000 CHO-Zellen
Inkubation : 3 Tage
Read out : Fluoresceindiacetat 10 μg/ml in PBS
IC50 [μg/ml] SI
Antibiotika [μg/ml] 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,031 0,016 0,008
Ciprofloxacin 119% 113% 112% 117% 97% 99% 118% 108% 116% 86% < 0,008 > 500
Moxifloxacin 111 % 105% 107% 112% 98% 95% 87% 92% 105% 1% 0,012 > 333
Trovafloxacin 39% 54% 77% 105% 109% 102% 109% 83% 101% 1% 0,012 166
Zellkontrolle 97% 102% 101% 99% 102% 97% 99% 100% 101% 100%
Infektionskontrolle 2,1% 1,7% 1,3% 1,9% 1 ,8% 1,5% 1,6% 2.0% 1,7% 1,9%
Tabelle 4 Bestirr imunc i des SI für verschiedene Antibiotika
Assayparameter
Keim : Staphylococcus aureus 133; moi = 0,00125
Zellen : 40 000 CHO-Zellen
Inkubation : 3 Tage
Read out : Fluoresceindiacetat 10 μg/ml in PBS
IC50 [μg/ml] SI
Antibiotika [μg/ml] 4 2 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 0,031 0,016 0,008
Ciprofloxacin 110% 109% 116% 118% 110% 2% 1% 2% 1% 1% 0,2 > 20
Moxifloxacin 97% 98% 106% 1 14% 104% 101 % 96% 106% 1 % 1 % 0,02 > 200
Trovafloxacin 23% 30% 71 % 101 % 105% 106% 107% 97% 2% 1 % 0,02 ♦ 75
Zellkontrolle 98% 101% 100% 98% 99% 98% 102% 102% 100% 101%
Infektionskontrolle 2,3% 1 ,5% 1 ,5% 1 ,3% 1 ,7% 1 ,6% 1,9% 2,3% 2,1% 1 ,8%

Claims

Patentansprtiche
1. Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen gegen nicht virale Mikroben, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Testansatz gleichzeitig potentielle
5 Wirkstoffe zusammen mit eukaryontischen Zellen und mit nicht-viralen
Mikroben inkubiert werden, die Vitalität der eukaryontischen Zellen bestimmt wird und anschließend solche Wirkstoffe ausgewählt werden, bei denen das Signal des entsprechenden Testansatzes signifikant größer ist als der Mittelwert der Infektionskontrolle bei mindestens einer Konzentration des 10 Wirkstoffes. fr
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass solche Wirkstoffe ausgewählt werden, bei denen das Signal größer ist als der 2 fache Mittelwert der Infektionskontrolle.
15
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den nicht viralen Mikroben um Prokaryonten handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den 20 Prokaryonten um Bakterien handelt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den nicht viralen Mikroben um intrazelluläre Mikroben oder therapie- resistente Mikroben handelt.
25
6. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3, 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Vitalität der eukaryontischen Zellen Vitalfarbstoffe eingesetzt werden.
30 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Vitalfarbstoff
Fluoreszenzfarbstoff ist.
8. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die eukaryontischen Zellen ein Reportergen aufweisen, das zur Generierung des Testsignal eingesetzt werden kann.
9. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet das die nicht viralen Mikroben nicht natürlich vorkommende Eigenschaften besitzen, wie z.B. gentechnologisch manipulierte Mikroorganismen.
10. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass als eukaryontische Zellen CHO-Zellen oder Verozellen eingesetzt werden.
11. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekenn- zeichnet, dass eine Mischung verschiedener Bakterienstämme verwendet wird.
12. Verfahren irgend einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung verschiedener eukaryontischer Zellen verwendet wird.
13. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass solche Substanzen ausgewählt werden, die einen Selektivitätsindex = CCso/ICsö von mindestens 10 aufweisen.
14. Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren als Hochdiirchsatzscreening bei einer Konzentration des Wirkstoffes von zwischen lOOnM und lOOμM durchgeführt wird .
15. Verbindungen, die mit dem Verfahren nach irgend einem der Ansprüche 1 bis 15 gefunden werden.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 15.
17. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 16 zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung und Prävention bakterieller Infektionen.
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