WO2004005515A1

WO2004005515A1 - イネｂｔ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子

Info

Publication number: WO2004005515A1
Application number: PCT/JP2003/003154
Authority: WO
Inventors: Toshiyuki Komori; Yoshimitsu Takakura; Yuko Hiei; Shoichi Suzuki; Yoshiki Kuraya
Original assignee: Japan Tobacco Inc.; Syngenta Limited
Priority date: 2002-07-05
Filing date: 2003-03-17
Publication date: 2004-01-15
Also published as: US7544856B2; CN1678745B; EP1541687A4; CA2491411A1; US20060179517A1; JPWO2004005515A1; AU2003213397A1; AU2003213397B2; EP1541687A1; CN1678745A

Abstract

　本発明は、イネＢＴ型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子を提供することを目的とする。　本発明の遺伝子は、配列番号７５のアミノ酸配列、又は配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。本発明の遺伝子は、好ましくは配列番号６９−７４、８０−８５又は配列番号２７の塩基４３９０７−４６２７９に記載の塩基配列を有する。

Description

明細書イネ B T型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子発明の詳細な説明

技術分野

本発明は、イネ B T型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子に関する。本出願は、 2 0 0 2年 7月 5日に提出された日本特許出願特願 2 0 0 2— 1 0 7 5 6 0号を基礎とする優先権主張出願である。当該日本特許出願の内容は全て本明細書に援用される。

背景技術

イネは自殖性植物であるため、品種間で交雑を行う場合には、まず自家受精を避けるためにイネの穎花が開花する直前に穎花内の雄しベを全て取り除き、次いで交雑をする花粉親品種由来の花粉を用いて受精させる必要がある。しかしながら、このような手作業による交雑方法で商業的規模での大量の雑種種子を生産することは不可能である。

そこで、ハイブリッドライスの生産には、細胞質雄性不稔を利用する三系法が利用されている。三系法とは、雄性不稔細胞質を保有する系統である不稔系統、

R f - 1遺伝子を保有する系統である回復系統、および核遺伝子は不稔系統と同一であって不稔細胞質を保有しない系統である維持系統とを使用する方法をいう。これらの 3系統を用いて、（ i ) 不稔系統に回復系統の花粉を受精させることによりハイブリッド種子を獲得することができ、（ i i ) 一方、不稔系統に維持系統の花粉を受精させることにより不稔系統を維持することができる。

≡系法で B T型雄性不稔細胞質を利用するにあたっては、回復系統のイネを育成するために、育種における各過程で育成中のイネが R f — 1遺伝子を保有すること、また、最終段階では R f — 1遺伝子をホモで保有することを確認する必要がある。また、三系法において、回復系統に使用する品種が確実に R f — 1遺伝子を保有することを調べたり、得られたハイプリッド種子が稔性を回復しているか確認するために、 R f 一 1遺伝子の存在を調べる必要が生じる場合もある。従来、植物体中での R f — 1遺伝子座の遺伝子型を推定するためには、まず、検定系統と交配を行った交配種子から植物体（F 1) を形成し、次いで F 1植物を自殖させてその種子の形成率が一定以上（例えば 70〜80%以上）である個体の出現頻度を調査する必要があった。なお、検定系統とは、維持系統、不稔系統あるいは両系統のセットを指し、目的とする被検定個体の細胞質が BT型か通常細胞質か、あるいは不明かにより適宜選択するものである。不稔系統を検定系統として用いる場合は母親として、維持系統を検定系統として用いる場合は父親として、それぞれ被検定個体に交配する。

しかしながら、これらの方法を行うには、莫大な労力と時間を要する。また、種子稔性は、環境要因の影響を受けやすいので、低温，日照不足などの不良環境で調査すれば、遺伝子型の構成によらず不稔になる場合があり、 R f — 1遺伝子座の遺伝子型推定が正確に行えないという問題を有していた。

このような問題を解消するために、最近では、分子生物学的方法により R f — 1遺伝子の存在を判別する方法も提案されている。それは、 R f — 1遺伝子と連鎖する塩基配列（以下、 DNA マ一カーという）を検出することにより、 R f — 1遺伝子の存在または不存在を調べる方法である。因みに、 R f — 1遺伝子の DN A配列は未解読であるため、直接 R f — 1遺伝子を検出することは、現在の技術では不可能であった。

例えば、イネの R f _ 1遺伝子座は第 10染色体上に存在し、そして、制限酵素断片長多型（RFLP) 解析に使用することができる DNAマ一カー（RFL Pマ一力一）座 G 291と G 127との間であることが報告されている（Fu k u t a e t a 1. 1 992, J p n J . B r e e d. 42 ( s u p 1. 1) 1 64— 165) 。このため、 R f - 1遺伝子と連鎖する DNAマーカー座G29 1および G 127の遺伝子型を調査することにより、 R f ― 1遺伝子座の遺伝子型を推定することが可能である。

しかしながら、従来の分子生物学的方法にはいくつかの問題が存在する。第一の問題は、従来の方法では、使用するマーカーが RFL Pマーカ一であり、これを検出するためにはサザンブロット解析を行う必要があるという点である。サザンブロット解析を行うためには、被検定個体から数マイクログラム単位の精製された DNAを必要とし、さらに制限酵素処理、電気泳動、ブロッテイング、プローブとのハイプリダイゼ一シヨン、およびシグナルの検出からなる一連の作業手順を行う必要があるため、多大な労力が必要であるうえに、検定結果を得るまでに 1週間程度かかっていた。

第二の問題は、 RFLPマ一カー座 G29 1と G 1 27の間の遺伝子地図距離は約 30 cM (イネ DNAでは約 9000 k b pに相当する）と長いため、二重組換えが起こる可能性が数％程度はあると考えられ、 R f - 1遺伝子座の遺伝子型が必ずしも正確に推定できないことである。

さらに第三の問題は、 R f 一 1遺伝子の存在を RF L Pマーカ一座 G 29 1および G 1 27の遺伝子型を調査することにより推定する場合、選抜の結果育成される稔性回復系統には、 R f — 1遺伝子と共に、 RFL Pマーカー座 G29 1と G 1 27の間の遺伝子領域も導入されるという点である。その結果、導入 DNA 配列は 30 cM以上の R f 一 1遺伝子ドナー親由来の染色体領域を有することになり、導入 DN A領域中に存在する可能性がある劣悪遺伝子を R f 一 1遺伝子と同時に導入してしまう危険性があつた。

このような問題を解決するため、 R f — 1遺伝子座と連鎖する優性 DNAマ一カー（特開平 7 - 222588) および共優性 D N Aマーカ一（特開平 9 - 3 1 3 1 87) が開発されている。これらのマ一カーは、 R f — 1遺伝子座とそれぞれ、 1. 6 ± 0. 7 c M (イネ DNAでは約 480 k b pに相当）および 3. 7 ± 1. 1 cM (イネ DNAでは約 1 1 1 O k b pに相当）の遺伝的距離で連鎖しており、両座は R f — 1遺伝子座を挟む位置関係にある。そのため、優性 PCR マーカー座および共優性 P CRマーカー座は、これらが両方とも存在することを検出することにより、 R f — 1遺伝子の存在を推定することができる。また、共優性 P CRマ一カーの使用は、 R f - 1遺伝子座の遺伝子型がホモかへテロかも推定することを可能にする。

しかしながら、これらの P CRマーカ一を使用する場合にも、依然としていくつかの問題がある。この共優性マーカーは R f — 1遺伝子座と 3. 7 ± 1. l c Mの遺伝距離を有するため、 R f ― 1遺伝子座との間での組換え頻度が高いという問題が十分には解決されていない。その結果、共優性マーカー自体についてはホモ型またはへテロ型まで正確に検出することができるが、共優性マーカー座と

R f 一 1遺伝子座との間で組換えが生じる場合に、 R f 一 1遺伝子座の遺伝子型の推定、特にホモ型またはへテロ型までの推定を正確に実施できないという問題がある。一方、優性マーカーを使用して R f — 1遺伝子座の遺伝子型を推定する場合、優性マーカーでは R f 一 1遺伝子がホモの個体（R f _ 1ZR f — 1) およびへテロの個体（R f _ lZr f — 1) の両方を区別することなく検出してしまう。そのため、上記共優性マーカーと優性マーカーとを組み合わせて利用して R f - 1遺伝子座の遺伝子型を推定したとしても、 R f 一 1遺伝子に関するホモ型とヘテロ型とを正確に識別することはできない。また、優性マーカ一を用いて行う PC Rでは、 P CR産物が得られなかった場合には、実験操作上の問題に起因する可能性も否定できない。さらに、これらの共優性マ一カーと優性マーカーとの間の遺伝的距離が約 5. 3 cM (約 1 590 k b p) と離れているため、 R f 一 1遺伝子ドナー親からの導入染色体領域長を短い長さに限定することができないので、この領域中に含まれる劣悪遺伝子の持ち込みを抑制できないという問題点も有している。

さらに、特開 2000— 1 3 9465には、イネ第 1 0染色体の R f — 1遺伝子の近傍に座乗する RFL Pマーカーの塩基配列に基づいて開発された、共優性 P CRマーカーが記載されている。しかしながら、それらの P CRマーカ一は、依然として R f — 1遺伝子からの遺伝的距離が約 1 c Mより離れているという問題を有している。

発明の開示

本発明は、イネの稔性を回復する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコ一ドする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入する、ことを含む。本発明の方法の、好ましい一態様において、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 7 5のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸は、以下の a) — p) の核酸から選択される：

a ) 配列番号 6 9の塩基 2 1 5— 2587を含む核酸； b) 配列番号 70の塩基 2 1 3 2585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8 2590を含む核酸

d) 配列番号 72の塩基 208 2580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149一 252 1を含む核酸

f) 配列番号 74の塩基 225— 2597を含む核酸

g ) 配列番号 27の塩基 43907— 46279を含む核酸；

h ) 配列番号 80の塩基 229— 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2599を含む核酸

k) 配列番号 83の塩基 220— 2592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

n) 上記 a) -m) のいずれかの核酸と少なくとも 70 %同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；

o) 上記 a) — m) のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び

p) 上記 a) — m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。

本発明の方法において、上記配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 7 5のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸は、好ましくは、以下の条件 1) 一 1 2) の少なくとも一つを満たす：

1) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基が Aである

2) 配列番号 70の塩基 17 67に相当する塩基が Aである

3 ) 配列番号 7 1の塩基 17 72に相当する塩基が Aである

4) 配列番号 72の塩基 1 762に相当する塩基が Aである

5) 配列番号 73の塩基 1 703に相当する塩基が Aである

6) 配列番号 74の塩基 1 779に相当する塩基が Aである

7) 配列番号 80の塩基 1783に相当する塩基が Aである 8) 配列番号 8 1の塩基 1 729に相当する塩基が Aである；

9) 配列番号 82の塩基 1 78 1に相当する塩基が Aである；

1 0) 配列番号 83の塩基 1 774に相当する塩基が Aである；

1 1) 配列番号 84の塩基 1 728に相当する塩基が Aである；又は

1 2) 配列番号 85の塩基 1 644に相当する塩基が Aである。

本発明はまた、上記配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のァミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコ一ドする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸を利用して、被検定イネ個体又は種子が R f 一 1遺伝子を有するか否かを識別する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、一態様において、好ましくは、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であつて、稔性回復機能を有する核酸が、以下の条件 1) — 1 2) の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子が R f 一 1遺伝子を有すると判断する：

I) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基が Aである

2) 配列番号 70の塩基 1 767に相当する塩基が Aである

3) 配列番号 7 1の塩基 1 772に相当する塩基が Aである

4) 配列番号 72の塩基 1 762に相当する塩基が Aである

5) 配列番号 73の塩基 1 703に相当する塩基が Aである

6) 配列番号 74の塩基 1 779に相当する塩基が Aである

7 ) 配列番号 80の塩基 1 783に相当する塩基が Aである

8) 配列番号 8 1の塩基 1 729に相当する塩基が Aである

9) 配列番号 82の塩基 1 78 1に相当する塩基が Aである

1 0) 配列番号 83の塩基 1774に相当する塩基が Aである；

I I) 配列番号 84の塩基 1728に相当する塩基が Aである；又は

1 2) 配列番号 85の塩基 1 644に相当する塩基が Aである。

本発明は、さらに、 R f — 1遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法を提供することを目的とする。本発明の抑制方法は、一態様において、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70%同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも 100塩基の長さのアンチセンスを導入する、ことを含む。

本発明はさらにまた、配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 7 5のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、を提供することを目的とする。本発明は、一態様において、以下の a) — p)

a ) 配列番号 69の塩基 2 1 5— 2587を含む核酸

b ) 配列番号 70の塩基 2 1 3— 2585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2590を含む核酸

d ) 配列番号 72の塩基 208— 2580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149— 2 52 1を含む核酸

f ) 配列番号 74の塩基 22 5— 2 597を含む核酸

g ) 配列番号 27の塩基 43907— 46279を含む核酸

h ) 配列番号 80の塩基 229— 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2 547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2599を含む核酸

k ) 配列番号 83の塩基 220— 2592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

n) 上記 a) — m) のいずれかの核酸と少なくとも 70 %同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；

o) 上記 a) -m) のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び

P) 上記 a) — m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸

から選択される核酸を提供する。

図面の簡単な説明

図 1は、 RFL Pマーカ一座 S 1 2564を起点とする染色体歩行の結果を示す。図 2は、 BACクローン AC 068923とラムダクローンコンティグとの位置関係を示す。

図 3は、 R f — 1座極近傍組換え型花粉（いずれも稔性あり）の R f — 1座極近傍の染色体構成を、その花粉から生じた 1 0個体（R S 1、 RS 2、 RC 1 - 8) のマーカー座の遺伝子型に基づき、明らかにした結果を示したものである。白抜き部分はジャポニカ型領域を、黒部分はィンディ力型領域を示す。

図 4は、第 1 0染色体上のマーカ一座と R f 一 1座との連鎖分析の結果に基づき、 R f — 1座の連鎖地図上での位置を示したものである。地図距離は、 104 2 F 1個体の分離データから算出した。

図 5は、相補性試験による R f — 1領域の同定のために使用した、 1 0個のゲノムクローン由来の断片を示す。染色体歩行により得られた λクローン（細い線）を用いて、太い直線で示した染色体領域について相補性試験を行った。 XS F 1 8は、欠失を含むクローンであることが分かったので、その欠失部分は点線で示した。

図 6は、 X S G 1 6由来の 1 5. 7 k b (実施例 1 0 ) 及び X S F 1 8由来の 16. 2 k b断片（実施例 8) を用いた相補性試験の結果を示す。 XS G 1 6由来の 1 5. 7 k bでは稔性が回復し、稲穂がたれている。

図 7は、 R f — 1遺伝子構造の模式図を示す。白棒部分および黒線部分は、それぞれェキソンおよびイントロンを示す。ェキソン部分については、塩基対数を示してある。

図 8は、相補性試験を行った I R 24ゲノム断片、 c DNAライブラリ一スクリーニングに用いたプローブ及び単離した c DNAから推定した R f - 1遺伝子の位置関係の模式図を示す。 R f — 1遺伝子の白棒部分および黒線部分は、それぞれ、ェキソンおよびイントロンを示す。ェキソン部分については、塩基対数を示してある。

発明を実施するための最良の形態

本発明者らは、まず、 R f — 1の存在部位を第 1 0染色体上の極めて狭い範囲に特定した。その結果に基づいて、 R f — 1遺伝子座の近傍に存在する P CRマ一力一を開発し、これらの PCRマ一カーが、 R f — 1遺伝子座と連鎖することを利用して、 R f _ 1遺伝子を検出する方法が見出された。具体的には、 R i— 1遺伝子座が、イネ第 1 0染色体上に存在する PC Rマーカー座 S 12564 T s p 509 I座と C 1 36 1 Mwo I座との間に座乗することを利用して、近傍に存在する新規の P CRマ一カー座の遺伝子型を調査することにより、 R f - 1遺伝子の有無の調査および R f 一 1遺伝子ホモ型個体の選抜を実施する。当該 R f — 1遺伝子を検出する方法につき、本発明者らは、平成 12年 8月 1 7日に特願 2000 - 247204として特許出願を行っている。当該出願の全内容は参考文献として本明細書に援用される。

I . 特願 2000— 247204に記載の R f - 1遺伝子座の遺伝子型を推定する方法

特願 2000— 247204は、 R f — 1遺伝子座がイネ第 1 0染色体上の R F LPマーカ一座 S 1 2564座と C 1 36 1座との間に座乗することを利用して、被検定イネ個体または種子が R f - 1遺伝子を持つか否かを識別する方法について記載している。

マーカ一

R f 一 1遺伝子座の近傍に存在する特定の領域に対して設計したプライマー対を用いて P CRを行い、その産物を特定の制限酵素で処理後電気泳動にかけると、ジャポニカ系統とィンデイカ系統との間で、異なる大きさのバンドが観察されることがある。そのような場合、インディ力系統に特徴的なバンドを R f — 1 連鎖バンドとする。本発明者らにより、 R f — 1遺伝子座は、イネ第 10染色体上に存在する P C Rマ一力一座 S 12564 T s p 509 I座と C 136 1 Mwo I座との間に座乗することが明らかにされ、その周辺での P C Rマ一カーは当業者が適宜開発して使用可能となった。

例えば、下記の群から選択される PCR ーカ一の少なくとも 1個を被検体ィネのゲノム中に存在するか否か検出することにより、被検定個体がこれらの PC Rマーカーと連鎖する R f 一 1遺伝子を持つか否かを識別する：

(1) マーカ一 1 ：配列番号 1および配列番号 2の配列を有する DNAをプライマ一として用いてゲノミック PCRを行い、得られた産物中の、制限酵素 E c oR I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のイネの間の多型を検出する、 PCRマーカー R 1 877 E c o R I ；

(2) マーカ一 2 ：配列番号 3および配列番号 4の配列を有する DN Aをプライマーとして用いてゲノミック PCRを行い、得られた産物中の、制限酵素 H i nd i I I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のイネの間の多型を検出する、 P CRマーカー G4003 H i n d i I I (配列番号 1 9) ；

(3) マーカー 3 ：配列番号 5および配列番号 6の配列を有する DN Aをプライマーとして用いてゲノミック P C Rを行い、得られた産物中の、制限酵素 Mwo I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のイネの間の多型を検出する、？じ尺マ一カ一〇 136 1 Mwo I (配列番号 2

0) ；

(4) マーカー 4 ：配列番号 7および配列番号 8の配列を有する DNAをプライマ一として用いてゲノミック PC Rを行い、得られた産物中の、制限酵素 Mwo I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のイネの間の多型を検出する、？じ尺マ一カ一021 55 Mwo I (配列番号 2

1) ；

(5) マーカー 5 ：配列番号 9および配列番号 1 0の配列を有する DNA をプライマーとして用いてゲノミック PCRを行い、得られた産物中の、制限酵素 M s p I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のイネの間の多型を検出する、 PCRマーカ一 G29 1 M s p I (配列番号 2

2) ；

(6) マーカー 6 ：配列番号 1 1および配列番号 1 2の配列を有する DN Aをプライマーとして用いてゲノミック PCRを行い、得られた産物中の、制限酵素 B s 1 I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のィネの間の多型を検出する、 PCRマーカ一 R 2303 B s 1 I (配列番号 2

3) ；

(7) マーカ一 7 ：配列番号 1 3および配列番号 14の配列を有する DN Aをプライマーとして用いてゲノミック PC Rを行い、得られた産物中の、制限酵素 B s t U I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のイネの間の多型を検出する、 P C Rマーカー S 1 00 1 9 B s t U I (配列番号 24) ；

(8) マーカー 8 ：配列番号 1 5および配列番号 1 6の配列を有する DN Aをプライマ一として用いてゲノミック PCRを行い、得られた産物中の、制限酵素 Kpn I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とインディ力系統のィネの間の多型を検出する、 P C Rマーカ一 S 1 0602 Κρ η I (配列番号 25) ；および

(9) マーカー 9 ：配列番号 17および配列番号 1 8の配列を有する DN Αをプライマーとして用いてゲノミック PCRを行い、得られた産物中の、制限酵素 T s p 509 I認識部位の有無に基づいて、ジャポニカ系統とィンデイカ系統のイネの間の多型を検出する、 P C Rマ一カー S 1 2 564 T s p 509 I (配列番号 26) 。

なお、上記 PC Rマーカーは、 R f — 1遺伝子座が、イネ第 10染色体上の 9 個の RFLPマーカ一領域 R 1 877、 G29 1、 R 2303、 S 1 2564, C 1 36 1、 S 1 001 9、 G4003、 S 1 0602 > および G 2 1 55付近に座乗する可能性が高いと考え（F u k u t a e t a に 1992, J p n J . B r e e d. 42 (s u p l . l) 164— 165による R F L P連鎖解析結果、および H a r u s h i ma e t a 1 - 1 99 8， Ge n e t i c s 148 479— 494によるイネ R F L P連鎖地図を参照）、これらの RFLPマ一カーを、後記参考例 1に記載するようにして、共優性 P CRマ一カーである CAP Sマーカ一または d CAP Sマーカ一 (M i c h a e l s a n d Am a s i n o 1 998, Th e P 1 a n t J o u r n a l 14 (3) 38 1 - 385 ； N e f f e t a 1. 1 998, Th e p l an t J o u r n a l 14 (3) 38 7 - 392 ) に変換した。この変換により、上記 P CRマーカーが得られた。これらの P C Rマーカーのうち、 PCRマーカー R 1 877 E c oR I、 G 29 1 M s p I (配列番号 22) 、 R 2303 B s l l (配列番号 2 3) および S 12 564 T s p 509 I (配列番号 26) からなる群と、 P CRマーカ一 C 1 36 1 Mwo I (配列番号 20) 、 S 1 00 19 B s t U I (配列番号 24) 、 G4003 H i n d l l l (配列番号 1 9) 、 S I 0602 K p n I (配列番号 25 ) 、および G 2 1 55 Mwo I (配列番号 2 1) からなる群とは、第 1 0染色体上で R f — 1遺伝子座を挾んで反対側に存在する。

従って、一態様において、（a) PCRマ一カー R 1 877 Ec o R I、 G 29 1 Ms p I、 R2303 B s 1 Iおよび S 1 2564 T s p 5 0 9 Iからなる群から選択される少なくとも 1個の P C Rマーカー、並びに（b) P C Rマ一力一 C 1 361 Mwo I、 S 1 00 1 9 B s t U I、 G400 3 H i n d i I K S 10602 Kp n l、および G 2 1 5 5 Mwo I からなる群から選択される少なくとも 1個の P CRマ一カーにより R f — 1連鎖バンドを検出することにより、 R f — 1遺伝子の存在を検出する。その際、上記 (a) の群から R f — 1遺伝子に最も近いマーカーとして、少なくとも PCRマ —カー S 1 2564 T s p 509 Iおよび上記（b) の群から少なくとも C 1 36 1 Mwo Iを使用することが好ましい。被検定イネのゲノム中に、

(a) の P CRマーカ一による R f — 1連鎖バンドと（b) の PCRマ一力一による R f — 1連鎖バンドの両方が検出されれば、そのイネが R f 一 1遺伝子を有する可能性を高い確率で推定することができる。

別の態様においては、上記（a) の群から少なくとも二つの PCRマーカー、及び（b) の群から少なくとも二つの PCRマーカ一により R f — 1連鎖バンドを検出する。例えば、（a) 及び（b) の群のマ一カーのうち、図 1に示す遺伝子地図において、 R f - 1遺伝子により近いマーカ一により R f — 1連鎖バンドが検出され、それより R f 一 1遺伝子から遠いマーカーにより R f 一 1連鎖バンドが検出されないイネ個体を選抜することにより、 R f 一 1遺伝子を有するが、不要な遺伝子領域をできるだけ含まないイネを選抜することが可能である。この場合も、（a) 及び（b) の各群のマーカ一のうち少なくとも一つは、それぞれ P C Rマーカー S 1 2 564 T s p 509 Iおよび C 1 361 Mwo lであることが好ましい。すなわち、 2種の P C Rマ一カー座 S 12564 T s P 509 Iと C 1 36 1 Mw o Iは、マーカ一座間距離にして 0. 3 c M離れている。この性質を利用することにより、 R f _ 1遺伝子ドナー親から導入する染色体領域を 1 cM程度に狭めることができる。その結果、ドナー親の R f — 1遺伝子近傍に存在する可能性がある劣悪遺伝子が回復系統に導入される可能性を最小限に抑えることができる。

R f 一 1遺伝子の検出

被検定イネゲノム中の R f - 1遺伝子を検出するには、上記配列番号 1一 1 8 のプライマ一を用いて、被検定イネゲノムから上記 P C Rマ一カーのいずれかを P CRで増幅させ、ポリメラーゼ連鎖反応—制限酵素断片長多型（PCR— RF L P) 法で検出する。 P CR— RFLP法は、比較する品種系統間において、 P CRにより増幅した DN A断片配列中の制限酵素認識部位に多型が存在する場合に、その制限酵素による切断パターンからいずれの型であるかを簡便に決定する方法である（D. E. Ha r r y, e t a 1. ， Th e o r A p p 1 Ge n e t ( 1 998) 97 : 327— 336) 。

制限酵素による切断パターンとしては、可視化されたゲル上に、使用したブライマ一対に応じて、以下の表 1のようなバンドの存在の有無が確認される。

表 1 検出されるバンドのおおよそのサイズ（b p) プライマー対 1によるマーカ一 1の検出（R1877 EcoRI)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 1500及び 1700 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 1500、 1700及び 3200 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 3200 プライマー対 2によるマーカ一 2の検出（G4003 Hindlll)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 362

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 95、 267及び 362 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 95及び 267 プライマ一対 3によるマ一カー 3の検出（C1361 Mwol)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 50及び 107 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 25、 50、 79及び 107 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 25、 50及び 79 プライマー対 4によるマーカー 4の検出（G2155 Mwol)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 25、 27及び 78 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 25、 27、 78及び 105 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 25及び 105. プライマー対 5によるマーカー 5の検出（G291 Mspl)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 25、 49及び 55 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 25、 49、 55及び 104 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 25及び 104 プライマー対 6によるマーカー 6の検出（R2303 Bsll)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 238、 655及び 679 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 238、 655、 679

及び 1334

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 238及び 1334 プライマ一対 7によるマーカ一 7の検出（S10019 BstUI)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 130、 218及び 244 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 130、 218、 244

及び 462

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 130及び 462 プライマ一対 8によるマーカ一 8の検出（S10602 Kpnl) 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 724

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 117、 607及び 724 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 117及び 607 プライマー対 9によるマーカ一 9の検出（S12564 Tsp509I)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をホモに有する場合： 41及び 117

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子をへテロに有する場合： 26、 41、 91及び 117 被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を持たない場合： 26、 41及び 91

I I . R f - 1遺伝子座領域の特定

以上、特願 2000 - 247204において、 R f — 1遺伝子座が DNAマ一力一座 S 1 2564 T s p 509 Iと C 1 361 Mwo l座との間に座乗することが本発明者らにより明らかにされ、これを利用した RFLP— PCR用マ —力一が記載されている。 R f ― 1遺伝子を持たない通常のジャポニカ品種に、戻し交雑により R f — 1遺伝子を導入することにより回復系統が育成される。その過程で、特願 2000— 247204に記載の R f 一 1遺伝子座の識別方法を用いると、回復系統の育成が効率的（必要期間は 2〜3年）になるだけでなく、導入断片長を制御することができる。

しかしながら、交雑による導入では、 R f — 1極近傍領域をも同時に導入することは避けられない。特願 2000 - 247204において、 R f — 1遺伝子座が DNAマ一カー座 S 1 2564 T s p 509 Iと C 136 1 Mwo l座との間に座乗することが解明されたが、両遺伝子座は約 0. 3 cM、即ち約 9 O k b pである。仮に R f — 1極近傍に劣悪遺伝子が存在すれば、 R f — 1遺伝子ともにその劣悪遺伝子も導入される可能性が否定できない。

そこで、本発明者らは DN Aマーカー座 S 1 2564 T s p 509 Iと C 1 36 1 Mwo I座の間の領域について、 R f — 1遺伝子座と DNAマーカー座 S 1 2564 T s p 509 I とが密接連鎖することを手がかりに、染色体歩行および遺伝学的解析を行うことにより、 R f 一 1遺伝子と連鎖する領域を調べた。その結果、 R f - 1遺伝子を含む R f - 1遺伝子座領域を約 76 k bまで特定し、そして当該領域の全塩基配列を決定することに成功した。本発明により、 BT型雄性不稔細胞質に対する稔性回復遺伝子の機能を遺伝子工学的に導入することが可能となった。

具体的には、特願 2000— 247204では、 M Sコシヒカリに M S— F R コシヒカリ（R f — 1座へテロ）の花粉をかけて作成した集団 1 042個体を用いて連鎖分析を行い、 R f — 1座と S 1 2564 T s p 509 I座との間での組換え個体を 1個体、 R f — 1座と C 1 36 1 Mwo I座との間での組換え個体を 2個体見出した（本明細書中の参考例 1一 2) 。本発明では、上記集団をさらに 4 1 03個体追加し、合計 5 145個体として解析を行った。その結果、新たに、 R f — 1座と S 1 2564 T s p 509 I座との間での組換え個体を 1 個体、 R f — 1座と C 1 36 1 Mwo I座との間での組換え個体を 6個体見出し、それぞれの組換え個体の合計を 2個体および 8個体とした。これら 1 0個体を R f 一 1座極近傍組換え個体として、本発明の高精度分離分析に供試することとした（実施例 1) 。

R f — 1座と S 12564 T s p 509 I座との間での組換え個体が 2個体に対し、 C 1 36 1 Mwo I座との間での組換え個体が 8個体という上記の組換え個体出現頻度は、 S 12 564 T s p 509 I座と C 1 361 Mwo I 座とを比較すると、 S 1 2564 T s p 509 I座のほうが遺伝学的に R f _ 1座に近いことを意味する。遺伝的距離（組換え価 CMが単位）と物理的距離

(塩基対数 b pが単位）とは必ずしも比例しないが、通常は遺伝的距離が短ければ物理的距離も短いと期待できる。

そこで、 S 12 564 T s p 509 I座を起点に染色体歩行を行うことにより、 R f — 1座を単離することとした（実施例 2) 。染色体歩行には、インディ力品種 I R 24およびジャポニカ品種あそみのりのゲノム DNAを用いて λ D ASH I Iベクタ一により作成したゲノミックライブラリーを供試した。 I R 24は尺 — 1保有品種、あそみのりは R f — 1非保有品種である。染色体歩行を進めた結果、 I R24のゲノミッククローンにより約 76 k bの染色体領域をカバーするコンティグ（複数のクローンを重複部分で重ね合わせて染色上での順に整列化したもの）を作成することができ、その全塩基配列（76363 b p) を決定した。

次いで、得られた塩基配列情報等を利用することにより、新たに 1 2個のマ一カーを開発し、既述の R f — 1座極近傍組換え個体 1 0個体を用いて、高精度分離分析を行った（実施例 3) 。その結果、上記の約 7 6 k bの染色体領域に含まれる 65 k bの配列が R f - 1遺伝子の機能の有無を決定する配列を包含することが示された。この領域は、 8個のゲノミッククローンから構成されるコンティグによりカバーされている。各クローンの長さは、約 1 2〜22 k bであり少なくとも 4. 7 k bの重複部を持つ。一方、イネの遺伝子の長さについては、短いものから長いものまであることが知られているが、大部分の遺伝子は数 k b以内であると考えられる。そのため、これら 8個のゲノミッククローンのうち、少なくともひとつは完全長の R f 一 1遺伝子を包含すると予測される。

本発明者らはさらに、上記 76 kbの染色体領域のうち、 R f — 1遺伝子領域をさらに絞り込むと共に、稔性回復能の存在を直接的に証明するために、相補性試験を行った。

具体的には、雄性不稔系統である MSコシヒカリの未熟種子に、上記 76 kb 領域内の 1 0個の部分断片（各 10〜2 1 kb) を、別々に遺伝子工学的に導入した（図 5) 。使用された 1 0個の部分断片のうち、 8個は先に染色体歩行で得られた 8個のゲノミッククローン（図 1、実施例 3に記載の XS E 1、 XS E 7、 XS F 4、 XS F 20、 XSG22、 XSG 16、 X S G 8及び X S H 1 8) に由来するものである。これらに加えて、さらに 2個のクローン XS F 18 および X S X 1に由来する断片についても相補性試験を行った。 XS F 1 8は X S F 20と 5 ' 末端及び 3 ' 末端（各々、配列番号 27の塩基 20328及び 4 1 92 1) が同一だが、途中の塩基 33947 - 3859 1を欠いている。これは、最初にクローン XS F 1 8が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、 XS F 20と命名したことに因る（実施例 8) 。また、 XSX 1 は、クローン XS G 8と XSH 18の重複部分がやや小さいため（約 7 k b) 、制限酵素処理およびィゲーシヨンにより両クローンから、重複部分を十分に含むようなクローンを新たに作成したものである（実施例 1 3) 。

R f - 1は優性遺伝子であるので、導入した断片が R f 一 1遺伝子を完全に包含している場合には、形質転換植物当代において稔性が回復する。相補性試験において、各断片について形質転換植物の種子稔性調査を行い、 λファージクローン X S G 1 6に由来する 1 5. 6 k b断片（配列番号 27の塩基 38 538 - 5 41 23を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（実施例 1 0) 。他の断片については、形質転換植物はすべて不稔であった。これらの結果から、上記 1 5. 6 k b断片が R f — 1遺伝子を完全に包含していることが示された。さらに、本発明により、 R f — 1遺伝子を遺伝子工学的に導入する方法が提供され、その有効性が実証された。

本発明者は、 λファージクローン XSG 1 6のどの部分が R f 一 1遺伝子を含むかをさらに特定するために、前述の 1 5. 6 k b断片（配列番号 27の塩基 3 8538 - 541 23を含む）よりも短い断片について相補性試験による種子稔性調査を行った。その結果、 XS G 1 6に由来する 1 1. 4 kb断片（配列番号 27の塩基 423 57 - 53743を含む）を導入した形質転換体において、種子稔性が回復していることが見出された（実施例 10 (2) ) 。さらに、より短い 6. 8 k b斬片（配列番号 27の塩基 42 1 32— 48883を含む）を導入した形質転換体においても、種子稔性が回復した（実施例 10 (3) ) 。これらの結果から、上記 6. 8 k b断片が R f — 1遺伝子を包含していることが示された。

本発明者らは、さらに研究をすすめ、稔性回復機能を有する核酸を特定し、それによってコードされるアミノ酸配列も明らかとなった。具体的には、実施例 1 4- 1 5に記載したように、先ず、配列番号 27の 43733— 44038及び 48306— 50226に相当する DNA断片を P C Rを用いて作成した。これらの 2種の断片をプローブ（プローブ P及び Q) として、コシヒカリに R f — 1 を導入した系統より作成した c DNAをライブラリ一をスクリーニングした。その結果、 6個のクローンの末端塩基配列が XS G 1 6の配列と一致し、 R f — 1 遺伝子を含むクローンとして単離され、塩基配列が解析された（配列番号 69— 74) 。

配列番号 69 - 74のいずれの配列も、配列番号 7 5のアミノ酸配列 1一 79 1を持つタンパク質をコードする。具体的には、各々配列番号 69の塩基 2 1 5 — 2587、配列番号 70の塩基 21 3— 2585、配列番号 7 1の塩基 2 1 8

— 2590、配列番号 72の塩基 208— 2580、配列番号 73の塩基 149

- 252 1及び配列番号 74の塩基 225— 2597が、いずれも配列番号 7 5 のアミノ酸配列 1— 79 1をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 27の塩基 43 907 -46279に対応する。

配列番号 75のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（R f 2) の推定アミノ酸配列（Cu i e t a 1. , 1 996 ) と比較したところ、 N末端の 7ァミノ酸残基（Me t - A 1 a -A r g - A r g - A 1 a -A 1 a - S e r ) がー致した。これら 7アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（L i u e t a 1. , 2001) 。これらのことから、今回単離した c DNAは R f — 1遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネ R f — 1とトウモロコシ R f 2とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。

また、今回単離した c DN Aの配列を I R 24のゲノム配列（配列番号 27 ) と比較し、 R f — 1遺伝子のェキソンとイントロンの構造を明らかにした（図 7 ) 。その結果、植物体內において、スプライシング様式およびポリ A付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。 R f - 1遺伝子のコ

—ド領域内には、イントロンは介在しない。

本発明者は、実施例 1 0 (3) の相補性実験で種子稔性を回復した 6. 8 k b 断片について、さらに相補性実験を行った。具体的には、実施例 16において、前記 6. 8 k b断片中の R f — 1遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2 k b断片（配列番号 27の塩基 42 1 32— 463 1 8) を用いて、相補性実験を行ったところ、種子稔性が回復した。

さらに、実施例 1 7において稔性回復機能を有する核酸を含むクローンを新たに 6個取得した。具体的には、先ず、配列番号 27の塩基 45522 -4554 5及び 45955 -459 32に相当する 2種類のプライマ一を用いて、 I R 2 4のゲノミッククローン XSG 16をテンプレートに PC Rを行い、 DNA断片を得た。当該 DNA断片をプローブ Rとして、前記プローブ Pとともにプラークハイプリダイゼ一ションを行なった。プローブ Pおよびプローブ Rのどちらでも陽性を示すプラークから、新たに 6個のクローンを得た（# 7— # 1 2) 。その結果を配列番号 80 - 85に示す。

配列番号 80 - 85のいずれの配列も、配列番号 7 5のアミノ酸配列 1— 7 9 1を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号 80 の塩基 229— 260 1、配列番号 8 1の塩基 1 75— 2547、配列番号 82 の塩基 227— 2 59 9、配列番号 83の塩基 220— 2592、配列番号 84 の塩基 174— 2 546及び配列番号 85の塩基 90— 2462が、いずれも配列番号 75のアミノ酸配列 1一 791をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 27の塩基 43907 -46279に対応する。

今回単離した c DN Aの配列を I R 24のゲノム配列（特願 200 1 - 285 247配列番号 27) と比較することにより、ヱキソンとイントロンの構造が明らかになつた（図 8) 。今回単離した c DNAのなかには、予想翻訳領域とは関係のないェキソンを含まず、単一ェキソンからなるものも 3個存在した（# 1 0 — # 1 2、配列番号 8 3— 85) 。

I I I . R f - 1遺伝子座を含む核酸

本発明は、稔性回復遺伝子（R f — 1) 座を含む核酸を提供する。

本発明の稔性回復遺伝子（R f — l) 座を含む核酸は、配列番号 27の塩基配列を有する核酸、又は配列番号 27の塩基配列と少なくとも 70 %同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸を含む。さらに、実施例 10に記載したように、配列番号 27の塩基配列のうち、特に塩基 38538— 54123に R f 一 1遺伝子が完全に含まれていると確認された。 R f — 1遺伝子を含む領域はさらに、好ましくは、配列番号 27の塩基 38 538— 54123、より好ましくは、塩基 423 57— 53743、さらに好ましくは、塩基 42 1 32— 48 8 83、さらにより好ましくは塩基 42 132 -463 1 8と特定された。本発明者らはさらに、研究を進め、 R f — 1遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。

a ) 配列番号 6 9の塩基 2 1 5— 2 58 7、

b ) 配列番号 7 0の塩基 2 1 3— 2 5 8 5、

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2 5 9 0、

d ) 配列番号 Ί 2の塩基 20 8— 2 58 0、

e ) 配列番号 7 3の塩基 149— 2 52 1、

f ) 配列番号 74の塩基 22 5— 2 5 9 7、

h ) 配列番号 8 0の塩基 22 9— 26 0 1、

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2 547、

j ) 配列番号 8 2の塩基 22 7— 2 5 9 9、

k ) 配列番号 8 3の塩基 22 0— 2 5 9 2、

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546及び

m) 配列番号 8 5の塩基 90— 246 2。

上記塩基配列は、 g) 配列番号 2 7の塩基 43 90 7 - 46 2 79に対応し、そして、いずれも配列番号 75のアミノ酸配列 1一 7 9 1をコードする。

以下、本明細書中、文脈により「配列番号 2 7の塩基配列」という用語は、配列番号 2 7全体、あるいは、その一部であって稔性回復機能に関与する部分、特に、塩基 38 5 3 8- 54 1 2 3を示す。より好ましくは、塩基 42 3 5 7 - 5 3 74 3、さらに好ましくは、塩基 42 1 32—48 88 3、さらにより好ましくは塩基 42 1 32 - 46 3 1 8を示す。そして、特に好ましくは、 g) 配列番号 2 7の塩基 43 90 7—46 2 7 9、あるいは、これに対応する、 a) 配列番号 6 9の塩基 2 1 5— 2 587、 b) 配列番号 Ί 0の塩基 2 1 3— 2 58 5、 c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2 5 9 0、 d) 配列番号 Ί 2の塩基 208 - 2 5 8 0、 e) 配列番号 7 3の塩基 149一 2 5 2 1、 f ) 配列番号 74の塩基 2 2 5— 2 5 9 7、 h) 配列番号 8 0の塩基 22 9— 2 60 1、 i ) 配列番号 8 1 の塩基 1 7 5— 2 547、 j ) 配列番号 8 2の塩基 2 27— 2 5 9 9、 k ) 配列番号 8 3の塩基 220— 2 59 2、 1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546又は m) 配列番号 8 5の塩基 90 - 246 2のいずれかを示す。後述する実施例では、稔性回復遺伝子（R f — l) を含む核酸として、 R f _ 1遺伝子を含むインディ力米の I R 24のゲノムライブラリーより核酸が単離され、配列番号 27の塩基配列が決定された。しかしながら、本発明の、稔性回復遺伝子（R f — l) を含む核酸の由来は、 R f — 1遺伝子を有するインディ力型品種由来のものであれば特に限定されない。 R f — 1遺伝子を有するインディ力型品種は、特に限定されず、例えば、 I R 24、 I R 8、 I R 36、 I R 64、 Ch i n s u r ah、 B o r o l Iが含まれる。 R f ― 1遺伝子を有しないジャポニカ型品種としては、例えば、限定されるわけではないが、あそみのり、コシヒカリ、きらら 397、アキヒカリ、あきたこまち、ササニシキ、キヌヒカリ、日本晴、初星、黄金晴、ヒノヒカリ、ミネアサヒ、あいちのかおり、ハツシモ、ァケポノ、フジヒカリ、峰の雪もち、ココノエモチ、ふくひびき、どんとこい、五百万石、ハナエチゼン、トドロキヮセ、はえぬき、どまんなか、ャマヒカリ等が知られている。「インディ力型品種」も「ジャポニカ型品種」も当業者に周知であり、当業者はどのようなイネ品種が本発明の対象となり得るか容易に判断できる。

本発明の核酸は、一本鎖および二本鎖型両方の DNAと共に、その RNA相補体も含む。 DNAには、例えば、ゲノム DNA (その対応する c DNAも含む）、化学的に合成された DNA、 PCRにより増幅された DNA、およびそれらの組み合わせが含まれる。

本発明の R f — 1遺伝子を含む核酸は、好ましくは配列番号 27の塩基配列を有する。 1つ以上のコドンが同一のアミノ酸をコードする場合があり、遺伝暗号の縮重と呼ばれている。このため、配列番号 27と完全には一致していない DN A配列が、配列番号 27と全く同一のァミノ酸配列を有する夕ンパク質をコードすることがあり得る。こうした変異体 DN A配列は、サイレント（s i 1 e n t) 突然変異（例えば、 PCR増幅中に発生する）から生じてもよいし、または天然配列の意図的な突然変異誘発の産物であつてもよい。

本発明の R f 一 1遺伝子は、好ましくは配列番号 75に記載のアミノ酸配列をコードする。しかしながら、これに限定されることなく、 1またはそれ以上のァミノ酸配列が欠失、付加または置換しているアミノ酸配列を有していてもよい。、稔性回復機能を有する限り、全ての相同タンパク質を含むことが意図される。

「アミノ酸変異」は 1から複数個、好ましくは、 1ないし 20個、より好ましくは 1ないし 1 0個、最も好ましくは 1ないし 5個である。 R f — 1遺伝子にコ一ドされるアミノ酸配列は、配列番号 75に記載のアミノ酸配列と、少なくとも約 70 %、好ましくは約 80%以上、より好ましくは 90 %以上、さらに好ましくは 95%以上、最も好ましくは 98 %以上の同一性を有する。

ァミノ酸の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算により決定してもよい。あるいは、 2つのタンパク質配列の同一性パーセントは、 Ne e d I em an, S . B. 及び W u n s c h , C. D. (J . M o 1. B i o l . ， 48 : 443 - 453, 1 970) のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（UWGCG) より入手可能な GAPコンビュ一タープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。 GA Pプログラムの好ましいデフォルトパラメ一ターには：（l) He n i k o f f , S及び He n i k o f f , J . G. (P r o c. a t l . Ac a d. S c i . USA, 89 : 109 15 - 1 09 1 9, 1992) に記載されるような、スコアリング ·マトリックス、 b l o s um62 ; (2) 12のギャップ加重； (3) 4のギャップ長加重；及び（4) 末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。

当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。同一性のパーセントは、例えば A l t s c h u l ら（Nu c l . Ac i d s . Re s . 25. ， p. 3389 - 3402, 1 997) に記載されている B L A S T プログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プロダラムは、ィン夕一ネット上で N a t i o n a 1 C e n t e r f o r B i o t e c hn o l o g y I n f o r m a t i o n (N C B I ) 、あるいは DNA D a t a B an k o f J a p a n (DDB J) のウェブサイトから利用することが可能である。 BLASTプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメータ一）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。同一の機能を有するタンパク質であっても、由来する品種の相違によって、そのアミノ酸配列に相違が存在しうることは当業者にとって周知の事実である。本発明の R f — 1遺伝子は、稔性回復機能を有する限り、配列番号 27の塩基配列のこのような相同体、変異体も含みうる。「稔性回復機能を有する」とは、当該 DN A断片が導入された場合に、イネ個体又は種子に稔性を付与することを意味する。稔性回復は、 R f _ 1遺伝子よりタンパク質が発現されることに因ってもよく、あるいは R f _ 1遺伝子の核酸（DNA又はRNA) 自体が稔性の付与に何らかの機能をしていてもよい。

限定されるわけではないが、 R f — 1遺伝子の相同体、変異体が稔性回復機能を有するか否かは、例えば、以下のように調べることが可能である。 MSコシヒカリ（不稔系統）にコシヒカリの花粉をかけることにより得た未熟種子を供試して、 H i e i e t a 1 (P l a n t J o u r n a l ( 1 9 94) , 6

(2) , p. 27 2 - 28 2) の方法に従い、被検定核酸断片を導入する。得られた形質転換体を通常の条件で栽培すると、被検定核酸断片が稔性回復機能を有する場合にのみ、種子が稔る。

R f 一 1遺伝子を有しないジャポニカ型のあそみのりの対応する領域に由来する核酸は、配列番号 28に示した塩基配列を有する。配列番号 2 8と配列番号 2 7の対応する部分は、全体として約 98 %の同一性を有する。よって、本発明の稔性回復遺伝子（R f — 1) 座を含む核酸は、配列番号 27と少なくとも約 7 0 %、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは 9 0 %以上、さらに好ましくは 9 5 %以上、最も好ましくは 98 %以上の同一性を有する。「配列番号 2 7 J は、特に好ましくは、 g) 配列番号 27の塩基 43 9 0 7— 46 2 7 9、あるいは、これに対応する、 a) 配列番号 69の塩基 2 1 5— 2 5 87、 b) 配列番号 7 0の塩基 2 1 3— 2 58 5、 c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2 5 9 0、 d) 配列番号 7 2の塩基 2 08— 2 5 80、 e) 配列番号 Ί 3の塩基 149— 2 5 2 1、 f ) 配列番号 74の塩基 2 2 5— 2 5 9 7、 h) 配列番号 8 0の塩基 2 2 9 — 2 60 1、 i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2 54 7、 j ) 配列番号 8 2の塩基 2 27— 2 5 9 9、 k) 配列番号 8 3の塩基 2 2 0— 2 592、 1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546又は m) 配列番号 85の塩基 90— 2462のいずれかを意図する。

核酸の同一性パーセントは、視覚的検査および数学的計算により決定してもよレ。あるいは、 2つの核酸配列の同一性パーセントは、 D e v e r e u xら， Nu c 1. Ac i d s R e s . , 12 : 387 (1984) に記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピュータ一グループ（UWGCG) より入手可能な GAPコンピュータ一プログラム、バージョン 6. 0を用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。 GAPプログラムの好ましいデフォルトパラメ一ターには：（1) ヌクレオチドに関する単一（un a r y) 比較マトリックス（同一に対し 1および非同一に対し 0の値を含む）、および S c hwa r t zおよび D a y h o f f監修， A t l a s o f P r o t e i n S e q u e n c e a n d S t r u c t u r e, Na t i o n a l B i ome d i c a 1 R e s e a r c h F o un d a t i o n, p p. 353 - 358 (1 979) に記載されるような、 G r i b s k o vおよび B u r g e s s , Nu c 1. Ac i d s R e s . 14 : 6745 (1 986) の加重比較マトリックス；（2) 各ギャップに対する 3. 0のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに 0. 10のペナルティ；および（3) 末端ギャップに対するべナルティなし、が含まれる。当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。

本発明の核酸はまた、配列番号 27の塩基配列に中程度にストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸、並びに、配列番号 27の塩基配列に高度にストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズすることが可能であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸を含む。本明細書において使用されるように、中程度にストリンジェントな条件は、例えば、 DNAの長さに基づき、一般の技術を有する当業者により、容易に決定することが可能である。基本的な条件は、 S amb r o o kら， Mo l e c u l a r C 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma nu a l , 第 2版， Vo l . 1, p p. 1. 1 0 1 - 1 04, Co l d S r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s, ( 1 989) に示されている。例えば、ニトロセルロースフィルターに関し、 5 XS S C、 0. 5 %SD S、 1. OmM EDTA ( H 8. 0) の前洗浄溶液、約 40 ないし 6 0 での、 1 X S S Cないし 6 XS S C (または約 42 :での約 5 0 %ホルムアミド中の、例えばス夕一ク溶液（S t a r k ' s s o 1 u t i o n ) などの他の同様のハイブリダィゼーシヨン溶液）のハイブリダィゼーシヨン条件、および約 6 0 、 0. 5 XS S C、 0. 1 % SD Sの洗浄条件の使用が含まれる。また、例えば、ハイブリダィゼーシヨン溶液が約 5 0 %ホルムアミドを含む場合、上記ハイブリダィゼ一シヨン温度は約 1 5 ないし 20で低めとなる。非常にストリンジェントな条件もまた、例えば DNAの長さに基づき、当業者により、容易に決定することが可能である。一般に、非常にストリンジェントな条件は、上記中程度にストリンジェン卜な条件よりも、より高い温度及び Z又はより低い塩濃度でのハイブリダィゼ一シヨン、及び又は洗浄条件を含む、例えば、約 60 ないし 65ででの 0. 1 X S S Cないし 0. 2 X S S Cのハイブリダィゼ一シヨン条件、および Z又は約 6 5 ないし 68で、 0. 2 XS S C、 0. 1 % SDS の洗浄条件を含む。当業者は温度および洗浄溶液塩濃度は、プローブの長さなどの要因にしたがい、必要に応じ調整してもよいことを認識するであろう。

「配列番号 2 7」は、特に好ましくは、 g) 配列番号 2 7の塩基 43 90 7 -

46 27 9、あるいは、これに対応する、 a) 配列番号 6 9の塩基 2 1 5— 2 5 87、 b ) 配列番号 70の塩基 2 1 3— 25 8 5、 c) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2 5 90、 d) 配列番号 72の塩基 20 8— 2 580、 e) 配列番号 7 3の塩基 149一 2 5 2 1、 f ) 配列番号 Ί 4の塩基 2 2 5— 2 5 97、 h) 配列番号 8 0の塩基 2 2 9— 2 60 1、 i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2 547、 j ) 配列番号 8 2の塩基 227 - 2 59 9、 k) 配列番号 8 3の塩基 2 20— 2

59 2、 1 ) 配列番每 84の塩基 1 74— 2 546又は m) 配列番号 8 5の塩基 90— 246 2のいずれかを意図する。

同様に、本発明の DNAには、 1つまたは複数の塩基の欠失、挿入または置換のため、配列番号 2 7の塩基配列とは異なるが稔性回復機能を有する核酸を含む。稔性回復機能を有する限り、欠失、挿入または置換される塩基の数は特に制限されないが、好ましくは 1個ないし数千個、より好ましくは 1個ないし千個、さらにこのましくは 1個ないし 500個、さらにより好ましくは 1個ないし 20 0個、最も好ましくは 1個ないし 100個である。

本明細書の記載に基づいて R f - 1遺伝子がより特定され、当業者が R f 一 1 遺伝子以外の部分または R f - 1遺伝子内のイントロン部分などの核酸を除いて使用することが可能である。また、既定のアミノ酸（特に配列番号 7 5に記載のアミノ酸配列）を、例えば同様の物理化学的特性を有する残基により置換してもよい。こうした保存的置換の例には、 1つの脂肪族残基を互いに、例えば I 1 e、 V a 1、 L e u, または A 1 aを互いに置換するもの； L y sおよび A r g、 01 \1ぉょび八 3 、または G 1 nおよび A s n間といった、 1つの極性残基から別のものへの置換；あるいは芳香族残基の別のものでの置換、例えば P h e、 T r p、または Ty rを互いに置換するものが含まれる。他の保存的置換、例えば、同様の疎水性特性を有する領域全体の置換が、周知である。当業者は、周知の遺伝子工学的手法により、 S amb r o o kら， Mo l e c u l a r C 1 o n i n g ： A L a b o r a t o r y Ma nu a l，第 2版， Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y P r e s s , (1 9 89) 等に記載の、例えば部位特異的突然変異誘発法を使用して、所望の欠失、挿入または置換を施すことが可能である。

本発明者らは、 R f — 1遺伝子を有するインディ力型の I R 24 (塩基配列 2 7) と、有しないジャポニカ型のあそみのり（塩基配列 28) および Ge nB a n kに登録されている日本晴 B ACクロ一ン（ァクセッション番号 AC 0689 23) とを比較した。その結果、 R f — 1遺伝子を含むインディ力型の R f — 1 領域は少なくとも、以下の 1塩基多型（SNP) を有することを見出した。

1) 配列番号 27の塩基 1 239に相当する塩基が Aである；

2) 配列番号 27の塩基 6227に相当する塩基が Aである；

3) 配列番号 27の塩基 20680に相当する塩基が Gである

4) 配列番号 27の塩基 45461に相当する塩基が Aである

5) 配列番号 27の塩基 49609に相当する塩基が Aである

6) 配列番号 27の塩基 56368に相当する塩基が Tである

7) 配列番号 27の塩基 57629に相当する塩基が Cである；及び 8) 配列番号 27の塩基 66267に相当する塩基が Gである。

よって、本発明の R f — 1領域を含む核酸は、好ましくは上記条件 1) 一 8) の 1つないし全てを満たす。

なお、後述の実施例 3において、 R f — 1遺伝子極近傍組換え個体（RS 1— RS 2、 RC 1 -RC 8) についてその R f — 1領域の染色体構成を調べた。その結果、配列番号 27の塩基 1 239ないし 6626 7の塩基配列、即ち、最大限に見積もっても P 4497 Mb 0 I座から B 5669 1 Xb a l座までの領域（約 65 k b) (図 3) に、 R f — 1遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることが明らかにされた。ただし、 R f — 1遺伝子の一部の遺伝子型がィンデイカ型であることが、 R f — 1遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディ力型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。極端な場合、ジャポニカ ·インディ力間でコーディング領域は完全に同一で、プロモーター領域だけに差違があり、そして、プロモーター領域及びコ一ディング領域の一部のみが上記 P 4497 Mb o l座から B 5669 1 Xb a l座までの領域（約 65 k b) に含まれることもあり得る。よって、上記共有インディ力型領域（配列番号 27の塩基 1 239ないし 66267) が R f 一 1遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。しかしながら、以下の理由、

1) 遺伝子の大きさは通常数 k bであり 1 0 k bを超えることは稀である； 2) 本発明で明らかにした I R 24のゲノム塩基配列（配列番号 27) は、上記共有インディ力型領域を完全に包含する；

3) 配列番号 27の 5 ' 末端は、上記共有インディ力型領域の 5 ' 末端から 1238 b p上流に位置し、別の遺伝子（S 1 2564) の一部である；および

4) 配列番号 27の 3 ' 末端は、上記共有インディ力型領域の 3 ' 末端から 1 0096 b p下流に位置する

により、少なくとも配列番号 27は R f — 1遺伝子全体を完全に包含すると考えられる。

このように、本発明者らは、まず R f — 1遺伝子領域を 76 k bまで絞り込むことに成功した。 ' 'よって、本発明の R f — 1遺伝子領域を含む核酸は、従来技術の特開 2 0 0 0— 1 3 946 5に記載の R f - 1遺伝子からの遺伝子距離が約 1 c M (約 3 0 0 k b) ある共優性マーカー座を用いて選抜した場合よりも、 R f — 1遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子を含む可能性が格段に低い。さらに、本発明者らの先の特願 200 0 - 247 2 04に記載の DN Aマ一力一座 S 1 2 5 64 T s p 50 9 Iと C 1 3 6 1 Mw o I座（両遺伝子座の距離は約 0. 3 c M) を用いて選抜した場合よりも他の遺伝子を含む可能性が低い。

さらに、本発明者らは相補性試験を行うことにより、配列番号 27の塩基配列のうち、特に塩基 38 53 8— 54 1 2 3に R f — 1遺伝子が完全に含まれていることを確認した。よって、本発明の一態様において、配列番号 27の塩基配列又は配列番号 2 7の塩基 3 85 38— 54 1 2 3の塩基配列と、少なくとも 7 0 %同一の塩基配列は、以下の条件 1) 及び 2) の少なくとも一つを満たす：

1) 配列番号 2 7の塩基 4546 1に相当する塩基が Aである；及び

2) 配列番号 2 7の塩基 4960 9に相当する塩基が Aである。

本発明者らはさらに、 R f - 1遺伝子を含む核酸として以下の領域を特定した。

a ) 配列番号 6 9の塩基 2 1 5— 2 58 7、

b ) 配列番号 7 0の塩基 2 1 3— 2 58 5、

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2 5 9 0、

d ) 配列番号 7 2の塩基 20 8— 2 58 0、

e ) 配列番号 Ί 3の塩基 149— 2 52 1、

f ) 配列番号 74の塩基 22 5— 2 59 7、

h ) 配列番号 8 0の塩基 22 9— 2 6 0 1、

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2 547、

j ) 配列番号 8 2の塩基 22 7— 2 5 9 9、

k) 配列番号 8 3の塩基 220 _ 2 5 9 2、

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546、及び

m) 配列番号 8 5の塩基 90— 246 2。

上記塩基配列は、 g) 配列番号 2 7の塩基 43 90 7 -46 2 7 9に対応す . る。本発明の核酸はさらに、 n) 上記 a) -m) のいずれかの核酸と少なくとも 70 %同一であり、力つ、稔性回復機能を有する核酸；

を含む。

,上記の配列番号 27の塩基 4546 1は、 1) 配列番号 69の塩基 1 769 ; 2 ) 配列番号 70の塩基 1 767 ； 3 ) 配列番号 7 1の塩基 1 7 72 ； 4 ) 配列番号 72の塩基 1762 ； 5) 配列番号 73の塩基 1 703 ； 6 ) 配列番号 74 の塩基 1 779 ； 7 ) 配列番号 80の塩基 1783 ； 8 ) 配列番号 8 1の塩基 1 729 ； 9) 配列番号 82の塩基 1 78 1 : 10) 配列番号 8 3の塩基 1 77 4 ； 1 1 ) 配列番号 84の塩基 1 728 ；及び 12 ) 配列番号 85の塩基 1 64 4に相当する。よって、特に好ましくは、本発明の方法に使用する核酸は、好ましくは、以下の条件 1) — 12) の少なくとも一つを満たす：

1) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基が Aである

2) 配列番号 70の塩基 1 767に相当する塩基が Aである

3) 配列番号 7 1の塩基 1 772に相当する塩基が Aである

4) 配列番号 72の塩基 1 762に相当する塩基が Aである

5) 配列番号 73の塩基 1 703に相当する塩基が Aである

6) 配列番号 74の塩基 1 779に相当する塩基が Aである

7) 配列番号 80の塩基 1 783に相当する塩基が Aである

8) 配列番号 8 1の塩基 1 729に相当する塩基が Aである

9) 配列番号 82の塩基 1 78 1に相当する塩基が Aである

1 0) 配列番号 83の塩基 1 774に相当する塩基が Aである；

1 1 ) 配列番号 84の塩基 1 728に相当する塩基が Aである；又は

1 2) 配列番号 85の塩基 1 644に相当する塩基が Aである。

I V. 一イネの捻性の回復方法本発明は、配列番号 27の塩基配列を有する核酸、又は配列番号 27の塩基配列と少なくとも 70 %同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸をィネに導入することにより、イネの稔性を回復する方法を提供する。本発明の方法はまた、配列番号 27の一部、特に、配列番号 27の塩基 38538— 54 1 2 3、好ましくは、塩基 42357— 53743、より好ましくは、塩基 42 1 3 2 - 48883の塩基配列を有する核酸、又は配列番号 27の塩基 38538 - 541 2 3、好ましくは、塩基 42357— 53743、より好ましくは、塩基 42 1 32—48883、さらにより好ましくは塩基 42 1 32— 463 1 8の塩基配列と少なくとも 70 %同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入してもよい。

本発明の方法は特に好ましくは、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入する。最も好ましくは、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸は、以下の a) — p) の核酸から選択される：

a ) 配列番号 69の塩基 2 1 5— 2587を含む核酸

b ) 配列番号 70の塩基 2 1 3— 2585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 18— 2590を含む核酸

d ) 配列番号 72の塩基 208— 2580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149— 252 1を含む核酸

f ) 配列番号 74の塩基 225— 2597を含む核酸

g ) 配列番号 27の塩基 43907— 46279を含む核酸；

h ) 配列番号 80の塩基 229— 260 1を含む核酸

ί ) 配列番号 8 1の塩基 1 75— 2547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2599を含む核酸

k ) 配列番号 83の塩基 220— 2592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸； n ) 上記 a ) — m) のいずれかの核酸と少なくとも 7 0 %同一であり、かつ、稔性回復機能を有する核酸；

o ) 上記 a ) — m) のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び

p ) 上記 a ) - m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。

本発明において、イネに導入されうる稔性回復遺伝子（R f — 1 ) 座を含む核酸は、先の「 I I I . R f — 1遺伝子座を含む核酸」において記載の核酸を使用しうる。核酸のイネへの導入方法は特に限定されず、公知の方法を使用することが可能である。本発明の核酸は公知の遺伝子工学的な方法によって導入しても、あるいは交配によっても導入してもよい。隣接する他の遺伝子の導入を防げる、育種年限を短縮できる、という観点より遺伝子工学的な方法の使用が好ましい。遺伝子工学的手法による形質導入のためにはいかなる適切な発現系を使用してもよい。組換え発現ベクターは、適切な転写または翻訳制御ヌクレオチド配列、例えば、哺乳動物、微生物、ウィルス、または昆虫遺伝子由来のものなどに、機能可能であるように連結されている、本発明のイネに導入されうる稔性回復遺伝子（R f — l ) を含む核酸を含む。

制御配列の例には、転写プロモーター、ォペレ一夕一、またはェンハンサ一、 m R N Aリボソーム結合部位、並びに転写および翻訳開始および終結を調節する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、制御配列が該 D N A配列に機能的に関連しているとき、機能可能であるように連結されている。したがって、プロモーターヌクレオチド配列は、該プロモーターヌクレオチド配列が D N A配列の転写を調節するならば、 D N A配列に、機能可能であるように連結されている。イネにおいて複製する能力を与える複製起点、および形質転換体を同定する選択遺伝子が、一般的に発現ベクターに取り込まれている。選択マーカ一としては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、またはカナマイシンもしくはネオマイシン、ハイグロマイシンまたはスぺクチノマイシン等の抗生物質耐性遺伝子などが例示される。さらに、必要に応じて適切なシグナルペプチド（天然または異種性）をコードする配列を、発現ベクターに取り込んでもよい。シグナルペプチド（分泌リーダ

―) の DNA配列を、インフレームで本発明の核酸配列に融合させ、 DNAがまず転写され、そして mRNAがシグナルペプチドを含む融合タンパク質に翻訳されるようにしてもよい

本発明によればまた、本発明の遺伝子を含む組換えベクターが提供される。プラスミドなどのベクタ一に本発明の遺伝子の D N A断片を組み込む方法としては、例えば、 S amb r o o k, J. ら， Mo l e c u l a r C l o n i n g， A L a b o r a t o r y Ma nu a l (2 n d e d i t i o n) , C o l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, 1. 53 (1 989) に記載の方法などが挙げられる。簡便には、市販のライゲーシヨンキット（例えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このようにして得られる組換えベクター（例えば、組換えプラスミド）は、宿主細胞であるイネに導入される。

ベクターは、簡便には当業界において入手可能な組換え用べクタ一（例えば、プラスミド DNAなど）に所望の遺伝子を常法により連結することによって調製することができる。本願発明の核酸断片を用いてイネに稔性を付与する場合には、特に、植物形質転換用べクタ一が有用である。榼物用べクタ一としては、植物細胞中で当該遺伝子を発現し、当該タンパク質を生産する能力を有するものであれば特に限定されないが、例えば、 pB I 22 1、 p B I 12 1 (以上 C 1 o n t e c h社製）、及びこれらから派生したベクターが挙げられる。また、特に単子葉植物たるイネの形質転換には、 p I G 1 2 1 Hm、 pTOK 233 (以上 H i e i ら， P l a n t J . , 6, 2 7 1 - 282 (1994) ) p S B 424 (Koma r i ら， P l an t J . ， 1 0, 165 - 174 (1 996 ) ) などが例示される。

形質転換植物は、上述のベクターの —ダルク口ニダ一ゼ（GUS) 遺伝子の部位に本願発明の核酸断片を入れ替えて植物形質転換用ベクターを構築し、これを植物に導入することで調整することができる。植物形質転換用ベクターは、少なくともプロモーター、翻訳開始コドン、所望の遺伝子（本願発明の核酸配列またはその一部）、翻訳終始コドンおよびターミネ一夕一を含んでいることが好ましい。また、シグナルペプチドをコードする DNA、ェンハンサ一配列、所望の遺伝子の 5 ' 側および 3 ' 側の非翻訳領域、選抜マーカー領域などを適宜含んでいてもよい。プロモーター、ターミネータ一は植物細胞で機能するものであれば特に限定されないが、構成的発現をするプロモーターとしては、上記べクタ一に予め組み込まれている 3 5 Sプロモーターの他に、ァクチン、ュビキチン遺伝子のプロモーターなどが例示される。

プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、一般に、 S amb r o o k, J . ら， Mo l e c u l a r C l on i n g, A L a b o r a t o r y Manu a l (2 n d e d i t i on) , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y, 1. 74 ( 1 989) に記載のリン酸カルシウム法または塩化カルシウム/塩化ルビジウム法、エレクト口ポレーシヨン法、エレクトロインジェクション法、 PEGなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用いる方法などが挙げられる。植物細胞の場合は、例えばリーフディスク法 [S c i e n c e, 227, 1 29 ( 1 985) ] 、エレクト口ポレーシヨン法 [Na t u r e, 3 1 9, 79 1 ( 1986) ] によって形質転換することがでさる。

特に植物への遺伝子導入法としては、ァグロパクテリゥムを用いる方法（Ho r s c h e t a 1. , S c i e n c e, 227, 129 (198 5) 、 H i e i e t a 1. , P l an t J . , 6， 27 1 - 282 ( 1 99 4) ) 、エレクトロボレ一ション法（F r omm e t a 1. ， N a t u r e， 3 1 9, 79 1 ( 1 986) ) 、 P E G法（P a s z k ows k i e t a 1. , EMB O J. , 3， 27 1 7 (1 984) ) 、マイクロインジェクシヨン法 (C r o s sway e t a 1. , Mo l . Ge n. Ge n e t . , 202, 1 79 ( 1 986) ) 、微小物衝突法（M c C a b e e t a 1. , B i o/T e c hn o l o gy, 6， 923 ( 1 988) ) などが挙げられる。所望の植物に核酸を導入する方法であれば特に限定されない。一方、交配による導入の場合には、例えば、以下のようにして行うことが可能である。先ず、 R f — 1供与親とジャポニカ品種とを交雑して得られた F iに、ジャポニカ品種を戻し交雑する。得られた個体のなかから、 S 1 2564 T s p 509 I座がジャポニカ型ホモ、 P 4497 M b o I座及び B 53627 B s t Z 17 I座がヘテロの個体を選別し、さらなる戻し交雑に供試する。得られた個体のなかから、 P 4497 Mb o I座及び B 5669 1 X b a I座がヘテロ、 B 53627 B s t Z 1 7 I座がジャポニカ型ホモの個体を選抜し、さらなる戻し交雑に供試する。以後は、戻し交雑各世代で、 P 4497 Mb o I座及び B 56691 X b a I座がヘテロの個体を選抜し、次の戻し交雑に供試する、という工程を 1 0回程度繰り返す。最後に、 P 4497 Mb o l座及び B 56691 Xb a I座がヘテロの個体を自殖させ、得られた個体から両座がインディ力型ホモの個体を選抜することにより、 P 4497 Mb o l座から B 5669 1 X b a I座までの限定された染色体領域を R f 一 1供与親から引き継ぐ回復系統を得ることができる。

本発明において、稔性回復遺伝子（R f — l) を含む核酸が単離されたことにより、 R f — 1遺伝子を遺伝子工学の技術を用いてイネ品種に導入し、回復系統を育成することが可能となった。本発明では R f — 1領域を先ず 76 k b以下にまで絞り込むことに成功した。よって本発明の R f ― 1遺伝子座を含む核酸は、従来技術と比較して、 R f - 1遺伝子の近傍に存在する他の遺伝子を含む可能性が格段に低い。さらに、本発明は R f — 1遺伝子を含む領域の全塩基配列を明らかにした。当業者は、本明細書の記載に基づき R f — 1遺伝子自体の解析することが進めることができる。よって、隣接する遺伝子を全く含まずに R f — 1遺伝子のみを導入することも可能となった。これは、隣接遺伝子が劣悪形質をもたらす遺伝子である場合に特に重要である。さらに、交雑の場合より早く、 1〜2年の短期間での回復系統を育成も可能となった。

そして、本明細書中の実施例 4一 1 3及び 1 7に記載の相補性試験では実際に、図 5に記載の 1 0個のクローン由来の断片を用い、ァグロバクテリウムを用いる方法により MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）を形質転換した。その結果、配列番号 27の塩基 38538 - 541 2 3、好ましくは、塩基 42357— 53 743、より好ましくは、塩基 42 1 3 2 - 48883, さらにより好ましくは塩基 421 32— 463 18の塩基配列を含む核酸によって、稔性回復系統が育成されることが証明された。

限定されるわけではないが、ァグロパクテリゥムを用いるイネの回復系統の作成方法は、例えば、 H i e i e t a 1. ， P l a n t J . ， 6， p. 27 1 - 282 (1 994) Koma r i e t a 1. , P l a n t J. , 1 0, p. 165 - 1 74 (1 996) , D i t t a e t a 1. , P r o c . Na t l . Ac a d. S c i . USA 77 : p. 7347 - 7

35 1 ( 1 980) 等に記載されている。

先ず、所期の挿入したい核酸断片を含むプラスミドベクターを作成する。ブラスミドベクタ一は、例えば、前記 Koma r i e t a 1. , P l a n t

J. , 1 0, p. 16 5 - 1 74 (1 996) らにプラスミドマップが記載されている、 p S B l l、 p S B 22等が使用可能である。あるいは、当業者は例えば前記 P SB 1 1、 p S B 22等のプラスミドベクターを基に、自ら適当なベクタ一を構築する事も可能である。本明細書後述する実施例では、 p S B l lを基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間べクタ一 p S B 200を作成して使用した。具体的には、先ず、ュビキチンプロモーターとュビキチンィントロン（Pu b i— u b i l ) に、ノパリン合成酵素のターミネ一ター（Tn o s ) を接続した。これより得られた Pu b i— u b i I— Tn o s接続体の u b i I— Tn o s間に、ハイグロマイシン耐性遺伝子（HYG (R) ) を挿入することにより、 P u b i— u b i I— HYG (R) — Tn o sからなる接続体を得た。この接続体を、 p SB l l (Koma r i ら、上述）の H i n d I I Iノ E c oR I断片に接続することにより、 PKY 20 5を得た。この pKY205 の P u b i上流に存在する H i n d I I I部位に N o t I、 N s pV、 E c oR V、 Kp n l、 S a c l、 E c o R Iの制限酵素部位を追加するためのリンカ一配列を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有する P S B 200を得た。

次いで、挿入核酸を含む組換えべクタ一を用いて大腸菌（例えば DH 5 a、 J M l 09、 MV 1 1 84等、いずれも例えば TAK A R A社より購入可能）を形質転換する。さらに、形質転換された大腸菌を用いて、ァグロパクテリゥム菌株を好ましくはヘルパー大腸菌株とともに、例えば、 D i t t a e t a l (1 980) の方法に従い、三菌系交雑 ( t r i p a r e n t i a l ma t i n g) を行う。限定されるわけではないが、ァグロパクテリゥムは例えば、 Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n s菌株 L B A 4404 p S B 1、 LBA44

04/p NB 1 , L B A 4404 p S B 3等を使用することが可能である。いずれも前述の Koma r i e t a 1. , P l a n t J . , 1 0, p.

165 - 1 74 ( 1 996) にプラスミドマップが記載されており、当業者は例えば自らベクター構築を行うことにより使用可能である。限定されるわけではないが、ヘルパー大腸菌は、例えば HB 1 0 1 Zp RK 20 1 3 (クローンテック社より入手可能）等が使用可能である。また、より一般的ではないが pRK20 73を保有する大腸菌もヘルパー大腸菌として使用可能との報告がある（L em a s e t a 1. , P 1 a s m i d 1 992, 27, p. 16 1 - 16 3) 。

次いで、所期の交配が生じたァグロパクテリゥムを用いて、例えば、 H i e i e t a 1 ( 1 994) の方法に準拠し、雄性不稔イネの形質転換を行う。形質転換に必要なイネ未熟種子は、例えば、雄性不稔イネにジャポニカ品種の花粉をかけることにより作成できる。

形質転換植物の稔性回復は、例えば出穂約 1か月後に、種子稔性を立毛調査することによって調べることが可能である。立毛調査とは、圃場などで栽培されている状態で観察する方法である。あるいは、実験室で穂の稔実率を調べる稔実率調査を行ってもよい。

V. R f — 1遺伝子の存在の有無の識別方法

本発明において R f - 1遺伝子の機能の有無を決定する配列が、イネ第 1 0染色体上の約 65 k bの多型検出用マーカー座 P 4497 Mb o lと B 5669 1 Xb a Iの間に存在することが明らかにされた。さらに、相補性試験により、配列番号 27の塩基配列のうち、特に塩基 38538— 541 23に R i— 1遺伝子が完全に含まれていることが確認された。また、 R f _ 1遺伝子を有するインディ力型品種（ I R 24) (配列番号 2 7) と当該遺伝子を有しないジャポニカ型品種（あそみのり（配列番号 28) および日本晴 B ACクローン AC 068923) の塩基配列を比較し、両者に複数の多型（p o 1 ymo r p h i s m) が存在することが明らかになった。その結果、 R f — 1遺伝子近傍領域における塩基配列の多型を利用することにより、被検定イネ個体又は種子が R f — 1遺伝子を有するか否かを、簡便、迅速かつ正確に識別することが可能となった。

よって、本発明はまた、 R f — 1遺伝子の機能の有無を決定する配列がイネ第 1 0染色体上の多型検出用マ一力一座 P 4497 Mb o l と B 5669 1 X b a Iの間に存在することを利用して、被検定イネ個体又は種子が R f _ 1遺伝子を有するか否かを識別する方法を提供する。

多型の検出は公知の任意の方法を使用して行うことが可能である。例えば、制限酵素断片長の多型（r e s t r i c t i o n f r a gme n t l e n g t h p o l ymo r ph i sm ; RFLP) を調べる方法、塩基配列の決定により直接的に決定する方法、ゲノム DNAを 8塩基認識制限酵素で切断後、末端を放射能標識し、さらに、 6塩基および 4塩基認識制限酵素で切断し、 2次元電気泳動で展開する方法（RLGS法、 Re s t r i c t i o n L an dma r k Ge n ome S c ann i n g) 等が知られている。さらに、 RFLPをポリメラ一ゼ連鎖反応（PCR) によって増幅 ·検出する AFLP (amp 1 i f i e d f r a gme n t l e n g t h p o l ymo r p h i sm ; P. V o s , ら、 Nu c l e i c Ac i d s R e s. Vo l . 23, p. 4407 -4414 ( 1 995 ) ) 分析も開発されている。

例えば、従来より以下に例示するような RF L Pを P CR増幅を用いて検出する方法（R F L Pマーカーの P C Rマーカー化）、マイクロサテライトの多型を P CR増幅を用いて検出する方法（マイクロサテライトマーカ一）が採用されてきた。

R F L Pマ一カーの P C Rマ一カー化

A. RFLPプローブ対応ゲノム領域の多型を利用して P C Rマーカ一化する方法（D. E. Ha r r y, B. Teme s g e n, D. B. N e a 1 e ； C o d om i n a n t PCR-b a s e d ma r k e r s f o r P i n u s t a e d a d e v e l o p e d f r om ma p e d c D N A c l o n e s, Th e o r. Ap p l . Ge n e t . ( 1 998) 97 : p. 327 - 336) 。これは、 RF L Pマーカ一プローブ配列（「RF L P」は、ある DN A断片をプローブに用いてサザン解析を行った場合に観察される多型である。プローブに用いた DN A断片の塩基配列を「R F L Pマ一カープローブ配列」と呼ぶ。）に対して設計したプライマーを用いてゲノム PCRを行った後、次の二方法のいずれかにより PCRマーカー化できる。第 1は、産物を一連の制限酵素で処理し、断片長多型を生じる制限酵素を探索する手法であり、第 2は、産物の塩基配列を品種間比較して多型を探索し、その多型を利用して PCRマーカー化する方法である。

B. RF L P原因部位を同定して P CRマーカ一化する方法。これは、 RF L Pマ一カープローブ配列内あるいはその周辺（通常数 k b以内）に存在する R F LP原因部位（比較する 2品種の一方のみが持つ制限酵素認識部位）を同定することにより、 P CRマ一カー化する方法である。

マイクロサテライトマーカー

マイクロサテライトとは、（CA) _nのような 2ないし 4塩基程度の繰り返し配列であり、ゲノム中に多数存在している。繰り返し数に品種間多型がある場合、隣接領域に設計したプライマ一を用いて PCRを行うと、 PCR産物長に多型が観察され、 DNA多型を検出することが可能となる。マイクロサテライトを利用した多型検出マーカ一は、マイクロサテライトマ一カーと呼ばれている (0. P a r n a u d, X. Ch e n, S . R. Mc C o u c h, , Mo l . Ge n. Ge n e t . ( 1 996) 252 : p. 597— 607) 。

本発明において多型の検出方法は特に限定されない。効率、簡便性の観点より、 P CRと RFLPを組み合わせて、比較する品種系統間において、 PC尺により増幅した DN A断片配列中の制限酵素認識部位に多型が存在する場合に、その制限酵素による切断パターンからいずれの型であるかを決定する P CR— RF L P法が好ましい。 PCR— RFLP法は、 CAP S (c l e a v e d amp l i f i e d p o l ymo r p h i c s e q u e n c e) とも B乎ば、れる。多型が見出される部位に適当な制限酵素認識部位が存在しない場合、 P CRの際に制限酵素部位を導入する CAP Sの修飾法、 d CAP S (d e r i v e d c l e a v e d amp l i f i e d p o l ymo r ph i c s e q u e n c e) も使用可能である（M i c h a e l s, S . D. a n d Am a s i n o， R. M. ( 1998) , Th e P l a n t J ou r n a l 14 (3) 38 1— 385 ; A. Ko n i e c z nyら，（1993) , P l a n t J . 4 (2) p. 403-41 0 ; Ne f f , M. M. , N e f f , J . D. ， C h o r y , J . a n d P e p p e r, A. E. ( 1 998) , Th e P l a n t J ou r n a l 14 (3) 387— 392) 。以下、より詳細に説明する。、

CAP S法、 d CAP S法

限定されるわけではないが、本発明の識別方法では

i ) R.f _ 1遺伝子座において、インディ力品種とジャポニカ品種の塩基配列において多型が見出される部位およびその隣接領域の塩基配列に基づいて、当該塩基配列を増幅するようにプライマ一対を作成し；

i i ) 被検定イネ個体又は種子のゲノム DNAを铸型として核酸増幅反応を行い；そして

i i i ) 前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて、被検定イネ個体又は種子が R f 一 1遺伝子を有するか否かを判断する。

工程 i ) におけるプライマー対の作成は、好ましくは

a) 前記核酸増幅産物の多型中に欠失領域を有する型が存在する場合、当該欠失領域の両側に欠失領域を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マ一力一とする；

b) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存在する場合、当該塩基置換部位の両側に置換部位を挾むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マ一カーとする；または

C ) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じない塩基置換が存在する場合、当該塩基置換部位を含み、そして、当該塩基置換部位を含む領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更するようなミスマッチ導入用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする；のいずれかの手段を含む。

限定されるわけではないが、本発明において、 R f — 1遺伝子の存在を識別するために利用可能な適当な多型部位は、例えば、 R f — 1遺伝子を有するインデイカ型品種（ I R 24) (配列番号 27) と当該遺伝子を有しないジャポニカ型品種（あそみのり（配列番号 28) および B ACクローン AC 068923) の塩基配列を比較し、以下のように多型検出用マーカ一の作成が可能となるように、適宜選択することができる。

例えば、見出された多型が制限酵素認識部位に差異を生じる場合、当該多型部位の両側に多型部位を挟むように核酸増幅プライマーを作成し、多型検出用に用いる。プライマ一を設計する際は、不要な産物を避けるために、反復性の高い配列に対して設計しない方が好ましい。見出された多型が制限酵素認識に差異を生じない場合、記述の d CAP S法を適用することにより、マーカーを作成することができる。 d CAP Sマーカーのプライマーを設計する際は、反復配列に対して設計しない方が好ましいことに加え、多型を識別しやするするため産物長が、好ましくは 50— 300塩基、より纾ましくは 100塩基程度となるようにするとよい。

見出された多型がマイクロサテライトに関するものであれば、当該マイクロサテライトを挟むように核酸増幅用プライマーを作成し、多型検出用に用いる。この場合も、反復配列に対してプライマーを設計しない方が好ましい。

1) 核酸増幅

本発明では、好ましくは、解明された被検定イネ個体又は種子の R f — 1遺伝視座の核酸配列の塩基配列に基づいて、多型を含む隣接領域を増幅するようにプライマ一対を作成する。当該プライマーを使用して、被検定イネ個体又は種子のゲノム DNAを鐽型に核酸増幅反応を行う。核酸増幅反応は好ましくは、複製連鎖反応（PCR) (サイキら、 1 985, S c i e n c e 230, p. 1 3 5 0 - 1 354) である。核酸増幅のためのプライマ一対は、多型部位およびその隣接領域の塩基配列に基づき公知の方法により作成することが可能である。具体的には、限定されるわけではないが、例えば、多型部位およびその隣接領域の塩基配列に基づき、以下の条件：

1 ) 各プライマ一の長さが 1 5— 3 0塩基であること；

2 ) 各プライマーの塩基配列中の G + Cの割合が 3 0 - 7 0 %であること；

3 ) 各プライマーの塩基配列中の A、 T、 Gおよび Cの分布が部分的に大きく偏らないこと；

4 ) プライマー対によって増幅される核酸増幅産物の長さが 5 0 - 3 0 0 0 塩基、好ましくは 5 0— 3 0 0塩基であること；そして

5 ) 各プライマー自身の塩基配列中、又はプライマー同士の塩基配列間に相補的な配列部分が存在しないこと

を満たすように、多型部位およびその隣接領域の塩基配列と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖 D N Aを製造し、または、必要であれば多型部位およびその隣接領域の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖 D N Aを製造する

ことを含む方法により、プライマー対を作成できる。

本発明において増幅される、多型部位の「隣接領域」とは、多型とその隣接領域の双方を含む領域が、好ましくは、 P C R法等の核酸増幅が可能な距離の範囲内にあることを意味する。限定されるわけではないが、好ましくは増幅される隣接領域が約 5 0塩基ないし約 3 0 0 0塩基、より好ましくは約 5 0塩基ないし約 2 0 0 0塩基の範囲内にある。多型を識別しやするするためは、産物長が好ましくは 5 0— 3 0 0塩基、より好ましくは 1 0 0塩基程度となるようにするとよい。限定されるわけではないが、隣接領域は、多型部位の 5 ' 側または 3，側に好ましくは約 0塩基ないし約 3 0 0 0塩基、より好ましくは約 0塩基ないし約 2 0 0 0塩基、より好ましくは約 0塩基ないし約 1 0 0 0塩基の範囲内にある。核酸増幅反応の手順及び条件は特に限定されず、当業者に周知である。当業者は、多型部位およびその隣接領域の塩基配列、プライマー対の塩基配列および長さ等の種々の要因に応じて適宜、条件を採用することが可能である。一般には、プライマー対の長さが長い程、 G + Cの割合が高いほど、 A、 T、 Gおよび Cの分布の偏りが小さい程よりストリンジェントな条件（より高温度でのァニーリング反応および核酸伸長反応、より少ないサイクル数）で核酸増幅反応を行うことが可能である。よりストリンジェン卜な条件の採用により、特異性の高い増幅反応が可能となる。 '

増幅反応は、限定されるわけではないが、例えば、铸型として使用するゲノム DNA50 n g、 d N T P各 200 2 M、 E xT a q™ (TAKAR A) 5 U を使用し、例えば、 94でにて 2分を 1サイクル行った後、 94でにて 1分、 5 8 にて 1分、 72tにて 2分を 1サイクルとして 30サイクル行い、最後に 7 2でにて 2分を 1サイクル行うことにより行うことができる。あるいは、 94でにて 2分を 1サイクル行った後、 94でにて 1分、 58 にて 1分、 72でにて 1分を 1サイクルとして 30サイクル行い、最後に 7 2でにて 2分を 1サイクル行うことにより行うこともできる。あるいは、別の態様においては、 94でにて 2分を 1サイクル行った後、 94でにて 30秒、 58 :にて 30秒、 72 にて 30秒を 1サイクルとして 35サイクル行い、最後に 72でにて 2分を 1サイクル行うことにより行うこともできる。

PCRの铸型として使用する被検定イネゲノムの DNAは、 E dwa r d sら (Nu c l e i c Ac i d s R e s. 8 (6) : 1 349, 1 99 1) の方法で、個体又は種子より簡易に抽出することができる。より好ましくは、標準的な方法により精製した DNAを用いるのがよい。 CTAB法（Mu r r ay M. G. ， e t a 1. , Nu c l e i c Ac i d s R e s . 8 (19) : 432 1 - 5, 1 980) は、特に好ましい抽出法である。 P CRを行うための錄型として使用する DNAの濃度は、終濃度で 0. 5 η /z 1 が好ましい。

2 ) 多型検出用マ一カーの作成

上記プライマー対を用いた核酸増幅反応により、増幅産物に多型が検出されるか否かを調査し、見出された多型に基づいて多型検出用マーカーを作成する。限定されるわけではないが、増幅産物に検出されうる多型としては以下のようなものがある。 a) 前記核酸増幅産物の多型中に欠失領域を有する型が存在する場合このような場合、欠失領域の両側に欠失領域を挟むように核酸増幅用プライマ一対を作成し、多型検出用マ一カーとする。欠失領域の大きさが十分な場合、例えば増幅産物をァガロースゲル電気泳動又はアクリルアミドゲル電気泳動等することにより、泳動度の差により多型の検出が可能である。例えば、ァガロースゲル電気泳動の場合には塩基対数に約 5 %以上の差がある場合、シーケンス用ァクリルアミドゲル電気泳動の場合には約 1塩基以上長さに差がある場合検出可能である。または、欠失領域外の塩基配列に相補的な配列を有するオリゴヌクレオチド若しくは DN A断片を解析用プロ一ブとして、核酸増幅産物に対してハイプリダイゼーシヨンを行うことにより、多型を検出することができる。あるいは、必要に応じ、増幅産物の塩基配列を決定して多型を確認してもよい。核酸の電気泳動、ハイブリダィゼーシヨン、塩基配列の決定等は公知の方法を使用でき、当業者は適宜採用可能である。このような場合は、増幅産物の長さの相違が直接多型を生じるので、これを利用した多型検出用マーカーを AL P (amp 1 i c on l e n g t h p o l ymo r p h i sm) マ一刀一と言つ。

b) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存在する場合

このような場合、当該塩基置換部位の両側に置換部位を挟むように核酸増幅用プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする。このような場合、核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じる塩基置換が存在する、即ち、核酸増幅産物中に、特定の 1または複数の制限酵素で切断されるものとされないものが存在する。よって、得られた増幅産物を制限酵素処理し、例えばァガロースゲル等で電気泳動し、泳動度の差により多型を検出することが可能である。必要に応じ、増幅産物の塩基配列を決定して多型を確認してもよい。

このような場合、 PCR等による増幅産物の制限酵素断片の長さの相違が多型を生じるので、これを利用した多型検出用マーカ一を CAP Sマーカーまたは P CR— RFLPマ一力一という（A. Kon i e c z n yら，上述）。

後述する実施例 1のプライマ一対 P 4497 Mb o I P 23945 Mb o I、 P 41 030 T a q l , P 45 177 B s t U I , B 59066 B s a J I及び B 5669 1 X b a Iがこのような場合に相当する。なお、前記 a) の核酸増幅産物の長さで多型を検出可能な場合であっても制限酵素処理を併用することにより、多型がより検出しゃすくなる場合がある。

c) 前記核酸増幅産物の多型中に制限酵素認識に差異を生じない塩基置換が存在する場合

このような場合、当該塩基置換部位を含み、そして、当該塩基置換部位を含む領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更するようなミスマッチ導入プライマー対を作成し、多型検出用マーカーとする。具体的には、天然の R f - 1遺伝子近傍領域の塩基配列に基づくプライマー対では核酸増幅産物に多型を生じるが制限酵素認識に差異を生じないため、片方のまたは双方のプライマーにミスマッチを導入し、当該塩基置換部位（多型）を含む領域を核酸増幅産物では制限酵素認識に差異を生じるような塩基配列に変更する。例えば、 PCR法を用いた部位特異的変異の導入による特定ヌクレオチドの置換、欠失又は付加の一般的な技術は、例えば M i k a e 1 i a nら、 Nu c 1. Ac i d s . R e s . 20 : 376. 1 992に記載された方法を用いることができる。上記ミスマッチ導入プライマ一を多型検出用マ一カーとして用いた増幅産物では、ミスマッチ導入部位において制限酵素認識に差異を有するため、核酸増幅産物中に、特定の 1または複数の制限酵素で切断されるものとされないものが存在する。よって、上述の b) の場合と同様に得られた増幅産物を制限酵素処理し、例えばァガロースゲル等で電気泳動し、泳動度の差により多型を検出することが可能である。

ミスマッチの導入は、プライマーの標的植物ゲノムへの結合性を失わせず、また、多型を生じている塩基置換を変化させるものであってもならない。多型を生じている塩基置換を利用してその近傍にミスマッチを導入して、塩基置換とミスマッチの双方の組み合わせにより制限酵素認識に差異が生じるようにする。このようなミスマッチの導入法は当業者に公知であり、例えば、 M i c h a e l s, S. D. an d Am a s i n o， R. M. (1 998) , Ne f f , M. M. ， Ne f f , J . D. , Ch o r y, J. a n d P e p p e r, A. E. ( 1998) 等に詳述されている。このような場合のマーカ一は、前述の b) の CAP Sマーカーの改良であり、 d CAPS (d e r i v e d CAP S) マーカーという。後述する実施例 3の P 9493 B s 1 Iがこのような場合に相当する。

なお、上記の b) または c) の場合において、品種間の多型とは無関係の余分な制限酵素部位が多く存在すると、多型に基づく制限酵素部位認識の相違が識別しにくくなる場合がある。このような場合、必要に応じプライマーにミスマッチを導入し、不必要な制限酵素部位をつぶしてもよい。例えば、実施例 3の B 60 304 M s p iでは、 Rプライマーにミスマッチを導入して多型と無関係な M s p I部位をつぶしている。

限定されるわけではないが、 C AP S法又は d CAP S法は、他の RF L P法等と比較していくつかの利点を有する。具体的には、例えば、 RFLP法と比較して、少量のサンプルで分析できる。分析に要する時間および労力を大きく軽減できる、といった利点がある。マイクロサテライトマーカ一と比較しても、作成した P CRマーカーの多型検出がアクリルアミド電気泳動よりも容易なァガロースゲル電気泳動で行えるという利点がある。

本発明の識別方法の好ましい実施態様

以下、例示のために本発明の被検定イネが R f - 1遺伝子を有するか否かを識別する方法の好ましい態様を記載する。本明細書の実施例において R f — 1遺伝子を有するインディ力型品種 I R 24の塩基配列（配列番号 27) において、ジャポニ力型品種の対応する領域と比較した結果、少なくとも以下の 1) — 8) の多型を有することを見出した。

1) 配列番号 27の塩基 1 239に相当する塩基が Aである；

2) 配列番号 27の塩基 6227に相当する塩基が Aである；

3) 配列番号 27の塩基 20 680に相当する塩基が Gである

4) 配列番号 27の塩基 4546 1に相当する塩基が Aである

5) 配列番号 27の塩基 49 609に相当する塩基が Aである

6) 配列番号 27の塩基 56 368に相当する塩基が Tである

7) 配列番号 27の塩基 57 629に相当する塩基が Cである；及び

8) 配列番号 27の塩基 66 267に相当する塩基が Gである。よって、本発明の好ましい実施態様において、上記 1) 一 8) の条件のいずれか 1つないし全部を満たす場合に、被検定イネの個体又は種子が R f — 1遺伝子を有すると判断する。

さらに、本発明者らは配列番号 27の塩基配列のうち、特に塩基 38 538— 5412 3、好ましくは、塩基 4235 7— 53743、より好ましくは、塩基 42 1 3 2— 48883、さらにより好ましくは塩基 42 1 32— 4631 8に R f 一 1遺伝子の機能発現に必須の領域が含まれていることを確認した。よつて、. '本発明の一態様において、配列番号 27の塩基配列又は配列番号 27の塩基 3853 8 - 54 123の塩基配列と、少なくとも 70 %同一の塩基配列が、以下の条件 1) 及び 2) の少なくとも一つを満たす場合に、被検定イネの個体又は種子が R f - 1遺伝子を有すると判断する：

1 ) 配列番号 27の塩基 4546 1に相当する塩基が Aである；及び

2) 配列番号 27の塩基 49609に相当する塩基が Aである。

上記の条件を満たすか否かは、公知の多型の検出方法を使用することが可能である。上記配列を含む隣接領域の塩基配列を直接決定してもよい。しかしながら、迅速性、簡便性の観点より、上述した CAP S法又は d CAP S法を採用することが好ましい。 CAP S法又は d CAP S法は、例えば以下のように行うことが可能である。

i ) 以下のいずれかの塩基、

1 ) 配列番号 27の塩基 1 239に相当する塩基；

2) 配列番号 27の塩基 6227に相当する塩基；

3) 配列番号 27の塩基 20680に相当する塩基

4) 配列番号 27の塩基 4546 1に相当する塩基

5) 配列番号 27の塩基 49609に相当する塩基

6) 配列番号 27の塩基 56368に相当する塩基

7) 配列番号 27の塩基 57629に相当する塩基；及び

8) 配列番号 27の塩基 66267に相当する塩基

を含む隣接領域の塩基配列に基づいて、上記塩基と隣接領域の双方を増幅するようにプライマー対を作成し； i i ) 被検定イネ個体又は種子のゲノム DN Aを錶型として核酸増幅反応を行レ；そして

i i i ) 前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて被検定イネ個体又は種子が R f 一 1遺伝子の有無を識別する。

核酸増幅反応産物の多型の検出は、限定されるわけではないが、例えば以下の 1) - 8) の 1つないし全てを満たす場合に被検定イネ個体又は種子が R f _ 1 遺伝子を有すると判断する、ことによって行う。

1) 配列番号 27の塩基 1 239に相当する塩基を含む領域が、 Mb o l認識配列を有しない；

2) 配列番号 27の塩基 6227に相当する塩基を含む領域が、 B s 1 I認識配列を有しない；

3) 配列番号 27の塩基 20680に相当する塩基を含む領域が、 Mb o l 認識配列を有する；

4) 配列番号 2 7の塩基 4 546 1に相当する塩基を含む領域が、 T a Q I 認識配列を有しない；

5) 配列番号 27の塩基 49609に相当する塩基を含む領域が、 B s t U I認識配列を有しない；

6) 配列番号 27の塩基 56368に相当する塩基を含む領域が、 M s p I 認識配列を有しない；

7 ) 配列番号 27の塩基 57629に相当する塩基を含む領域が、 B s a J

I認識配列を有しない；及び

8) 配列番号 27の塩基 66267に相当する塩基を含む領域が、 Xb a I 認識配列を有しない。

ただし、上記 1) 一 8) の領域の各多型を検出可能な制限酵素であれば、上記に限定されるものではない。

本発明の識別方法は、好ましくは、

i ) 以下のいずれかの塩基、

1) 配列番号 2 7の塩基 4 546 1に相当する塩基；又は

2) 配列番号 27の塩基 49609に相当する塩基；を含む隣接領域の塩基配列に基づいて、上記塩基と隣接領域の双方を増幅するようにプライマー対を作成し；

i i ) 被検定イネ個体又は種子のゲノム D N Aを铸型として核酸増幅反応を行い；そして

i i i ) 前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて被検定イネ個体又は種子が R f — 1遺伝子の有無を識別する。限定されるわけではないが、工程 i i i ) が、以下の条件 1 ) 及び 2 ) の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子が R f 一 1遺伝子を有すると判断する：

1 ) 配列番号 2 7の塩基 4 5 4 6 1に相当する塩基を含む領域が、 T a q I 認識配列を有しない；及び

2 ) 配列番号 2 7の塩基 4 9 6 0 9に相当する塩基を含む領域が、 B s t U I認識配列を有しない。

上記の配列番号 2 7の塩基 4 5 4 6 1は、 1 ) 配列番号 6 9の塩基 1 7 6 9 ; 2 ) 配列番号 7 0の塩基 1 7 6 7 ； 3 ) 配列番号 7 1の塩基 1 7 7 2 ； 4 ) 配列番号 7 2の塩基 1 7 6 2 ； 5 ) 配列番号 7 3の塩基 1 7 0 3 ； 6 ) 配列番号 7 4 の塩基 1 7 7 9 ； 7 ) 配列番号 8 0の塩基 1 7 8 3 ； 8 ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 2 9 ； 9 ) 配列番号 8 2の塩基 1 7 8 1 ； 1 0 ) 配列番号 8 3の塩基 1 7 7 4 ； 1 1 ) 配列番号 8 4の塩基 1 7 2 8 ;及び 1 2 ) 配列番号 8 5の塩基 1 6 4 4に相当する。

増幅反応に使用するプライマー対は、配列番号 2 7の塩基配列に基づき、好ましくは前述した条件を満たすように当業者が適宜選択可能である。好ましくは、配列番号 3 9及び 4 0、配列番号 4 1及び 4 2、配列番号 4 3及び 4 4、配列番号 4 5及び 4 6、配列番号 4 7及び 4 8、配列番号 4 9及び 5 0、配列番号 5 1 及び 5 2、並びに配列番号 5 3及び 5 4からなるグループから選択される塩基配列を有するいずれかのプライマ一対を使用する。より好ましくは、プライマー対は、配列番号 4 5及び 4 6、並びに配列番号 4 7及び 4 8からなるグループから選択される。または、必要であれば上記ブラーマ一対の配列に基づき、多型部位およびその隣接領域の塩基配列に対する結合特異性を失わないように置換、欠失又は付加を施した配列をプライマ一として採用することも可能である。得られた PCR産物を、制限酵素断片長多型に関して調べるため、それぞれの PCRマーカーに存在する制限部位に対応する制限酵素で切断する。この切断は、用いる制限酵素の推奨反応温度で数時間〜一昼夜インキュベーションすることにより行う。制限酵素で切断したそれぞれの増幅 P CRサンプルは、例えば約 0. 7 %ないし 2 %ァガロースゲルあるいは約 3 %の M e t a P h o r ^TMァガロースゲルで電気泳動することにより解析する。例えば、ゲルをェチジゥムブ口マイド中紫外線下で可視化する。

本発明の最も好ましい態様において、制限酵素による切断パターンとしては、可視化されたゲル上に、使用するプライマ一対に応じて、以下の表 2のようなァンドの存在の有無が確認される。

表 2 検出されるバンドのおおよそのサイズ（b p)

P 4497 Mo b lによる増幅制限酵素 Mb o l

(配列番号 39および 40)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 7 30

有しない場合： 385、 345

P 949 3 B s 1 Iによる増幅制限酵素 B s 1 I

(配列番号 41および 42)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 1 26

有しない場合： 1 00、 26

P 23945 Mb o lによる増幅制限酵素 Mb o l

(配列番号 43および 44)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 1 60、 1 00 有しない場合： 260 P 4 1030 Ta q lによる増幅制限酵素 T a q l

(配列番号 45および 46)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 2 80

有しない場合： 90、 1 90

P 45 1 77 B s t U Iによる増幅制限酵素 B s t U I

(配列番号 47および 48)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 20, 65, 730

有しない場合： 20,65, 175,555

B 60304 Ms p iによる増幅制限酵素 Ms p i

(配列番号 49および 50)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 3 30

有しない場合： 220、 1 10

B 59066 B s a J Iによる増幅制限酵素 B s a J I

(配列番号 5 1および 52)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 420

有しない場合： 6 5、 355

B 5669 1 Xb a lによる増幅制限酵素 Xb a l

(配列番号 53および 54)

被検定イネゲノムが Rf-1遺伝子を有する場合（ホモ）： 6 70

有しない場合： 140、 530

なお、後述の実施例 3において、花粉稔性を有する R f — 1遺伝子極近傍組換え個体（RS 1—RS 2、 RC 1 -RC 8) について、上記 8種のプライマー対を含めた 14種の多型マーカーを使用して、 R f - 1領域の染色体構成を調べた。その結果、いずれの個体も P 9493 B s I Iないし 59066 B s a J Iの間については、インディ力型品種由来の R f — 1遺伝子を有することが確認された。この結果から、図 3で示したような染色体構成をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、 R f — 1遺伝子が機能していることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディ力型領域、すなわち、最大限に見積もっても P 4497 Mb o I座から B 5669 1 X b a I座までの領域（約 65 k b) に、 R f — 1遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。

なお、本発明では、交雑による個体の出現頻度から S 1 2564 T s p 50 9 I座と R f — 1座とが非常に近接しているとの予測に基づき、染色体歩行を始めた。実際、本発明の高精度分離分析の結果、両座の遺伝的距離は約 0. 04 c Mと算出された。現在公知となっている R f — 1座連鎖マ一力一のなかで、最も密接に連鎖しているマーカーは、先述の特開 2000— 1 39465に記載されているマーカーのひとつであるが、そのマーカーでも R f — 1座との遺伝的距離は 1 cMと記載されている。イネの場合、平均すると 1 cMは 300 k bに相当すると考えられており、特開 2000— 1 39465のマーカ一を起点に染色体歩行を開始したのでは、 R f 一 1遺伝子領域の絞込みに相当の時間を要したと考えられる。

V I . R f 一 1遺伝子の稔性回復機能の抑制方法

本発明において、稔性回復機能を有する核酸を含む、稔性回復遺伝子（R f — 1) 座を含む核酸が単離され、その全塩基配列が決定されたことにより、 R f — 1遺伝子の稔性回復機能を遺伝子工学的に制御することが可能となった。よつて、本発明は、さらに、 R f — 1遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法を提供する。

本発明の R f — 1遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法は、例えば、配列番号 27の塩基配列を有する核酸、又は配列番号 27の塩基配列と少なくとも 70% 同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも 1 00塩基の長さのアンチセンスを導入する、ことを含む。

本発明の R f 一 1遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法は、一態様において、配列番号 2 7の塩基 38538— 541 23、好ましくは、塩基 42357— 5 3743、より好ましくは、塩基 42 1 32— 48883の塩基配列を有する核酸、又は配列番号 27の塩基 38538— 54123、好ましくは、塩基 423 57— 5 3743、より好ましくは、塩基 42 1 32— 48883、さらにより好ましくは塩基 42 1 32 - 463 1 8の塩基配列と少なくとも 70 %同一の塩基配列であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも 1 00塩基の長さのアンチセンスを導入することを含む。

本発明の R f — 1遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法は、特に、好ましい一態様において、配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 7 5のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも 1 00塩基の長さのアンチセンスを導入することを含む。

最も好ましくは、配列番号 7 5のアミノ酸配列、又は配列番号 7 5のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸は、以下の a) — P) の核酸から選択される：

a) 配列番号 69の塩基 2 15— 2 587を含む核酸

b ) 配列番号 70の塩基 2 1 3— 2 585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 18— 2 590を含む核酸

d ) 配列番号 72の塩基 208— 2 580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149一 2 52 1を含む核酸

f ) 配列番号 74の塩基 225— 2 597を含む核酸

g ) 配列番号 27の塩基 43907—46279を含む核酸；

) 配列番号 80の塩基 2 29 - 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 75— 2 547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 2 27— 2 599を含む核酸 k ) 配列番号 83の塩基 220— 2 592を含む核酸；

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546を含む核酸；

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

o) 上記 a) — m) のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び

P) 上記 a) — m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。アンチセンスは、少なくとも 1 00塩基以上、より好ましくは 500塩基以上、最も好ましくは 1000塩基以上の長さである。導入の技術上の簡便性等の観点より、好ましくは 1 0000塩基以下、より好ましくは 5000塩基以下である。アンチセンスは、公知の方法により合成することが可能である。アンチセンスのイネへの導入は公知の方法により、例えば、 T e r a d a e t a 1. (P l a n t C e l l Phy s i o l . 2000 J u l , 41 (7) , p. 88 1 - 888) に記載の方法により行うことが可能である。

また、限定されるわけではないが、 To s l 7 (H i r o c h i k a H. e t a 1. 1 996， P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA 93, p. 7783— 7 788) などの転移因子の挿入変異系統のなかから、配列番号 27の塩基配列内に転移因子が挿入された系統を選抜することにより、 R f — 1が破壊された系統を育成することも可能であると考えられる。さらに、植物においても相同組換えにより遺伝子破壊が研究されている。その系の確立により、配列番号 27の塩基配列を有する核酸、または配列番号 27の塩基配列と少なくとも 70%同一である核酸を用いて、 R f 一 1遺伝子を変異型 R f — 1遺伝子に置換することにより、稔性回復機能を抑制することも可能であると考えられる。参考文献 F u k u t a e t a 1. 1 992, J p n J . B r e e d. 42 (s u p 1. 1) p. 1 64- 1 65

2. 特開平 7 - 22 2588

3. 特開平 9 - 3 1 3 1 87

4. 特開 2000— 139465

5. Ha r u s h i ma e t a 1. 1 998, Ge n e 1 c s 148 p. 479 - 494

6. M i c h a e l s a nd Am a s i n o 1 9 98, Th e

P 1 a n t J o u r n a l 14 (3) p. 38 1— 385

7. N e f f e t a 1. 1 998, Th e p l a n t o u r n a 1 14 (3) p. 387 - 392

8. D. E. Ha r r y, e t a 1 ， T h e o A p 1 Ge n e t ( 1 998) 97 : p. 327 336

9. H i e i e t a 1. , P l a n t J o u r n a l ( 199 4) ， 6 (2) , p. 272 - 282

1 0. K o m a r i e t a 1. P l a n t o u r n a 1 ( 19 96) 10, p. 1 65 - 174

. D i t t a e t a 1. , P r o c. Na t l . Ac a d. S c

1 . USA (1980) ， 77 : p 7347 - 735 1

2. P. Vo s , ら、 Nu c l e i c Ac i d s R e s . V o

23 P 4407 -4414 ( 1 995)

1 3. O. P a r n aud, X. ら， Mo l . Ge n. Ge n e t . ( 996) 252 : p . 597 - 607

14. A. Ko n i e c z nyら，（1 993) , P l an t J. 4 (2) p. 403 -41 0

1 5. Edwa r d sら， Nu c l e i c Ac i d s R e s . 8 (6) ： 1 349, 1 991

1 6. Mu r r a y M. G. ら， Nu c l e i c Ac i d s R e s . 8 (1 9) ： 432 1 - 5, 1 980 1 7. T e r a d a e t a 1. , P l a n t C e l l P h y s i o 1. 2000 J u l , 41 (7) , p. 88 1— 888

18. H i r o c h i k a H. e t a 1 - 1996, P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA 93, p. 7 783 - 7 788

1 9. C u i , X. ， W i s e, R. P. a n d S c h a n b l e, P. S. ( 1 996) Th e r f 2 n u c l e a r r e s t o r e r g e n e o f ma l e - s t e r i l e T— c y t o l a sm ma i z e. S c i e n c e, 27 2, 1 334- 1 336

20. L i u, F. , C u i , X. ， Ho r n e r, H. T. , We i n e r, H. an d S c h n a b 1 e , P. S . (200 1 ) M i t o c h on d r i a l a l d e hy d e d e hy d r o g e n a s e a c t i v i t y i s r e q u i r e d f o r ma l e f e r t i l i t y i n ma i z e. Th e P l a n t C e l l , 1 3， 1 0 6 3- 1 078 実施例

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するためのものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾 ·変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。

参考例

以下の参考例は、本出願人の先の特許出願特願 2000— 247204 (2 000年 8月 17日出願）に記載された実施例に基づく。

参考例 1 R f — 1遺伝子座周辺 RF LPマーカーの PC Rマーカ一化

本参考例においては、 R f — 1遺伝子座周辺 RF L Pマーカー 9個（R 1 87 7、 G29 1、 R 2303、 S 1 2564 , C 1 36 1、 S 1001 9 G 40 03、 S 1 0602、 G 21 5 5) を P CRマーカー化した。

(1) 材料および方法 R f - 1遺伝子座周辺 R F L Pマーカー 9個（R 1 877、 G 29 1、 R 23 03、 S 1 2564, C 1 36 1、 S 1 00 1 9、 G4003、 S 10602 , G2 1 5 5) を農林水産省農業生物資源研究所から購入し、ベクタ一内の挿入塩基配列を決定した後、以下の手順で実験を行った。なお、本文中のイネ品種のうち、あそみのりはジャポニカ米であり、 I R 24はインディ力米である。

(2) ゲノミックライブラリーの作製

あそみのりの緑葉から、 CTAB法により各々トータル DNAを抽出した。 M b o Iで部分消化後、 N aC l密度勾配遠心（6〜20 %直線勾配、 20で、 3 7000 r pm、 4時間、全容量 1 2m l ) によりサイズ分画を行った。各分画 (約 0. 5m 1 ) の一部を電気泳動にかけ、 1 5〜 20 k bの DNAを含む分画を選抜 '精製した。ライブラリーの作製は、 L amb d a DASH I I (S t r a t a g e n e) をべクタ一に用いて、付属プロトコールに準拠して行つた。パッケージングには、 G i g a P a c k I I I Go l d (S t r a t a g e n e) を用いた。ノ、。ッケ一ジング後、 SM Bu f f e r 500 n 1およびクロロフオルム 20 II 1を添加した。遠心後の上清にクロロフオルム 20 1 を添加し、ライブラリー溶液とした。

ライブラリ一溶液の 50倍希釈液 5 1を用いて、 XL— 1 B l u e M RA (P 2) に感染させた。その結果、あそみのりについては 83個のプラークが出現した。ライブラリ一あたりでは、 4. 1 5 X 10⁵ρ ί uとなり、平均挿入断片長を 20 k bとすると、 8. 3 X 10⁹b pをカバーする計算になる。これは、イネゲノム（4 X 10⁸b p) に対して十分な大きさのライブラリーであると考えられた。

(3) R 1 877、 C 136 1および G4003対応ゲノミッククローンの単離

C 13 6 1および G 4003については、 R F L Pマーカ一プロ一ブを含むプラスミドを単離した後、制限酵素処理 ·電気泳動により、 RFLPマ一力一プロ —ブ部分を分離し、 DNA回収フィルタ一（T a k a r a SUPREC— 0 1) を用いて目的の DNAを回収した。 R 1 877については、マ一カープローブ両端部に対してプライマーを設計し、あそみのりトータル DNAをテンプレートに PC Rを行い、産物を電気泳動後、前述の方法で回収した。回収した DNA は、 r e d i p r i me DNA l a b e l l i n g s y s t em (Am e r s h am P h a rma c i a) を用いてラベルし、ライブラリースクリ一二ング用プローブとした。なお、 PCRは常法により行った（以下、同様）。ライブラリーのスクリーニングは、プラークを Hy b o n d— N+ (Ame r s h am P h a r ma c i a) にブロットした後、常法により行った。 I s tスクリーニング後、陽性プラーク周辺を打ち抜き、 SMバッファーに懸濁し、 2 n dスクリーニングに供試した。 2 n dスクリーニング後、陽性プラークを打ち抜き、さらに 3 r dスクリーニングを行い、単一プラークを分離した。

分離した目的プラークを SMバッファーに懸濁後、プレートライセート法によりファージを一次増殖した。得られたファージ増殖液を用いて、振とう培養法により二次増殖を行った後、 L amb d a s t a r t e r k i t (Q I AG EN) を用いてファージ DNAを精製した。

各マ一力一について、 8枚のプレートを用いて 1 s tスクリーニングを行つた。プレート 1枚につきライブラリー溶液を 1 0 1使用した。 3 r dスクリ一ニングまで行った結果、 R 1877、 C 1 36 1および G4003対応ゲノミツククローンを、それぞれ、 4個、 3個および 3個単離した。

(4) R 1 8 77の P C Rマーカー化

単離したゲノミッククロ一ンを解析し、 R F L Pの原因部位、即ち、 I R 24 (インディ力米）には存在しあそみのり（ジャポニカ米）には存在しない E C O

R I部位を同定することにより、 P CRマーカ一化を行った。

具体的には、単離した 4クローンについて以下の解析を行った。まず、 T 3および T 7プライマ一を用いて、各クローンの挿入断片の両末端の塩基配列を明らかにした。つぎに、マーカ一プローブ両端部に対して外向きのプライマーを設計し、 T 3および T 7プライマーと組合わせ（合計 4プライマ一組合せ）、各クロ

—ンをテンプレートに P CRを行った。

また、各クローンを No t Iおよび E c oR Iで消化した後、電気泳動することにより、挿入断片長および各 E c oR I断片長を推定した。これらの解析の結果、各クローンの位置関係を明らかにすることができた。一方、 RF L P解析ではマーカープローブ R I 877により日本晴（ジャポニカ米）では 20 k b、 Ka s a l a t h (ィンディ力米）では 6. 4 k bの E c o R I断片が検出されること（ f t p ： ZZ f t p. s t a f f , o r. j p/p u b/g e n e t i cma p 98/p a r e n t s o u t h e r n/c h r l O /R 1877. J PG) ことが知られている。これらの事実を併せ考えることにより、 I R 24には存在しあそみのりには存在しない E c o R I部位のおおよその位置が推定できた。そこで、その周辺を増幅するように設計したプライマ一組合わせ（配列番号 1と配列番号 2) を用いて、 94でにて 1分、 58でにて 1 分、 72でにて 2分を 1サイクルとし 30サイクルの PCR条件にてゲノミック P C Rを行った。得られた P C R産物を E c o R I処理した後、 0. 7 %ァガロースゲルで電気泳動した。

その結果、あそみのり一 I R 24間で期待通りの多型が観察された。すなわち、 PCR産物（約 3200 b p) の E c oR I処理により、 I R 24では 1 5 00 b pと 1700 b pとに切断されるのに対し、あそみのりでは切断されなかつた。あそみのり一 I R 24の R I L (R e c omb i n a n t I n b r e d L i n e) を用いてこの P C Rマーカ一をマッピングした結果、 RFLP マーカー座 R 1877と同一領域に位置づけられ、 RF L Pマーカ一 R 1 877 が P CRマーカ一に変換されたことが証明され、このマーカ一を R 1 877 E c o R Iと命名した。

(5) G4003の P CRマ一カー化

単離したゲノミッククローンを解析し、 RFLPの原因部位、即ち、あそみのりには存在し I R 24には存在しない H i n d I I I部位を同定することにより、 P C Rマ一カー化を行った。

R 1 877と同様の解析を行い、単離した 3クローンの位置関係を明らかにした。 R F L P解析ではマーカープローブ G4003により日本晴（ジャポニカ米）では 3 k b、 K a s a 1 a t hでは 10 k b (インディ力米）の H i n d I I I断片が検出されること（ f t p : Z/ f t p. s t a f f , o r. j p/p u b/g e n e t i cma Q S/ a r e n t s ou t h e r n / c h r 10 /R 1 877. J PG) ことが知られている。これらの事実を併せ考えることにより、あそみのりには存在し I R 24には存在しない H i n d I I I部位が、 2 個の候補部位のいずれかであると推定された。そこで、各 H i n d i I I部位周辺を増幅するように設計したプライマー組合せ（配列番号 3および配列番号 4) を用いて、 94 X：にて 30秒、 58 " にて 30秒、 72 :にて 30秒を 1サイクルとし 3 5サイクルの条件で、ゲノミック P CRを行った。得られた PCR産物を H i n d I I I処理後、 2 %ァガ口一スゲルで電気泳動したところ、マーカ一プローブ内部の H i n d I I I部位が多型部位であることが示された。すなわち、 P CR産物（362 b p) の H i n d i I I処理により、あそみのりでは 9 5 b pと 267 b pとに切断されるのに対し、 I R 24では切断されなかった。マッピングの結果、 R F L Pマーカ一 G 4003が P C Rマーカ一に変換されたことが証明され、このマーカーを G4003 H i n d i I I (配列番号 1 9) と命名した。

(6) C 136 1の P CRマーカ一化

単離したゲノミッククローンの塩基配列情報に基づいてプライマ一を設計した。あそみのりおよび I R 24のト一タル DN Aをテンプレートに P CRを行い、産物を電気泳動後、既述の方法で回収した。回収した DNAをテンプレートに用いて、 AB I Mo d e l 3 10により各品種の塩基配列を解読し、多型作出に利用可能な変異を探索した。

R 1877と同様の解析を行い、単離した 3クローンのおおよその位置関係を明らかにすることはできた。しかし、 C 136 1マーカ一周辺には P CR増幅しにくい領域や塩基配列を解読できない領域が存在することが明らかになり、 R F L P原因部位を同定することは困難であると考えられた。そこで、比較的長い P CR産物（2. 7 k b) が得られる領域に着目し、 d CAP S化を試みることにした。

具体的には、あそみのり、コシヒカリ（以上、ジャポニカ米）及び Ka s a l a t h、 I R 24 (以上、インディ力米）を用いて、前記領域のゲノミック PC R産物の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米 ·ィンデイカ米間で多型を示す部位を 6ケ所見出すことができた。そのうちのひとつについて、 dCAP S化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号 5および配列番号 6を用い、 9 4 にて 30秒、 58 " にて 30秒、 72 にて 30秒を 1サイクルとし 35サィクルの PC R条件にて PC Rを行った。得られた P C R産物を Mwo I処理後、 3%Me t a Ph o r ^TMァガロースで電気泳動することにより解析した。あそみのりでは 2箇所で切断され、約 25 b p、 50 b p、 79 b pのバンドが観察され、 I R 24では 1箇所で切断され、約 50 b p、 1 07 b pのバンドが観察された。マッピングの結果、 R F L Pマーカ一 C 1 36 1が P C Rマ一力一に変換されたことが証明され、このマ一力一を C 1 36 1 Mwo I (配列番号 20) と命名した。

(7) G 2 1 55の P C Rマーカー化

マーカープローブ両端部に対してプライマ一を設計し、あそみのり、コシヒ力リ、 1尺 24ぉょび1 2 1 6 (戻し交雑によりコシヒカリに R f — 1遺伝子を導入した系統、遺伝子型は R f — 1ZR f — 1) のトータル DN Aをテンプレートに P C Rを行った。 PC R産物の精製および多型作出に利用可能な変異の探索は、既述の方法で行った。

具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、 R f — 1遺伝子保有品種系統（ I R 24および I L 2 1 6) と R f — 1遺伝子非保有品種系統

(あそみのりおよびコシヒカリ）との間の変異が 3ケ所見出された。そのうちのひとつを利用して、 d CAP S化を行った。この過程で、プライマーとして配列番号 7及び配列番号 8を用い、 94 にて 30秒、 58でにて 30秒、 72 にて 30秒を 1サイクルとし 3 5サイクルの P CR条件にて P CRを行った。得られた P C R産物を Mwo I処理後、 3%Me t a Ph o r ^TMァガロースで電気泳動することにより解析した。あそみのりでは 1箇所で切断され、約 25 b p及び 1 05 b pのバンドが観察され、 I R 24では 2箇所で切断され、約 25 b p、 27 b p及び 78 b pのバンドが観察された。マッピングの結果、 RFL P マーカ一 G2 1 55が P CRマ一カーに変換されたことが証明され、このマーカ —を G2 1 55 Mwo I (配列番号 2 1 ) と命名した。

(8) G 29 1の P C Rマーカー化マーカ一プローブ内部配列に対してプライマ一を設計し、種々のプライマ一組合わせで PCRを行い、期待される大きさの増幅産物が得られるプライマー組合わせを探索した。探索により見出したプライマー組合わせで、あそみのり、コシヒカリ、 I R 24および I L 2 1 6のトータル DN Aをテンプレートに P C Rを行った。 PCR産物の精製および多型作出に利用可能な変異の探索は、既述の方法で行った。

具体的には、マーカープローブ配列に対して設計したプライマーを用いて、供試品種のゲノミック PCRを行い、産物の塩基配列を比較した。その結果、 R f ― 1遺伝子保有品種系統（ I R 24および I L 2 16) と R f — 1遺伝子非保有品種系統（あそみのりおよびコシヒカリ）との間の変異が 4ケ所見出された。そのうちのひとつを利用して、 d CAP S化を行った。この過程で、プライマ一として配列番号 9及び配列番号 1 0を用い、 94 にて 30秒、 58 にて 30 秒、 72でにて 30秒を 1サイクルとし 35サイクルの PC R条件にて PC Rを行った。得られた PC R産物を Ms p I処理後、 3%Me t a P h o r ^TMァガロースで電気泳動することにより解析した。 R f — 1遺伝子保有品種系統では 2 箇所で切断され、約 25 b p、 49 b p及び 55 b pのバンドが観察され、 R f ― 1遺伝子非保有品種系統では 1箇所で切断され、約 25 b p及び 104 b pのバンドが観察された。マッピングの結果、 R F L Pマーカー G 291が P C Rマ —カーに変換されたことが証明され、このマーカ一を G29 1 Ms p i (配列番号 22) と命名した。

(9) R 2303の P C Rマーカー化

マ一力一プローブ内部配列に対してプライマーを設計し、あそみのり（ジャポ二力米）、 I R 24および K a s a 1 a t h (ィンディ力米）のトータル DN A をテンプレートに P CRを行った。産物の精製および多型作出に利用可能な変異の探索は、既述の方法で行った。

供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米一インディ力米間の変異が見出された。この変異は、 B s 1 I認識部位に生じていたので、そのまま CAP Sマーカーとした。この過程で、プライマ一として配列番号 1 1及び配列番号 1 2を用い、 94 にて 1分、 58でにて 1分、 72 にて2分を 1サィクルとし 3 0サイクルの PC R条件にて P CRを行った。得られた P CR産物を B s 1 I処理後、 2 %ァガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポ二力米では 1箇所で切断され、約 2 38 b p及び 1 3 34 b pのバンドが観察され、インディ力米では 2箇所で切断され、約 2 38 b p、 6 5 513 及び6 7 9 b pのバンドが観察された。マッピングの結果、 RFL Pマーカー R 2 3 0 3が PCRマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーを R 2 3 0 3 B s 1 I (配列番号 2 3) と命名した。

( 1 0) S 1 0 0 1 9の P C Rマ一カー化

S 1 0 0 1 9の P CRマーカー化は、上記 R 2 30 3の P C Rマーカー化の方法（9) にしたがって行った。

具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米一インディ力米間の変異が見出された。この変異は、 B s t U I認識部位に生じていたので、そのまま CAP Sマ一カーとした。この過程で、プライマーとして配列番号 1 3及び配列番号 14を用い、 94 にて1分、 5 8でにて 1分、 Ί 2°C にて 1分を 1サイクルとし 30サイクルの PCR条件にて P CRを行った。得られた PCR産物を B s t U I処理後、 2 %ァガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では 1箇所で切断され、約 1 3 0 b p及び 46 2 b pのバンドが観察され、ィンデイカ米では 2箇所で切断され、約 1 3 0 b p、 2 1 8 b P及び 244 b pのバンドが観察された。マッピングの結果、 RFLPマーカ — S 1 0 0 1 9が P CRマーカ一に変換されたことが証明され、このマーカーを B s t U I (配列番号 24) と命名した。

( 1 1) S 1 0 6 02の P C Rマ一力一化

S 1 0 60 2の P CRマーカ一化は、上記 R 2 3 0 3の P CRマーカ一化の方法（9) にしたがって行った。

具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米一インディ力米間の変異が見出された。その変異を利用して、 CAP S化を行つた。この過程で、プライマーとして配列番号 1 5及び配列番号 1 6を用い、 9 4°Cにて 1分、 5 8 にて 1分、 7 2でにて 1分を 1サイクルとし 3 3サイクルの P CR条件にて P CRを行った。得られた P CR産物を Kp n I処理後、 2 % ァガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では 1箇所で切断され、約 1 1 7 b p及び 607 b pのバンドが観察され、インディ力米では切断されず、 724 b pのバンドが観察された。マッピングの結果、 RFLPマーカ一 S 1 0 602が PCRマーカーに変換されたことが証明され、このマーカーを S 106 02 Kp n I (配列番号 25) と命名した。

(1 2) S 1 2 564の P CRマーカー化

S 1 2 564の PCRマーカ一化は、 R 2303の P C Rマ一カー化の方法にしたがって行った。

具体的には、供試品種の対応領域の塩基配列を比較した結果、ジャポニカ米一インディ力米間の変異が見出された。その変異を利用して、 d CAP S化を行つた。この過程で、プライマーとして配列番号 17及び配列番号 1 8を用い、 9 4でにて 30秒、 58でにて 30秒、 72"Cにて 30秒を 1サイクルとし 35サィクルの PC R条件にて PC Rを行った。得られた PC R産物を T s p 509 I 処理後、 3 %Me t a P h o r ^TMァガロースで電気泳動することにより解析した。ジャポニカ米では 2箇所で切断され、 26 b p、 41 b p及び 9 1 b pのバンドが観察され、インディ力米では 1箇所で切断され、 41 b p及び 1 1 7 b p のバンドが観察された。マッピングの結果、 RF L Pマーカー S 12564が P C Rマーカーに変換されたことが証明され、このマーカ一を S 1 2564 T s P 509 I (配列番号 26) と命名した。

参考例 2 R f — 1遺伝子座のマッピング

MSコシヒカリに MS— FRコシヒカリの花粉をかけて作成した F 1集団 10 42個体の幼苗から DNAを抽出し、分析に供試した。ここで、 MSコシヒカリとは、細胞質を BT型雄性不稔細胞質に置換したコシヒカリである（世代： BC 1 O F 1 ) 。また、 MS— FRコシヒカリとは、 I R 8 (農業生物資源研究所より入手）に由来する R f — 1遺伝子を MSコシヒカリに導入した系統である（R f - 1遺伝子座へテロ）。

まず、 R f — 1遺伝子座を挟むと考えられる、参考例 1に記載の 2個のマーカ一座 R 1 877 E c o R Iおよび G 2 1 5 5 Mw o Iにおける各個体の遺伝子型を調査した。 R 1877 E c o R I座または G 2 1 55 Mwo l座に関してジャポニカ米型ホモ個体を、これら 2マーカー座間での組換え体とみなした。つぎに、各組換え体について、さらに、 G291 Ms p l座、 R23 03 B s l l座、 S 12564 Ts p 509 I座、 C 1361 Mwo I 座、 S 10019 B s tU I座、 G4003 H i nd i I I座ぉょび 1 0602 Kp n I座の遺伝子犁を調査し、組換え位置を同定した。

R 1877 E c o R I座および G 2155 Mw o I座に関する遺伝子型調査の結果、稔性を回復した 46個体が R f 一 1遺伝子座付近での組換え体であることが明らかになった。これら組換え体について、 R f _ l遺伝子座近傍マー力一座の遺伝子型を調査した結果を表 3に示す。

0

表 3 Rf-1 座近傍組換え個体のマーカー座遺伝子型

Locus 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 16 19 20 21 22 23

R1877 EcoRI J J J J J J J J H H H " H H H H H •H H H H H H H

G291 spl H J J J J J J J H H H H H H H H H H H H H H H

R2303 Bsl! H H J J J J J J H H H H H H H H H H H H H H H

S12564 Tsp509l H H H H H H H J H H H H H H H H H H H H H H H

C1361 Mwol H H H H H H H H J J H H H H H H H H H H H H H

S10019 BstUI H H H H H H H H J J J J J J J J H H H H H H H

G4003 Hlndlll H H H H H H H H J J J J J J J J J J J J J J J

S106O2 Kpnl ■ H H H H H H H H J J J J J J J J J J . J J J J J

G2155 Mwol H H H H H H. H ： H . J J . J J J · J J J J J J J J J J

24 25 26 27 + 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 3Θ 39 40 41 42 43 44 45 46

H H H H H H H H - H H H H H. H H H H H H H H H H

H H . H H H H H H H H H H H H H H H H H■ ' H , H H H

H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H ： H H H

H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H H

H . H H H H H H H H H H H H H . H H H H H H H H H

■H- H H H H. H H H H H H H H H H H H H Ή H H. H H

J ' J J J J J J J J H H H H H H H H H H H . H H H

J J J J J J J J J J J J J J J J J J J • J J H H

J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J J

シヒカリ 52ホモ

コシヒカリ aa/Ms-FRコシヒ力リ型ヘテロ表 3に示されたように、 S 1 2 564 T s p 509 Iマ一カーがジャポニカ型である個体 8と、 C 1 36 1 Mwo I座マ一カーがジャポニカ型である個体 9 および個体 1 0が得られた。いずれも稔性を回復した個体であることから、前者は R f — 1座と S 1 2564 T s p 509 I座との間での組換え個体、 R f _ 1座と C 1 36 1 Mwo I座との間での組換え個体と解し、 R f — l遺伝子は S 12564 T s p 509 I座と C 1 36 1 Mw o I座との間に存在することが判明した。上記交配において、 BT型雄性不稔細胞質を持つ個体では、 R f 一 1遺伝子をもつ花粉のみが受精能力を持つとの報告（C. S h i n j y o , J APAN. J . GENET I CS Vo l . 44， No. 3 ： 149 - 1

56 ( 1 969) ) に基づいて、 R f — 1遺伝子座を詳細連鎖地図上に位置づけることができた（図 4)

実施例 1 R f — l座極近傍組換え個体の獲得

(材料および方法）

MSコシヒカリ（世代： BC 10 F 1) に MS— FRコシヒカリ（世代： B C 9 F 1、 R f — l座へテロ）の花粉をかけて作成した B C 1 0 F 1集団 4 1 03 個体を用い、各固体から DNAを抽出し、上記参考例 2と同様に、 S 12 564 T s p 50 9 I座および C 136 1 Mw o I座の遺伝子型を調査した。 S 12 564 T s p 509 I座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、 R f — l座と S 12564 T s p 509 I座との間での組換えにより生じた個体とみなし、 C 136 1 Mwo I座の遺伝子型がコシヒカリ型ホモ個体を、 R f — 1座と C 1 36 1 Mwo I座との間での組換えにより生じた個体とみなした。

(結果および考察）

41 03個体を調査した結果、 R f — 1座と S 1 2564 T s p 509 I座との間での組換え個体を 1個体、 R f — 1座と C 1 36 1 Mwo l座との間での組換え個体を 6個体見出した。一方、上記参考例 2において交配により得られた 1042個体を調査した結果、表 3に示したように、 R f — 1座と S 1 256 4 T s p 509 I座との間での組換え個体を 1個体、 1^ _ 1座と( 1 36 1 Mwo I座との間での組換え個体を 2個体見出している。合計すると、 5 145個体から、 R f — 1座と S 1 2564 T s p 509 I 座との間での組換え個体を 2個体、 R f — 1座と C 1 36 1 Mwo l座との間での組換え個体を 8個体獲得できたことになる。これら 1 0個体を以下の実施例における高精度分離分析に供試することにした。

実施例 2 染色体歩行

(1) 1回目染色体歩行

(材料および方法）

ジャポニカ品種あそみのり（R f — 1非保有品種）のゲノム DNAを用いて、参考例 1に記載したように L amb d a DASH I Iベクターによりゲノミックライブラリ一を作成し、染色体歩行に供試した。

RF L Pプロ一ブ S 1 2564の部分塩基配列（ァクセッション番号 D 47 284) に対して次のプライマー対：

5 ' -atcaggagcct tcaaat tgggaac- 3 ' (配列番号 29) および

5 ' -ctcgcaaattgcttaattttgacc - 3 ' (配列番号 30 )

を設計し、あそみのりトータル DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PC Rを行った。得られた約 1 200 b pの増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。精製した DNA は、 r e d i p r i me DNA l a b e l l i n g s y s t em Ame r s h am P h a rma c i a社）を用いてラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ A、図 1) とした。

ライブラリーのスクリーニングは、プラークを Hy b o nd— N⁺ (Ame r s h am Ph a rma c i a社）にブロッ卜した後、常法により行った。単一プラークを分離した後、 L amb d a M i d i k i t (Q I AG EN社）を用いてプレートライセ一卜法によりファージ DN Aを精製した。

(結果および考察）

スクリーニングにより 4個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（WSA 1および WSA 3) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WSA 1 および WS A 3に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した（DNAシ一ケンサー 3 7 7、 AB I社）。

(2) 2回目染色体歩行

(材料および方法）

既述のあそみのりゲノミックライブラリーに加え、インディ力品種 I R 24 (R f - 1保有品種）のゲノム DNAから同様に作成した I R 24ゲノミツクライブラリーを、染色体歩行に供試した。

(1) で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対： 5 ' -tgaaggagttatgggtgcgtgacg- 3 ' (配列番号 3 1 ) および

5 - t tgccgagcacact tgccatgtgc- 3 (配歹 'J番号 32 )

を設計し、 WS A 3の DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行つた。得られた 524 b pの増幅産物を、既述の方法で精製 · ラベルし、ライブラリ一スクリーニング用プローブ（プローブ E、図 1) とした。

ライブラリ一のスクリーニングおよびファージ DN Aの精製は、既述の方法で行った。

(結果および考察）

あそみのりゲノミックライブラリ一スクリーニングにより 1 5個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（WSE 8) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WS E 8に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。

I R 24ゲノミックライブラリースクリーニングにより 7個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（XS E 1および XS E 7) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマ一歩行により、 XS E 1および XSE 7に対応する I R 24ゲノム塩基配列を決定した。

(3) 3回目染色体歩行

(材料および方法）

既述のあそみのりゲノミックライブラリ一および I R 24ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。 (2) で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対して次のプライマー対： 5 ' -gcgacgcaatggacatagtgctcc- 3 ' (配列番号 3 3 ) および

5 - t tacctgccaagcaatatccatcg- 3 (配列番 34)

を設計し、 WS E 8の DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCRを行つた。得られた 1 1 5 9 b pの増幅産物を、既述の方法で精製 ' ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ F、図 1) とした。

ライブラリーのスクリ一ニングおよびファージ DN Aの精製は、既述の方法で行った。

(結果および考察）

あそみのりゲノミックライブラリ一スクリーニングにより 8個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（WS F 5および WS F 7) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマ一歩行により、 WS F 5および WS F 7に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。

I R 24ゲノミックライブラリ一スクリ一ニングにより 1 3個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（XS F 4および XS F 2 0) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマ一歩行により、 X S F 4および X S F 2 0に対応する I R 24ゲノム塩基配列を決定した。

(4) 4回目染色体歩行

(材料および方法）

既述のあそみのりゲノミックライブラリ一および I R 24ゲノミックライブラリーを、染色体歩行に供試した。

(3) で明らかにしたあそみのりゲノム塩基配列に対してプライマー対： 5， -aaggcatactcagtggagggcaag- 3 (配歹 'J番号 3 5 ) および

5 ' — t taacctgaccgcaagcacctgtc- 3 (配歹幡号 36 )

を設計し、 WS F 7の DNAをテンプレートに用いて、定法に従い P CRを行つた。得られた 45 6 b pの増幅産物を、既述の方法で精製 ' ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ G、図 1) とした。ライブラリ一のスクリーニングおよびファージ DN Aの精製は、既述の方法で行った。

(結果および考察）

あそみのりゲノミックライブラリースクリーニングにより 6個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのふたつ（WS G 2および WS G 6) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマー歩行により、 WS G 2および WS G 6に対応するあそみのりゲノム塩基配列を決定した。

I R 24ゲノミックライブラリ一スクリーニングにより 14個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちの 3 クローン（XSG8、 XSG 1 6および XS G 22) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマ一歩行により、 XS G8、 3016ぉょび 3 G 22に対応する I R 24ゲノム塩基配列を決定した。

(5) 5回目染色体歩行

(材料および方法）

既述の I R 24ゲノミックライブラリ一を、染色体歩行に供試した。

本発明者らは、 T I GR (Th e I n s t i t u t e f o r Ge n om

1 c R e s e a r c h) の公開ホームページを閲覧し、 RFL Pマ一カー S 1

2564を包含する BAC (B a c t e r i a 1 A r t i f i c i a l C h r omo s ome) クロ一ン（ァクセッション番号 AC 068923) が公開デ

—夕べ一ス（Ge nB a nk) に登録されていることを見出した。この BACクローンは、ジャポニカ品種日本晴のゲノム DNAを含むものであり、塩基配列を比較したところ、（1) ― (4) で作成したあそみのりおよび I R 24のコンテイダ領域を完全に包含することが示された（図 2) 。

そこで、この B ACクローンの一部を増幅する次のプライマー対：

5 ' -tggatggactatgtggggtcagtc- 3 ' (配列番号 37 ) および

5 ' -agtggaagtggagagagtagggag- 3 ' (酉己列番号 38) を設計し、 I R 24トータル DNAをテンプレートに用いて、定法に従い PCR を行った。得られた約 600 b pの増幅産物を、既述の方法で精製 · ラベルし、ライブラリースクリーニング用プローブ（プローブ H、図 1) とした。

ライブラリーのスクリーニングおよびファージ DN Aの精製は、既述の方法で行った。

(結果および考察）

I R 24ゲノミックライブラリースクリーニングにより 1 5個のクローンが得られ、末端塩基配列の解析および制限酵素断片長解析の結果から、そのうちのひとつ（XSH 18) は図 1に示した位置関係にあることが示された。プライマ一歩行により、 XSH 18に対応する I R 24ゲノム塩基配列を決定した。実施例 3 高精度分離分析

(1) PCRマ一力一 P 4497 Mb o lの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 28) とを比較した結果、配列番号 27の 1239番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 28の 1 263 1番目の塩基は Gであることを見出し ,た。

この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P 4497 Mb o l F ：

5 -ccctccaacacataaatggttgag- 3 (酉己列番号 39 )

(配列番号 27の塩基 85 3— 876に相当）

(配列番号 28の塩基 12247— 12270に相当）

および .

P 4497 M o l R ：

5 ' -tttctgccaggaaactgttagatg- 3 ' (配列番号 40)

(配列番号 27の塩基 1 583— 1 560に相当）

(配列番号 28の塩基 12 975— 1 2952に相当）を用いて当該部位周辺の P CR増幅を行い約 730 b pの断片を増幅する。増幅産物を Mb o l処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は Mb 0 Iの認識配列 (GATC) をもたず、 Mb 0 I処理により切断されないのに対し、あそみのり DNAからの増幅産物は Mb o Iの認識配列をもち、 Mb o l処理により切断されるため、 Mb 0 I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(2) PCRマーカ一 P 949 3 B s 1 Iの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 28) とを比較した結果、配列番号 27の 6227番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 28の 1 7627番目の塩基は Cであることを見出した。

この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P 9493 B s 1 I F ：

5， -gcgatct tatacgcatactatgcg- 3 (配列番号 41)

(配列番号 27の塩基 6 129 - 6 1 52に相当）

(配列番号 28の塩基 1 7529— 1 75 52に相当）

および

P 9493 B s 1 I R ：

5 ' -aaagtctttgttccttcaccaagg- 3 ' (配列番号 42)

(配列番号 27の塩基 6254 - 6231に相当）

(配列番号 28の塩基 1 7654— 1763 1に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 1 26 b pの断片を増幅する。増幅産物を B s 1 I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24 DNAからの増幅産物は B s 1 Iの認識配列 (C CNNNNNNNGG) をもたず、 B s 1 I処理により切断されないのに対し、あそみのり DN Aからの増幅産物は B s 1 Iの認識配列をもち、 B s 1 I処理により切断されるため、 B s 1 I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

なお、本マ一カーの開発には、 d C AP S法（M i c h a e 1 s a n d A ma s i n o 1 998, N e f f e t a 1 1 998) を適用した。具体的には、前記 P 9493 B s 1 I Rプライマーの使用により、配列番号 2 7の 62 36および配列番号 28の 1 7636の aが gに置換される。これにより、あそみのり DNA由来の断片は、配列番号 28の 1 7626— 1 7636の部分の配列が CC t t t c c t t となり、 B s 1 I処理により切断される。

(3) P CRマーカ一 P 23945 Mb o lの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 28) とを比較した結果、配列番号 27の 20680番目の塩基が Gであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 28の 32079番目の塩基は Aであることを見出した。

この差異の検出には、先ず次のプライマ一対：

P 23945 Mb o l F ：

5 — gaggat t tatcaaaacaggatggacg— 3 (配列番 43)

(配列番号 27の塩基 205 1 9 - 20544に相当）

(配列番号 28の塩基 3 1 9 1 8— 3 1 943に相当）

および

P 23945 Mb o l R ：

5， - tgggcggcagcagtggaggataga- 3 ' (配歹 'J番号 44)

(配列番号 27の塩基 207 78— 207 55に相当）

(配列番号 28の塩基 32 1 77— 32 1 54に相当）

を用いて当該部位周辺の PC R増幅を行い 260 b pの断片を増幅する。増幅産物を Mb o l処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は Mb o Iの認識配列 (GATC) をもち、 Mb o I処理により切断されるのに対し、あそみのり DN Aからの増幅産物は Mb o Iの認識配列をもたず、 Mb o I処理により切断されないため、 Mb o I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(4) P CRマーカー P 4 1 0 30 T a Q Iの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 28) とを比較した結果、配列番号 27の 45461番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 28の 49164番目の塩基は Gであることを見出した。

この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P 41030 T a q I F：

5 — aagaagggagggttatagaatctg- 3 (配歹 U番 45)

(配列番号 27の塩基 45369— 45392に相当）

(配列番号 28の塩基 49072— 49095に相当）

および

P 41030 T a q I R：

5 — atatcaggactaacaccactgctc- 3 (配列番号 46)

(配列番号 27の塩基 45648-45625に相当）

(配列番号 28の塩基 49351— 49328に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 280 bpの断片を増幅する。増幅産物を Ta q l処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は T a q Iの認識配列 (TCGA) をもたず、 T a q I処理により切断されないのに対し、あそみのり DN Aからの増幅産物は T a q Iの認識配列をもち、 T a Q I処理により切断されるため、 T a q I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(5) P C Rマーカー P 45177 B s t U Iの開発

実施例 2で明らかにした I R24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) とあそみのりコンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 28) とを比較した結果、配列番号 27の 49609番目の塩基が Aであるのに対し、当該位置に対応する配列番号 28の 533 1 1番目の塩基は Gであることを見出した。

この差異の検出には、先ず次のプライマー対：

P 45 1 77 B s t U I F ：

5 ' - acgagtagtagcgatct tccagcg- 3 (酉己列番号 47)

(配列番号 27の塩基 49355 -49378に相当）

(配列番号 28の塩基 53057 - 5 3080に相当）

および

P 45 1 77 B s t U I R ：

5 — cagcgtgaaac taaaaacggaggc - 3 (配列番号 48)

(配列番号 27の塩基 50 166— 50 143に相当）

(配列番号 28の塩基 53868— 53845に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い 8 1 2 b pの断片を増幅する。増幅産物を B s t U I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は B s t U Iの認識配列（CGCG) を 2個所もち、 B s t U I処理により 3個の断片に切断されるのに対し、あそみのり DN Aからの増幅産物は B s t U Iの認識配列を 3個所もち、 B s t U I処理により 4個の断片に切断されるため、 B s 1; ； 1処理後の13 N A鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(6) P CRマーカー B 60304 Ms p lの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC 068923) の塩基配列とを比較した結果、配列番号 27の 56368番目の塩基が Tであるのに対し、当該位置に対応する AC 068923の塩基は Cであることを見出した。

この差異の検出は、先ず次のプライマ一対：

B 603 04 Ms p l F ：

5 ' — atcccacatcatcataatccgacc— 3 (酉己列番号 49 (配列番号 27の塩基 56 149— 56 1 7 2に相当）

および

B 60304 Ms p l R ：

5 -agcttctcccttggatacggtggcg- 3 (酉己列番号 50 )

(配列番号 27の塩基 56479— 5645 5に相当）

を用いて当該部位周辺の P CR増幅を行い約 330 b pの断片を増幅する。増幅産物を Ms p i処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は M s p Iの認識配列 (CCGG) をもたず、 M s p I処理により切断されないのに対し、日本晴 DN Aからの増幅産物は M s p Iの認識配列をもち、 M s p I処理により切断されるため、 M s p I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

なお、本マーカ一の開発には、 d CAP S法を適用した。具体的には、 B 60 304 Ms l Rプライマ一の使用により、配列番号 27の 56463の g が tに置換される。これにより、配列番号 27の 56460— 56463の Ms P Iの認識配列 CCG_^が c c g tとなり、 Ms p lによって切断されなくなる。よって、 I R 24由来の断片は Ms p Iの認識配列を一つも有さず、一方、日本晴由来の DN Aは、配列番号 27の 56367— 56370に対応する領域に 1箇所 Ms p Iの認識配列を有することとなる。

(7) P CRマーカ一 B 59066 B s a J Iの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC 068923) の塩基配列とを比較した結果、配列番号 27の 57629番目の塩基が Cであるのに対し、当該位置に対応する AC 068923の塩基は CCであることを見出した。

この差異の検出は、先ず次のプライマー対：

B 59066 B s a J I F ：

5， -atttgttggttagttgcggctgag- 3 ' (配列番号 5 1 )

(配列番号 27の塩基 57563- 57586に相当）および

B 59066 B s a J I R ：

5 ' -gcccaaactcaaaaggagagaacc- 3 ' (酉己列番号 52)

(配列番号 27の塩基 5798 3 - 57960に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 420 b pの断片を増幅する。増幅産物を B s a J I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24 DN Aからの増幅産物は B s a J Iの認識配列（CCNNGG) をもたず、 B s a J I処理により切断されないのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は B s a J Iの認識配列をもち、 B s a J I処理により切断されるため、 B s a J I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(8) P CRマーカー B 56 69 1 Xb a lの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンティグに対応するゲノム塩基配列（配列番号 27) と既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC 068923) の塩基配列とを比較した結果、配列番号 27の 66267番目の塩基が Gであるのに対し、当該位置に対応する AC 068923の塩基は Cであることを見出した。

この差異の検出は、先ず次のプライマー対：

B 56691 X b a I F ：

5 -cctcaagtctcccctaaagccact - 3 ( 列番号53)

(配列番号 27の塩基 66 1 29— 66 1 52に相当）

および

B 5669 1 X b a I R ：

5， -gctctactgctgataaaccgtgag- 3 (ge列番 54)

(配列番号 27の塩基 66799— 66776に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 670 b pの断片を増幅する。増巾; 産物を Xb a l処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は Xb a Iの認識配列 (TCTAGA) をもたず、 X b a I処理により切断されないのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は Xb a Iの認識配列をもち、 Xb a I処理により切断されるため、 Xb a I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(9) P CRマ一カー B 53627 B s t Z 1 7 Iの開発

実施例 2で明らかにした I R 24コンテイダに対応するゲノム塩基配列（配列番号 2 7 ) と既述の B ACクローン（ァクセッション番号 AC 068923) の塩基配列とを比較した結果、配列番号 27の 6933 1番目の塩基が Tであるのに対し、当該位置に対応する AC 068923の塩基は Cであることを見出した。

この差異の検出は、先ず次のプライマ一対：

B 53627 B s t Z 1 7 I F ：

5， - tggatggactatgtggggtcagtc- 3 ' (配列番号 5 5)

(配列番号 27の塩基 68965 - 68988に相当）

および

B 53627 B s t Z 1 7 I R :

5 - agtggaagtggagagagtagggag- 3 (配列番号 56)

(配列番号 27の塩基 69582— 69559に相当）

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い約 620 b pの断片を増幅する。増幅産物を B s t Z 1 7 I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 I R 24DNAからの増幅産物は B s t Z 1 7 Iの認識配列（GTATAC) をもち、 X b a I処理により切断されるのに対し、日本晴 DNAからの増幅産物は B s t Z 17 Iの認識配列をもたず、 B s t Z 1 7 I処理により切断されないため、 B s t Z 1 7 I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(1 0) P C Rマーカー B 40936 Ms e lの開発

以下の（10) ― (1 2) の P CRマ一カーの開発はいずれも、配列番号 27 の 3 ' 末端 76363よりもさらに下流（3 ' 末端）側に相当する塩基配列についての研究に関する。既述の BACクローン（ァクセッション番号 AC 068923) の塩基配列に対して、次のプライマ一対：

5 ' - tacgacgccatttcactccat tgc- 3 ' (配列番号 57 )

および

5 ' -catttctctatgggcgttgctctg- 3 ' (配列番号 58)

を設計した。このプライマ一対を用いて、 MS— FRコシヒカリ（ー 1座の遺伝子型は R f — l R f - 1) およびコシヒカリのトータル DNAをテンプレ一卜に、定法に従い PC Rを行った。得られた約 1 300 b pの増幅産物を、 7 ガロースゲルでの電気泳動後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。精製した DNAの塩基配列を、 DNAシーケンサ一 377 (AB I社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。

そのひとつは、次のプライマ一対：

B 409 36 M s e l F ：

5 — acctgtaggtatggcaccttcaacac— 3 (酉己列番^■ 59リ

および

B 409 36 Ms e l R ：

5 ' -ccaaggaacgaagt tcaaatgtatgg- 3 (配列番号 60リ

を用いて当該部位周辺の P CR増幅を行い、増幅産物を Ms e I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 MS 一 FRコシヒカリ（R i— l R f — 1 ) DNAからの増幅産物は M s e Iの認識配列（TTAA) をもち、 Ms e I処理により切断されるのに対し、コシヒ力リ DNAからの増幅産物は M s e Iの認識配列をもたず、 Ms e I処理により切断されないため、 M s e I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

なお、本マーカ一の開発には、 d CAP S法を適用した。

(1 1) P C Rマーカー B 1 9839 Mwo lの開発

既述の B ACクローン（ァクセッション番号 AC 068923) の塩基配列に対して、次のプライマ一対：

5 ' - tgatgtgtttgggcatccctttcg- 3 ' (配列番号 6 1 ) および

5 ' -gagataggggacgacagacacgac- 3 ' (配歹 'J番号 62)

を設計した。このプライマ一対を用いて、 MS— FRコシヒカリ（R f — 1 R f - 1 ) およびコシヒカリのトータル DNAをテンプレートに、定法に従い PC Rを行った。得られた約 1 200 b pの増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。精製した DNAの塩基配列を、 DNAシーケンサー 377 (AB I社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。

そのひとつは、次のプライマ一対：

B 1 9839 Mwo I F ：

5 ' -tcctatggctgtttagaaactgcaca- 3 ' (配列番号 63 )

および

B 1 9839 Mwo I R：

5 — caagt tcaaacataactggcgt tg— 3 ( 列番号64)

を用いて当該部位周辺の P CR増幅を行い、増幅産物を Mwo I処理後、ァガロ —スゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 MS 一 FRコシヒカリ（R f — 1 R f — 1) DNAからの増幅産物は Mwo Iの認識配列（GCNNNNNNNGC) をもたず、 Mw o I処理により切断されないのに対し、コシヒカリ DNAからの増幅産物は Mwo Iの認識配列をもち、 Mw o I処理により切断されるため、 Mwo I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロ —スゲル中の移動度の差異として検出することができる。

なお、本マ一カーの開発には、 d CAP S法を適用した。

(1 2) PCRマーカー B 2387 B f a I の開発

5 ' -cactgtcctgtaagtgtgctgtgc- 3 ' (配列番号 65 )

および

5 -caagcgtgtgataaaatgtgacgc- 3 (配列番号 66 ) を設計した。このプライマー対を用いて、 MS— FRコシヒカリ（R f — 1 R f - 1 ) およびコシヒカリのトータル DNAをテンプレートに、定法に従い PC Rを行った。得られた約 1300 b pの増幅産物を、ァガロースゲルでの電気泳動後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。精製した DN Aの塩基配列を、 DN Aシーケンサ一 3 77 (AB I社）により解析した結果、数個所において多型を見出すことができた。

そのひとつは、次のプライマ一対：

B 238 7 B f a I F ：

5 ' - tgcctactgccattact tgtgac- 3 ' (配列番号 67)

および

B 238 7 B f a I R ：

5 ' -acatactaccgtaaatggtctctg- 3 ' (配列番号 68 )

を用いて当該部位周辺の PCR増幅を行い、増幅産物を B f a I処理後、ァガロースゲルで電気泳動することにより、可視化することができる。すなわち、 MS — FRコシヒカリ（R f — 1 R f — 1 ) DNAからの増幅産物は B f a Iの認識配列（CTAG) をもたず、 B f a I処理により切断されないのに対し、コシ , ヒカリ DNAからの増幅産物は B f a Iの認識配列をもち、 B f a l処理により切断されるため、 B f a I処理後の DNA鎖長が異なり、ァガロースゲル中の移動度の差異として検出することができる。

(1 3) 分離分析

実施例 1で得られた、 R f — 1座と S 12564 T s p 509 I座との間での組換え個体 2個体（R S 1および R S 2) および R f — 1座と C 136 1 M wo I座との間での組換え個体 8個体（1 じ 1から1^〇 8) について、上記 (1) ないし（1 2) で開発した 1 2個の DNAマーカ一座の遺伝子型を調査した。結果を、各個体の S 12564 T s p 509 I座および C 1 36 1 Mw o I座の遺伝子型とともに表 4に示した。表⁴ 7座極近傍組換え個体のマーカー座遺伝子型

Locus ' . SI S2 RC1 RC2 RC3 RC4 RC5 RC6 RC7 RC8

S12564 Tsp509l J J H H H H H H H H

P4497 Mbol J J H H H H H H H H

P9493 8sll . H H H H H H H H H H

P23945 Mboi H H H H H H H H H H

P4I030 Taql. H H H H H H H H H H

P 5177 BstUI H H H H H H H H H H

860304 Mspl H H H H H H H H H H

B59066 BsaJI H H H H H H H H H H

Θ56691 Xbal H H H H H H H H H

B53627 Bst217l H H H H H H H H H

B40936 sel H H H H H H H H H

B 19839 wol H . H H ■ H H J H H H

B2387 Bfal H H H H H J H H J

C.1361 Mwol H H J J J J J J J

Iシヒカリ Sホモ .

Iシヒカリ型 ZMS-FRコシヒカリ型へテロ

表 4は、いずれの個体も P 9493 83 1 1なぃし 590.66 B s a J I の間については、インディ力型品種由来の R f — 1染色体領域を有することを示す。この結果から、図 3で示したような染色体構をもつ組換え型花粉において、花粉の受精能力があること、すなわち、 R ί— 1遺伝子が機能していることが示された。これは、これらの組換え型花粉が共有するインディ力型領域、すなわち、最大限に見積もっても Ρ 4497 Mb ο I座から Β 5669 1 X b a I座までの領域（約 65 k b) に、 R f — 1遺伝子の機能の有無を決定する配列が含まれることを意味する。

ただし、 R f — 1遺伝子の一部の遺伝子型がインディ力型であることが、 R f - 1遺伝子の遺伝子機能発現に重要であり、残りの部分はジャポニカ型でもインディ力型でも遺伝子機能に大きな差異を生じない可能性がある。よって、上記共有インディ力型領域（配列番号 27の塩基 1239ないし 66267) が R ί— 1遺伝子全体を完全に包含するとは、断定できない。しかしながら、以下の理由、

3) 配列番号 27の 5 ' 末端は、上記共有インディ力型領域の 5，末端から 1 238 b p上流に位置し、別の遺伝子（S 1 2564) の一部である；および 4) 配列番号 27の 3 ' 末端は、上記共有インディ力型領域の 3，末端から

1 009 6 b p下流に位置する

実施例 4 XSE 1由来の 9. 7 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XSE 1 (図 1および 5) を No t Iで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 9, 7 k bの断片（配列番号 2 7の塩基 1— 9657を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。

一方、 p SB l l (K oma r i ら、上述）を基に、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間べクタ一 p S B 200を作成した。具体的には、先ず、ュビキチンプロモーターとュビキチンィントロン（P u b i— u b i l ) に、ノパリン合成酵素のターミネータ一（Tn o s) を接続した。これより得られた P u b i -u b i l -Tn o s接続体の u b i I -Tn o s間に、ハイグロマイシン体制遺伝子（HYG (R) ) を挿入することにより、 P u b i— u b i I— H YG (R) —Tn o sからなる接続体を得た。この接続体を、 p SB 1 1の H i n d I I I /E c o R I断片に接続することにより、 pKY 205を得た。この ρ ΚΥ 205の P u b i上流に存在する H i n d I I I部位に N o t I、 N s p V、 E c oRV、 Kp n l、 S a c l、 E c oR Iの制限酵素部位を追加するためのリンカ一部位を挿入することにより、ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを有する p S B 200を得た。

上記プラスミドベクター P S B 200を No t lで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP (T AKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクタ一断片を精製した。

上記により準備した、 XS E 1由来の 9. 7 k b断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g t i o n K i t V e r . 1 (TAKA RA社）を用いてライゲ一シヨン反応を行った。反応後、エタノール沈殿により DN Aを回収した。回収した DN Aを純水（M i 1 1 i p o r e社製装置により作成）に溶解後、大腸菌 DH 5ひと混合し、エレクト口ポレーシヨンに供試した。エレクト口ポレーシヨン後の溶液を、 LB培地で振盪培養（37° (：、 1時間）した後、スぺクチノマイシンを含む LBプレートに広げ、加温（37°C、 16時間）した。生じたコロニーのなかの 24個についてプラスミドを単離した。その制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、組換えプラスミドにより形質転換された所望の大腸菌を選抜した。

上記により選抜した大腸菌を、 Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n s菌株 L B A4404 p S B 1 (Koma r i e t a 1 , 199 6) およびへルパ一大腸菌 HB 1 0 1/ p RK 20 1 3 (D i t t a e t a 1， 1 980) とともに供試して、 D i t t a e t a l (1 980) の方法に従い、三菌系交雑 ( t r i p a r e n t i a l ma t i n g) を行つた。スぺクチノマイシンを含む A Bプレ一卜に生じたコロニーのなかの 6個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のァグロパクテリゥムを選抜した。

上記により選抜したァグロパクテリゥムを用いて、 H i e i e t a 1 ( 1994) の方法に準拠し、 MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要な MSコシヒカリの未熟種子は、 M Sコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。

形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、 ' 48個体の植物を、 1 5000アールのワグネルポットに移植し（4個体ノポット）、移植 3〜4週間後に短日条件の温室に移した。出穂約 1か月後に、種子稔性を立毛調査した。 (結果および考察）

形質転換植物 48個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 9. 7 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 5 XS E 7由来の 14. 7 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XS E 7 (図 1および 5) を E c 0 R Iで完全消化後、ェ夕ノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを ΤΕ溶液に溶解後、 D NA B l un t i n g K i t (TAKARA社）により平滑化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された 14. 7 k bの断片（配列番号 27の塩基 26 1 8 - 1726 1を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGE N社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクター p S B 200を S a c Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP (TAKARA社）により脱リン酸化し、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 DNA B l un t i ng K i t

(TAKARA社）により平滑化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。

上記により準備した、 XSE 7由来の 14. 7 k b断片とベクタ一断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (TAK ARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 48個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 1 4. 7 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 6 XS F4由来の 2 1. 3 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法） λファージクローン XS F 4 (図 1および 5) を N o t Iで部分消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 2 1. 3 k bの断片（配列番号 27の塩基 1 2478— 33750を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGEN 社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクター p S B 200を N o t Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP

(TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクタ一断片を精製した。

上記により準備した、 XS F 4由来の 2 1. 3 k bの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t Ve r. 1 (TA KARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 48個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 2 1. 3 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 7 XS F 20由来の 1 3. 2 k b断に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XSF 20 (図 1及び 5) を S a 1 Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 DN A B l un t i n g K i t (TAKARA社）により平滑化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された 1 3. 2 k bの断片（配列番号 2の塩基 26809 -40055を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGEN 社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクター p S B 200を E c 0 R Vで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP (TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。

上記により準備した、 XS F 20由来の 1 3. 2 k bの断片とベクタ一断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (T AKARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 44個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 1 3. 2 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 8 XS F 1 8由来の 1 6. 2 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XS F 1 8は XS F 20と 5 ' 末端及び 3 ' 末端（各々、配列番号 27の塩基 20328及び 41 92 1) と同一だが、途中の塩基 339 47 - 3 8591を欠いている。よって、配列番号 2 7の塩基 20328 - 33 946及び 38592 -41 92 1を含む。これは、最初にクローン XS F 18 が単離されたが、単離後の増殖の過程で上記欠失を生じたことが判明したため、再度増殖をやり直すことにより、完全型のクローンを単離し、 XSF 20と命名したことに因る。

λファージクローン XS F 1 8 (図 5) を No t Iで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 1 6. 2 k bの断片（配列番号 2 7の塩基 2 1 065- 33946及び 38592 -41 92 1を含む）を、 Q I AE X I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクター p S B 200を No t Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP

(TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクタ一断片を精製した。上記により準備した、 XSF 1 8由来の 1 6. 2 k bの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (T AKARA社）を用いてライゲ一シヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 48個体は、いずれも不稔であった（図 6) 。このことから、導入した 1 6. 2 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 9 XS G22由来の 1 2. 6 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XSG22 (図 1および 5) を No t Iで部分消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 1 2. 6 k bの断片（配列番号 27の塩基 3 1 684— 44109を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGE N社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクタ一 p S B 200を No t Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP

(TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。

上記により準備した、 XSG22由来の 1 2. 6 k bの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (T AKARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 48個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 1 2. 6 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 1 0 XSG 1 6由来の 1 5. 7 k b断片に関する相補性試験

(1) (材料および方法）

λファージクローン XS G 16 (図 1および 5) を No t lで部分消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 1 5. 7 k bの断片（配列番号 27の塩基 38 538— 54123を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGE N社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクタ一 p S B 20 0を N o t Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP

上記により準備した、 XSG 16由来の 1 5. 7 k b断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (TA KARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 47個体のうち、少なくとも 37個体は、明らかに稔性を回復していた（図 6) 。このことから、導入した 1 5. 7 k b断片のなかのイネ（ I R 24) に由来する部分である 1 5586塩基（配列番号 27の塩基 38538 - 5412 3) が、完全長の R f - 1遺伝子を包含していると考えられた。

(2) XSG 1 6内部の 1 1. 4 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XS G 16を A 1 wN Iおよび B s iWIで完全消化後、エタノール沈殿により DN Aを回収した。回収した DN Aを TE溶液に溶解後、 DNA B l u n t i n g K i t (TAKARA社）により平滑化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけ、分離された 1 1. 4 k bの断片を、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。

プラスミドベクタ一 p S B 1 1 (Koma r i e t a 1. P l a n t J p u r n a l , 1 996) を Sma lで完全消化後、エタノール沈殿により D NAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP (TAKARA 社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。

上記により準備したふたつの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t Ve r. 1 (T AK A R A社）を用いてライゲ一シヨン反応を行った。反応後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを純水（M i 1 1 i p o r e社製装置により作成）に溶解後、大腸菌 D H 5 αと混合し、エレクトロポレーシヨンに供試した。エレクト口ポレーシヨン後の溶液を、 LB培地で振とう培養（3 7。C、 1時間）した後、スぺクチノマイシンを含む LBプレ —トに広げ、加温（37°C、 1 6時間）した。生じたコロニーのなかの 14個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。

上記により選抜した大腸菌を、 Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n s菌株 LBA4404/p S B 4U (高倉ら、特願 200 1 - 26998 2 (WO 02/0 1 9803 A 1 ) ) およびヘルパー大腸菌 H B 1 0 1 Z p RK 20 1 3 (D i t t a e t a 1 , 1 980) とともに供試して、 D i t t a e t a 1 ( 1 980) の方法に従い、三菌系交雑（ t r i p a r e n t i a 1 ma t i n g) を行った。スぺクチノマイシンを含む A Bプレートに生じたコロニーのなかの 1 2個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のァグロパクテリゥムを選抜した。

形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、 1 20個体の植物を、 1 5000アールのワグネルポットに移植し（4個体ノポット）、移植約 1か月後に短日条件の温室に移した。出穂約 1か月後に、各個体から標準的な穂を 1穂サンプリングし、種子稔性（総もみ数に対する稔実もみの割合）を調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 1 20個体のうち、 59個体が 1 0 %以上の種子稔性を示し、そのうち 1 9個体は 70 %以上の種子稔性を示した。このことから、導入した 1 1. 4 k b断片（配列番号 27の 42357番目の塩基から 53743番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須の R f — 1遺伝子領域を包含していると考えられた。

(3) XSG 1 6内部の 6. 8 kb断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクロ一ン XS G 1 6を Hp a Iおよび A 1 wN Iで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 6. 8 k bの断片を、 Q I AE X I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。

プラスミドベクター p S B 1 1の調整を含め、以後の過程は上記（2) に記載の方法に準拠した。

(結果および考察）

形質転換植物 120個体のうち、 67個体が 10%以上の種子稔性を示し、そのうち 26個体は 70 %以上の種子稔性を示した。このことから、導入した 6. 8 k b断片（配列番号 27の 42 1 32番目の塩基から 48883番目の塩基まで）が、稔性回復の機能を発現するうえで必須の R f — 1遺伝子領域を包含していると考えられた。

実施例 1 1 XSG8由来の 16. 9 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XS G 8 (図 1および 5) を No t Iで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 1 6. 9 k bの断片（配列番号 27の塩基 46558 - 63364を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGEN 社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクタ一 p S B 200を N o t Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP (TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクター断片を精製した。

上記により準備した、 XSG8由来の 1 6. 9 k b断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (TAK ARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）

形質転換植物 48個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 1 6. 9 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 1 2 XSH 1 8由来の 20. 0 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

λファージクローン XSH 18 (図 1および 5) を No t Iで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 20. O k bの断片（配列番号 27の塩基 56409 - 76363を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGE N社）を用いて精製した。

一方、プラスミドベクター p SB 200を No t Iで完全消化後、エタノール沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I AP (TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクタ一断片を精製した。

上記により準備した、 XSH 18由来の 20. 0 k bの断片とベクター断片の二つの断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (T AKARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）形質転換植物 44個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 2 0. O k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 1 3 XSG8および XSH 1 8の重複部由来の 19. 7 k b断片に関する相補性試験

(材料および方法）

実施例 1 1におけるライゲーションによって得られた所望の大腸菌から単離したプラスミド（XSG 8 S B 200、F) を、 S a i lおよび S t u Iで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 12. 8 k bの断片 (配列番号 27の塩基 50430— 63 197を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。

一方、実施例 1 2におけるライゲーシヨンによって得られた所望の大腸菌から単離したプラスミド（XSH 1 8 SB 200 R) を、 S a l l、 S t u Iおよび Xh o lで完全消化し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。分離された 6. 9 k b断片（配列番号 27の塩基 631 94 - 701 16を含む）を、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いて精製した。

さらに、プラスミドベクタ一 p S B 200を E c o R Vで完全消化後、ェタノ —ル沈殿により DNAを回収した。回収した DNAを TE溶液に溶解後、 C I A P (TAKARA社）により脱リン酸化した。反応液をァガロースゲルによる電気泳動にかけた後、 Q I AEX I I (Q I AGEN社）を用いてゲルからベクタ一断片を精製した。

上記により準備した、 XS G8由来の 12. 8 kbの断片、 XSH 1 8由来の 6. 9 k bの断片、及びべクタ一断片の三個の断片を供試して、 DNA L i g a t i o n K i t Ve r. 1 (TAKARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。ライゲーシヨン産物は、 XSG8および XSH1 8の重複部由来の 1 9. 7 k b断片（配列番号 27の 50430— 70 1 1 6を含む）（図 5の XSX 1) を含む。以後、実施例 4に記載の方法に準拠して、形質転換植物を作成 ·調査した。

(結果および考察）形質転換植物 40個体は、いずれも不稔であった。このことから、導入した 1 9. 7 k b断片は、少なくとも完全長の R f — 1遺伝子を包含していないと考えられた。

実施例 14 c DN Aライブラリーの作成

先ず、戻し交雑によりコシヒカリに R f — 1を導入した系統 I L 2 16 (遺伝子型は R f - 1/R f - 1) を作成した。前記 I L 2 16を慣行法で温室栽培し、葉耳間長が— 5〜5 cmの生育段階で幼穂をサンプリングした。 SD S—フエノ一ル法（Wa t a n a b e, A. an d P r i c e, C. A. ( 1 982) T r a n s l a t i o n o f mR N A s f o r s u b u n i t s o f c h l o r o p l a s t c o u p l i n g f a c t o r 1 i n s p i n a c h. P r o c e e d i n g s o f t h e Na t i o n a l Ac a d emy o f S c i e n c e s o f t h e U. S. A. , 79, 6304 - 6308) でトータル R N Aを抽出した後、 Q u i c kP r e p mR N A Pu r i f i c a t i on K i t (Ame r s h am P h a rma c i a B i o t e c h) により p o l y (A) + R N A を精製した。

次いで、精製した P o 1 y (A) + RNA を供試して、 Z A P— c D N A S yn t h e s i s K i t (S t r a t a g e n e) により c DNAライブラリーを作成した。作成したライブラリ一（1m l ) のタイタ一は 1600000 0 p f uZm 1と算出され、十分な大きさであると判断された。

実施例 1 5 c DNAライブラリーのスクリーニング

(1) スクリーニング用プライマーの作成

以下の 2種類のプライマ一、

センスプライマー

5 -tctcattctctccacgccctgctc— 3 (配列番号 76 )

アンチセンスプライマー

5 - acggcggagcaat tcgtcgaacac - 3 (配列番号 77 ) を用いて、 I R 24のゲノミッククローン XSG 1 6をテプレートに P CRを行った。配列番号 76及び 77は各々、配列番号 27の塩基 43733— 437 56及び 44038 - 440 1 5に相当する。

電気泳動後、約 300 b pの増幅産物を Q I AEX I I Ge l E x t r a c t i o n K i t (Q I A G E N) によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、 Re d i p r i me I I DNA l a b e l l i n g s y s t em (Ame r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h) ^用レて³² P—ラベルした（以下、「プローブ P」と呼称する）。

また、以下の 2種類のプライマー、

センスプライマー

5， -agtgtgtggcatggtgcatttccg- 3 ' (配列番号 78)

アンチセンスプライマ一

5， -ctctacaggatacacggtgtaagg- 3 (酉己列番号 79

を用いて、 I R 24のゲノミッククローン XS G 1 6をテンプレートに PCRを行った。配列番号 78及び 79は各々、配列番号 27の塩基 48306— 483 29及び 50226- 50203に相当する。電気泳動後、約 1 900 b pの増幅産物を上述の方法によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、上述の方法で³² P—ラベルした（以下、「プローブ Q」と呼称する）。

(2) c DNAライブラリーのスクリーニング

実施例 14で作成した c DNAライブラリーを供試して、約 1 5000ブラークが出現した寒天培地を 70枚作成した。各寒天培地について 2回ずつプラークリフトを行レ、 Hyb o nd— N^T 、Ame r s h am P h a rma c i a B i o t e c h) に転写した。一方のメンブレンをプローブ Pとのハイブリダイゼ一ションに、もう一方のメンブレンをプロ一ブ Qとのハイブリダイゼーションに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。

ハイブリダィゼ一シヨンは、 2 50mM Na₂HP〇₄、 1 mM EDTA および 7 % SDSを含むハイブリダィゼ一シヨン溶液にプローブを添加し、 6 5でで 1 6時間行った。洗浄は、 1 X S S Cおよび 0. 1 % SDSを含む溶液により 6 5 ：、 1 5分で 2回行った後、 0. 1 53 (：ぉょび0. 1 % SDS を含む溶液により 65で、 1 5分で 2回行った。洗浄後のメンブレンを FU J I X B AS 1000 (F u j i Ph o t o F i l ms) で解析した。

その結果、プローブ Pおよびプローブ Qのどちらでも陽性を示すプラークが 8 個見出された。そこで、それらプラークを単離し、製造者（S t r a t a g e n e) の手引書に従い p B 1 u e s c r i p tにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。 8個のクローンのうち、 6個のクローンの耒端塩基配列が X S G 16の配列と一致した。それら 6クローンの全塩基配列を決定し、結果を、配列表の配列番号 69 - 74に示した。

配列番号 69 - 74のいずれの配列も、配列番号 7 5のアミノ酸配列 1— 79 1を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号 69 の塩基 2 1 5— 2587、配列番号 70の塩基 2 13— 2 585.—、配列番号 7 1 の塩基 2 1 8— 2590、配列番号 72の塩基 208— 2 580、配列番号 73 の塩基 149— 2 52 1及び配列番号 74の塩基 225— 259 7が、いずれも配列番号 7 5のアミノ酸配列 1— 79 1をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 27の塩基 43907— 46279に対応する。

配列番号 75のアミノ酸配列を、トウモロコシの稔性回復遺伝子（R f 2) の推定アミノ酸配列（Cu i e t a 1. , 1 996 ) と比較したところ、 N 末端の 7アミノ酸残基（Me t -A 1 a -A r g - A r g -A 1 a -A 1 a— S e r ) がー致した。これら 7アミノ酸残基はミトコンドリアへの標的化シグナルの一部と考えられている（L i u e t a 1. , 2001) 。これらのことから、今回単離した c DNAは R f - 1遺伝子のコーディング領域を完全に包含すると考えられる。イネ R f _ lとトウモロコシ R f 2とのアミノ酸レベルでの相同性は、前述の領域を除いては見られない。遺伝子産物がミトコンドリアに移行してからの稔性回復機構は、両者で異なるものと推測される。

また、今回単離した c DNAの配列を I R 24のゲノム配列（配列番号 27 ) と比較することにより、ェキソンとイントロンの構造が明らかになった（図 7) 。その結果、植物体内において、スプライシング様式およびポリ A付加位置を異にする種々の転写産物が混在していることが示された。

実施例 1 6 相補性試験実施例 1 0 (3) において、稔性回復能を持つことが証明された I R 24由来の 6. 8 k bゲノム断片を含むプラスミド中の、 R f — 1遺伝子のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2 k b断片を用いて、相補性実験を行つた。

先ず、上記実施例 10 (3) のプラスミドを E c oR Iで処理し、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。 R f — 1のプロモー夕一領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2 k b断片（配列番号 27の塩基 42 1 32— 4631 8に相当する）を分離し、 Q I AEX I I (Q I AGEN) を用いてゲルから回収した。この 4. 2 k b断片を、 E c oR I処理後 C I AP (TAKARA) 処理した pB 1 u e s c r i p t I I SK (—）とともに供試して、 DNA L i g a t i o n K i t V e r . 1 (TAKARA社）を用いてライゲーシヨン反応を行った。反応後、エタノール沈殿により DNAを回収した。

回収した DNAを純水（M i l l i p o r e社製装置により作成）に溶解後、大腸菌 DH 5ひと混合し、エレクト口ポレーシヨンに供試した。エレクトロボレ —シヨン後の溶液を、 LB培地で振とう培養（37°C、 1時間）した後、アンピシリンを含む LBプレートに広げ、加温（37°C、 1 6時間）した。生じたコロニーのなかの 12個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。つぎに、選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、 B amH Iおよび S a 1 Iで処理後、ァガロースゲルによる電気泳動を行い、 R f — 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2 k b断片を分離し、 Q I AEX I I (Q I AGE N) を用いてゲルから回収した。

一方、 Tn o s J H0072 ( n o sターミネータ一およびアンピシリン耐性遣伝子カセットを持つ中間ベクター）を B amH Iおよび S a l Iで処理後、ァガロースゲルによる電気泳動を行った。 n 0 s夕一ミネ一ターおよびアンピシリン耐性遺伝子カセットとを包含する 3. O k b断片を分離し、 Q I AEX I I (Q I AGEN) を用いてゲルから回収した。

R f - 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2 k b断片及び Tn o s J H 0072由来の断片を、前述の方法でライゲ一ション反応およびポレ一シヨンを行った。アンピシリンを含む L Bプレートに広げ、加温（37° C、 1 6時間）後、生じたコロニーのなかの 12個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。

さらに、上述のとおり選抜した大腸菌から単離したプラスミドを、 S g f Iで処理後、ァガロースゲルによる電気泳動を行い、 R f — 1のプロモーター領域と予想翻訳領域とを包含する 4. 2 k b断片を分離し、 Q I AEX I I (Q I AG EN) を用いてゲルから回収した。この 4. 2 k b断片を、 P a c l処理後 C I AP (TAKARA) 処理した p S B 200 P a c (ハイグロマイシン耐性遺伝子カセットを持つ中間ベクター）とともに供試して、前述の方法でライゲ一ション反応およびポレーシヨンを行った。スぺクチノマイシンを含む L Bプレートに広げ、加温（37°C、 1 6時間）後、生じたコロニーのなかの 1 6個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンおよび境界部塩基配列を調査することにより、所望の大腸菌を選抜した。

以上の工程により、 R f — 1のプロモータ一領域と R f — 1の予想翻訳領域を含む断片に n o sターミネ一ターが接続されたキメラ遺伝子が、中間ベクター内に揷入された大腸菌が得られた。この大腸菌を、 Ag r o b a c t e r i um t ume f a c i e n s菌株 L B 4404/p S B l (K o m a r i e t a 1， 1 996) およびヘルパー大腸菌 HB 10 1/ p RK 20 1 3 (D i t t a e t a 1 , 1 980) とともに供試して、 D i t t a e t a 1 ( 1 980) の方法に従い t r i p a r e n t i a l ma t i ngを行った。スぺクチノマイシンを含む A Bプレ一卜に生じたコロニーのなかの 6個について、プラスミドを単離し、制限酵素断片長パターンを調査することにより、所望のァグロパクテリゥムを選抜した。

上記により選抜したァグロパクテリゥムを用いて、 H i e i e t a 1

( 1 994) の方法に準拠し、 MSコシヒカリ（BT細胞質を持ち、核遺伝子はコシヒカリとほぼ同一）の形質転換を行った。形質転換に必要な MSコシヒカリの未熟種子は、 MSコシヒカリにコシヒカリの花粉をかけることにより作成した。形質転換植物は、馴化後、長日条件の温室に移した。移植適期まで育成した後、 32個体の植物を、 1ノ5000アールのワグネルポットに移植し（4個体？ポット）、移植 3〜4週間後に短日条件の温室に移した。出穂約 1か月後に、種子稔性を立毛調査した。その結果、 32個体のうち 28個体は、稔性を回復していることがわかった。

以上の結果から、予想翻訳領域を発現させることにより R f - 1遺伝子の機能を付与できることが、実験的に証明された。

実施例 1 7 c DNA単離

実施例 1 5は、プローブ Pおよびプローブ Qにより I R 24幼穂由来 c DNA ライブラリ一をスクリーニングし、どちらのプローブでも陽性を示すプラークを単離 ·解析することにより、 6個の c DNAを単離した。本実施例では、プロ一ブ Pおよび下記のプローブ Rにより同様のスクリーニングを行うことにより、さらに 6個の c DNAを単離した。詳細は、以下のとおりである。

まず、 2種類のプライマー、

センスプライマー

5 — cagttgggttgaaacctaatactg— 3 (配夕' !j番^" 86 )

アンチセンスプライマー

5 — cactaaaccgttagacgagaaagc— 3 (酉己列番"^ 87 )

を用いて、 I R 24のゲノミッククローン XS G 1 6をテンプレートに P CRを行った。配列番号 86および 87は各々、配列番号 27の塩基 45522 - 45 545及び 45955— 45932に相当する。

電気泳動後、約 430 b pの増幅産物を Q I AEX I I (Q I AGEN) によりァガロースゲルから回収した。回収した断片を、 Re d i p r i me I I DNA l a b e l l i n g s y s t em (Ame r s h am P h a r m a c i a B i o t e c h) を用いて³² P—ラベルした（プローブ R、図 8 ) 。

I R 24幼穂由来 c DNAライブラリーを供試して、約 1 5000プラークが出現した寒天培地を 20枚作成した。各寒天培地について 2回ずつプラークリフトを行い、 Hy b o n d— N+ (Ame r s h am Ph a rma c i a B i o t e c h) に転写した。一方のメンブレンを実施例 15のプローブ Pとのハイブリダイゼーションに、もう一方のメンブレンをプローブ Rとのハイブリダイゼーシヨンに用いた。一連の作業は、製造者の手引書に従って行った。その結果、プローブ Pおよびプローブ Rのどちらでも陽性を示すプラークが 12個見出された。

そこで、それらプラークを単離し、製造者（S t r a t a g e n e) の手引書に従い p B 1 u e s c r i p tにサブクローニングした後、末端塩基配列を調査した。 1 2個のクロ一ンのうち、 6個のクローンの末端塩基配列が XS G 1 6の配列と一致したため、それら 6クローンの全塩基配列を決定した（# 7—# 1 2) 。その結果を配列番号 80— 85に示す。

配列番号 80— 85のいずれの配列も、配列番号 7 5のアミノ酸配列 1 _ 79 1を持つタンパク質をコードすると推定される。具体的には、各々配列番号 80 の塩基 229— 260 1、配列番号 8 1の塩基 1 75— 2547、配列番号 82 の塩基 227— 2599、配列番号 83の塩基 220— 2592、配列番号 84 の塩基 1 74— 2546及び配列番号 85の塩基 90— 2462が、いずれも配列番号 75のアミノ酸配列 1— 79 1をコードする。なお上記塩基配列は、配列番号 27の塩基 43907 -46279に対応する。

今回単離した c DNAの配列を I R 24のゲノム配列（配列番号 27 ) と比較することにより、ェキソンとイントロンの構造が明らかになった（図 8) 。今回単離した c DNAのなかには、予想翻訳領域とは関係のないェキソンを含まず、単一ェキソンからなるものも 3個存在した（# 1 0— # 1 2、配列番号 83 - 8 5) 。

Claims

請求の範囲

1. 配列番号 75のァミノ酸配列、又は配列番号 75のァミノ酸配列と少なくとも 70%同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸をイネに導入することにより、イネの稔性を回復する方法。

2. 配列番号 75のアミノ酸配列をコードする核酸をイネに導入することにより、イネの稔性を回復する、請求項 1に記載の方法。

3. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸が、以下の a) — p) の核酸から選択される、請求項 1又は 2に記載の方法：

a ) 配列番号 69の塩基 2 15— 2 587を含む核酸

b ) 配列番号 70の塩基 2 13— 2 585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 18— 2 590を含む核酸

d) 配列番号 72の塩基 208— 2 580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149— 2 52 1を含む核酸

f ) 配列番号 74の塩基 225— 2597を含む核酸

g ) 配列番号 27の塩基 43907— 46279を含む核酸；

h) 配列番号 80の塩基 229 - 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 175— 2 547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2 599を含む核酸

k ) 配列番号 83の塩基 220— 2 592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

o) 上記 a) — m) のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び p) 上記 a) — m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。

4. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %同一のアミノ酸配列をコ一ドする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸が、以下の条件 1) 一 12) の少なくとも一つを満たす、請求項 3に記載の方法：

1) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基が Aである

2) 配列番号 70の塩基 1 7 67に相当する塩基が Aである

3) 配列番号 7 1の塩基 1 7 72に相当する塩基が Aである

4) 配列番号 72の塩基 1 7 62に相当する塩基が Aである

5) 配列番号 73の塩基 1 703に相当する塩基が Aである

6) 配列番号 74の塩基 1 7 79に相当する塩基が Aである

7) 配列番号 80の塩基 1 783に相当する塩基が Aである

8) 配列番号 8 1の塩基 1729に相当する塩基が Aである

9) 配列番号 82の塩基 1 7 81に相当する塩基が Aである

10) 配列番号 83の塩基 1 774に相当する塩基が Aである；

1 1) 配列番号 84の塩基 1 728に相当する塩基が Aである；又は

12) 配列番号 85の塩基 1 644に相当する塩基が Aである。

5. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 7 5のアミノ酸配列と少なくとも 7 0 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸を利用して被検定イネ個体又は種子が稔性回復遺伝子（R f — 1遺伝子）を有するか否かを識別する方法。

6. 以下の a) - p) の核酸：

a ) 配列番号 69の塩基 2 15— 2 587を含む核酸

b) 配列番号 70の塩基 2 13— 2 585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 18— 2 590を含む核酸

d ) 配列番号 72の塩基 208— 2 580を含む核酸

e ) 配列番号 7 3の塩基 149一 2 52 1を含む核酸

f ) 配列番号 74の塩基 225— 2 597を含む核酸 g) 配列番号 27の塩基 43 907 -46279を含む核酸； h ) 配列番号 80の塩基 229— 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2 547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2 599を含む核酸

k ) 配列番号 83の塩基 220 - 2 592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2 546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

0) 上記 a) — m) のいずれかの核酸と中程度又は高程度のストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ、稔性回復機能を有する核酸；及び

P) 上記 a) — m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸のいずれかを利用する、請求項 5に記載の方法。

7. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸が、以下の条件 1) — 1 2) の少なくとも一つを満たす場合に被検定ィネ個体又は種子が R f 一 1遺伝子を有すると判断する、請求項 5又は 6に記載の方法：

1) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基が Aである

2) 配列番号 70の塩基 1 767に相当する塩基が Aである

3) 配列番号 7 1の塩基 1 772に相当する塩基が Aである

4) 配列番号 72の塩基 1 762に相当する塩基が Aである

5 ) 配列番号 73の塩基 1703に相当する塩基が Aである；は

6) 配列番号 74の塩基 177 9に相当する塩基が Aである

7) 配列番号 80の塩基 1783に相当する塩基が Aである

8) 配列番号 8 1の塩基 1729に相当する塩基が Aである

9) 配列番号 82の塩基 1 78 1に相当する塩基が Aである 10) 配列番号 83の塩基 1 774に相当する塩基が Aである；

1 1) 配列番号 84の塩基 1 728に相当する塩基が Aである；又は

12) 配列番号 85の塩基 1 644に相当する塩基が Aである。

8. i ) 以下のいずれかの塩基、

1) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基

2) 配列番号 70の塩基 1 767に相当する塩基

3) 配列番号 7 1の塩基 1 772に相当する塩基

4) 配列番号 72の塩基 1 762に相当する塩基

5) 配列番号 73の塩基 1 703に相当する塩基

6) 配列番号 74の塩基 1 779に相当する塩基

7 ) 配列番号 80の塩基 1783に相当する塩基

8) 配列番号 8 1の塩基 1 729に相当する塩基

9) 配列番号 82の塩基 178 1に相当する塩基

10) 配列番号 83の塩基 1 774に相当する塩基；

1 1) 配列番号 84の塩基 1 728に相当する塩基；及び

12) 配列番号 85の塩基 1 644に相当する塩基

を含む隣接領域の塩基配列に基づいて、上記塩基と隣接領域の双方を増幅するようにプライマー対を作成し；

i i) 被検定イネ個体又は種子のゲノム DNAを铸型として核酸増幅反応を行レ；そして

i i i ) 前記核酸増幅産物に見出される多型に基づいて被検定イネ個体又は種子が R f - 1遺伝子の有無を識別する、請求項 6又は 7に記載の方法。

9. 工程 i i i ) が、以下の条件 1) 一 1 2) の少なくとも一つを満たす場合に被検定イネ個体又は種子が R f _ 1遺伝子を有すると判断する、請求項 8に記載の方法：

1 ) 配列番号 69の塩基 1 769に相当する塩基を含む領域が、 T a Q I認識配列を有しない；

2) 配列番号 70の塩基 1 767に相当する塩基を含む領域が、 Ta Q I認識配列を有しない； 3 ) 配列番号 71の塩基 1772に相当する塩基を含む領域が、 T a Q I認識配列を有しない；

4) 配列番号 72の塩基 1762に相当する塩基を含む領域が、 Taq l認識配列を有しない；

5) 配列番号 73の塩基 1703に相当する塩基を含む領域が、 T a q I認識配列を有しない；

6 ) 配列番号 Ί 4の塩基 1779に相当する塩基を含む領域が、 T a Q I認識配列を有しない；

7) 配列番号 80の塩基 1783に相当する塩基を含む領域が、 Taq I認識配列を有しない；

8) 配列番号 81の塩基 1729に相当する塩基を含む領域が、 Taq l認識配列を有しない；

9) 配列番号 82の塩基 1781に相当する塩基を含む領域が、 Taq l認識配列を有しない；

10) 配列番号 83の塩基 1774に相当する塩基を含む領域が、 Taq l 認識配列を有しない；

1 1 ) 配列番号 84の塩基 1 7 28に相当する塩基を含む領域が、 T a Q I 認識配列を有しない；又は

12) 配列番号 85の塩基 1644に相当する塩基を含む領域が、 T a Q I 認識配列を有しない。

10. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸、に対し相補的な塩基配列から選択される、連続した少なくとも 10 0塩基の長さのアンチセンスを導入することにより、 R f — 1遺伝子の稔性回復機能を抑制する方法。

11. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70 %同一のアミノ酸配列をコードする核酸が、以下の a) - p) の核酸から選択される、請求項 10に記載の方法：

a ) 配列番号 69の塩基 215— 2587を含む核酸； b) 配列番号 70の塩基 2 1 3— 2585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2590を含む核酸

d ) 配列番号 72の塩基 208— 2580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149— 252 1を含む核酸

' f) 配列番号 74の塩基 225— 2597を含む核酸

g) 配列番号 27の塩基 43907 -46279を含む核酸；

h ) 配列番号 80の塩基 229— 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2599を含む核酸

k) 配列番号 83の塩基 220— 2592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

P) 上記 a) -m) のいずれかの核酸に 1ないし複数の塩基が欠失、挿入又は置換しており、かつ、稔性回復機能を有する核酸。

1 2. 配列番号 75のアミノ酸配列、又は配列番号 75のアミノ酸配列と少なくとも 70%同一のアミノ酸配列をコードする核酸であって、稔性回復機能を有する核酸。

1 3. 以下の a) — p) の核酸から選択される、請求項 1 1に記載の核酸： a ) 配列番号 6 9の塩基 2 1 5— 2587を含む核酸

b) 配列番号 70の塩基 2 1 3 - 2585を含む核酸

c ) 配列番号 7 1の塩基 2 1 8— 2590を含む核酸

d ) 配列番号 72の塩基 208— 2580を含む核酸

e ) 配列番号 73の塩基 149— 252 1を含む核酸

f ) 配列番号 74の塩基 225— 2597を含む核酸

g ) 配列番号 27の塩基 43907— 46279を含む核酸； h) 配列番号 80の塩基 229 - 260 1を含む核酸

i ) 配列番号 8 1の塩基 1 7 5— 2547を含む核酸

j ) 配列番号 82の塩基 227— 2599を含む核酸

k) 配列番号 83の塩基 220 - 2592を含む核酸

1 ) 配列番号 84の塩基 1 74— 2546を含む核酸

m) 配列番号 85の塩基 90— 2462を含む核酸；

n) 上記 a) — m) のいずれかの核酸と少なくとも 70 %同一であり、力、つ、稔性回復機能を有する核酸；