WO2004002950A1

WO2004002950A1 - スルフェニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法

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Publication number: WO2004002950A1
Application number: PCT/JP2003/004308
Authority: WO
Inventors: Hiroki Kuyama; Eiji Ando; Osamu Nishimura
Original assignee: Shimadzu Corporation
Priority date: 2002-06-28
Filing date: 2003-04-03
Publication date: 2004-01-08
Also published as: JPWO2004002950A1; AU2003236369A1; EP1533296A1; EP1533296A4; JP3976048B2; US20050221413A1

Abstract

(1)一般式:R-S-X(Ｉ)(式中、Rは、同位体で標識された少なくとも1つの構成元素を有する有機基を表し、Xは脱離基を表す。)で表されるスルフェニル化合物、それを含むラベル化試薬、及びそのラベル化試薬を用いるペプチドの解析法。好ましくは、前記有機基Rは構成元素としてC、H、N、場合によりO及び/又はpを含み、前記同位体は、2H、13C、15N、17O、18Oからなる群から選ばれる安定同位体である。

Description

明細書スルフエニル化合物、ラベル化試薬、及びペプチドの解析方法技術分野

本発明は、生体細胞又は組織中の発現タンパク質の網羅的解析に関し、ょリ詳しくは、発現タンパク質の解析に好適な化合物、それを用いたラベル化試薬、及びラベル化試薬を用いた発現タンパク質の定量的解析技術に関する。背景技術

スルフエニル化合物は、卜リブ卜ファン残基のィンドール環と反応するため、従来から卜リブ卜ファン残基の選択的ラベル化試薬として知られている。タンパク質の解析法としては、従来から 2次元ゲル電気泳動（2 D— P A G E ) による方法が用いられている。この方法においては、まず、生体試料から抽出されたタンパク質を 2 D— P A G Eを用いて分離 ·精製し、 2次元的に得られるゲルィメージから目的とするスポットを切り出す。次いで還元アルキル化、酵素消化などの工程を経てマススぺグ卜ロメ卜リーにより（例えば P M F法）、注目するスポッ卜がどのようなタンパク質であるかを解析する。また、ディファレンシャルディスプレイにより 2種の生体試料中のタンパク質の相対量比を求めることができるしかしこの方法では、高濃度で含まれるタンパク質（ハウスキーピングタンパク質）が存在する場合、低濃度で存在する調節タンパク質などは細胞全体のライセー卜を分析した場合、ほとんど検出できないという問題がある。また、ディファレンシャルディスプレイでの定量性が不十分であること、ゲル板の不均一性に起因する再現性の無さ、高分子タンパク質の分離が困難であることなども問題であった。 ' 一方、昨今のポストゲノムの流れの中で、タンパク質の効率的な消化方法、消化によって生じた複雑なポリぺプチド混合物の分離方法、及びポリぺプチドのァミノ酸配列を解析するマススぺクトルのイオン化法が開発され、ペプチドをマススペクトルで解析できるようになった。これに伴い、マススペクトルを応用するという観点からのペプチドの解析法が種々考案されてきており、新規で有用なラベル化試薬が求められている。このような観点から開発された試薬の Ίつに、 I C A T (Isotope Coded Affinity Tag) 試薬が挙げられる。これを用いる方法は、ヮシン卜ン大学の Aebersoldらによリ開発された、夕ンパク質発現量の変化を定量する方法の 1つである。（例えば、非特許文献： R.Aebersold et al.,Nature Biotech.,1999,17,994-999,特許文献： W O 0 0 / 1 1 2 0 8参照） I C A T法では夕ンパク質中のシスティン残基に注目し、ピオチンを含有する特殊なアルキル化試薬によりシスティンの S H基をラベル化する。この方法は発現された広い量的な差異を持つ生体内タンパク質を定量することができ、タンデ厶マスと組み合わせて発現量が変化したタンパク質の同定も可能である。

しかし、タンパク質中のシスティン含量が大きいため、上記の方法では最終的に得られるマススペクトルが複雑であることが予想される。また、ラベル化されたペプチドフラグメントを分離するためにアビジンカラムという特殊なカラムを必要とすることや、反応試薬の分子量が比較的大きい（6 0 0程度）ため反応性が十分でないことも問題である。発明の開示

発明の目的

そこで，本発明の目的は、反応性及び選択性に優れ、マススペクトルでの解析が容易で定量性も高く、かつ特殊なカラ厶を必要としないラベル化試薬に用いることができるスルフエニル化合物、それを用いたラベル^試薬、及びそのラベル化試薬を用いたタンパク質 ·ペプチドの解析方法を提供することにある。発明の概要

本発明者らは、鋭意検討した結果、同位体で標識された少なくとも 1つの構成元素を有するスルフエニル化合物によって、上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明には、以下の発明が含まれる。

( 1 ) 一般式：

R - S -X ( I )

(式中、 Rは、同位体で標識された少なくとも 1つの構成元素を有する有機基を表し、 Xは脱離基を表す。）

で表されるスルフエニル化合物。

(2) 前記有機基 Rは構成元素として C、 H、 N、場合により O及びノ又は Pを含み、前記同位体は、 ²H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0、 ¹⁸0からなる群から選ばれる安定同位体である、（1 ) に記載のスルフエニル化合物。

(3) 前記スルフエニル化合物の分子量が、前記化合物と同一構造でぁリ且つ前記同位体で標識されていない化合物の分子量よりも 3〜1 2、好ましくは 6 〜1 0大きい、（1 ) 又は（2) に記載のスルフエニル化合物。

(4) 前記同位体で標識された構成元素の数が 3以上例えば 3 ~1 2、好ましくは 6〜1 0である、（1 ) 〜（3) のいずれかに記載のスルフエニル化合物。

(5) 前記有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基、又は置換されていても良いァリール基である、（1 )〜（4)のいずれかに言己載のスルフエニル化合物。

(6) 前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 N0₂基、 COOH基、 S0₃H基、 OH基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールォキシ基からなる群から選ばれる、（5) に記載のスルフエニル化合物。

(7) 前記置換されていても良いァリール基が有する置換基は、 NO ₂基、 COOH基、 S0₃H基、 OH基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、（5) に記載のスルフエニル化合物。

(8) . 前記有機基 Rは、置換されていても良いフエニル基である、（5) 又は (7) に記載のスルフエニル化合物。

(9) 前記脱離基 Xがハロゲン原子である、（1 ) 〜（8) のいずれかに記載のスルフ Iニル化合物。

(1 0) 2—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 4—ニトロ [ ¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2， 4一ジニ卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—ニトロ— 4一力ルポキシ [¹³C₆] ベンゼンスルフェニルクロリドからなる群から選ばれる、い）〜（5) 及び（7) 〜（9) のいずれかに記載のスルフ Iニル化合物。

(1 1 ) —般式：

R-S-X ( I )

で表されるスルフエニル化合物を含むラベル化試薬。

(1 2) 前記有機基 Rは構成元素として C、 H、 N、場合により 0及び/又は Pを含み、前記同位体は、 ²H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0、 ¹⁸0からなる群から選ばれる安定同位体である、（1 1 ) に記載のラベル化試薬。

(1 3) 前記スルフエニル化合物の分子量が、前記化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物の分子量よリも 3〜 1 2、好ましくは 6〜1 0大きい、（1 1 ) 又は（1 2) に記載のラベル化試薬。

(1 4) 前記同位体で標識された構成元素の数が 3以上、例えば 3〜 1 2、好ましくは 6〜1 0である、（1 1 )〜（1 3)のいずれかに記載のラベル化試薬 (1 5) 前記有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基、又は置換されていても良いァリール基である、（1 1 )〜（1 4)のいずれかに記載のラベル化

(1 6) 前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 N0₂基、 COOH基、 S0₃H基、 OH基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、（1 5) に記載のラベル化試薬。

(1 7) 前記置換されていても良いァリール基が有する置換基は、 N0₂基、 COOH基、 S0₃H基、 OH基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、（1 5) に記載のラベル化試薬。

(1 8) 前記有機基 Rは、置換されていても良いフエニル基である、（ 1 5) 又は（1 7) に記載のラベル化試薬。

(1 9) 前記脱離基 Xがハロゲン原子である、（1 1 ) 〜（1 8) のいず'れかに記載のラベル化試薬。

(20) 前記スルフエニル化合物が、 2—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスノレフエニルクロリド、 4一二トロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2， 4—ジニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—二卜口一 4-カノレボキシ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリドからなる群から選ばれる、（1 1 ) 〜 (1 5) 及び（Ί 7) 〜（1 9) のいずれかに記載のラベル化試薬。

(21 ) ペプチドの解析の用途における、（1 1 ) 〜（20) のいずれかに記載のラベル化試薬。

以下、本明細書においてペプチドとは、タンパク質を含む意味で用いる。

(22) 前記スルフエニル化合物から選ばれた 1つの化合物（以下、「重い試薬 Jと表記する。）と、前記重い試薬と同一構造であり且つ前記同位体で標謙されていない化合物（以下、「軽い試薬」と表記する。）とをそれぞれ別個に含む、（1 1 ) 〜（21 ) のいずれかに記載のラベル化試薬。

本発明のラベル化試薬は、前記重い試薬は、前記軽い試薬との分子量の差力 3 ~1 2、好ましくは 6 ~1 0となるように設計されていることが好ましい。

(23) —般式：

R-S-X ( I )

で表されるスルフエニル化合物を含むラベル化試薬を用いるペプチドの解析法。

(24) 前記有機基 Rは構成元素として C、 H、 N、場合により O及び/又は Pを含み、前記同位体は、 ²H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0、 ¹⁸0からなる群から選ばれる安定同位体である、（23) に記載のペプチドの解析法。

(25) 前記スルフエニル化合物の分子量が、前記化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物の分子量よりもさ〜 1 2、好ましくは

6〜1 0大きい、（23) 又は（24) に記載のペプチドの解析法。

(26) 前記同位体で標識された構成元素の数が 3以上、例えば 3〜 1 2、好ましくは 6〜1 0である、（23) ~ (25)のいずれかに記載のペプチドの解析法。

(27) 前記有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基又はァリール基である、（23) 〜（26) のいずれかに記載のペプチドの解析法。

(28) 前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 N0₂基、 COOH基、 S0₃H基、 OH基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、（27) に記載のペプチドの解析法。

(29) 前記置換されていても良いァリール基が有する置換基は、 N 0₂基、 COOH基、 S0₃H基、 OH基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、（27) に記載のペプチドの解析法。

(30) 前記有機基 Rが置換されていても良いフエニル基である、（27)又は（29) に記載のペプチドの解析法。 (31 ) 前記脱離基 Xが、ハロゲン原子である、（23) ~ (30) のいずれかに記載のぺプチドの解析法。

(32) 前記式（ I ) で表される同位体で標識されたスルフ 1ニル化合物が、 2—二卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 4—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2， 4—ジニ卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—二卜ロー 4一カルボキシ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリドからなる群から選ばれる、（23) 〜（27) 及び（29) 〜（31 ) のいずれかに記載のペプチドの解析法。

(33) 前記ラベル化試薬が、前記式（ I ) で表される同位体で標識されたスルフエニル化合物から選ばれた 1つの化合物（重い試薬）と、前記選ばれた化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）とをそれぞれ別個に含む、 (23)〜（32)のいずれかに記載のペプチドの解析法本発明のペプチドの解析法においては、前記重い試薬が、前記軽い試薬との分子量の差が 3〜1 2、好ましくは 6〜1 0となるように設計されていることが好ましい。

(34) 前記ラベル化試薬を用いて、解析すべきペプチドのアミノ酸残基をラベル化し、得られたラベル化ペプチドをマススぺク卜ロメドリーにより測定する、（23) 〜（33) のいずれかに記載のペプチドの解析法。

(35) (i) 解析すべきペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか一方を用いてラベル化し、ラベル化された解析 Tべきペプチドを得て、

(N)別途、対照ペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化し、ラベル化された対照ペプチドを得て、

(iii) (0 で得られたラベル化された解析すべきペプチドと（ii) で得られたラベル化された対照ペプチドとを混合し、

(iv)混合したラベル化ペプチドをマススぺクトロメ卜リーによって測定する、 ( 34) に記載のペプチドの解析法。

(36) 必要に応じて酵素消化及び又は還元とアルキル化とによる化学的処理を行う、（34) 又は（35) に記載のペプチドの解析法。

(37) 前記酵素消化を剪記ラベル化の前又は後に行う、（36) に記載のぺプチドの解析法。

(38) 前記化学的処理を前記ラベル化の前又は後に行う、（36) に記載のペプチドの解析法。

(39) 前記化学的処理、前記酵素消化、及び前記ラベル化をこの順で行う、（36) に記載のペプチドの解析法。

(40) 前記化学的処理、前記ラベル化、及び前記酵素消化をこの順で行う、（36) に記載のペプチドの解析法。

(4 Ί ) 前記ラベル化、前記化学的処理、及び前記酵素消化をこの順で行う、（36) に記載のペプチドの解析法。

(42) 前記ラベル化の後、必要に応じゲル濾過による分離と逆相カラ厶を用いる分離とを含むラベル化ペプチドの精製を行う、（34)に記載のペプチドの解析法。

(43) 前記アミノ酸残基が卜リブ卜ファン残基である、（34) に記載のぺプチドの解析法。

(44) (23) に記載のペプチドの解析法によって見出されるペプチドを含む新規化合物。

(45) (23) に記載のペプチドの解析法によって見出されるペプチドを含む新規化合物から開発される医薬品候補化合物。図面の簡単な説明

図 1は、実施例 3の LCチャートである。

図 2は、実施例 4のカラムの分離におけるラベル化ペプチドフラグメントのピーク対の数を表したグラフである。

図 3は、実施例 5のマススぺク卜ゾレチャートである。

図 4は、実施例 6のマススぺク卜レチャートである。

図 5は、図 4のマススペクトルチャートの続きである。

図 6は、実施例 8のマススぺク卜;!レチャートである。発明を実施するための形態

本発明は、式：

R— S— X ( I )

(式中、 Rは、同位体で標識された少なくとも 1つの構成元素を有する有機基を表し、 Xは脱離基を表す。） . で表されるスルフエニル化合物である。このスルフエニル化合物は、同定すべき化合物のラベル化試薬として用いることができ、特に、ペプチド解析におけるラベル試薬として有用である。

また、前記重い試薬と前記軽い試薬とをそれぞれ別個に含む 2種の試薬を組み合わせたラベル化試薬を用いることによリ、マススぺクトルを応用したペプチドの解析が容易になる。上記式（ I ) 中、有機基 Rは、構成元素として C、 H、 N、場合により O及びノ又は Pを含む置換基である。また、前記同位体は安定同位体が好ましく、このようなものとしては、 ² H、 ¹³ C、 ¹⁵ N、 ¹⁷0、 ¹⁸0などが挙げられる。

重い試薬と軽い試薬とを組み合わせてペプチドのラベル化試薬として用いるとき、重い試薬によってラベル化されたペプチド及び軽い試薬によってラベル化されたペプチドを混合してマススぺク卜ロメトリ—によって測定する。この場合、前述の同位体の存在によって、それぞれのラベル化べプチドの質量数に差が生じる。この差は、重い試薬の分子量と軽 ( 試薬の分子量との差に相当する。このとき、質量数の差は 3〜1 2ダルトンが好ましく、 6〜1 0ダルトンがより好ましい。質量数の差が 3ダルトン以上開くことにより、重い試薬による化学修飾を受けたラベル化ペプチドと、軽い試薬による化学修飾を受けたラベル化べプチドとの双方のスぺクトルピークが重なりにくくなるため、解析がしゃすい。このことから、本発明のスルフエニル化合物の分子量は、その化合物と同一構造であリ且つ同位体で標識されていない化合物の分子量よリも 3〜 1 2大きいことが好ましく、 6〜1 0大きいことがより好ましい。従って、本発明のスルフエニル化合物が同位体として ² H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0などの質量数が 1大きい同位体のみを含む場合、同位体で標識された構成元素の数は 3以上、例えば 3〜1 2個が好ましく、 6〜1 0個がより好ましい。

一方、本発明のスルフエニル化合物が同位体として ¹⁸0などの質量数が 2大きい同位体を含む場合は、 3以上の質量数の差を与えるために 3個以上の同位体を必要としない場合もある。例えば、同位体として ¹⁸0のみを含むスルフエニル化合物の場合、 ¹⁸0で標識された構成元素が 2個あれば、マススペクトルにおいて 4ダルトンの差か'生じ、好ましい質量数の差を与えることができる。

そして、これら本発明のスルフエニル化合物を重い試議とし、軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬として用いる場合は、重い試薬の分子量は、軽い試薬の分子量との差が 3〜1 2となるように設計されることが好ましく、 6 ~ 1 0となるように設計されることがより好ましい。

前記（ Γ) 式中の有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基又は置換されていても良いァリール基であることが好ましい。前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 N 0 ₂基、 C O O H基、 S 0 ₃ H基、 O H基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基などが挙げられるが、これらに限定されない。

また、前記置換されていても良いァリール基が有する置換基は、 N 0 ₂基、 C O O H基、 S 0 ₃ H基、 O H基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基などが挙げられるが、これらに限定されない。

これら置換基は、当該試薬の反応性、溶解性などを調節するため適宜選択することができる。

また、前記有機基 Rは、置換されていても良いフエニル基であることが好ましい。

好ましく設定された有機基 Rを有することにより、ラベル化試薬として用いた時に、逆相力ラ厶など通常の力ラムにより容易にラベル化ぺプチドの分離ができるようになる。

前記（ I ) 式中の脱離基 Xとしては、 F、 C l、 B r、 Iなどのハロゲン原子が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明のスルフエニル化合物の分子量は、ラベル化すべきペプチドとの反応性を考慮して、 1 90程度が好ましい。

特に、本発明のスルフエニル化合物としては、 2—二トロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 4—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2， 4一ジニ卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—ニトロ— 4—力ルポキシ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリドが好ましい。

本発明のスルフエニル化合物は、対応するジスルフイド、チオール、スルフィドなどからハロゲン化などの方法により合成できる。例えば、有機基 Rとして 6 個の ¹³Cで標識されたフエ二ル基を有するスルフエニル化合物を、例えばスルフイドから^成する方法として、以下に記述する方法が挙げられる。】

まず、前駆体のスルフィドは、例えばニトロ [¹³C₆] クロ口ベンゼンなどの [

¹³C₆]ベンゼン誘導体にベンジルメルカブタンを反応させることにより、 [¹³c₆ ] フエ二ルペンジルスルフイドとして得る。

次に、得られた [¹³c₆] フエ二ルペンジルスルフィドに、八ロゲン化剤を反応させ、目的とするスルフエニル化合物を得る。ハロゲン化剤としては、スルフリルクロリドゃ臭素などを用いると良い。溶媒としては、四塩化炭素、エチレンクロリドなどを用いると良い。反応条件としては、例えば 1 0 °C〜4 5 °Cで 5分〜 1時間かけて反応させる。

これらの諸条件は、当業者が適宜定めると良い。

このようにして得られたスルフエニル化合物の同定は、得られたスルフエニル化合物のマススぺクトルと、その化合物と同一構造であり且つ同位体標識されていない化合物のマススぺクトルとを比較することによって行うことができる。また、双方の¹³ C及び¹ H N M Rをそれぞれ比較することによつても同定を行うことができる。本発明のスルフエニル化合物を用いることにより、同定すべき化合物に目印として標識置換基（R— S—基）を導入することができるため、ラベル化試薬として用いることができる。

スルフエニル化合物は、ペプチド中に存在する卜リブ卜ファン残基のインドール環と選択的に反応することが知られているため、特に本発明の同位体で標識されたスルフエニル化合物は、ペプチドの解析におけるラベル化試薬として有用であ ₀

卜リブ卜ファンはタンパク質において、機能面及び活性面において重要な役割を演じているアミノ酸である。トリプ卜ファンを含むペプチドとしては、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH)、ガラニン（Galanin)、副甲状腺ホルモン（PTH)、 —キモ卜リブシン、ダラミシジン A、リゾチームなどが挙げられる。

卜リブ卜ファンのタンパク質中含有量は、ァミノ酸の中でも最も少ない部類に属するため、ラベル化反応及び酵素消化後のペプチドのマススぺクトルが単純となり、その解析が容易となる。これはプロテオー厶解析を行う上で大変有利である。

スルフエニル化合物（同位体で標識された本発明のスルフヱニル化合物及び従来の標識されていないスルフエニル化合物）は、卜リブ卜ファン残基が有するィンドール環への求電子置換反応によって、卜リブ卜ファン残基をラベル化する。この反応は、 I C A T法におけるシスティン残基と I C A T試薬との求核置換反応ょリも反応性が高いということが期待できる。

スルフエニル化合物によるラベル化によって生成したラベル化トリプ卜ファン残基含有べプチドは、ラベル化前の卜リブ卜ファン残基含有べプチドょリも疎水性が高いため、 I C A T法で用いるような特殊なカラムを使用することなくその分離 ·精製を行うことができる。たとえば、ゲル濾過や逆相カラムなどで十分分離 ·精製が可能である。本発明のペプチドの解析法は、解析すべきペプチドのアミノ酸残基をラベル化し、得られたラベル化ペプチドをマススぺク卜ロメ卜リーにより測定する。解析すべきペプチドは、 2種以上のペプチドの混合物である場合もある。本発明は、ラベル化反応、マススペクトルの測定の工程を含む。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いる場合は、ラベル化反応、必要に応じラベル化ぺプチドの混合、及びマススペクトルの測定の工程を含む。

また本発明は、必要に応じ、好ましくは酵素的処理によるペプチドの断片化（酵素消化)、及び/又は還元とアルキル化とによる化学的処理の工程を含む。さらに本発明は、必要に応じ、ゲル濾過による分離と、逆相カラムを用いる分離とを含む精製の工程を含む。

上記工程のうち、ラベル化、酵素消化、及び化学的処理の各工程を組み合わせた本発明における過程としては、（a ) 酵素消化の後にラベル化を行う過程、（b )ラベル化の後に酵素消化を行う過程、（c )化学的処 3fの後にラベル化を行う過程、（d ) ラベル化の後に化学的処理を行う過程、 ( e ) 化学的処理、酵素消化、及びラベル化をこの順で行う過程、（f )化学的処理、ラベル化、及び酵素消化をこの順で行う過程、及び、（g ) ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行う過程が挙げられる。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いる場合、解析すべきペプチドのサンプルとは別に、対照ペプチドのサンプルを用意する。解析すべきぺプチドが 2種以上のぺプチドの混合物である場合は、対照べプチドも対応する 2種以上のペプチドの混合物を用いることができる。サンプルの例としては、例えば、解析すべきペプチドのサンプルが病細胞に由来するタンパク質であリ、対照ペプチドのサンプルが前記病細胞に対応する正常細胞に由来するタンパク質である場合が挙げられる。この場合、対応するこれらのサンプルは互いにペプチド構成が異なる。解析すべきぺプチドのサンプル及び対照べプチドのサンプルとしては、それぞれ 1種類ずつ用いても良いし、一方及び Z又は他方を 2種類以上用いても良い。

ラベル化反応は、通常の方法を用いて行う。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いる場合は、解析すべきペプチドを、重い試薬及び軽い試薬のいずれか一方を用いてラベル化を行い、別途、対照ペプチドを、重い試薬及び軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化を行う。例えば、解析すべきぺプチドを重い試薬を用い、対照ペプチドを軽い試薬を用いてラベル化しても良いし、解析すべきぺプチドを軽い試薬を用い、対照べプチドを重い試薬を用いてラベル化しても良い。

このようにして別々にラベル化することによって、少なくとも 2種類のラベル化ペプチドを得ることができる。本発明においては、ラベル化に加え、必要に応じて、ペプチドの断片化を行うことができる。断片化は酵素消化によって行うことが好ましい。（以下、断片化を酵素消化によって行うとして本発明を説明する。）酵素消化は前記ラベル化の前又は後に行うことができる。すなわち本発明には（a ) 酵素消化の後にラベル化を行う過程、又は（b ) ラベル化の後に酵素消化を行う過程が含まれる。

酵素消化に用いる酵素は、高い基質特異性を有するトリプシン、リシルエンドぺプチダーゼ、卜ロンビン、プラスミン、カリクレイン、ゥロキナーゼなどのェンドぺプチダーゼが好ましい。酵素消化によって、ペプチドはペプチドフラグメン卜に断片化される。また、本発明においては、ラベル化に加え、必要に応じ、還元反応とアルキル化反応とによる化学的処理を行うことができる。後述する理由で、化学的処理と前記ラベル化との順番は任意である。すなわち本発明には、（c )化学的処理の後にラベル化を行う過程、（d ) ラベル化の後に化学的処理を行う過程が含まれる。アルキル化の形態としては、 S—力ルバミドメチル化や S—力ルポキシメチル化などが挙げられるが、これらに限定されない。

解析すべきペプチドはシスティン残基やジスルフィド結合を有することがある。システィン残基の S H基は反応性が高いため、ジスルフイド結合を形成しジチ才基に変化しやすく、予期せぬペプチド構造を形成することがある。ジスルフィド結合は高い p H環境において他のジスルフィド結合と交換する性質があるため、通常高い P H環境で行われる酵素消化の段階でペプチド構造が変化し、解析が困難になることがある。化学的処理を行うと、この問題を回避することができる。すなわち化学的処理においては、酵素消化で影響を受けやすいジチ才基を、前記還元反応によってジスルフィド結合を還元的に開裂させ、アルキル化することによってアルキルチオ基へ変化させる。

従って、前記酵素消化と化学的処理とを組み合わせて行う場合（すなわち、本発明においてラベル化、酵素消化、及び酵素消化を組み合わせて行う場合）は、化学的処理の後に酵素消化を行うことが好ましい。

ここで、前記したように、酵素消化は前記ラベル化の前でも後でも行うことができる。従って、（化学的処理の後に行われる）酵素消化をラベル化の前に行う場合は、本発明には、（e )化学的処理、酵素消化、及びラベル化をこの順で行う過程が含まれる。一方、（化学的処理の後に行われる）酵素消化をラベル化の後に行う場合は、酵素消化はこれら 3つの工程で最後に行うこととなる。酵素消化の前に行われる化学的処理とラベル化との順番は前述のように任意であるため、この場合、本発明には、（f ) 化学的処理、ラベル化、及び酵素消化をこの順で行う過程、又は、（ g ) ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行う過程が含まれる。化学的処理とラベル化との順番が任意である理由は次のとおりである。

解析すべきぺプチドがシスティン残基を有する場合、システィン残基は本発明におけるラベル化によって、卜リブ卜ファン残基と同様にラベル化され得る。従つて、システィン残基のラベル化という副反応を回避する目的で、前記化学的処理はラベル化の前に行うことができる。

しかし、前記化学的処理はラベル化の後に行うこともできる。前述のように、解析すべきぺプチドにシスティン残基が含まれている場合、このシスティン残基はラベル化において副反応をもたらす。このとき、システィン残基とラベル化試薬とが反応して形成される結合はジスルフィド結合である。副反応で形成されたジスルフイド結合は、前記化学的処理によって還元的開裂及びアルキル化することができる。従って、本発明においては、化学的処理をラベル化の後に行うこともできる。

以上の理由で、本発明において化学的処理とラベル化との順番は任意である。前述のようにして、解析すべきぺプチドからラベル化ぺプチド又はラベル化べプチドフラグメントを得る。 (以下、ラベル化ペプチド又はラベル化ペプチドフラグメン卜を単にラベル化ペプチド分子と表記する。また、ラベル化反応が未反応のべプチド又はべプチドフラグメントを未ラベル化べプチド分子と表記する。）ラベル化ペプチド分子は、精製されることが好ましい。ラベル化ペプチド分子は、トリプトファン残基がラベル化されておリ、未ラベル化べプチド分子よリも疎水性が高い。このため、通常使用される ODSなどを用いた逆相カラムによって、ラベル化ペプチド分子と未ラベル化ペプチド分子との分離が容易にできる。従つて本発明においては、 I CAT法で用いるような特殊なカラムを使用する必要がなくなるという利点がある。

また、逆相カラムでの精製を行う前に、ゲル濾過を行うことがょリ好ましい。ゲル濾過用担体は、セフアデックス、バイオゲル、ァガロースゲルなどが挙げられるが、セフアデックスが好ましい。また、セフアデックスは LH20が最適である。ゲル濾過によって、未反応及び加水分解を受けたラベル化試薬を分離することができ、より純度の高いラベル化ペプチド分子を得ることができる。必要に応じ精製されたラベル化ペプチド分子は、マススぺク卜ロメトリーによって測定される。重い試薬と軽い試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いた場合は、マススぺクトルの測定を行う前に、解析すべきぺプチドのサンプル及び対照ペプチドのサンプルを混合することができる。これによリそれぞれのサンプルのラベル化べプチド分子が混合される。それぞれのラベル化ペプチド分子は、マススペクトルの測定時に混合された状態であれば良いため、混合する時期は、ラベル化の後、マススぺク卜ルの測定の前であれば、酵素消化、化学的処理、又は精製のいずれの段階でも良い。混合されたラベル化ペプチド分子は、マススぺク卜ロメ卜リーによって測定される。マススぺク卜ロメ卜リーのイオン化法としては、 FD法、 S I MS法、 FAB 法、 MALD I法、 ES I法などが挙げられる。分析計としては、二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型（TOF) 質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロ卜ロン質量分析計などが挙げられる。

本発明においては、マススペクトル（MS) の結果と、タンデムマススぺクトル（MSZMS) の結果とを組み合わせてペプチドの解析を行うことができる。重い試薬と輊ぃ試薬とを組み合わせたラベル化試薬を用いた場合、マススぺク卜ル（MS) では、軽い試薬の分子量と重い試薬の分子量との差に相当する質量数の差を有するフラグメントイオンの対ピークを見つけることができる。この積分比は、それぞれのサンプルに存在するラベル化ペプチドのモル比に相当し、すなわち、対応するもとの解析すべきペプチドと対照ペプチドとのモル比に相当する。また、タンデ厶マススペクトル（M S ZM S ) と、データベースの検索とにより得られる配列情報から、それぞれのラベル化べプチド分子に相当するもとの解析すべきぺプチドと対照べプチドとをそれぞれ同定することができる。なお、解析すべきぺプチドのサンプル又は対照べプチドのサンプルのいずれか一方には含まれているペプチドが、いずれか他方には対応するペプチドとして含まれていない場合がある。すなわち、サンプルの一方にはペプチドが発現していて、いずれか他方には対応するペプチドが発現していない場合がある。この場合、マススぺク卜ルにおいては、一方にシグナルが観測されるが、他方には対応するシグナルが観測されないため、混合されたサンプルのスペクトルからはこのようなペプチド由来のシグナルを見つけることは困難である。従ってこのような場合は、本発明のペプチドの解析法における全ての工程、すなわち、ラベル化、酵素消化、化学的処理、精製、及びマススペクトルの測定を、各サンプルにおいて別々に行うと良い。そして、スペクトルチャートの横軸（質量電荷）（m/z)を等幅にして出力し、両者を比較して見ることで相対量比が 1 ： 0のシグナルを探し求めることによって解析を行うことができる。前述のように、本発明によると、適切なスルフエニル化合物を得ることによつ：て、ペプチド解析におけるラベル化をより反応性良く、より選択性良く行うことができるラベル化試薬を提供することができる。また、そのような反応性及び選択性に優れたラベル化試薬をべプチドの解析に用いることによつて、解析すべきタンパク質のサンプル、及び対照ペプチドのサンプルにそれぞれ存在している対応ぺプチドの種類とその発現量の違いとをより正確且つ容易に知ることができる。また、特定のペプチドがサンプル中の他のペプチドに比べてどれ位含まれているかということもより正確且つ容易に知ることができる。このように本発明によると、発現夕ンパク質の網羅的解析をよリ定量的且つ効率的に行うことができる。本発明の方法によると、発現タンパク質レベルで通常細胞と病細胞とのぺプチド搆成の違いを知ることができるため、病細胞の活動化段階をコントロールしているメカニズム等を解明する手がかりを知ることができる。すなわち、本発明によって明らかにされたペプチドが特定の疾患に関与するものである場合、該ぺプチドを標的として特異的に作用し、その機能を効果的に制御する化合物をコンビユー夕で理論的にデザィンすることによって、医薬品候補化合物を創出することができる。また、該ペプチドをコードする遺伝子の情報を見出し、該遺伝子の発現を特異的に制御する物質を医薬品候補化合物として創出することができる。本発明の方法は、これら医薬品候補化合物の創出をよリ効率的なものにすることができる。実施例

以下に実施例によリ本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

[実施例〗：スルフエニル化合物の合成]

本実施例では、 2—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド（重い試薬 ) を、対応するスルフィドから合成した。

(スルフィドの合成）

1 (6. 1 X I 0— ³mo I ) の 2—ニトロクロ口 [¹³C₆] ベンゼンを 1 m Iのメタノールに溶解し、ここに 8 g (6. 6X 1 0— ³mo I ) のべンジルメルカブタン、 0. 8m l (0. 01 mo I ) のピリジンを加え、 1 6時間加熱還流した。室温に放冷し 2—ニトロ [¹³C₆] フエ二ルペンジルスルフィドを析出させ、この結晶を濾別し、メタノールで洗浄した。風乾後黄色結晶として 2—二卜口 [¹³C₆] フエ二ルペンジルスルフイド 1. 38 g (90%) が得られた。

(重い試薬の合成）

前述のようにして得られた 2—二卜口 [¹³C₆]フエ二ルペンジルスルフィド 1 . 38 g (5. 5X 1 0— ³m o I ) にエチレンクロリド 10 m Iを加え、さらにスルフリルクロリド 940 m g (7. 9 X Ί 0一³ m o I ) を加え、室温で撹拌した。反応溶液を湯浴で 50〜 60°Cに加温しながら減圧濃縮した。得られた油状物に石油エーテルを加え、生じた結晶を濾別した。結晶を石油エーテルで洗浄し風乾して 2—二卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリドを 938mg (87 %) を得た。

(同定）

得られた重い試薬と、対応する軽い試薬（2—二卜口 [¹²C₆] ベンゼンスルフェニルクロリド）とをそれぞれマススぺク卜ロメトリ一により測定した。重い試薬と軽い試薬の構造式を化 Ίに示す。式中、 *は、 ¹³Cで標識された炭素原子を表す。化 1

重い試薬軽い試薬 •重い試薬

(m/z) 195.10(M⁺, 34.1), 160.10(15.2), 144.10(4.7), 131.10(25.0), 114.10(15.6), 99.20(100.0), 83.10(10.6), 71.20(32.3), 54.20(12.3)

•軽い試薬

(m/z) 189.00(M⁺, 35.3), 154.10(15.8), 138.10(4.9), 125.10(26.3), 108.10(17.6), 93.10(100.0), 78.10(14.1), 66.10(32.2), 50.20(15.3)

t 重い試薬と軽い試薬とのマススぺクトルを比較すると、分子イオン及びべンゼン環を有するフラグメン卜ィオンは全て 6ダル卜ンの差があリ、それぞれのフラグメン卜ピークの強度は全て同程度であった。

[実施例 2 ：分離実験]

モデルぺプチドとして ACTH、 Galanin及び PTH、ラベル化試薬として 2—二卜口 [¹²C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド（軽い試薬）を用い、ラベル化されたペプチドとラベル化されていないペプチドとが分離されるかどうかを確認する実験¾：行った。

ACTH 1 6 0 A6 g (5. 4 X 1 0— ⁸m o I ) を 7 0 %酢酸水溶液 1 00 μ Iに溶解した。ここに 2—二卜口 [¹²C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド 0. 4 1 m g (4 O m o I ) を加え、室温下 1時間ポルテックスミキサーにより撹拌した。反応溶液を氷冷後、氷冷したエーテル 800 \を加え、遠心分離した。沈殿を氷冷したエーテルで洗浄し、ラベル化体を得た。ラベル化したペプチドと、ラベル化に供しなかったペプチドとをそれぞれ混合し、逆相カラム（L C) による分離を行った。 Galanin及び ΡΤΗについても同様にして分離を行い、それぞれの保持時間を以下に示した。（ラベル化したペプチドは、 mod-を用いて表した。）なお、簡略された系であるため、酵素消化は行わなかった。 (保持時間）

ACTH 1 6. 57分

mod-ACTH 34. 78分

Galanin 2 1. 78分

mod-Galanin 35. 27分

PTH 24. 78分

mod-PTH 35. 47分

(条件）

A buffer ： 0. 01 M HCOOH-E t ₃N (pH 4. 5)

B液： CH₃CN

B液の勾配： 0%〜1 00 %を 50分かけて流した。

カラム： Shimpack VP-ODS、 250*4. 5mm 上に示すように、ラベル化されたものとそうでないものとでは、 3種全てにおいて保持時間に 1 0〜1 8分の差が生じた。従って、 LCによってラベル化ペプチドのみを分離できることが分かった。また、 2—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド（重い試薬）を用いて同様の分離実験を行ったところ、保持時間は同一であったため、重い試薬でもラベル化べプチドのみを分離できることが分かった。

[実施例 3 ：分離実験]

(ラベル化）

モデルタンパク質としてリゾチームを用い、実施例 2と同じ趣旨の分離実験を行った。本実施例では、ラベル化、化学的処理、及び酵素消化をこの順で行ったリゾチームを実施例 2と同様の方法で「軽い試薬 J を用いてラベル化し、洗浄、凍結乾燥した。次いで以下に示す方法により化学的処理（ジスルフイド結合の還元及び S—カルバミドメチル化）と酵素消化とを行った。

(ジスルフイド結合の還元）

i

ここに、 1 00mM NH₄HC0₃溶液を加えて溶解し、 1つのジスルフイド結合に対し 50倍量の DTTを加え、 56 °Cで 1時間反応させた。

(S—力ルバミドメチル化）

反応溶液を室温まで放冷後、ョードアセトアミドの 1 0 OmM NH₄HC0₃溶液を加え、室温で 1時間反応させた。反応溶液をセフアデックス G 1 0のカラムで精製し、凍結乾燥した。

(酵素消化）

ここに 50mM NH₄HC0₃-5mM C a C I ₂溶液に溶解したトリプシンを適当量加え、 37°C、 1 6時間反応させた。上述の一連の処理を行つて得られたラベル化ぺプチドフラグメントを含む消化物を、 LCにより分離した。このときの LCチャートを図 1に示す。図 1においては、横軸に保持時間（分； min)、縦軸にピーク強度（mAU) を表す。その結果、保持時間 29~39分の画分（detected fraction a) に目的とするラベル化ぺプチドフラグメントが全て含まれていた。表 1は、 LCの前（before LC) におけるリゾチーム由来ペプチドと、 LCの後（after LC) に detected fraction a (Fr.a) において観測されたリゾチーム由来ペプチドフラグメントとのマススぺクトルにおける（質量/電荷）（m/z)を比較してまとめたものである。表中、括弧内の数字はアミノ酸配列の番号を表し、 Wが付された数字はラベル化された卜リブトファンを含有するペプチドフラグメントを表す。 beforeし C after LC (Fr.a)

874.81 (15-21)

1198.86 (117-125W) 1198.45 (117-125W) 1299.74 (62-68W) 1299.25 (62-68W)

1429.06 (34-45)

1479.03 (22-33W) 1479.38 (22-33W)

1487.07 (115-125W) 1486.42 (115-125W) 1754.34 (46-61)

(条件)

A： 0. 1 %T F A

B : 0. 07%TFA i n CH₃CN

Bの勾配： 0%〜1 00%を1 00分かけて流した。

カラ厶： Shimpack VP-ODS、 1 50*4. 6mm 上に示すように、 L Cによってラベル化べプチドフラグメン卜のみを分離できる；: とが分かった。また、 2—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド（重い試薬）を用いて同様の分離実験を行ったところ、重い試薬でもラベル化ペプチドのみを分離できる:: とが分かった。

[実施例 4 ：分離実験]

本実施例では、ラッ卜（ウィスター (Wister)) 血清を用い、ラベル化、酵素消化及び分離精製後、実際に目的とするトリプ卜ファン含有ペプチドフラグメントがどのように濃縮されてくるのかを調べる実験を行った。サンプルは、ラット血清 2 μ I (総蛋白量 Ί O O /i g ) を 2サンプル用意し、それぞれについて一方のサンプルは「軽い試薬他方のサンプルは「重い試薬」を用いて実施例 2と同様にしてラベル化した。これらを混合し、実施例 3と同様にして化学的処理及び酵素消^を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。次いでセファデックス L H 2 0のカラムで分離精製を次のような条件で行った。力ラム容量 2 . 0 m l

分取容量 1 2 0 ^ 1

溶離溶媒 3 0 %ァセ卜ニ卜リレ汾取後、 1フラクションづっ MALDI— TOFMSで確認を行い、 6ダル卜ンの差で親れるラベル化ペプチドフラグメントのピークを観測した。図 2は、このピーク対の数をカウン卜し、グラフ化したものである。図 2は、横軸に分取番号

(fraction number)、縦軸にピーク対の数 (number of pair peaks) を表す。図 2 がすように、フラクションの 1 6から 2 3くらいまで目的のピーク対が見られた。すなわち、分取については Ί . 8 m lから 2 . 8 m Iの計 1 m Iを取れば良いことがわかった。ま実際は、これより多少多めにとつてもかまわない事がわかった。

[実施例 5 ]

本実施例では、卜リブ卜ファン残基とシスティン残基とを両方有するぺプチドを用いた。実施例 3及び 4のように、ラベ化をィ匕学的処理の前に行う場合、システィン残基はトリブトファン残基と同様にラベル化され、ラベル化の直後は、システィン残基及びトリプ卜ファン残基が両方ラベル化されたぺプチドが生成し得る。このべプチドが化学的処理後にはトリプ卜ファン残基のみがラベル化されたぺプチドに変換されることを確認する実験を行った。 NDDGGFSEEWEAQRDSHLGC (配列表の配列番号 1 ) の配列を有するぺプチド、 presininn-1 (331-349)-Cys (Bachem社製、 MW=2252.3) を用い、実施例 2 と同様にしてラベル化を行った。ラベル化前のペプチドの MALD TOFMSのスぺク卜ルチヤ一卜（シグナル強度： 1 0 8 m V ) を図 3下段に示し、ラベル化によつて得られたラベル化ペプチドの MALD^TOFMSのスぺクトルチヤ一卜（シグナル強度： 2 1 m V ) を図 3中段に示す。なお、図 3中の全てのチャートにおいて、横軸は (質量/電荷) ((Mass/Charge)； (m/z)) を表し、縦軸はイオンの相対強度（％lnt.) を表す。これらチャートが示すように、（m/z)= 2 2 5 2 . 0 4のシグナルを与える配列表の配列番号 1のぺプチドが、（m/z)= 2 5 5 9 . 4 4のシグナルを与える化合物に変化した。これは、卜リブトフアンとシスティンの両方がラベル化されたペプチド NDDGGFSEEW(Nbs)EAQRDSHLGC(Nbs) (配列表の配列番号 2) に相当する。ここで W(Nbs)は、ラベル化された卜リブ卜ファン残基を表し、 C(Nbs)は、ラベル化されたシスティン残基を表す。

次に、還元，アルキル化による一連の化学的処理を、それぞれ TCEPとョードァセ卜アミドとによって行った。このとき得られたペプチドの MALDI-TOFMSのスペクトルチヤ一卜（シグナル強度： 6 O m V ) を図 3上段に示す。これらチヤ一卜が示すように、（m/z)= 2 5 5 9 . 4 4のシグナルを与える配列表の配列番号 2のペプチドが、（m/z)= 2 4 3 6 . 6のシグナルを与える化合物へと変化した。これはラベル化によるシスティン上の標識置換基が還元剤で開裂し、ョードアセ卜アミドによりアミドメチル化（AM) されたペプチド

NDDGGFSEEW(Nbs)EAQRDSHLGC(AM) (配列表の配列番号 3 ) である。ここで、 C(AM)は、アミドメチル化されたシスティン残基を表す。

[実施例 6 ：定量的解析]

まず、サンプルペプチドとして ACTH、 Galaninを用い、 2つの異なる状態の細胞をこれらのぺプチドの含有比率を次のように設定することでモデル化した。 'セル A ACTH： Galanin= 1 ： 1 (モル比）

•セル B ACTH： Galanin= 1 ： 2 (モル比）

'セル Aとセル Bとの含有 ACTH比セル A :セル B = 1 : 1 (モル比） 'セル Aとセル Bとの含有 Galanin比セル A :セル B = 1 ： 2 (モル比）次に、これら各々の系について、セル Aについては「軽い試薬 J を用い、セル Bについては「重い試薬」を用い、実施例 2と同様の方法でラベル化反応を行つた。これらの系は簡略化されたものであるため、化学的処理及び酵素消化は行わなかった。

さらに、ラベル化反応後のこれら 2つの系を混合し、セフアデックス G 2 5を用いてゲル濾過した。ゲル濾過したペプチドを、 L Cを用いてラベル化ペプチドのみを分離した。このようにして得られたラベル化ペプチドを、 MALDI— TOFMSによって測定した。得られたマススペクトルを図 4及び図 5 (図 4の続き）に示した。図 4及び図 5において、横軸は (質量/電荷) ((Mass/Charge)； (m/z)) を表し、縦軸はィ才ンの相対強度（％lnt.) を表す。

マススペクトルの結果より、イオンのピーク強度比から、設定したペプチド含有率が正確に反映された。なお、「軽い試薬」によって修飾を受けたペプチドをし- mod、 Γ重い試薬 j によって修飾を受けたペプチドを H-modと表記した。

•イオンピーク

(m/z) =3086.60 [ACTH (し mod)]、 3092.64 [ACTH(H-mod)]、 3316.68 [ Galanin(L-mod)], 3322.68 [Galanin(H-mod)]

• ピーク強度比

ACTH (し mod)： ACTH (H-mod) = 1 ： 1 Galanin (し- mod)： Galanin(H-mod)= 1 ： 2 [実施例 7 ：定量的解析]

モデルペプチドとして、 α—ラク卜アルブミン（LCA— BOVIN )、ダリセルアルデヒドー 3—フォスフエ一卜デヒドロゲナーゼ（G3P__RABrr )、フォスフォリラーゼ B ( PHS2 RABIT )、及びオボアルブミン（ OVAL CHICK ) (全てシグマ社製）を用い、 2つの異なる状態の細胞をこれらのぺプチドの含有比率を次のように設定することでモデル化した。

'セル A LCA_BOVIN, G3P_RAB1T. PHS2_RAB1T, OVAL_CHICK

(全て 1 2 . 5 gずつ含有）

'セル B LCA— BOVIN、 G3P_RABIT> PHS2_RABIT, OVAL— CHUCK

(全て 2 5 t _gずつ含有）

•セル Aとセル Bとの含有ペプチド比セル A :セル B= 1 ： 2 (モル比）次に、これら各々の系について、セル Aについては「軽い試薬」を用い、セル Bについては Γ重い試薬」を用い、実施例 2と同様の方法でラベル化反応を行つた。ラベル化後 2つの溶液を混合し、次いで実施例 3と同様に化学的処理 ¾び酵素消化を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。この消化物をセファテックス L H 2 0のカラムで分離精製して MALDI-TOFMS分析を行つた。その結果を表 2に示す。表 2には遺伝子名（Gene Name)、同定されたぺプチドの配列（Peptide Sequence Identified) , (軽い試薬でラベル化されたぺプチドの量) / (重い試薬でラベル化されたぺプチドの量）の実測比（Observed Ratio (¹³C。/ ¹³C₆))、（軽い試薬でラベル化されたペプチドの量） Z (重い試薬でラベル化されたペプチドの量）の理論比（Expected Ratio (¹³C₀ / ¹³C₆))、実測比の平均と理論比との差（Mean+-SD)、及びエラー値（Error(%)) を示す。表 2に示すように、用いたサンプルペプチド各々について、ラベル化ペプチドフラグメン卜に由来する卜リブ卜ファン含有べプチドフラグメン卜が同定できた。さらに、観測されたそれぞれの実測比については、エラー値が 9 %以下であリ、理論比と良い一致を示した。表 2

(同定されたペプチドフラグメント）

• LCA—BOVIN由来

IWCK (配列表の配列番号 4 )

LDQWLCEK (配列表の配列番号 5 )

LDQWLCEKL (配列表の配列番号 6 )

VGINYNLAHK (配列表の配列番号 7 )

• G3P_RABIT由来

GLWEK (配列表の配列番号 8 )

GLWEKAFK (配列表の配列番号 9 ) • PHS2一 RAB1T由来

LWR

LISWYDNEFGYSNR (配列表の配列番号 1 0)

•OVAに CHICK由来

WIR

EWTR (配列表の配列番号 1 1 )

f

EWTRMVIR (配列表の配列番号 1 2) [実施例 8 ：定量的解析]

本実施例ではラッ卜（ウィスター）の血清にサンプル蛋白質である卵白リゾチー厶（シグマ社製）を加えて、実際にリゾチーム由来のシグナルが観測されるかどうかを調べた（スパイクテス卜）。 2つの異なる状態の細胞をこのペプチドの含有量を次のように設定することでモデル化した。

•セル A ラット血清 5 l + 卵白リゾチーム 3 μ g (0. 21 n m o I ) 'セル B ラット血清 5 l + 卵白リゾチ一厶 6 ig (0. 42 nmo I ) •セル Aとセル Bとの含有リゾチーム比セル A:セル B=1 : 2 (モル比）なお、用いたラッ卜血清 5 μ I中の総蛋白量は 0. 28mg、アルブミンは 0. 1 4 m g ( 2. 1 nmo I ) である。

次に、これら各々についてセル Aにっては「重い試薬」を用い、セル Bについては「軽い試薬」を用い実施例 2と同様の方法でラベル化反応を行った。ラベル化後の反応溶液を混合し、次いで実施例 3と同様に化学的処理及び酵素消化を行い、ラベル化ペプチドフラグメントを含む消化物を得た。この消化物をセフアデックス LH 20のカラムで分離精製して MALDI-TOFMS分析を行った。このときのスペクトルチャートを図 6に示す。図 6中、横軸は（質量 Z電荷） ((Mass/Charge)； (m/z)) を表し、縦軸はイオンの相対強度 (%lnt.) を表す。図 6に示すようにリゾチーム由来のフラグメント、（m/z) = 1 1 9 9 . 3 3、 1 2 0 5 . 2 7が観測され、ピークの強度比は 2： 1であった。従って、実測比（observed ratio) は 2であり、理論比（expected ratio) 2と一致した。すなわち、エラ一値は 0 %である。このことは、生体サンプル中においても添加したリゾチ一厶の相対比がそのまま酵素消化後に得られたぺプチドフラグメン卜の相対比として得られたことを示している。上記実施例の結果が示すように、本発明の方法を用いるとエラー値が全て 9 % 以下となり、高い定量性を示した。

[実施例 9 ：定量的解析]

本実施例では実際の生体試料を用いて定量的解析を行った。

以下の 2つの系統のラッ卜血清を用いた。

A： SPF VAF Crj Wister rat (正常ラッ卜）

B ： SPF/VAF GK/Crj rat (高血糖ラッ卜、血糖値 3 7 2 m g Z d I ) 各々のラッ卜からの血清を 2 i Iずつサンプルとして用い、し CQ DecaXP ( Thermo Rnnigan社製） -LCAd-Vpシステム（㈱島津製作所製）によって

ESI- S/ S測定を行った以外は実施例 7と同様に定量的解析を行った。その結果、その結果を表 3に示す。表 3には遺伝子名（Gene Name)、同定されたべプチドの配列（Peptide Sequence Identified), (正常ラット由来のペプチドの量） / (高血糖ラット由来のぺプチドの量）の実測比（Observed Ratio (Wister / GK)) を示す。表 3

(同定されたペプチドフラグメント）

AWAVAR (酉 5列表の配列番号 1 3 )

NTAAWAK (配列表の配列番号 1 4 )

WKIRK (配列表の配列番号 1 5 ) 上述のように、実施例においては、スルフエニル化合物として 2—二卜口 [¹³ C ₆ ] ベンゼンスルフエニルクロリドを合成し、それをラベル化試薬として用い、 ACTH. Galanin, PTH、リゾチーム、ラッ卜血清、 presinHin-1 (331 -349)-Cys、 α—ラク卜アルブミン、グリセルアルデヒド一 3—フォスフェートデヒドロゲナーゼ、フォスフォリラ一ゼ8、及び才ポアルブミンの解析に用いた。しかし、本発明は、上記スルフエニル化合物に限られることなく、一般式（I) で表されるすベてのスルフエニル化合物に適用される。また、本発明のラベル化試薬は、一般式（I) で表されるすべてのスルフエニル化合物を用いることができる。さらに、本発明の方法は、上記ペプチドに限られることなく、タンパク質を含めるすべてのペプチド I適用することができる。そのため、前述の実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、全て本発明の範囲内のものである。なお、配列表フリーテキス卜（人工配列の記載（Description of Artificial Sequence)) において、配列番号 1は、プレセ二リン一 1 ( 3 3 1 — 3 4 9 )— Cys であり、配列番号 2は、ラベル化されたプレセ二リン— 1 (3 3 1 — 349)-Cys であリ、配列番号 3はアミドメチル化されたラベル化プレセ二リン一 1 (3 3 1 — 349)— Cysである。

産業上の利用可能性

本発明によれば、反応性及び選択性に優れ、マススぺクトルでの解析が容易で定量性も高く、かつ特殊な力ラ厶を必要としないラベル化試薬に用いることができるスルフエニル化合物、それを用いたラベル化試薬、及びそのラベル化試薬を用いたタンパク質 ·ペプチドの解析方法が提供される。

Claims

請求の範囲

1. (1 ) —般式：

R - S -X ( I )

で表されるスルフェニル化合物。

2. 前記有機基 Rは構成元素として C、 H、 N、場合によリ 0及び/又は P を含み、前記同位体は、 ²H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0、 ¹⁸0からなる群から選ばれる安定同位体である、請求の範囲第 1項に記載のスルフエニル化合物。

3. 前記スルフエニル化合物の分子量が、前記化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物の分子量よリも 3〜 1 2大きい、請求の範囲第 1項に記載のスルフエニル化合物。

4. 前記同位体で標識された構成元素の数が 3以上である、請求の範囲第 1 項に記載のスルフヱニル化合物。

5. 前記有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基、又は置換されていても良いァリール基である、請求の範囲第 1項に記載のスルフ Iニル化合物。

6. 前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 N0₂基、 CO OH基、 S0₃H基、 OH基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、請求の範囲第 5項に記載のスルフエニル化合物。

7. 前記置換されていても良いァリール基が有する置換基は、 N0₂基、 CO OH基、 S0₃H基、 OH基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、請求の範囲第 5項に記載のスルフエニル化合物。

8. 前記有機基 Rは、置換されていても良いフエニル基である、請求の範囲第 5項に記載のスルフエニル化合物。

9. 前記脱離基 Xがハロゲン原子である、請求の範囲第 1項に記載のスルフェニル化合物。

10. 2—二卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 4—ニトロ [¹³ C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2， 4一ジニ卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—二卜ロー 4—カルボキシ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリドからなる群から選ばれる、請求の範囲第 1項に記載のスルフエニル化合物。

11. 一般式：

R-S-X ( I )

で表されるスルフエニル化合物を含むラベル化試薬。

12. 前記有機基 Rは構成元素として C、 H、 N、場合により O及び又は P を含み、前記同位体は、 ²H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0、 ¹⁸0からなる群から選ばれる安定同位体である、請求の範囲第 1 1項に記載のラベル化試薬。

13. 前記スルフエニル化合物の分子量が、前記化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物の分子量よりも 3〜1 2大きい、請求の範囲第 1 1項に記載のラベル化試薬。

14. 前記同位体で標識された構成元素の数が 3以上である、請求の範囲第 1 1項に記載のラベル化試薬。

15. 前記有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基、又は置換されていても良いァリール基である、請求の範囲第 Ί 1項に記載のラベル化試薬。

16. 前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 N0₂基、 C OOH基、 S0₃H基、 OH基、アルコキシ基、ァリール基、ァリールォキシ基からなる群から選ばれる、請求の範囲第 1 5項に記載のラベル化試薬。

17. 前記置換されていても良いァリール基が有する置換基は、 NO ₂基、 C O OH基、 S0₃H基、 OH基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、請求の範囲第 1 5項に記載のラベル化試薬。

18. 前記有機基 Rは、置換されていても良いフエニル基である、請求の範囲第 1 5項に記載のラベル化試薬。

19. 前記脱離基 Xがハロゲン原子である、請求の範囲第 1 1項に記載のラベルイヒ試薬。

20. 前記スルフエニル化合物が、 2—二卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエ二ルクロリド、 4—ニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2, 4—ジニ卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—二卜ロー 4—カルボキシ

C¹³c₆]ベンゼンスルフエニルクロリドからなる群から選ばれる、請求の範囲第

1 1項に記載のラベル化試薬。

21. ペプチドの解析の用途における、請求の範囲第 1 1項に記載のラベル化

22. 前記スルフヱニル化合物から選ばれた 1つの化合物と、前記選ばれた 1 つの化合物（重い試薬）と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）とをそれぞれ別個に含む、請求の範囲第 1 1項に記載のラベル化試薬。

23. 一般式：

R - S -X ( I )

24. 前記有機基 Rは構成元素として C、 H、 N、場合により O及び/又は P を含み、前記同位体は、 ² H、 ¹³C、 ¹⁵N、 ¹⁷0、 ¹⁸0からなる群から選ばれる安定同位体である、請求の範囲第 23項に記載のペプチドの解析法。

25. 前記スルフエニル化合物の分子量が、前言化合物と同一構造であり且つ前記同位体で標識されていない化合物の分子量よりも 3~1 2大きい、請求の範囲第 23項に記載のペプチドの解析法。

26. 前記同位体で標識された構成元素の数が 3以上である、請求の範囲第 2 3項に記載のぺプチドの解析法。

27. 前記有機基 Rは、置換されていても良いアルキル基又はァリール基である、請求の範囲第 23項に記載のペプチドの解析法。

28. 前記置換されていても良いアルキル基が有する置換基は、 NO ₂基、 C OOH基、 S0₃H基、 OH基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、請求の範囲第 27項に記載のペプチドの解析法。

29. 前記置換されていても良い,ァリール基が有する置換基は、 N0₂基、 C OOH基、 S0₃H基、 OH基、アルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァリール才キシ基からなる群から選ばれる、請求の範囲第 27項に記載のペプチドの解析法。

30. 前記有機基 Rが置換されていても良いフエニル基である、請求の範囲第 27項に記載のペプチドの解析法。

31. 前記脱離基 Xが、ハロゲン原子である、請求の範囲第 23項に記載のぺプチドの解析法。

32. 前記式（ I )で表される同位体で標識されたスルフエニル化合物が、 2 一二卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 4一二卜口 [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、 2， 4ージニトロ [¹³C₆] ベンゼンスルフエニルクロリド、及び 2—二卜ロー 4一カルボキシ [¹³C₆]ベンゼンスルフエニルクロリドからなる群から選ばれる、請求の範囲第 23項に記載のペプチドの解析法。

33. 前記ラベル化試薬が、前記式（ I )で表される同位体で標識されたスルフエニル化合物から選ばれた 1つの化合物（重い試薬）と、前記選ばれた化合物と同一構造でぁリ且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬）とをそれぞれ別個に含む、請求の範囲第 2 3項に記載のペプチドの解析法。

34. 前記ラベル化試薬を用いて、解析すべきぺプチドのァミノ酸残基をラベル化し、得られたラベル化ペプチドをマススぺクトロメ卜リ一により測定する、請求の範囲第 2 3項に記載のぺプチドの解析法。

35. (0 解析すべきペプチドを、前記式（ I ) で表される同位体で標識されたスルフエニル化合物から選ばれた 1つの化合物（重い試薬）、及び前記選ばれた化合物と同一搆造であリ且つ前記同位体で標識されていない化合物（軽い試薬 ) のいずれか一方を用いてラベル化し、ラベル化された解析すべきペプチドを得て、

(ii)別途、対照ペプチドを、前記重い試薬及び前記軽い試薬のいずれか他方を用いてラベル化し、ラベル化された対照ぺプチドを得て、

(iv) 混合したラベル化ペプチドをマススぺク卜ロメトリーによって測定する、請求の範囲第 3 4項に記載のペプチドの解析法。

36. 必要に応じて酵素消化及び Z又は還元とアルキル化とによる化学的処理を行う、請求の範囲第 3 4項に記載のペプチドの解析法。

37. 前記酵素消化を前記ラベル化の前又は後に行う、請求の範囲第 3 6項に記載のぺプチドの解析法。

38. 前記化学的処理を前記ラベル化の前又は後に行う、請求の範囲第 3 6項に記載のペプチドの解析法。

39. 前記化学的処理、前記酵素消化、及び前記ラベル化をこの順で行う、請求の範囲第 3 6項に記載のペプチドの解析法。

40. 前記化学的処理、前記ラベル化、及び前記酵素消化をこの順で行う、請求の範囲第 3 6項に記載のぺプチドの解析法。

41. 前記ラベル化、前記化学的処理、及び前記酵素消化をこの順で行う、請求の範囲第 3 6項に記載のペプチドの解析法。

42. 前記ラベル化の後、必要に応じゲル濾過による分離と逆相カラ厶を用いる分離とを含むラベル化ペプチドの精製を行う、請求の範囲第 3 4項に記載のぺプチドの解析法。

43. 前記ァミノ酸残基が卜リブ卜ファン残基である、請求の範囲第 3 4項に記載のペプチドの解析法。

44. 請求の範囲第 2 3項に記載のペプチドの解析法によって見出されるぺプチドを含む新規化合物。

45. 請求の範囲第 2 3項に記載のペプチドの解析法によって見出されるぺプチドを含む新規化合物から開発される医薬品候補化合物。