WO2004001046A1 - Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (cysdv) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a cysdv obtenidas mediante dicho método - Google Patents

Método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (cysdv) en plantas, construcciones genéticas usadas y plantas resistentes a cysdv obtenidas mediante dicho método Download PDF

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cysdv
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Maribel Franco Redrejo
Juan Manuel Aguilar Aguilar
Cristina FERNÁNDEZ MARCO
Juan DÍAZ PENDÓN
Emilio RODRÍGUEZ CEREZO
Miguel Angel Aranda Regules
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
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    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/00022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the present invention relates to a method for generating resistance against
  • Cucurbit yellow stunting disorder virus in plants susceptible to CYSDV infection.
  • the invention also relates to the genetic constructs derived from the genome of the virus used in said method and to the plants obtained by said method.
  • CYSDV has replaced BPYV as a result of the displacement of T. vaporariorum by B. tabaci that appears to have taken place in at least some geographical areas (Wisler et al., 1998; Berdiales et al., 1999).
  • CYSDV has been detected and causes serious problems in cucurbit crops in the Arab Emirates, Spain, Portugal, Morocco, Riverside and North America (Célix et al., 1996; Wisler et al., 1998; Abou-Jawdah and col., 2000; Desbiez et al., 2000; Kao et al., 2000; Louro et al., 2000).
  • yellowing symptoms caused by CYSDV are frequently observed in 100% of the plants in the affected greenhouses, resulting in very serious economic losses due to the significant reductions in crop yields.
  • CYSDV is a member of the genus Crinivirus (Family Closteroviridae; Martelli et al., 2000) that, like other members of this genus, invades the phloem tissue of infected plants and appears to remain restricted to it. Its range of hosts is limited to species of the Cucurbitaceae family (Célix et al., 1996). Its particles are shaped like a flexible rod and a length of 750 to 800 nm (Liu et al., 2000).
  • the CYSDV genome is a single-stranded messenger and bipartite RNA, that is, it is formed by two RNA molecules that have been called RNAl and RNA2 (Célix et al., 1996), and so far it has only been partially sequenced.
  • CYSDV control is currently based on the control of its B. tabaci vector and the use of preventive health strategies, although these methods are having very limited results. Undoubtedly, the best option for the control of CYSDV would be the use of cultivars carrying genetic resistance to the virus. However, at the moment only one possible source of natural resistance to CYSDV (López-Sesé and Gómez-Guillamón, 2000) has been described and this is in melon.
  • the objective of the present invention is to provide a method for generating genetic resistance against CYSDV in plants susceptible to this virus.
  • RNA virus sequences or genes that have been used successfully to generate pathogen-derived resistance in plants include: 1) capsid protein genes, 2) RNA-dependent RNA polymerase genes RNA, 3) motion protein genes and 4) tospovirus nucleoprotein genes.
  • the virus resistance phenotype is associated with the post-transcriptional gene silencing (PTGS) of the transgene (Beachy, 1997) such that the PTGS seems to target not only the transgene but also to the homologous genes of a possible invasive virus (English et al., 1996; Marathe et al., 2000).
  • dsRNAs double stranded RNAs
  • the genes silenced by transforming plants with inverted repeats may be from the genome of a possible invasive virus and, therefore, the expected phenotype with respect to viral infection in transgenic plants is virus resistance (Waterhouse et al., 1998 ).
  • the objective of the present invention is to provide a method for generating genetic resistance against CYSDV in plants previously susceptible to the virus by transforming plants with transgenes carrying a sequence with an inverted repeat derived from the viral genome.
  • the invention relates to a nucleic acid construct comprising a first nucleotide sequence capable of regulating transcription in a plant of a second nucleotide sequence, said second nucleotide sequence comprising: (i) a nucleotide sequence corresponding to a fragment of the CYSDV RNAl, and (ii) an inverted repeat of all or part of said nucleotide sequence (i).
  • the invention in another aspect, relates to a vector comprising said nucleic acid construct.
  • the invention relates to a plant cell transformed with said nucleic acid construct or with said vector.
  • the invention relates to a transgenic plant cell comprising, integrated in its genome, said nucleic acid construct.
  • Transgenic plants comprising at least one of said transgenic cells also constitute an aspect of the present invention.
  • the invention relates to a plant transformed with said nucleic acid construct or with said vector.
  • the invention relates to a plant that is a clone or a descendant of said transgenic or transformed plant.
  • the invention relates to a hybrid plant with improved resistance against CYSDV, prepared by crossing said transgenic plant, or transformed, or a clone or descendant thereof, with a second plant susceptible to CYSDV infection. .
  • the invention relates to a propagule, such as a seed, of any of said transgenic, transformed or hybrid plants.
  • the invention relates to a seed of a plant comprising said second nucleotide sequence comprising (i) a sequence of nucleotides corresponding to a fragment of the CYSDV RNAl, and (ii) an inverted repeat of all or part of said nucleotide sequence (i).
  • the invention in another aspect, relates to a method for generating resistance against the yellowing virus and cucurbit dwarfism (CYSDV) in plants susceptible to CYSDV infection, which comprises transforming a plant cell of a plant susceptible to infection by CYSDV with said nucleic acid construct and regenerate the plant from said transformed plant cell.
  • CYSDV cucurbit dwarfism
  • the invention relates to the use of said nucleic acid construction in the production of a transgenic plant with improved resistance to CYSDV infection.
  • Figure 1 shows the complete sequence of the CYSDV RNAl.
  • the nucleotide sequence is numbered. Under the nucleotide sequence appears its probable translation to amino acids. The reading frame that is probably translated is indicated to the left of each line of the amino acid sequence.
  • Figure 2 is a diagram representing the possible gene organization of CYSDV RNAl. Open rectangles represent ORFs.
  • ORF la the area indicated by a black rhombus has sequence homology with methyl transferase domains (Rozanov et al., 1992) and the area indicated by a black star with helicase domains (Gorbalenya and Koonin, 1993).
  • ORF Ib the area indicated by a black square has sequence homology with RNA polymerase domains (Koonin and Dolja, 1993). The horizontal black segments correspond to the cDNA clones used in complete RNAl sequencing.
  • the horizontal shaded segments represent cDNA clones initially obtained and used to design oligonucleotides to prepare the aforementioned clones.
  • the arrows indicate the oligonucleotides used in the synthesis of the first chain of cDNAs and / or in their amplification by PCR.
  • Figure 3 shows the alignment of the CYSDV and LIYV nucleotide sequences corresponding to the 5'-UTR (A) and 3'-UTR (B) regions of their RNAs 1. Identical nucleotides appear between the two sequences on a black background .
  • Figure 4 shows the alignment of the CYSDV and L1YV amino acid sequences corresponding to the methyltransferase domains (A; Rozanov et al., 1992), helicase (B; Gorbalenya and Koonin, 1993) and RNA polymerase (C; Koonin and Dolja, 1993) possibly encoded by their RNAs 1. On the black background the identical amino acids appear between both sequences. On gray background, similar amino acids.
  • Figure 5 shows the alignment of CYSDV and BYV sequences in the RNAl region in which a change (+1) of the reading phase can lead to the expression of the Ib protein.
  • Figure 6 shows the organization of the resistance and selection module that carries the genetic construction introduced in the transgenic plants. The scheme corresponds to the region between the right (RB) and left (LB) edges of the Ti plasmid of Agrobacterium.
  • RB to LB are indicated: the 35S promoter of Cauliflower Mosaic Virus (CaMV), the viral transgene formed by the nucleotide sequence between nucleotides 6,116 to 6,827 of the CYSDV RNAl sequence (numbering as in Figure 1) and an inverted repetition of said sequence (nts complementary to 6,827 to 6,116 of the CYSDV RNAl; numbering as Fig. 1), the CaMV poly (A) terminator, the nopalin synthetase (NOS) gene promoter, the gene of neomycin phosphotransferase II and the poly (A) terminator of the genNOS.
  • CaMV Cauliflower Mosaic Virus
  • NOS nopalin synthetase
  • Figure 7 is a representative scheme of the process followed and of the intermediate constructions used for the preparation of the genetic construction used in this invention to transform plants.
  • A it is: Cloning in pGEM-T Easy of the 862pb fragment amplified by PCR with the oligonucleotides MA160-MA161.
  • B is: Cloning in pGEM-T Easy of the 712pb fragment amplified by PCR with the oligonucleotides MA160-MA174.
  • C is: Digestion with Sma ⁇ .
  • D Digestion with EcoRl and purification of the 730 bp fragment, followed by treatment with Klenow.
  • E Ligation.
  • the CYSDV genome RNAl was sequenced completely.
  • the nucleotide sequence of the CYSDV RNAl was obtained as described in Example 1.
  • the CYSDV RNAl has 9,123 nucleotides (nt) (SEQ. LD. No.: 1) ( Figure 1).
  • a search in the databases (BLASTN program; GCG Software Package, Madison, WI, USA) has shown that the maximum sequence homology is with the lettuce infectious yellowing virus (LIYV), which is the member type of the genus Crinivirus, Family Closteroviridae (Martelli et al., 2000).
  • the first two ORFs are organized in a similar way as they are in LIYV (Klaasen et al, 1995).
  • the first ORF (ORF la) comprises nucleotides 95 to 6,028 and can be translated into a protein of 1,976 amino acids with a calculated molecular weight of 227 kDa.
  • ORF la two motifs conserved in proteins associated with virus replication can be identified. Between amino acids 514 and 871 there is a methyltransferase motif (MET; Rozanov et al., 1992); In addition, this sequence has a high similarity with the homologous domain in LIYV (42.6% of identical amino acids in an alignment of 357 residues; Figure 4A).
  • the product encoded by the ORF Ib contains the typical conserved motifs of RNA-dependent RNA polymerases (RdRp; Koonin and Dolja, 1993) and is closely related to the alleged RdRp of LIYV (55.9% of identical amino acids in an alignment of 474 waste; Figure 4C).
  • the ORF Ib is in a reading frame other than the ORF la, specifically displaced a nucleotide downstream (+1). It has been proposed for Beet Yellowing Virus (BYV), a type member of the genus Closterovirus, that the homologous product to that encoded by CYSDV ORF Ib be expressed via phase change (+1) of the ribosome during translation (Agranovsky et al., 1994).
  • ORFs 2 (nts 7,554-7,690), 3 (nts 7,704-8,342) and 4 (nts 8,389-9002) have the capacity to encode proteins of 48, 212 and 192 amino acids, respectively, with calculated molecular weights of 5, 25 and 22 kDa, respectively.
  • the proteins potentially encoded by ORFs 2, 3 and 4 do not show significant similarity with any protein whose sequence is available in the databases, nor has any motif conserved in their corresponding sequences been found.
  • the invention provides a nucleic acid construction, hereinafter construction of the invention, comprising: a first nucleotide sequence capable of regulating transcription in a plant of a second sequence of nucleotides, said second nucleotide sequence comprising:
  • said nucleotide sequence (i) may contain any nucleotide sequence of the CYSDV RNAl. Also, the length of said sequence (i) may vary within a wide range, typically between 25 and 4,000 nt. However, in a particular embodiment, said nucleotide sequence (i) comprises an ORF Ib nucleotide sequence of the CYSDV RNAl, such as the nucleotide sequence comprised between nucleotides 6,116 and 6,827 of the nucleotide sequence of the CYSDV RNAl ( SEQ ID NO: 2).
  • the inverted repetition [sequence (ii)] present in the construction of the invention refers to a nucleotide sequence comprising all or part of said nucleotide sequence (i), in the sense or antisense direction with respect to said sequence (i ), so that it can form a dsRNA when the repetition is transcribed.
  • the length of the inverted repetition may vary within a wide range, typically between 25 and 4,000 nt.
  • said nucleotide sequence (ii) comprises the inverted repetition of the nucleotide sequence comprised between nucleotides 6,116 and 6,827 of the nucleotide sequence of the CYSDV RNAl.
  • the construction of the invention may optionally contain a spacer sequence (iii) between said sequences (i) and (ii).
  • the length of said spacer sequence (iii) may vary within a wide range, typically between 10 and 500 nt.
  • said spacer sequence (iii) comprises the nucleotide sequence comprised between nucleotides 6,828 and 6,974 of the nucleotide sequence of the CYSDV RNAl (SEQ. ID. No.: 3).
  • the first nucleotide sequence of the construct of the invention comprises a functional promoter in plants.
  • Said functional promoter in plants can be a constitutive, inducible or tissue specific promoter.
  • any functional promoter in plants can be used in the preparation of the construction of the invention, for example, the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus (CaMV), the promoter of the nopalin synthetase gene (pNOS), the promoter of the polyubiquitinal (publ) gene, the Agrobacterium rhizogenes rolC promoter (phloem specific), or the Phaseolus vulgaris pl2 promoter (epidermis specific).
  • said plant functional promoter is the CaMV 35S promoter.
  • the construction of the invention may also contain a functional transcription terminator in plants.
  • any functional transcription terminator in plants can be used in the preparation of the construction of the invention, for example, the CaMV poly (A) terminator, the NOS gene poly (A) terminator, etc.
  • said functional transcription terminator in plants is the CaMV poly (A) terminator.
  • the construction of the invention comprises a functional plant promoter capable of regulating transcription in plants of a second nucleotide sequence, and a functional transcription terminator in plants, said second nucleotide sequence comprising:
  • the construction of the invention may optionally contain a third nucleotide sequence that allows a plant transformed with said construction to be selected, said third nucleotide sequence being operatively linked to a functional plant promoter that regulates the expression of said third nucleotide sequence and a terminator of functional transcription in plants.
  • any nucleotide sequence that allows selecting a plant transformed with the construction of the invention can be used, for example, the neomycin phosphotransferase II (nptll) gene, capable of conferring resistance to kanamycin, the hygromycin phosphotransferase gene (hpt), capable of conferring hygromycin resistance, the phosphinothricin acetyl transferase (Barr / PAT) gene, capable of conferring resistance to bialaphs, or the csrl-i gene, capable of conferring sulfonyl urea resistance.
  • nptll neomycin phosphotransferase II
  • hpt hygromycin phosphotransferase gene
  • Barr / PAT phosphinothricin acetyl transferase
  • csrl-i gene capable of conferring sulfonyl urea resistance.
  • said third nucleotide sequence comprises the nptll gene capable of conferring kanamycin resistance in a plant transformed with a construction of the invention containing said sequence.
  • any functional transcription promoter and terminator in plants can be used.
  • said plant functional promoter that regulates the expression of said third nucleotide sequence is the pNOS promoter and said plant functional transcription terminator is the poly (A) terminator of the NOS gene.
  • the genetic construction provided by this invention used for plant transformation, includes a module designed to generate resistance to CYSDV and enable the selection of transforming plants.
  • This module is inserted between the right (RB) and left (LB) edges of the Ti plasmid (tumor-inducing) of Agrobacterium, and all included in a selectable binary vector (SVS297-NOS) capable of replicating in Escherichia coli and Agrobacterium.
  • the organization of the resistance / selection module is outlined in Figure 6.
  • This module contains, from RB to LB, the following elements: i) the CaMV 35S promoter, to confer strong and constitutive expression to the viral transgene;
  • the viral transgene formed by the nucleotide sequence identified as SEQ. LD. N °: 2 and its inverted repetition, there being a spacer sequence between the two sequences consisting of the nucleotide sequence identified as SEQ. ID.
  • the sequences used for the construction of the viral transgene derive from the sequence corresponding to the ORF Ib of the CYSDV RNAl, which is the ORF containing the RdRp motifs (Koonin and Dolja, 1993; Figure 2);
  • the viral transgene is designed so that after transcription in the cell nucleus, "fork” type dsRNA (Waterhouse et al., 1998) is generated with a paired region of 711 nt and a "loop" (unpaired) region of 147 nt ;
  • the CaMV poly (A) terminator iii) the CaMV poly (A) terminator; iv) the promoter of the nopalin synthetase (NOS) gene, to confer strong and constitutive expression selection transgene;
  • NOS nopalin synthetase
  • Example 2 describes the preparation of the construction of the invention described previously, used for the transformation of melon and cucumber plants, using E. coli as a host of plasmid vectors.
  • the invention may be inserted into an appropriate vector. Therefore, in another aspect, the invention relates to a vector comprising a construction of the invention.
  • the choice of the vector will depend on the host cell into which it will be subsequently introduced.
  • said vector may be a plasmid which, when introduced into a host cell, is integrated into the genome of said cell and replicated together with the chromosome (or chromosomes) in which (or in which) It has integrated either a viral vector.
  • said vector may be an expression vector provided with a series of elements that allow transcription of a particular nucleic acid in the host cell.
  • Said expression vector may be an RNA or DNA vector.
  • the construction of the invention as well as the vectors provided by it can be used to transform plants.
  • plant includes whole plants; vegetative organs and structures (for example, leaves, stems and tubers); estate; flowers and floral organs and structures (for example, bracts, sepals, petals, carpels, anthers, ovules, etc.), seeds (including embryos, endosperm and seed coat) and fruits; plant tissue (e.g. vascular tissue, etc.) and plant cells, as well as the progeny of a plant.
  • vegetative organs and structures for example, leaves, stems and tubers
  • estate flowers and floral organs and structures (for example, bracts, sepals, petals, carpels, anthers, ovules, etc.), seeds (including embryos, endosperm and seed coat) and fruits
  • plant tissue e.g. vascular tissue, etc.
  • plant cells as well as the progeny of a plant.
  • the kind of plants that can be used for the implementation of the method provided by this invention includes any plant susceptible to being infected by CYSDV, such as
  • the invention relates to a plant cell transformed with a construct of the invention or with a vector provided by this invention.
  • Host cells that can be transformed with the construct or vector provided by this invention are preferably plant cells.
  • the transformation of plant cells can be carried out by conventional methods.
  • said construction or vector can be introduced directly into the genomic DNA of the plant cell by employing techniques such as electroporation and microinjection of plant cell protoplasts, or expression vectors provided by this invention can be introduced directly into plant tissue through the use of ballistic methods, for example, by particle bombardment.
  • the invention relates to a plant transformed with a construction of the invention or with a vector provided by this invention.
  • the construction of the invention can be stably integrated into the genome of the plant cell, generating a transgenic cell that can regenerate a transgenic plant which can be used to generate hybrid plants by sexual crossing with other transgenic or non-transgenic plants.
  • the invention relates to a transgenic plant cell comprising, integrated in its genome, a construction of the invention.
  • a transgenic plant comprising at least one of said transgenic cells provided by this invention constitutes a further aspect of this invention.
  • the invention relates to a plant that is a clone or a descendant of a transformed or transgenic plant provided by this invention.
  • the invention in another aspect, relates to a hybrid plant with improved resistance to CYSDV infection, prepared by crossing a transgenic plant or a transformed plant provided by this invention, or a clone or descendant of said plants, with a second plant susceptible to CYSDV infection.
  • the invention relates to a propagule of a transgenic plant or of a transformed plant provided by this invention, or of a clone or descendant of said plants.
  • said propagule comprises a seed.
  • the invention relates to a seed of a plant comprising (i) a nucleotide sequence corresponding to a fragment of the CYSDV RNAl, and (ii) an inverted repetition of all or part of said nucleotide sequence ( i), that is, the second nucleotide sequence defined in the construction of the invention.
  • the invention relates to the use of said construction of the invention in the production of plants, for example, transgenic plants, with improved resistance against CYSDV. Therefore, in another aspect, the invention relates to a method for generating resistance against CYSDV in plants susceptible to infection by said virus comprising transforming a plant cell of a plant susceptible to infection by CYSDV with a construction of the invention and regenerate the plant from said transformed plant cell.
  • the construction of the invention can be used in processes to improve plants susceptible to being infected by CYSDV, such as cucurbits, some of which, or their fruits, are consumed by humans or by animals. These plants with improved resistance against CYSDV constitute an important improvement of the traditional plants since they allow to increase the yield of the crops, thus reducing the economic losses caused by CYSDV.
  • a construct of the invention was used to transform an unarmed strain of Agrobacterium. The integrity of the sequences introduced in Agrobacterium was checked by polymerase chain reaction assay (PCR). A strain of Agrobacterium carrying the entire genetic construct was used to transform melon and cucumber plants using standard procedures.
  • T0 generation Those plants that were positive by this test (T0 generation) were selected to carry out preliminary susceptibility tests to viral infection in T0 and to obtain seeds of a next generation (TI). Preliminary susceptibility tests on T0 were used to select IT lines that were also tested for susceptibility to CYSDV infection. CYSDV susceptibility tests were performed as described in Example 3.
  • EXAMPLE 1 Sequencing of CYSDV RNAl
  • purified dsRNA was used from cucumber plants infected with the virus. The preparation of dsRNA was done as described in Valverde et al. (1990) including the modifications described by Célix et al. (nineteen ninety six). From this dsRNA a cDNA library was generated using random oligonucleotides, obtaining around 500 recombinant clones. A proportion of these clones was sequenced at their ends using the universal and reverse MI 3 oligonucleotides, capable of initiating the sequencing reaction in regions of the vector used in the cloning that are flanking the inserts.
  • sequences thus obtained were compared with the sequence corresponding to the LIYV RNAl (Klaasen et al., 1995).
  • Four of the sequenced clones showed sequence homology with genomic regions of the LIYV RNAl (indicated with a shaded horizontal segment in Figure 2).
  • the sequences of these clones were used to generate another set of cDNA clones that covered the full length of the CYSDV RNAl using two strategies: one to generate cDNA clones at the 5 'and 3' ends of the RNAl, and another to generate clones internal
  • RNA1 In order to generate cDNA clones at the 5 'and 3' ends of the RNA1, the procedure was as follows. First, a poly (A) tail was added to the free 3'-OH ends of the dsRNAs. Thus, at 1 ⁇ l of dsRNA at an approximate concentration of 10 ng / ⁇ l, 1 ⁇ l of 0.1 M methyl mercury hydroxide (SIGMA Chemical Co., St Louis, MO, USA) was added and incubated at room temperature for 10 minutes After that time 1 ⁇ l of 1.4 M ⁇ -mercaptoethanol was added, mixed and incubated on ice for 10 minutes.
  • SIGMA Chemical Co. St Louis, MO, USA
  • cDNA synthesis was carried out using an oligo (dT) that started in the poly (A) tail added.
  • oligo (dT) that started in the poly (A) tail added.
  • 5 ⁇ l of 5-fold reverse transcriptase concentrate buffer Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany
  • 2 ⁇ l of 5 mM dNTPs 50 U of RNase inhibitor (Amersham Pharmacia Biotech)
  • 1 ⁇ l were added DTT 100 mM
  • 1 ⁇ l reverse transcriptase (Expand RT, Boehringer)
  • 2 ⁇ l of oligo (dT) at a concentration of 100 ng / ⁇ l. This mixture was incubated for 1 h and 30 minutes at 37 ° C.
  • the cDNAs thus generated were amplified by PCR using specific oligonucleotides designed from previously obtained sequences (shaded horizontal segments in Figure 2) and oligo (dT).
  • the oligonucleotide used to amplify the 3 'end was named U28-475 and the oligonucleotide used to amplify the 5' end was named U31-617 (Table 1).
  • PCR amplification resulted in single and approximately 1.8 kbp and 0.9 kbp DNA fragments for the 3 'and 5' ends, respectively.
  • oligonucleotides were designed from the sequences initially obtained (indicated with a shaded horizontal segment in Figure 2) that were used in reactions of RT-PCR using dsRNA as template. These specific oligonucleotides were MA147, U148-32 and L28-821, complementary to the alleged viral sequence, and MA146, 511 and U148-1274, identical to the alleged viral sequence (Table 1). In the RT-PCR experiment the following oligonucleotide combinations were used: MA147 and MA146, U148-32 and 511 and L28-821 and U148-1274.
  • the synthesis of the first cDNA chain was performed using 10 ⁇ l of dsRNA from infected plants at a concentration of 10 ng / ⁇ l for each of the three combinations of oligonucleotides used. To this RNA was added 1 ⁇ l of 0.1 M methyl mercury hydroxide and kept at room temperature 10 minutes.
  • the following reagents were then added: 1 ⁇ l of 1.4 M ⁇ -mercaptoethanol, 5 ⁇ l of the 5-fold concentrated reverse transcriptase buffer (Boehringer Manheinn, Manheinn, Germany), 1 ⁇ l of a mixture of 10 mM dNTPs, 50 U of RNase inhibitor (Amersham Pharmacia Biotech, UK), 1 ⁇ l of 100 mM DTT, 1 ⁇ l of reverse transcriptase (Expand RT, Boehringer), 2 ⁇ l of complementary oligonucleotides (at a concentration of 100 ng / ⁇ l), all in a final volume of 25 ⁇ l. This mixture was kept at 37 ° C for 1 h and 20 minutes.
  • the second chain of the cDNA was synthesized.
  • 5 ⁇ l of Taq polymerase buffer concentrated 10 times Bioline, London, UK
  • 2 ⁇ l of 25 mM Cl 2 Mg 2 ⁇ l of 25 mM Cl 2 Mg
  • 1 ⁇ l of 10 mM dNTPs 0.5 ⁇ l of identical oligonucleotides were added to the viral sequence (at a concentration of 100 ng / ⁇ l) and 1 ⁇ l of Taq polymerase (BioTaq; Bioline, London, UK), all in a final volume of 50 ⁇ l.
  • This mixture was subjected to the following PCR cycles: one cycle of denaturation at 94 ° C for 4 minutes, thirty cycles of denaturation at 94 ° C for 30 s followed by hybridization of the oligonucleotides at 45 ° C for 30 s followed by polymerization of the cDNA at 72 ° C for 3 minutes, and a final polymerization cycle at 72 ° C for 7 minutes.
  • the result of the PCR was checked by electrophoresis of an aliquot in an agarose gel stained with ethidium bromide.
  • This fragment was ligated to the pRdRp vector, which had previously been linearized with Smal. Ligation was used to transform E.coli and colonies that had incorporated the EcoRI-blunt fragment in opposite orientation to that of the insert corresponding to the pre-existing CYSDV sequence in pRdRp were selected. This is how the construction called pLRRdRp originated ( Figure 7). From this construct, the EcoRI fragment that was inserted into the EcoRI site of plasmid pExSem-2 was cleaved.
  • Plasmid pExSem-2 is a derivative of pUC18 (Sambrook et al., 1989) containing the CaMV 35S promoter and terminator (P35S and T35S, respectively); in pExSem-2, P35S and T35S are flanked by HindIII restriction targets and among them there are three other targets, EcoRI, Ncol and Ndel. This last step resulted in the pExIRRdRp construction ( Figure 7).
  • the HindlIIds pExIRRdRp fragment was cleaved, purified from agarose gel and ligated to the psvs297-NOS vector that had previously been linearized with HindIII. Bacteria transformed with this ligation and carrying the appropriate insert were selected, giving rise to psvsExIR construction ( Figure 7), which is what has been used to transform plants.
  • EXAMPLE 3 Analysis of the susceptibility of plants to viral infection
  • the procedure followed to analyze the susceptibility of plants to CYSDV infection has included the steps of i) inoculation under controlled conditions of the virus in the plants to be tested and in the corresponding controls and ii) monitoring the development of the disease and the progress of the virus in the inoculated plants.
  • the methods of maintenance and inoculation of plants with CYSDV are described in López-Sesé and Gómez-Guillamón (2000).
  • the presence or absence of CYSDV in plant material was determined by virus detection using molecular hybridization techniques in imprints on nylon membranes of tissue sections (tissue-print; see for an example Narváez et al., 2000). In addition, on certain occasions it was necessary to estimate the amount of virus and not just its presence or absence.
  • RNA from plant samples (0.2 g) was extracted following the method described by Célix et al. (nineteen ninety six). Then, on the one hand, an aliquot of these extracts was electrophoresed in agarose gels in order to estimate the amount of total RNA present with respect to patterns of known amounts and, on the other hand, aliquots of these extracts were inserted into membranes of nylon that underwent a standard process of detection of viral RNA by molecular hybridization against a probe designed to specifically detect viral RNA.
  • the probe used in molecular hybridizations was cRNA and obtained by in vitro transcription using plasmid pLM12.2 as a template ( Figure 2). It is noteworthy that this plasmid contains a different viral sequence from the one used to create the transgene and, therefore, the probe derived from this plasmid only detects virus RNA and not viral type RNA generated from the transgene.
  • Plasmid pLM12.2 was linearized using the restriction enzyme Sphl.
  • Martelli GP Agranovsky AA, Bar-Joseph M, Boscia D, Candresse T, Coutts RHA, Dolja VV, Duffus JE, Falk BW, Gonsalves D, Jelkmann W, Karasev AV, Minafra A., Murant A, Namba S, Niblett CL , Vetten HJ, Yoshikawa N (2000) Family Closteroviridae. h Taxonomy virus. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Virases.
  • Valverde RA Nameth ST, Jordán RL (1990) Analysis of double-stranded RNA for plant viras diagnosis. Plant Dis 74, 255-258.
  • Wisler GC Duf ⁇ us JE, Liu H-Y, Li RH (1998) Ecology and epidemiology of whitefly-transmitted Closteroviruses. Plant Dis 82: 270-280.

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Abstract

Se describe una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNA1 del Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). Dicha construcción puede utilizarse para generar resistencia frente a CYSDV en plantas susceptibles a la infección por dicho virus.

Description

MÉTODO PARA GENERAR RESISTENCIA FRENTE AL VIRUS DEL AMARILLEO Y ENANISMO DE LAS CUCURBITÁCEAS (CYSDV) EN PLANTAS, CONSTRUCCIONES GENÉTICAS USADAS Y PLANTAS RESISTENTES A CYSDV OBTENIDAS MEDIANTE DICHO MÉTODO
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un método para generar resistencia frente al
Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV. La invención también se refiere a las construcciones genéticas derivadas del genoma del virus usadas en dicho método y a las plantas obtenidas mediante dicho método.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades de los amarilleos de las cucurbitáceas causadas por closterovirus transmitidos por mosca blanca tienen una gran importancia económica en diversas áreas del mundo. En las epidemias inicialmente descritas se observó que el agente inductor de estas enfermedades era el Virus del pseudo-amarilleo de la remolacha (Beet pseudo-yellows virus; BPYV), un closterovirus transmitido en la naturaleza por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Duffus, 1965; Coffin y Couts, 1995). Sin embargo, en las epidemias que están ocurriendo más recientemente se está observando que los amarilleos están inducidos por el Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (Cucurbit yellow stunting disorder virus; CYSDV), un closterovirus que se transmite en la naturaleza por la mosca blanca Bemisia tabaci (Célix y col., 1996). De hecho, se ha propuesto que CYSDV haya reemplazado a BPYV como consecuencia del desplazamiento de T. vaporariorum por B. tabaci que parece haber tenido lugar en, al menos, algunas áreas geográficas (Wisler y col., 1998; Berdiales y col., 1999). En la actualidad, CYSDV ha sido detectado y causa problemas graves en cultivos de cucurbitáceas de los Emiratos Árabes, España, Portugal, Marruecos, Líbano y Norte América (Célix y col., 1996; Wisler y col., 1998; Abou- Jawdah y col., 2000; Desbiez y col, 2000; Kao y col, 2000; Louro y col., 2000). En España, los síntomas de amarilleos causados por CYSDV se observan con frecuencia en el 100% de las plantas de los invernaderos afectados, resultando en pérdidas económicas muy graves debido a las importantes reducciones ocasionadas en los rendimientos de las cosechas.
CYSDV es un miembro del género Crinivirus (Familia Closteroviridae; Martelli y col., 2000) que, como otros miembros de este género, invade el tejido floemático de las plantas infectadas y parece permanecer restringido a éste. Su gama de huéspedes está limitada a especies de la familia de las cucurbitáceas (Célix y col., 1996). Sus partículas tienen forma de varilla flexuosa y una longitud de 750 a 800 nm (Liu y col., 2000). El genoma de CYSDV es de RNA monocatenario de sentido mensajero y bipartito, esto es, está formado por dos moléculas de RNA que se han denominado RNAl y RNA2 (Célix y col., 1996), y por el momento ha sido sólo parcialmente secuenciado. Las secuencias de nucleótidos de genes de CYSDV publicadas hasta ahora corresponden al RNA2 del genoma viral (Célix y col, 1996; Livieratos y col., 1999; Livieratos y Coutts, 2002). La diversidad genética de aislados de CYSDV provenientes de diversas áreas del mundo ha sido analizada para dos regiones genómicas del RNA2, el gen homólogo de la proteína 70 de respuesta a choque térmico (heat shock 70 homologue protein; HSP70h) y el gen de la proteína de la cápsida del virus (capsid protein; CP). Los resultados de estos análisis sugieren que la diversidad de CYSDV es inusualmente baja entre las especies de la familia Closteroviridae, aunque aun así es posible diferenciar dos grupos genéticos, las llamadas subpoblaciones oriental y occidental (Rubio y col., 1999; Rubio y col, 2001).
Teniendo en cuenta la importancia económica de la enfermedad causada por CYSDV, es imprescindible el diseño de estrategias eficientes para el control de la enfermedad inducida por este virus. El control de CYSDV se basa actualmente en el control de su vector B. tabaci y en el uso de estrategias sanitarias preventivas, aunque estos métodos están teniendo unos resultados muy limitados. Indudablemente, la mejor opción para el control de CYSDV sería el uso de cultivares portadores de resistencia genética al virus. Sin embargo, por el momento sólo se ha descrito una posible fuente de resistencia natural a CYSDV (López-Sesé y Gómez-Guillamón, 2000) y ésta es en melón. Sería muy deseable contar con otras fuentes de resistencia, y no sólo en melón, sino también en otras cucurbitáceas de importancia económica y que estén afectadas por CYSDV. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un método para generar resistencia genética frente a CYSDV en plantas susceptibles a este virus.
Dada la existencia de un número muy limitado de posibles donadores de resistencia natural a CYSDV (López-Sesé y Gómez-Guillamón, 2000) es conveniente plantear la generación de resistencia al virus mediante la transformación de plantas con genes foráneos (transgenes) capaces de conferir este carácter. Existen numerosos ejemplos de resistencias a virus conseguidas mediante la introducción de transgenes en el genoma de especies de plantas previamente susceptibles (revisado en Wilson, 1993; Beachy, 1997). Los diversos métodos utilizados para obtener resistencias en plantas a través de la introducción de transgenes están basados en el uso de genes originales de plantas (ej. Whitham y col., 1996), en el uso de genes o secuencias derivados del patógeno viral (resistencia "derivada del patógeno" [Wilson, 1993]) o en el uso de genes de otros orígenes (ej. Dickman y col., 2001). Algunos ejemplos de secuencias o genes de virus de RNA que han sido utilizados con éxito para generar resistencia derivada del patógeno en plantas (revisado en Beachy, 1997) incluyen: 1) genes de proteínas de cápsidas, 2) genes de polimerasas de RNA dependientes de RNA, 3) genes de proteínas del movimiento y 4) genes de nucleoproteínas de tospovirus. En un número elevado de estos casos se ha observado que el fenotipo de resistencia al virus está asociado con el silenciamiento génico post-transcripcional (PTGS) del transgén (Beachy, 1997) de tal manera que el PTGS parece tener como diana no sólo al transgén sino también a los genes homólogos de un posible virus invasor (English y col., 1996; Marathe y col., 2000). Por otra parte, se ha demostrado recientemente que la transformación de plantas con construcciones genéticas portadoras de secuencias de nucleótidos con una repetición invertida capaces de dar lugar a RNAs bicatenarios (dsRNAs) está asociada con el PTGS de genes con secuencias homologas a esos dsRNAs (Waterhouse y col., 1998). Los genes silenciados mediante la transformación de plantas con repeticiones invertidas pueden ser del genoma de un posible virus invasor y, por tanto, el fenotipo esperable con respecto a la infección viral en las plantas transgénicas es de resistencia al virus (Waterhouse y col., 1998). COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
El objetivo de la presente invención consiste en proporcionar un método para generar resistencia genética frente a CYSDV en plantas previamente susceptibles al virus mediante la transformación de las plantas con transgenes portadores de una secuencia con una repetición invertida derivada del genoma viral.
En un aspecto, la invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos: (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNAl de CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende dicha construcción de ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transformada con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, dicha construcción de ácido nucleico. Las plantas transgénicas que comprenden, al menos, una de dichas células transgénicas también constituyen un aspecto de la presente invención. En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transformada con dicha construcción de ácido nucleico o con dicho vector.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que es un clon o un descendiente de dicha planta transgénica o transformada.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta híbrida con resistencia mejorada frente a CYSDV, preparada por cruce de dicha planta transgénica, o transformada, o de un clon o descendiente de las mismas, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un propágulo, tal como una semilla, de cualquiera de dichas plantas transgénicas, transformadas o híbridas. En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta que comprende dicha segunda secuencia de nucleótidos que comprende (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNAl de CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para generar resistencia frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV, que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con dicha construcción de ácido nucleico y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de dicha construcción de ácido nucleico en la producción de una planta transgénica con resistencia mejorada a la infección por CYSDV.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra la secuencia completa del RNAl de CYSDV. La secuencia de nucleótidos aparece numerada. Bajo la secuencia de nucleótidos aparece su traducción probable a aminoácidos. El marco de lectura que probablemente se traduce aparece indicado a la izquierda de cada línea de la secuencia de aminoácidos.
La Figura 2 es un diagrama que representa la posible organización génica del RNAl de CYSDV. Los rectángulos abiertos representan ORFs. En el ORF la, el área señalada por un rombo negro tiene homología de secuencia con dominios metil- transferasa (Rozanov y col., 1992) y el área señalada por una estrella negra con dominios helicasa (Gorbalenya y Koonin, 1993). En el ORF Ib, el área señalada por un cuadrado negro tiene homología de secuencia con dominios polimerasa de RNA (Koonin y Dolja, 1993). Los segmentos negros horizontales corresponden a los clones de cDNA utilizados en la secuenciación completa del RNAl. Los segmentos sombreados horizontales representan clones de cDNA inicialmente obtenidos y utilizados para diseñar oligonucleótidos para preparar los clones antes mencionados. Las flechas indican los oligonucleótidos utilizados en la síntesis de la primera cadena de cDNAs y/o en su amplificación por PCR.
La Figura 3 muestra el alineamiento de las secuencias de nucleótidos de CYSDV y de LIYV correspondientes a las regiones 5'-UTR (A) y 3'-UTR (B) de sus RNAs 1. Sobre fondo negro aparecen los nucleótidos idénticos entre ambas secuencias. La Figura 4 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de CYSDV y de L1YV correspondientes a los dominios metiltransferasa (A; Rozanov y col., 1992), helicasa (B; Gorbalenya y Koonin, 1993) y RNA polimerasa (C; Koonin y Dolja, 1993) posiblemente codificados por sus RNAs 1. Sobre fondo negro aparecen los aminoácidos idénticos entre ambas secuencias. Sobre fondo gris, los aminoácidos similares.
La Figura 5 muestra el alineamiento de secuencias de CYSDV y de BYV en la región del RNAl en la que un cambio (+1) de la fase de lectura puede dar lugar a la expresión de la proteína Ib. La Figura 6 muestra la organización del módulo de resistencia y selección que porta la construcción genética introducida en las plantas transgénicas. El esquema corresponde a la región comprendida entre los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) del plásmido Ti de Agrobacterium. Aparecen indicados desde RB a LB: el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el transgén viral formado por la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 a 6.827 de la secuencia del RNAl de CYSDV (numeración como en la Figura 1) y una repetición invertida de dicha secuencia (nts complementarios a 6.827 a 6.116 del RNAl de CYSDV; numeración como Fig. 1), el terminador poly(A) de CaMV, el promotor del gen nopalin-sintetasa (NOS), el gen de la neomicin-fosfotransferasa II y el terminador poly(A) del genNOS.
La Figura 7 es un esquema representativo del proceso seguido y de las construcciones intermedias usadas para la preparación de la construcción genética utilizada en esta invención para transformar plantas. En esta figura (A) es: Clonación en pGEM-T Easy del fragmento de 862pb amplificado por PCR con los oligonucleótidos MA160-MA161. (B) es: Clonación en pGEM-T Easy del fragmento de 712pb amplificado por PCR con los oligonucleótidos MA160-MA174. (C) es: Digestión con Smaϊ. (D): Digestión con EcoRl y purificación del fragmento de 730pb, seguido de tratamiento con Klenow. (E): Ligación. (F): Digestión con EcoBI y purificación del fragmento de 1.6Kb, seguido de clonación en el sito EcoRΪ de pExSem-2. (G): Digestión con HindlH y purificación del fragmento de 2.1 Kb seguido de clonación en el sitio Hindm de svs297. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
1) Secuencia de nucleótidos del RNAl de CYSDV
Como paso previo a la preparación de las construcciones genéticas proporcionadas por esta invención para transformar plantas con secuencias de genes virales, se procedió a secuenciar completamente el RNAl del genoma de CYSDV. La secuencia de nucleótidos del RNAl de CYSDV se obtuvo tal como se describe en el Ejemplo 1. El RNAl de CYSDV tiene 9.123 nucleótidos (nt) (SEQ. LD. N°: 1) (Figura 1). Una búsqueda en las bases de datos (programa BLASTN; GCG Software Package, Madison, WI, USA) ha puesto de manifiesto que la máxima homología de secuencia la tiene con el Virus del amarilleo infeccioso de la lechuga (LIYV), que es el miembro tipo del género Crinivirus, Familia Closteroviridae (Martelli y col., 2000). Un análisis de la capacidad codificadora de este RNA (programa FRAMES; GCG Software Package, Madison, WI, USA) ha revelado que posiblemente contenga 5 marcos abiertos de lectura (ORFs) flanqueados por dos secuencias no codificantes (UTRs) (Figura 2). La UTR situada en el extremo 5' del RNAl consiste en 94 nt hasta el codón de iniciación del ORF la. La UTR situada en el extremo 3' del RNAl consiste en 221 nt desde el codón de terminación del ORF 4 hasta el último nt del RNAl . Ambas UTRs tienen una similitud significativa con las correspondientes regiones del RNAl de LLYV (Figura 3). El primer codón AUG de iniciación de traducción se encuentra en la posición 95 aguas abajo del extremo 5'. Los dos primeros ORFs están organizados de forma similar a como lo están en LIYV (Klaasen y col, 1995). El primer ORF (ORF la) comprende los nucleótidos 95 a 6.028 y se puede traducir en una proteína de 1.976 aminoácidos con un peso molecular calculado de 227 kDa. En esta proteína se pueden identificar dos motivos conservados en proteínas asociadas con la replicación de virus. Entre los aminoácidos 514 y 871 existe un motivo metiltransferasa (MET; Rozanov y col., 1992); además, esta secuencia tiene una similitud elevada con el dominio homólogo en LIYV (42,6% de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 357 residuos; Figura 4A). En la región carboxi-terminal (aminoácidos 1678 a 1941) existe un dominio helicasa (HEL; Gorbalenya y Kooning, 1993); el dominio homólogo en LIYV tiene una elevada similitud con esta región (42,02% de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 264 residuos; Figura 4B). La región de la proteína codificada por el ORF la que se encuentra entre los motivos MET y HEL no muestra similitud significativa con ninguna proteína cuya secuencia esté disponible en las bases de datos. El producto codificado por el ORF Ib contiene los motivos conservados típicos de RNA polimerasas dependientes de RNA (RdRp; Koonin y Dolja, 1993) y está estrechamente relacionado con la supuesta RdRp de LIYV (55,9% de aminoácidos idénticos en un alineamiento de 474 residuos; Figura 4C). El ORF Ib se encuentra en un marco de lectura distinto del ORF la, concretamente desplazado un nucleótido aguas abajo (+1). Se ha propuesto para el Virus del amarilleo de la remolacha (BYV), miembro tipo del género Closterovirus, que el producto homólogo al codificado por el ORF Ib de CYSDV se exprese vía cambio de fase (+1) del ribosoma durante la traducción (Agranovsky y col., 1994). La comparación directa de las secuencias de nucleótidos en la zona de solape de los ORFs la y Ib de BYV y CYSDV muestra una similitud significativa entre éstas (Figura 5) y permite predecir que el posible cambio de fase pueda ocurrir en el residuo U-6.026 de la secuencia del RNAl de CYSDV. Los ORFs 2 (nts 7.554-7.690), 3 (nts 7.704-8.342) y 4 (nts 8.389-9002) tienen capacidad para codificar proteínas de 48, 212 y 192 aminoácidos, respectivamente, con pesos moleculares calculados de 5, 25 y 22 kDa, respectivamente. Las proteínas potencialmente codificadas por los ORFs 2, 3 y 4 no muestran similitud significativa con ninguna proteína cuya secuencia esté disponible en las bases de datos, ni tampoco se ha encontrado ningún motivo conservado en sus correspondientes secuencias.
2) Construcción genética utilizada para la transformación de plantas En un aspecto, la invención proporciona una construcción de ácido nucleico, en adelante construcción de la invención, que comprende: una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
(i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNAl del CYSDV, y
(ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i). En principio, dicha secuencia de nucleótidos (i) puede contener cualquier secuencia de nucleótidos del RNAl del CYSDV. Asimismo, la longitud de dicha secuencia (i) puede variar dentro de un amplio intervalo, típicamente entre 25 y 4.000 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende una secuencia de nucleótidos ORF Ib del RNAl del CYSDV, tal como la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 y 6.827 de la secuencia de nucleótidos del RNAl de CYSDV (SEQ. ID. N°: 2).
La repetición invertida [secuencia (ii)] presente en la construcción de la invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que comprende la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i), en dirección sentido o antisentido con respecto a dicha secuencia (i), de manera que pueda formar un dsRNA cuando la repetición se transcribe. La longitud de la repetición invertida puede variar dentro de un amplio intervalo, típicamente entre 25 y 4.000 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia de nucleótidos (ii) comprende la repetición invertida de la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.116 y 6.827 de la secuencia de nucleótidos del RNAl de CYSDV.
La construcción de la invención puede contener, opcionalmente, una secuencia espaciadora (iii) entre dichas secuencias (i) y (ii). La longitud de dicha secuencia espaciadora (iii) puede variar dentro de un amplio intervalo, típicamente entre 10 y 500 nt. No obstante, en una realización particular, dicha secuencia espaciadora (iii) comprende la secuencia de nucleótidos comprendida entre los nucleótidos 6.828 y 6.974 de la secuencia de nucleótidos del RNAl de CYSDV (SEQ. ID. N°: 3).
La primera secuencia de nucleótidos de la construcción de la invención comprende un promotor funcional en plantas. Dicho promotor funcional en plantas puede ser un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido. En principio, cualquier promotor funcional en plantas puede ser utilizado en la preparación de la construcción de la invención, por ejemplo, el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor del gen nopalin sintetasa (pNOS), el promotor del gen polyubiquitinal (publ), el promotor de Agrobacterium rhizogenes rolC (específico de floema), o el promotor de Phaseolus vulgaris pl2 (específico de epidermis). En una realización particular, dicho promotor funcional en plantas es el promotor 35S del CaMV. La construcción de la invención puede contener, además, un terminador de la transcripción funcional en plantas. En general, cualquier terminador de la transcripción funcional en plantas puede ser utilizado en la preparación de la construcción de la invención, por ejemplo, el terminador poli(A) de CaMV, el terminador poli(A) del gen NOS, etc. En una realización particular, dicho terminador de la trancripción funcional en plantas es el terminador poli(A) de CaMV.
En una realización particular, la construcción de la invención comprende un promotor funcional en plantas capaz de regular la transcripción en plantas de una segunda secuencia de nucleótidos, y un terminador de la transcripción funcional en plantas, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
(i) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. LD.
N°: 2;
(ii) la repetición invertida de dicha SEQ. ID. N°: 2; y
(iii) entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii), la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N°:
3.
La construcción de la invención puede contener, opcionalmente, una tercera secuencia de nucleótidos que permite seleccionar una planta transformada con dicha construcción, estando dicha tercera secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos y a un terminador de la transcripción funcional en plantas. Prácticamente cualquier secuencia de nucleótidos que permita seleccionar una planta transformada con la construcción de la invención puede ser utilizada, por ejemplo, el gen de la neomicin- fosfotransferasa II (nptll), capaz de conferir resistencia a kanamicina, el gen de la higromicin-fosfotransferasa (hpt), capaz de conferir resistencia a higromicina, el gen de la fosfinotricin acetil transferasa (Barr/PAT), capaz de conferir resistencia a bialafos, o el gen csrl-i, capaz de conferir resistencia a sulfonil-urea. En una realización particular, dicha tercera secuencia de nucleótidos comprende el gen nptll capaz de conferir resistencia a kanamicina en una planta transformada con una construcción de la invención que contiene dicha secuencia. Asimismo, en principio, puede utilizarse cualquier promotor y terminador de la transcripción funcionales en plantas. No obstante, en una realización particular, dicho promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos es el promotor pNOS y dicho terminador de la transcripción funcional en plantas es el terminador poli(A) del gen NOS.
En una realización concreta de esta invención, la construcción genética proporcionda por esta invención, usada para la transformación de plantas, incluye un módulo diseñado para generar resistencia a CYSDV y posibilitar la selección de plantas transformantes. Este módulo está inserto entre los bordes derecho (RB) e izquierdo (LB) del plásmido Ti (tumor-inducing) de Agrobacterium, y todo ello incluido en un vector binario seleccionable (SVS297-NOS) capaz de replicarse en Escherichia coli y Agrobacterium. La organización del módulo de resistencia/selección se esquematiza en la Figura 6. Este módulo contiene, desde el RB al LB, los siguientes elementos: i) el promotor 35S del CaMV, para conferir al transgén viral expresión fuerte y constitutiva;
ii) el transgén viral, formado por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. LD. N°: 2 y su repetición invertida, existiendo entre ambas secuencias una secuencia espaciadora constituida por la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N°: 3; las secuencias utilizadas para la construcción del transgén viral derivan de la secuencia correspondiente al ORF Ib del RNAl de CYSDV, que es el ORF que contiene los motivos RdRp (Koonin y Dolja, 1993; Figura 2); el transgén viral está diseñado para que tras su transcripción en el núcleo celular se genere dsRNA de tipo "horquilla" (Waterhouse y col., 1998) con una región apareada de 711 nt y una región "bucle" (no apareada) de 147 nt;
iii) el terminador poli(A) de CaMV; iv) el promotor del gen nopalin-sintetasa (NOS), para conferir al transgén de selección expresión fuerte y constitutiva;
v) el gen de la neomicin-fosfotransferasa II, para conferir resistencia a kanamicina a las plantas transformadas; y
vi) el terminador poli(A) del gen NOS.
La construcción de la invención puede obtenerse mediante el empleo de técnicas convencionales conocidas por los técnicos en la materia. En el Ejemplo 2 se describe la preparación de la construcción de la invención descrita previamente, utilizada para la transformación de plantas de melón y pepino, utilizando E. coli como huésped de los vectores plasmídicos.
La construcción de la invención puede estar insertada en un vector apropiado. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un vector que comprende una construcción de la invención. La elección del vector dependerá de la célula hospedadora en la que se va a introducir posteriormente. A modo de ejemplo, dicho vector puede ser un plásmido que, cuando se introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de dicha célula y se replica junto con el cromosoma (o cromosomas) en el que (o en los que) se ha integrado o bien un vector viral. Εn una realización particular, dicho vector puede ser un vector de expresión provisto de una serie de elementos que permiten la transcripción de un ácido nucleico determinado en la célula hospedadora. Dicho vector de expresión puede ser un vector RNA o DNA.
3 Transformación y caracterización de las plantas transformantes
La construcción de la invención así como los vectores proporcionados por la misma pueden ser utilizados para transformar plantas.
Tal como se utiliza en esta descripción, el término "planta" incluye plantas completas; órganos y estructuras vegetativas (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos); raíces; flores y órganos y estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, carpelos, anteras, óvulos, etc.), semillas (incluyendo embriones, endospermo y el recubrimiento de la semilla) y frutos; tejido vegetal (por ejemplo, tejido vascular, etc.) y células vegetales, así como a la progenie de una planta. La clase de plantas que puede ser utilizada para la puesta en práctica del método proporcionado por esta invención incluye a cualquier planta susceptible de ser infectada por el CYSDV, tal como una cucurbitácea, por ejemplo, melón, sandía, pepino, etc. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transformada con una construcción de la invención o con un vector proporcionado por esta invención. Las células hospedadoras que se pueden transformar con la construcción o el vector proporcionado por esta invención son, preferentemente, células vegetales. La transformación de las células vegetales puede realizarse por métodos convencionales. A modo ilustrativo, dicha construcción o vector puede ser introducido directamente en el DNA genómico de la célula vegetal mediante el empleo de técnicas tales como electroporación y microinyección de protoplastos de células vegetales, o bien vectores de expresión proporcionados por esta invención pueden ser introducidos directamente en el tejido vegetal mediante el empleo de métodos balísticos, por ejemplo, por bombardeo de partículas. Una revisión de técnicas relacionadas con la transferencia genética a plantas, incluyendo vectores, métodos de transferencia de DNA, etc., se recoge en, por ejemplo, el libro titulado "Ingeniería genética y transferencia génica", de Marta Izquierdo, Ed. Pirámide (1999), en particular, en el capítulo 9, titulado "Transferencia génica a plantas", páginas 283-316. Las células vegetales transformadas que derivan de cualquiera de las técnicas de transformación mencionadas previamente pueden ser cultivadas para regenerar la planta completa que poseerá el genotipo transformado y, por tanto, manifestará el fenotipo deseado, es decir, una resistencia mejorada frente a CYSDV. La regeneración de las plantas completas se realiza mediante el empleo de técnicas convencionales. A modo ilustrativo, las técnicas de regeneración dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido, dependiendo, en general, de un marcador (biocida y/o herbicida) introducido junto con la construcción de la invención. La regeneración de plantas a partir de protoplastos cultivados ha sido descrita, por ejemplo, por Evans y col., (1983), y Binding (1985). La regeneración de las plantas también puede obtenerse a partir de callos de plantas, explantes, órganos y partes de una planta [Klee y col, (1987)]. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una planta transformada con una construcción de la invención o con un vector proporcionado por esta invención. La construcción de la invención puede ser integrada de forma estable en el genoma de la célula vegetal, generándose una célula transgénica que puede regenerar una planta transgénica la cual puede ser utilizada para generar plantas híbridas mediante cruce sexual con otras plantas transgénicas o no transgénicas.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, una construcción de la invención. Una planta transgénica que comprende, al menos, una de dichas células transgénicas proporcionadas por esta invención constituye un aspecto adicional de esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta que es un clon o un descendiente de una planta transformada o transgénica proporcionada por esta invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una planta híbrida con resistencia mejorada a la infección por CYSDV, preparada por cruce de una planta transgénica o de una planta transformada proporcionada por esta invención, o de un clon o descendiente de dichas plantas, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un propágulo de una planta transgénica o de una planta transformada proporcionada por esta invención, o de un clon o descendiente de dichas plantas. En una realización particular, dicho propágulo comprende una semilla.
En otro aspecto, la invención se relaciona con una semilla de una planta que comprende (i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNAl del CYSDV, y (ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i), es decir, la segunda secuencia de nucleótidos definida en la construcción de la invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el empleo de dicha construcción de la invención en la producción de plantas, por ejemplo, plantas transgénicas, con resistencia mejorada frente a CYSDV. Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un método para generar resistencia frente a CYSDV en plantas susceptibles a la infección por dicho virus que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con una construcción de la invención y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada.
La construcción de la invención puede ser utilizada en procesos de mejora de plantas susceptibles de ser infectadas por CYSDV, tales como las cucurbitáceas, algunas de las cuales, o sus frutos, son consumidas por los seres humanos o por los animales. Estas plantas con resistencia mejorada frente a CYSDV constituyen una importante mejora de las plantas tradicionales puesto que permiten aumentar el rendimiento de las cosechas, reduciendo de ese modo las pérdidas económicas causadas por CYSDV. En una realización particular, una construcción de la invención se utilizó para transformar una cepa desarmada de Agrobacterium. La integridad de las secuencias introducidas en Agrobacterium se comprobó mediante ensayo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una cepa de Agrobacterium portadora de la construcción genética íntegra se utilizó para transformar plantas de melón y de pepino utilizando procedimientos habituales. A partir de esa transformación se obtuvo un número de plantas capaces de crecer en medio de selección y, por tanto, supuestamente transgénicas. La presencia del transgén en esas plantas se confirmó mediante PCR. Aquellas plantas que resultaron positivas mediante este ensayo (generación T0) se seleccionaron para llevar a cabo ensayos preliminares de susceptibilidad a la infección viral en T0 y para obtener semillas de una siguiente generación (TI). Los ensayos preliminares de susceptibilidad en T0 sirvieron para seleccionar líneas de TI que se ensayaron también para susceptibilidad a la infección por CYSDV. Los ensayos de susceptibilidad a CYSDV se realizaron tal como se describe en el Ejemplo 3.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma. Para la realización de la parte experimental se ha seguido, de forma general, a Sambrook y Russell (2001) en las técnicas de Biología Molecular y a Foster y Taylor (1998) en las técnicas de Virología.
EJEMPLO 1 Secuenciación del RNAl de CYSDV Para la secuenciación del RNAl de CYSDV se usó como molde dsRNA purificado a partir de plantas de pepino infectadas con el virus. La preparación de dsRNA se hizo como se describe en Valverde y col. (1990) incluyendo las modificaciones descritas por Célix y col. (1996). A partir de este dsRNA se generó una librería de cDNA utilizando oligonucleótidos al azar, obteniéndose en torno a 500 clones recombinantes. Una proporción de estos clones fue secuenciada en sus extremos utilizando los oligonucleótidos MI 3 universal y reverse, capaces de iniciar la reacción de secuenciación en regiones del vector utilizado en el clonaje que son flanqueantes a los insertos. Las secuencias así obtenidas se compararon con la secuencia correspondiente al RNAl de LIYV (Klaasen y col., 1995). Cuatro de los clones secuenciados mostraron homología de secuencia con regiones genómicas del RNAl de LIYV (señaladas con un segmento horizontal sombreado en la Figura 2). Las secuencias de estos clones se utilizaron para generar otro conjunto de clones de cDNA que cubrieran la longitud completa del RNAl de CYSDV usando dos estrategias: una para generar clones de cDNA a los extremos 5' y 3' del RNAl, y otra para generar clones internos.
Para generar clones de cDNA a los extremos 5' y 3' del RNAl se procedió como sigue. En primer lugar se añadió una cola de poli(A) a los extremos 3 '-OH libres de los dsRNAs. Así, a 9 μl de dsRNA a una concentración aproximada de 10 ng/μl se añadió 1 μl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M (SIGMA Chemical Co., St Louis, MO, USA) y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Al cabo de ese tiempo se añadió 1 μl de β-mercaptoetanol 1,4 M, se mezcló y se incubó en hielo durante 10 minutos. A esta mezcla se añadieron 4 μl de tampón concentrado 5 veces de la poli(A) polimerasa de levadura (USB Co., Cleveland, Ohio, USA), 1 μl de ATP 2 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech, UK), 1 μl de poli(A) polimerasa de levadura (USB) y 2 μl de agua. Esta mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos, se extrajo con fenol-cloroformo y se precipitó con etanol. El concentrado seco resultante de esta precipitación se disolvió en 11 μl de agua y se le añadió 1 μl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M, se incubó 10 minutos a temperatura ambiente y se le añadió 1 μl de β- mercaptoetanol 1,4 M. A continuación, se procedió a la síntesis de cDNA utilizando un oligo(dT) que iniciase en la cola de poli(A) añadida. Así, a los 13 μl anteriores se añadieron 5 μl de tampón 5 veces concentrado de la transcriptasa reversa (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania), 2 μl de dNTPs 5 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech), 1 μl de DTT 100 mM, 1 μl de transcriptasa reversa (Expand RT, Boehringer) y 2 μl de oligo(dT) a una concentración de 100 ng/μl. Esta mezcla se incubó durante 1 h y 30 minutos a 37°C. Al cabo de este tiempo se procedió a amplificar por PCR los cDNAs así generados mediante el uso de oligonucleótidos específicos diseñados a partir de las secuencias previamente obtenidas (segmentos horizontales sombreados en la Figura 2) y el oligo(dT). El oligonucleótido empleado para amplificar el extremo 3' se denominó U28-475 y el oligonucleótido empleado para amplificar el extremo 5' se denominó U31-617 (Tabla 1). La amplificación por PCR dio lugar a fragmentos de DNA únicos y de aproximadamente 1,8 kbp y 0,9 kbp para los extremos 3' y 5', respectivamente. Ambos fragmentos fueron ligados al plásmido pCR- BluntlI-TOPO (ínvitrogen Co., Carisbad, CA, USA) y clonados en E. coli. Por cada fragmento de cDNA se secuenciaron dos clones (clones pLM0,9-ll, pLM0,9-12, pLM2 y pLM44; Figura 2) y cada posición (nt) en esos clones ha sido leída al menos dos veces.
Tabla 1 Oligonucleótidos utilizados
-τ . „ . _, ,, , . ,. , ,,. . Posición en el RNAl de
Nombre Secuencia 5 -3' del o gonucleotido v^nv
MA146 CCATGTTAAGGTAGTACTGG 841-860
U31-617 GTTTACAGGATTTTATGGTC 950-931
511 TATGGTACCCGTTACAAGTCT 1235-1255
MA147 CTGGGCATAGCAATCTTGGCTC 1314-1293
U148-1274 AGGGAAGGTCACTCAAATCA 2605-2624
U148-32 CGGATTGAAAAACTGTTGA 3058-3040
U28-475 CCCGATCCGAAGGTCAGATT 7301-7320
L28-821 TGTCGGAAAAGAAATGATT 7665-7647
Oligo(dT) CCCTCTAGATATCTCGAGTCGAC(T)17
MA160 CGCATATGTCCTTGGTAAATCC 6116-6132
MA161 GTCCCGGGTTCCAGTATATCTCG 6974-6958
MA174 GTCCCGGGTGTGATAAGCCTCC 6827-6812
Para generar clones internos a los extremos del RNAl se diseñaron oligonucleótidos específicos a partir de las secuencias obtenidas inicialmente (señaladas con un segmento horizontal sombreado en la Figura 2) que se usaron en reacciones de RT-PCR usando como molde dsRNA. Estos oligonucleótidos específicos fueron MA147, U148-32 y L28-821, complementarios a la supuesta secuencia viral, y MA146, 511 y U148-1274, idénticos a la supuesta secuencia viral (Tabla 1). En el experimento de RT-PCR se utilizaron las combinaciones de oligonucleótidos siguientes: MA147 y MA146, U148-32 y 511 y L28-821 y U148-1274. La síntesis de la primera cadena del cDNA se realizó utilizando 10 μl de dsRNA de plantas infectadas a una concentración de 10 ng/μl por cada una de las tres combinaciones de oligonucleótidos empleados. A este RNA se añadió 1 μl de hidróxido de metil mercurio 0,1 M y se mantuvo a temperatura ambiente 10 minutos. A continuación se añadieron los reactivos siguientes: 1 μl de β-mercaptoetanol 1,4 M, 5 μl del tampón de transcriptasa reversa concentrado 5 veces (Boehringer Manheinn, Manheinn, Alemania), 1 μl de una mezcla de dNTPs 10 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech, UK), 1 μl de DTT 100 mM, 1 μl de transcriptasa reversa (Expand RT, Boehringer), 2 μl de los oligonucleótidos complementarios (a una concentración de 100 ng/μl), todo ello en un volumen final de 25 μl. Esta mezcla se mantuvo a 37°C durante 1 h y 20 minutos. A continuación, se procedió a la síntesis de la segunda cadena del cDNA. A lμl de la mezcla anterior se añadieron 5 μl de tampón de polimerasa Taq concentrado 10 veces (Bioline, Londres, UK), 2 μl de Cl2Mg 25 mM, 1 μl de dNTPs 10 mM, 0,5 μl de los oligonucleótidos idénticos a la secuencia viral (a una concentración de 100 ng/μl) y 1 μl de polimerasa Taq (BioTaq; Bioline, Londres, UK), todo ello en un volumen final de 50 μl. Esta mezcla se sometió a los siguientes ciclos de PCR: un ciclo de desnaturalización a 94°C durante 4 minutos, treinta ciclos de desnaturalización a 94°C durante 30 s seguida de la hibridación de los oligonucleótidos a 45°C durante 30 s seguida de la polimerización del cDNA a 72°C durante 3 minutos, y un ciclo final de polimerización a 72°C durante 7 minutos. El resultado del PCR se comprobó por electroforesis de una alícuota en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Tras transiluminación con luz ultravioleta, en este gel se observaron bandas específicas de los tamaños aproximados 0,5 kbp, 1,8 kbp y 5 kbp para las combinaciones de oligonucleótidos MA146/MA147, 511/U148-32 y U148-1274/L28-821, respectivamente. Estos fragmentos de DNA fueron ligados al plásmido pCR-BluntLI-TOPO (Invitrogen Co., Carisbad, CA, USA) o al plásmido pGEM-T Easy vector System II (Promega Co., Madison, WL USA) y clonados en E. coli. Por cada fragmento de cDNA se secuenciaron dos clones (clones pLM0,5-7, pLM0,5-9, pLM12-2, pLM12-9, pLM15 y pLM24; Fig. 2) y cada posición (nt) en esos clones ha sido leída al menos dos veces.
EJEMPLO 2
Preparación de las construcciones genéticas usadas para transformar plantas
Para la preparación de la construcción genética usada para transformar plantas se procedió como se esquematiza en la Figura 7. Mediante el uso de los oligonucleótidos MA160 y MA161 (Tabla 1) se amplificó mediante PCR sobre el plásmido pLM15 (Figura 2) un fragmento de DNA de 858 nt (nt 6116 al nt 6974 de la secuencia del RNA 1 de CYSDV [Figura 1]). Este fragmento se ligó al plásmido pGEM-T Easy System II (Promega) y se clonó en E. coli dando lugar a la construcción pRdRp (Figura 7). Usando los oligonucleótidos MA160 y MA174 se amplificó un fragmento de DNA de 711 nt (nt 6116 al nt 6827 de la secuencia del RNAl de CYSDV [Figura 1]). De nuevo, este fragmento se ligó al plásmido pGEM-T Easy System II (Promega) y se clonó en E. coli dando lugar a la construcción p5'RdRp (Figura 7). El fragmento EcoRI de 730 nt del pásmido p5'RdRp se escindió del plásmido, se purificó y se hizo romo en sus extremos (fragmento EcoRI-bhmt) mediante tratamiento con el fragmento klenow de la polimerasa I de DNA de E. coli. Este fragmento se ligó al vector pRdRp, que previamente se había linearizado con Smal. La ligación se usó para transformar E.coli y se seleccionaron colonias que hubieran incorporado el fragmento EcoRI -blunt en orientación opuesta a la del inserto correspondiente a la secuencia de CYSDV preexistente en pRdRp. Así se originó la construcción denominada pLRRdRp (Figura 7). De esta construcción se escindió el fragmento EcoRI que se insertó en el sitio EcoRI del plásmido pExSem-2. El plásmido pExSem-2 es un derivado de pUC18 (Sambrook y col., 1989) que contiene el promotor y el terminador del 35S de CaMV (P35S y T35S, respectivamente); en pExSem-2, P35S y T35S están flanqueados por dianas de restricción HindIII y entre ellos existen otras tres dianas, EcoRI, Ncol y Ndel. Este último paso dio lugar a la construcción pExIRRdRp (Figura 7). El fragmento HindlIIds pExIRRdRp fue escindido, purificado de gel de agarosa y ligado al vector psvs297-NOS que previamente se había linearizado con HindIII. Las bacterias transformadas con esta ligación y que portaban el inserto adecuado fueron seleccionadas, dando lugar a la construcción psvsExIR (Figura 7), que es la que se ha utilizado para transformar plantas.
EJEMPLO 3 Análisis de la susceptibilidad de plantas a la infección viral El procedimiento seguido para analizar la susceptibilidad de plantas a la infección por CYSDV ha comprendido los pasos de i) inoculación en condiciones controladas del virus en las plantas a testar y en los correspondientes controles y ii) seguimiento del desarrollo de la enfermedad y del progreso del virus en las plantas inoculadas. Los métodos de mantenimiento e inoculación de plantas con CYSDV están descritos en López-Sesé y Gómez-Guillamón (2000). Aquí se describen los métodos utilizados para la estima de la gravedad de síntomas inducidos por CYSDV y para la medida de la acumulación de CYSDV en las plantas inoculadas.
Para la comparación de síntomas se elaboró una escala (0 a 5) de la gravedad de los síntomas que puede inducir CYSDV en melón y pepino (Tabla 2).
Tabla 2
Escala de la gravedad de los síntomas que CYSDV puede inducir en plantas de melón y pepino
Escala Descripción
0 No síntomas
Ninguna hoja completamente amarilla. Clorosis internervial sólo en hojas
1 básales, el resto de las hojas tiene moteado clorótico suave hasta la hoja 15 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay síntomas.
Ninguna hoja completamente amarilla. Clorosis internervial hasta la hoja 5 contada desde la hoja inoculada. Desde ésta, moteado clorótico hasta la hoja 14-15 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay síntomas.
2 hojas básales completamente amarillas exceptuando los nervios, que permanecen verdes. Desde éstas, clorosis internervial en hojas básales que
3 según se asciende en la planta se toma en moteado clorótico. La última hoja con moteado clorótico es la 11-12 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay síntomas.
1-2 hojas básales completamente amarillas, las 2 siguientes amarillas con nervios verdes. Desde éstas, clorosis internervial en hojas básales que según
4 se asciende en la planta se torna en moteado clorótico. La última hoja con moteado clorótico es la 7 contada desde el ápice. Desde esta hoja hasta el ápice no hay síntomas.
3-4 hojas básales completamente amarillas. Síntomas de clorosis internervial y moteado clorótico hasta la 2-3 hoja contada desde el ápice.
Utilizando dicha escala, se realizaron estimas de gravedad de síntomas sobre plantas correspondientes a líneas transgénicas y controles no transgénicos inoculadas simultáneamente; además, para minimizar efectos no debidos a la infección viral sobre el desarrollo de síntomas, el número y distribución de las plantas siempre obedeció a un diseño experimental apropiado. La determinación de la presencia o ausencia de CYSDV y/o su nivel de acumulación en tejidos de plantas se realizó sobre muestras tomadas a las dos semanas y a las cinco semanas post-inoculación. La estima de la gravedad de síntomas se realizó a las cinco semanas post-inoculación (siete semanas post-transplante desde el semillero a maceta). Los muéstreos se realizaron en seis niveles distintos de las plantas analizadas: en la hoja cuarta sobre la hoja inoculada (nivel I), en la octava (nivel II), en la 16 (nivel III), en la 22 (nivel TV), en la 26 (nivel V) y en la 30 (nivel VI). Cada nivel fue tratado independientemente, para poder así seguir la evolución de la distribución espacial de la infección viral en cada entrada de germoplasma considerada. La presencia o ausencia de CYSDV en material vegetal se determinó mediante la detección del virus utilizando las técnicas de hibridación molecular en improntas sobre membranas de nylon de secciones de tejidos (tissue-print; ver para un ejemplo Narváez y col., 2000). Además, en determinadas ocasiones fue necesario estimar la cantidad de virus y no sólo su presencia o ausencia. Para ello se utilizó una técnica basada en la hibridación molecular conocida como dot-blot cuantitativo. El dot-blot cuantitativo consistió, brevemente, en lo siguiente. El RNA total de muestras de plantas (0,2 g) se extrajo siguiendo el método descrito por Célix y col. (1996). A continuación, por un lado se sometió a electroforesis en geles de agarosa una alícuota de estos extractos con objeto de estimar la cantidad de RNA total presente con respecto a patrones de cantidades conocidas y, por otro lado, se insertaron alícuotas de estos extractos en membranas de nylon que se sometieron a un proceso estándar de detección del RNA viral por hibridación molecular frente a una sonda diseñada para detectar específicamente RNA viral. Para la realización de los dot-blots cuantitativos se insertaron también en las membranas cantidades conocidas de RNA viral que posibilitaron obtener para cada blot una curva patrón de cantidades de RNA viral frente a señal de hibridación. Las señales de hibridación se cuantificaron por densitometría óptica. Las curvas patrones permitieron deducir por intrapolación las cantidades absolutas de RNA viral presente en cada extracto de RNA total. Finalmente, las cantidades absolutas de RNA viral se refirieron a las cantidades absolutas de RNA total de cada muestra.
La sonda utilizada en las hibridaciones moleculares, tanto en improntas de tejidos como en dot-blot, fue de cRNA y obtenida por transcripción in vitro utilizando como molde el plásmido pLM12.2 (Figura 2). Es de destacar que este plásmido contiene una secuencia viral distinta de la usada para crear el transgén y que, por tanto, la sonda derivada de este plásmido sólo detecta RNA del virus y no RNA de tipo viral generado a partir del transgén. Para la preparación de las sondas se procedió como se describe a continuación. El plásmido pLM12.2 se linearizó utilizando el enzima de restricción Sphl. Para la reacción de transcripción in vitro se utilizaron 10 μl de este DNA linearizado a una concentración de 100 ng/μl a los que se añadieron 20 μl de tampón de transcripción concentrado 5 veces (Amersham Pharmacia Biotech), 10 μl de DTT 100 mM, 20 μl de una mezcla de rNTPs 2,5 mM que contiene DIG-11-UTP (Boehringer) en una concentración 1 mM, 50 U de inhibidor de RNasas (Amersham Pharmacia Biotech) y 50 U de la transcriptasa SP6 (Amersham Pharmacia Biotech), todo ello en un volumen final de 100 μl. Esta mezcla se mantuvo a 37°C durante 1 h 30 minutos. Transcurrido este tiempo se añadieron 10 U de DNasa libre de RNasas (Boehringer) y se continuó la incubación durante otros 30 minutos. A continuación, se añadieron a la mezcla 4 μl de EDTA 0,5 M, 5 μl de CILi 8 M y 300 μl de etanol puro, se mantuvo a -20°C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró por centrifugación. El precipitado seco se resuspendió en 50 μl de agua a los que se añadieron otros 50 μl de tampón carbonato de pH 10,2 para proceder a la hidrólisis controlada del cRNA. Esta mezcla se mantuvo a 60°C durante 56 minutos y, a continuación, se añadieron 5 μl de ácido acético al 10%, 10 μl de acetato sódico 3 M y 250 μl de etanol puro. Se mantuvo a -20°C durante 3 h y el cRNA precipitado se concentró mediante centrifugación. El precipitado seco se resuspendió en 100 μl de formamida al 50%. La sonda así preparada se utilizó a diluciones 1:1000 en tampón estándar de hibridación, siguiendo los procedimientos al uso.
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Una constracción de ácido nucleico que comprende una primera secuencia de nucleótidos capaz de regular la transcripción en una planta de una segunda secuencia de nucleótidos, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
(i) una secuencia de nucleótidos correspondiente a un fragmento del RNAl del Virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), y
(ii) una repetición invertida de la totalidad o parte de dicha secuencia de nucleótidos (i).
2. Constracción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende una secuencia de nucleótidos del ORF Ib del RNAl del CYSDV.
3. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (i) comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. LO. N°: 2.
4. Construcción según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de nucleótidos (ii) comprende la repetición invertida de la secuencia de nucleótidos identificada como
SEQ. ID. N°: 2.
5. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, una secuencia de nucleótidos (iii), espaciadora, entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii).
6. Constracción según la reivindicación 5, en la que dicha secuencia de nucleótidos (iii) espaciadora comprende la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N°: 3.
7. Constracción según la reivindicación 1, en la que dicha primera secuencia de nucleótidos comprende un promotor funcional en plantas.
8. Constracción según la reivindicación 7, en la que dicho promotor funcional en plantas es un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido.
9. Construcción según la reivindicación 8, en la que dicho promotor funcional en plantas es el promotor 35S del Virus del mosaico de la coliflor (CaMV).
10. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, un terminador de la transcripción funcional en plantas.
11. Construcción según la reivindicación 10, en la que dicho terminador de la trancripción funcional en plantas es el terminador poli(A) de CaMV.
12. Constracción según la reivindicación 1, que comprende un promotor funcional en plantas capaz de regular la transcripción en plantas de una segunda secuencia de nucleótidos, y un terminador de la transcripción funcional en plantas, comprendiendo dicha segunda secuencia de nucleótidos:
(i) la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. LD.
N°: 2;
(ii) la repetición invertida de dicha SEQ. LD. N°: 2; y
(iii) entre dichas secuencias de nucleótidos (i) y (ii), la secuencia de nucleótidos identificada como SEQ. ID. N°: 3.
13. Construcción según la reivindicación 1, que comprende, además, una tercera secuencia de nucleótidos que permite seleccionar una planta transformada con dicha construcción, estando dicha tercera secuencia de nucleótidos operativamente unida a un promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos y a un terminador de la transcripción funcional en plantas.
14. Constracción según la reivindicación 13, en la que dicha tercera secuencia de nucleótidos comprende el gen de la neomicin-fosfotransferasa II, capaz de conferir resistencia a kanamicina en una planta transformada con dicha construcción.
15. Construcción según la reivindicación 13, en la que dicho promotor funcional en plantas que regula la expresión de dicha tercera secuencia de nucleótidos es el promotor del gen nopalin sintetasa (pNOS).
16. Constracción según la reivindicación 13, en la que dicho terminador de la transcripción funcional en plantas es el terminador poli(A) del gen NOS.
17. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
18. Una célula vegetal transformada con una constracción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o con un vector según la reivindicación 17.
19. Una célula vegetal transgénica que comprende, integrada en su genoma, una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
20. Una planta transgénica que comprende, al menos, una célula transgénica según la reivindicación 19.
21. Una planta transformada con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, o con un vector según la reivindicación 17.
22. Una planta que es un clon o un descendiente de la planta de la reivindicación 20 ó
21.
23. Una planta híbrida con resistencia mejorada frente al virus del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV), preparada por cruce de una planta transgénica según la reivindicación 20, una planta transformada según la reivindicación 21, o un clon o descendiente de las mismas, según la reivindicación 22, con una segunda planta susceptible a la infección por CYSDV.
24. Un propágulo de una planta según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23.
25. Propágulo según la reivindicación 24, que comprende una semilla.
26. Una semilla de una planta que comprende la segunda secuencia de nucleótidos definida en las reivindicaciones 1 a 6.
27. Un método para generar resistencia frente al viras del amarilleo y enanismo de las cucurbitáceas (CYSDV) en plantas susceptibles a la infección por CYSDV, que comprende transformar una célula vegetal de una planta susceptible a la infección por CYSDV con una construcción de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, y regenerar la planta a partir de dicha célula vegetal transformada.
28. Uso de una construcción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en la producción de una planta transgénica con resistencia mejorada a la infección por CYSDV.
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