WO2004000877A2 - Peptides issus de la glycoproteine g du virus de la rage, ligands du recepteur de basse affinite des neurotrophines (p75-ntr) et leurs applications - Google Patents

Peptides issus de la glycoproteine g du virus de la rage, ligands du recepteur de basse affinite des neurotrophines (p75-ntr) et leurs applications Download PDF

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    • C12N2810/6081—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses negative strand RNA viruses rhabdoviridae, e.g. VSV

Definitions

  • the present invention relates to peptides derived from the glyco-protein G of the rabies virus, ligands of the low affinity receptor for the neurotrophins plS ( ⁇ ) and to their applications as a vector for the targeted transport of molecules of interest. in cells expressing this receptor, useful for the treatment of genetic or acquired diseases, implying a dysfunction of these cells, in particular neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease or Alzheimer's disease.
  • Rabies virus is a neurotropic virus responsible for fatal encephalomyelitis in humans and domestic and wild mammals, usually transmitted by the bite of an infected animal with clinical signs of the disease.
  • This virus is a Lyssavirus (family of Rhabdoviridae); it is classified in genotype 1 (GT1), the genotypes GT2 to GT7 corresponding respectively to the Lagos Bat virus (LB), Mokola (Mok), Duvenhague (Duv) and to European bat Lyssaviruses (EBL of types 1 and 2) or Australian (ABL).
  • Lyssaviruses are enveloped viruses comprising a single glycoprotein (G), associated in trimers, in the form of spicules forming protrusions on the surface of the lipid envelope.
  • G glycoprotein
  • Glycoprotein G has three major functions: (i) due to its interaction with cellular receptors, it allows the attachment of the virus to cells and is the major determinant of Lyssavirus neurotropism, (ii) it induces protective, humoral immunity ( neutralizing antibodies) and cell, and (iii) it allows the fusion of the viral envelope with the cell membrane, by a pH-dependent process.
  • Rabies virus glycoprotein G is a type I transmembrane protein of 505 amino acids comprising an external domain of 439 amino acids, a transmembrane domain of 22 amino acids and a domain
  • N-glycosylation sites Three potential N-glycosylation sites have been located lises: the first located at the amino acid in position 32 is glycosylated very inefficiently, the second in position 204 or 247 is glycosylated only in certain strains and the third, located in position 319 is always glycosylated. Folding, intracellular transport and oligomerization have been analyzed for the Pasteur and ERA strains and it has been shown that glycoprotein G acquires trimeric organization in the endoplasmic reticulum. A potential fusion peptide has been located in the region corresponding to the amino acid residues of positions 102 to 179.
  • glycoprotein G The antigenic structure of glycoprotein G has been extensively characterized using monoclonal antibodies directed against this glycoprotein. About 50 mutants of glycoprotein G resistant to neutralization by the rabies virus (CVS strain) were isolated and classified into independent antigenic sites according to their mutation and their reactivity with the anti-G monoclonal antibodies. Two conformational immunodominant sites (site II and site LII), two minor sites (site a and linear epitope) and several other epitopes were located in the external domain of glycoprotein G:
  • - Site II is a major antigenic site, recognized by 70% of monoclonal antibodies; it consists of the amino acid residues corresponding to positions 34 to 42 and 184 to 210, linked by a disulfide bridge between the cysteines in positions 35 and 207,
  • the UI site is a conformational site constituted by the residues of positions 330 to 340; it plays an essential role in the propagation and pathogenic power of the virus: (i) the mutation of the Arg333 residue leads to a loss of virulence for adult animals, the Arg333 mutant is capable of infecting peripheral neurons, but is propagates only in a limited number of categories of neurons of the central nervous system and (ii) the mutation of the Lys330 residue abolishes the penetration of the virus into sensory and motor neurons, after an intramuscular infection,
  • the site a is constituted by the residues of positions 342 and 343 and the linear epitope is constituted by the residues corresponding to positions 251 to 264.
  • the rabies virus glycoprotein G adopts at least two conformations, called N (neutral) and I (inactive for fusion).
  • N neutral
  • I inactive for fusion
  • the glycoprotein G in conformation I is no longer recognized by the monoclonal antibodies of site II, but the virus can be neutralized by monoclonal antibodies which do not recognize the virus when the protein is in conformation N.
  • P75 NTR is a type I glycoprotein of the TNF receptor superfamily, comprising an external domain (ectodomain) including four domains rich in cysteine (CRD for Cystein Rich Domain), involved in the binding of the ligand and the dimerization of the receptor, a rod rich in serine and threonine which is very glycosylated, as well as an intracellular domain including a signal of cell death, potentially involved in apoptosis (Chao et al., J. Neurol. , 199, 25, 1373-1385).
  • P75 NXR is expressed in many neuronal and non-neuronal tissues in the young subject. In adults, its expression is more limited; it is detected in several categories of neurons, mainly at the synapses, as well as in other tissues such as muscle, inner ear, testes and submandibular glands.
  • NGF Nem Growth Factor
  • BDNF Brain-Derived Nerve Factor
  • NT-3 and NT-4/5 neurotrophins binds NGF (Nerve Growth Factor) and other neurotrophins, such as BDNF (Brain-Derived Nerve Factor) and neurotrophins NT-3 and NT-4/5.
  • the neurotrophic receptor binding domain has not been precisely identified; it has been shown that some basic amino acids are essential, suggesting the existence of ionic interactions between neurotrophins, positively charged, and the external domain, rich in cysteine residues.
  • the heteropolymer formed by the binding of neurotrophins to the p75 NTR receptor can optionally associate with a protein of the Trk family (TrkA, B or C, depending on the ligand) to form a site of high affinity for neurotrophins; the p75 NTR - NGF-TrkA complex is internalized in vesicles and transported retrograde to the level of the neuron cell bodies (Lalli G. et, al., J. Cell Biol., 2002, 156, 2, 233-239) .
  • peptide fragments of the rabies virus glycoprotein G capable of binding specifically to the p75 NTR receptor.
  • These peptides, ligands for the p75 NTR receptor represent vectors capable of addressing (or targeting) and internalizing (by endocytosis) molecules of interest, efficiently and specifically in cells expressing this receptor, in particular in neurons.
  • the subject of the present invention is a peptide capable of specifically binding to the p75 receptor, characterized in that it comprises between 35 and 101 amino acids and includes at least the fragment corresponding to positions 318 to 352 of the mature G glycoprotein of the virus. rabies, said positions being identical for all strains of the rabies virus. According to an advantageous embodiment of said peptide, it consists of amino acid residues 318 to 352 of the mature glycoprotein G of the rabies virus.
  • said peptide (peptide PI) corresponds to positions 318-352 of the mature glycoprotein G of the rabies virus and has the following sequence:
  • X ! represents L or I
  • X 2 represents K, T or N
  • X 3 represents S or P
  • f represents V or I
  • X 5 represents R, Q, M, L, I, S, K, G or E
  • X 6 represents T or E
  • X represents N
  • X 8 represents I or L
  • X 9 represents K, T or N
  • X ⁇ 0 represents G or E
  • X 12 A or V
  • X 13 represents G or E.
  • said PI peptide has the sequence SEQ ID NO: 2: FNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCH.
  • said peptide corresponds to positions 291-391 of the glycoprotein G of the rabies virus and has the following sequence:
  • Y represents H or P
  • Y represents I or L
  • Y 3 represents P or S
  • Y represents G or D
  • Y 5 represents N or H.
  • said peptide P2 has the sequence SEQ ID NO: 1
  • the present invention also relates to a chimeric peptide, characterized in that it comprises, at its ⁇ -terminal end, a peptide as defined above, and at its C-terminal end, a trimerization motif.
  • said chimeric peptide further comprises, between the C-terminal end of said peptide and the ⁇ -terminal end of said trimerization motif, a binding fragment comprising between 1 and 10 amino acids, preferably, a fragment comprising at least 8 glycines.
  • said peptides allow specific addressing to neuronal cells as well as internalization of molecules of interest in neuronal cells, in particular for the treatment of neurodegenerative diseases.
  • these peptides bind specifically to the low affinity receptor for NGF (p75 NTR ) and more particularly to the first domain rich in cysteines (CRD1) of said receptor, while the neurotrophins bind to the second and third domains rich in cysteines (CRD2 and 3).
  • the PI peptide according to the invention does indeed have addressing and internalization properties in neuronal cells, whereas this is not the case for the peptide corresponding strictly to the UI site (positions 330-340) ; indeed, the fragment 318-329 of the mature glycoprotein of the rabies virus, at the N-terminal end and in particular the presence of a phenylalanine at the N-terminal end (corresponding to position 318 of the mature glycoprotein ) and fragment 341-352 of the mature rabies virus glycoprotein, at the C-terminal end and in particular the presence of a histidine in the C-terminal position, in the peptide according to the invention are necessary to obtain l 'activity sought.
  • peptide P2 which also includes the fragment 318-352. More specifically, the mechanism of action of the peptides according to the invention can be considered as the following:
  • this bond is preferably (but not exclusively) covalent and takes place via a cleavable linker, which after cleavage, will release the molecule of interest in the cell; said linker advantageously contains an S-S bridge which will be reduced, an ester which will be cleaved in the acid compartments of the cell or a glycan.
  • a fusion peptide is not necessary.
  • the peptides according to the invention can be obtained, advantageously either by chemical synthesis, or by expression in conventional expression systems (bacteria, recombinant baculoviruses, yeasts, etc.) and purification using anti- G directed against one of the antigenic sites contained in the said peptide.
  • the present invention also relates to a chimeric protein, characterized in that it comprises at its N-terminal end, the ectodomain of the glycoprotein G of the rabies virus corresponding to positions 1-432 or to positions 1-439 of said glycoprotein G, which ectodomain includes the peptide corresponding to positions 318-352, and at its C-terminal end, a trimerization motif.
  • said chimeric protein further comprises, between the C-terminal end of the ectodomain of the glycoprotein G of the rabies virus and the N-terminal end of the trimerization motif, a fragment linker comprising between 1 and 10 amino acids, preferably a fragment comprising at least 8 glycines.
  • said trimerization motif corresponds to the domain of 27 amino acids originating from the fibritin of bacteriophage T4 and has the following sequence:
  • both the chimeric peptide and the chimeric protein according to the invention interact stably with p75; in particular, the chimeric protein forms more stable trimers than the ectodomain of the glycoprotein G of the rabies virus (fragment 1-432 or fragment 1-439); in fact, the ectodomain of glycoprotein G forms trimers (at high concentration) which dissociate in the form of monomers when the concentration decreases.
  • the present invention also relates to a complex molecule, characterized in that it comprises a peptide or a chimeric protein, as defined above, associated, covalently or not, with a molecule of interest, capable of treating a neurodegenerative disease.
  • said peptide or said chimeric protein and said molecule of interest are covalently linked via a suitable linker.
  • said linker is cleavable in the cell and comprises either an S-S bridge, or an ester, or a glycan.
  • the peptide or the chimeric protein according to the invention is associated with the molecule of interest by any known method:
  • association is carried out using coupling systems; - non-covalent associations are also possible.
  • the present invention also relates to a nucleic acid molecule, characterized in that it codes for a peptide or a chimeric protein, as defined above.
  • nucleic acid molecule codes for the peptide PI as defined above (peptide derived from the glycoprotein G of the rabies virus).
  • said nucleic acid molecule has the following sequence: ttc aac aaa ace Rj atg gaa gct gat gct cac tac R 2 R 3 R 4 R 5 R ⁇ tgg R 7 gag R 8 atc ecc tca R 9 R 10 tgt ctg R ⁇ R 12 gga R 13 aggtgt cat, in which: R ⁇ represents a codon L or a codon I, R 2 represents a codon K, a codon T or a codon N, R 3 represents a codon S or a codon P, Ri represents a codon V or a codon I, R 5 represents a codon R, a codon, Q, a codon M, a codon L, a codon I, a codon S, a codon K, a codon G or a codon E, R ⁇ represents a codon T or a codon E, R
  • said nucleic acid molecule has the following sequence: ttc aac aaa ace ctg atg gaa gct gat gct cac tac aag tca gtc cgg ace tgg aat gag atc atc ecc tca aag ggg tgt ctg aga gtt gga ggg agg tgt cat (SEQ ID NO: 3)
  • nucleic acid molecule codes for the peptide P2 as defined above.
  • the different nucleic acid molecules according to the invention coding for the fragments 318-352, 291-391 and 1-439 of the glycoprotein G can in particular be found from the sequence databases and in particular from the numbers of following accesses: J02293 (strain ERA), CAD44953 and AJ506997.1 (strain CVS), UI 1748, U03764 or UI 1758 (strain Ontario). They include variants of these different nucleic acid molecules which code for a fragment having the same properties as those set out above.
  • the present invention also relates to vectors containing a nucleic acid molecule coding for a peptide or a chimeric protein, as defined above and host cells (bacteria, viruses and in particular baculoviruses and yeasts, in particular) comprising these vectors .
  • Such vectors are useful as vectors for gene therapy.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, characterized in that it essentially comprises (i) a product selected from the group consisting of a complex molecule as defined above, a naked nucleic acid molecule as defined above or a vector as defined above, said nucleic acid molecule or said vector being associated with a molecule of interest and (ii) at least one pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention also relates to a tool for specific screening of molecules modulating the link between the glycoprotein G of the rabies virus and the low affinity neurotrophin receptor (p75 NTR ) specific for neuronal cells, characterized in that it comprises : - cells expressing a peptide according to the invention comprising at least the fragment corresponding to amino acid residues 318 to 352 of the mature glycoprotein G of the rabies virus and in particular the peptides PI or P2 according to the invention, such as defined above, a chimeric peptide as defined above or a chimeric protein as defined above (linking element 1); and - cells expressing the low affinity neurotrophin receptor (p75 NTR ), preferably only the CRDl of said receptor (binding element 2).
  • said cells express a peptide selected from the group consisting of the PI peptide consisting of amino acid residues 318 to 352 of the mature glycoprotein G of the rabies virus, the peptide P2 consisting of amino acid residues 291-391 of the mature rabies virus glycoprotein G and a chimeric protein, as defined above.
  • said screening tool comprises cells expressing the PI peptide constituted by amino acid residues 318 to 352 of the mature glycoprotein G of the rabies virus as defined above.
  • At least one of the two connecting elements is in a soluble form.
  • the soluble form of the peptide consists in particular of amino acid residues 318 to 352 of the mature glycoprotein G of the rabies virus, preferably obtained by synthesis.
  • the soluble form of the low affinity neurotrophin receptor (p75 NTR ) consists of at least the CRDl fragment and at most the ectodomain of the p75 receptor fused to an Fc fragment of a human IgG1 immunoglobulin.
  • the present invention further relates to a method for selecting ligands specific for the p75 receptor, characterized in that it essentially comprises:
  • the method implemented can be either a direct method or a method by competition.
  • a subject of the present invention is also the use of a chimeric protein or a peptide, as defined above, for the preparation of a medicament useful for the treatment of genetic or acquired diseases involving a dysfunction of cells expressing the p75 NTR receptor, in particular neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease or Alzheimer's disease.
  • the present invention also relates to the use of a chimeric protein or a peptide, as defined above, for the preparation of a medicament intended to inhibit myelin inhibitors; such products thus promote neuronal regeneration, especially in the event of trauma or damage to the spinal cord.
  • the present invention also relates to the use of a chimeric protein or a peptide, as defined above, for the preparation of a medicament useful in the treatment of cancers.
  • Figure 1 illustrates the expression of the recombinant protein p75-Fc in COS cells:
  • Figure 1 A illustrates the structure of the dimeric soluble p75 NTR receptor (p75-Fc) comprising the external or ectodomain domain of p75 NTR (p75ECD) fused to the Fc domain of the heavy chain of a human IgGl (hlgdFc) of the soluble p75-Fc receptor;
  • FIG. 1B illustrates the Western blot analysis of O 2004/000877
  • FIG. 12 the expression of the p75-Fc protein in the supernatant of COS cells transiently transfected with the recombinant plasmid (P-p75 / Fc), and FIG. 1C illustrates the analysis, in SDS-PAGE and blue staining of Coomassie, protein p75-Fc purified in column of protein A-Sepharose.
  • - Figure 2 illustrates the analysis of the interaction of the soluble p75-Fc receptor with the rabies virus:
  • Figure 2A illustrates the ELISA analysis;
  • Figure 2B shows that the p75-Fc protein neutralizes the CVS strain.
  • Figure 3 illustrates the interaction between the srr mutant and the p75-Fc protein or anti-G monoclonal antibodies (Figure 3A); the immune complexes are analyzed by SDS-PAGE and autoradiography (FIG. 3B).
  • FIG. 4 illustrates the binding of the srr mutants to a membrane form of the ⁇ 756 receptor:
  • FIG. 4A illustrates the expression of RVG on the cell surface;
  • FIG. 4B illustrates the binding of cells labeled Sf21-p75 to monolayers of BSR cells infected with CVS or of srr mutants.
  • - Figure 5 illustrates the maturation of the srr mutants.
  • FIG. 6 the binding of I25 I-RVG to PC 12 cells:
  • Figure 6A results obtained by incubation of 20 ng / ml of , 25 I-RVG or 10 ng / ml of 125 I-NGF with PC 12 cells in the presence of non-radioactive competitors;
  • Figure 6B Scatchard plot.
  • - Figure 7 illustrates the binding of RGV to CRDl mutants: point mutations in the plasmid CRDl and the protein is expressed in COS-7 cells; the cells are biotinylated on their surface, lysed and the extracts are precipitated with streptavidin beads, then the p75 receptor is detected by Western blot.
  • Figures 8A and 8B illustrate the binding of I-RVG to point mutants of CRDl.
  • the last amino acid of the glycoprotein G ectodomain (a lysine) is replaced by an arginine.
  • FIG. 10 represents the level of expression of the soluble proteins A, B and C, as defined in FIG. 9: an aliquot of the supernatants of the insect cells infected with the recombinant baculovirus A, B or C was analyzed in polyacrylamide-SDS gel in reducing condition. The presence of glycoprotein G was revealed by Western blotting (immunoblotting) with the antibody 17D2.
  • FIG. 11 represents the oligomerization of the recombinant glycoproteins G (A, B and C): analysis by sedimentation at equilibrium in gradient 5-20% of sucrose of the proteins produced in the supernatant of insect cells infected with baculovirus recombinants.
  • - COS-7 cells (supplied by Brian Seed, MGH Boston), are cultured in DMEM medium (GIBCO BRL) supplemented with 10% fetal bovine serum, at 37 ° C, in a humid incubator, in the presence of 5% CO 2 .
  • the Sf21 cells of Spodoptera frugiperda are cultured at 28 ° C in TC100 medium (GIBCO BRL) supplemented with 10% fetal bovine serum.
  • TC100 medium GIBCO BRL
  • PC 12 cells are cultured in MEM medium (GIBCO
  • the rabies virus strain CVS (Challenge Virus Strain) is amplified and titrated by the beach technique, according to the protocols described in Raux et al., Virology, 1995, 210, 400-408.
  • the anti-G 30AA5 and 40DC2 monoclonal antibodies bind to site H (Préhaud et al., J. Virol., 1988, 62, 1-7),
  • the monoclonal antibodies 50AD1 and 41BC2 bind to site III (Tuffereau et al., Virol, 1989, 172, 206-212)
  • the monoclonal antibody 9B4 binds to the a site (Benmansour et al., J. Virol, 1991, 65, 4198-4203),
  • the 17D2 monoclonal antibody binds to the linear epitope (Lafay et al., J. Gen. Virol, 1996, 77, 339-346) and.
  • the antibody 21H8 binds to the specific conformation of the acid conditions (Raux et al., 1995, cited above) O 2004/000877
  • Mutants in which the cysteine-rich domain (CRD) is deleted are obtained by the PCR-recombinant technique, using a p75 plasmid comprising the entire coding sequence of the human p75 gene, amplified with specific oligonucleotides and subcloned in the BamHI site of the plasmid pcDNAl [Invitrogen, ref. V490-20, 1992 (bacteria MC1061 / P3, ampicillin + tetracycline selection)], as a template and specific primers for introducing CRD deletions into the extracellular part of the protein.
  • CRD cysteine-rich domain
  • Table I below specifies the primers which were used to obtain the deletion mutants.
  • Table I primers (SEQ H) NO: 4 to 13) used for the deletion mutants
  • a and b two PCR fragments (a and b) are obtained and then a fusion PCR is carried out using the primers RA1 and RB5 and the PCR fragments a + b.
  • Point mutations are introduced into CDR1 using the QuickChange TM site-directed mutagenesis kit (Stratagene).
  • the mutations are introduced into the gene by amplification using the DNA polymerase Pfu Turbo TM and two synthetic primers carrying the desired mutation. The incorporation of the primers generates a mutated plasmid.
  • the DNA template methylated or semi-methylated
  • the digestion product is used to transform bacteria MC 1061.
  • a p75 NTR cDNA fragment was amplified by PCR using the Tfu polymerase (PROMEGA) and a pair of primers comprising a sense primer, complementary to the signal sequence, containing an Xhol site (5 'CGCGGG ⁇ T ⁇ GAGATGGACGGGCCGCGC3', SEQ ID NO: 14) and an antisense primer corresponding to the 3 'sequence of the O-glycosylated stem, containing a BamHI site 5' GCGGATCCCATCGGCCAGGGATC3 ', SEQ ID NO: 15).
  • the amplification product obtained is digested with the enzymes BamHI and Xhol and inserted between the corresponding sites of the plasmid (Langner et al., Arch. Virol, 1993, 130, 157-170) to give the recombinant plasmid P-p75 / Fc .
  • the insert cloned into the recombinant plasmid P-p75 / Fc was verified by sequencing.
  • COS cells were transiently transfected with the recombinant plasmid P-p75 / Fc by the DEAE-dextran technique.
  • the culture supernatant was harvested 72 h after transfection, clarified by low speed centrifugation and loaded onto a column of protein A-Sepharose (SIGMA).
  • SIGMA protein A-Sepharose
  • the p75-Fc protein was eluted in a 0.1 M glycine pH 3 buffer and neutralized by the addition of 1 M Tris HC1 pH8, at the final concentration 50 mM.
  • the protein thus obtained was dialyzed against a PBS buffer (10 mM phosphate (pH 7), 137 mM NaCl, 2.6 mM KC1), using the FastDialyzer Interbiotech dialysis system (INTERCHIM) and stored at - 80 ° C.
  • the protein concentration was determined by the Bradford method using a commercial reagent (PIERCE).
  • the purified protein was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS (SDS-PAGE) and colora- Coomassie Blue and Western blotting, using a polyclonal anti-p75 antibody.
  • RV (RVG) and VSV (VSVG) glycoproteins are purified using the method described by Gaudin Y. et al. (Virology, 1992, 187, 627-632) slightly modified. Briefly, the purified viruses are treated with 1% of CHAPS (3 - [(3-cholaminopropyl) dimethyl-ammonio-l -propane sulfonate) in the presence of a mixture of protease inhibitors (chymostatin, leupeptin, antipapain and pepstatin to 2 ⁇ g / ml each and 16 ⁇ g aprotinin per ml) for 30 minutes at 37 ° C. The solubilized virions are deposited on a sucrose gradient at
  • the fractions containing the trimeric glycoprotein corresponding to the sedimentation coefficient 9S are mixed and loaded onto a DEAE-Trisacryl column (IBF, Biotechnics) in a mixture of 10 mM NaCl, 10 mM Tris pH 8 containing 1% of CHAPS. Glycoproteins are eluted by a buffer comprising 250 mM
  • the detergent is removed by successive dialysis against PBS buffer and the protein concentration is determined by the Bradford quantification method.
  • the final protein product consists of pure RVG or VSVG rosettes, having on average 10 trimers per rosette and at a concentration ranging from 0.8 to 1 mg / ml.
  • Transfected COS-7 cells were treated with 10 ⁇ g of purified RVG in 1.5 ml of DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) for 2 hours at room temperature. The cells are washed 3 times and fixed using 4% of cold paraformaldehyde. The cells are then incubated with specific anti-G antibodies and a goat anti-mouse antibody conjugated to ⁇ -galactosidase (Southern
  • the iodization of the RVG or of a peptide according to the invention is carried out by the lactoperoxidase method until an average specific activity of 7.5 ⁇ 10 7 cpm / ⁇ g is obtained.
  • the RVG or the peptide according to the radiolabelled invention is purified by size exclusion chromatography using a column
  • the cells are suspended in Eppendorf tubes with 20 ng / ml of I25 I-RVG (approximately 30 pM, considering a trimer accessible to rosette fixation) in PBS containing 1 mg / ml bovine serum albumin (BSA), 1 mM MgCl 2 , and 0.5 mM CaCl 2 , in the presence or absence of non-radioactive (cold) competitors.
  • BSA bovine serum albumin
  • MgCl 2 1 mM MgCl 2
  • CaCl 2 0.5 mM CaCl 2
  • Non-specific fixation is determined by the use of an excess of unmarked RVG (400 times).
  • BSR cells (10 6 cells in 35 mm dishes) are infected with each virus (multiplicity of infection or moi 2). 24 hours after infection, the cells are radiolabeled for 1 hour at 37 ° C. with 50 ⁇ Ci of 35 S-methionine and 35 S-cysteine (Promix, Amersham) in MEM medium without methionine or cysteine (GIBCO).
  • the cell extracts are incubated for 1 hour at 4 ° C with different monoclonal antibodies (2 ⁇ l of ascites fluid) or p75-Fc (4 ⁇ g) pre-adsorbed on protein A-Sepharose.
  • the immune complexes are analyzed by SDS-PAGE at 12%. Immunoprecipitated RVG is detected by autoradiography (Kodak Biomax films). 5.e. SDS-PAGE and immunoblot analysis Protein samples are brought to the boil for 5 min in Laemmli buffer. The electrophoresis is carried out in a discontinuous SDS-PAGE gel. The proteins are then stained with Coomassie Blue and then transferred to nitrocellulose membranes (BA85, Schleicher and Schuell).
  • the membranes are saturated with 5% skimmed milk in a buffer, TBS (saline Tris-buffer) containing 0.05% Tween 20 for 30 min then incubated for 1 hour with goat anti-mouse antibody conjugated with peroxidase ( Sigma). The immune complexes are detected after washing in a TBS-Tween chemiluminescence buffer (ECL).
  • TBS saline Tris-buffer
  • ECL TBS-Tween chemiluminescence buffer
  • Rabies virus (CVS strain), purified according to conventional techniques as described in Gaudin et al. (Virol., 1992, 187, 627-632), was diluted in TD buffer (137 M NaCl, 5 mM KC1, 0.7 mM NaHPO 4 , 25 mM Tris- HCl, pH 7.5), distributed in a 96-well plate (50 ng / well in 50 ⁇ l), then the plates were dried overnight at 37 ° C. The plates were saturated with a PBS solution containing 10% (W / V) of skim milk powder.
  • a suspension of radiolabelled p75-Sf21 cells is added to a monolayer of BSR cells infected with different mutants (moi 2 for 30 h) and incubated for 30 minutes at room temperature.
  • the unbound p75-Sfil cells are eliminated by three washes with PBS and the specific binding is measured by counting the radioactivity associated with the infected BSR cells.
  • CVS virus clones (10 6 pfu) are incubated with 5 ⁇ g of p75-Fc, for 1 hour at 37 ° C., then with 10 ⁇ g of anti-human IgG for 1 hour at 37 ° C.
  • the non-neutralized virus is spread on a monolayer of BSR cells in 24-well plates. After 3 hours at 37 ° C, the supernatant cells are collected and subjected to a new neutralization-amplification cycle. Each clone is amplified three or four times, in the presence of p75-Fc and anti-human IgG and the plates tested for the selection of variants.
  • RNAgents® total RNA (Promega).
  • the complementary DNA (cDNA) of the RVG gene is obtained by the RT-PCR technique: first with AMV reverse transcriptase (Promega) and then with Taq polymerase (Promega) using primers specific for RVG gene. The cDNA fragment is then purified and sequenced using a T7 sequencing kit (T7-sequencing kit, Amersham). 7) Pulse-hunting experiences
  • the soluble form of the p75 receptor is obtained in accordance with Example 1.3).
  • the results of the analysis of the cell supernatant presented in FIG. 1B show the presence of a protein recognized by anti-p75 antibodies, which has an apparent molecular weight of approximately 97.4 kD, corresponding to that expected for a p75-Fc fusion protein.
  • the p75-Fc protein is also recognized by a monoclonal antibody recognizing a conformational epitope of p75 (antibody ME20.4 recognizing the domains rich in cysteine (CRDs 3 and 4) and by a polyclonal anti-human IgG serum. was purified on a column of protein A-Sepharose with a yield of 5 ⁇ g / ml. Analysis in SDS-PAGE and staining with Coomassie blue, of the purified protein shows that the protein p75-Fc obtained is pure at 90 % ( Figure 1C).
  • the binding of the soluble receptor to the rabies virus was analyzed by ELISA, according to the protocol described in Example 1.5.f.
  • a dish is inoculated with rabies virus (CVS line) and incubated with different quantities of p75-Fc or human immunoglobulins G.
  • CVS line rabies virus
  • FIG. 2A A representative experiment is shown in Figure 2A.
  • P75-Fc binds to the virus in a concentration-dependent manner, with an estimated Kd of 400 nM.
  • Human immunoglobulins G do not bind to the rabies virus under the same conditions.
  • the specific interaction between the soluble form of the p75 receptor and the rabies virus indicates that no cofactor is required for this interaction. This is in agreement with the ability of p75-Fc to co-precipitate with RVG solubilized from the virus by detergents in the form of monomers or trimers.
  • an incubation step with an anti-human immunoglobulin G specific for the Fc part of the chimera was added. This antibody should not interfere with the interaction between the p75-Fc receptor and the RVG, which occurs at the N-terminal part of the p75 receptor.
  • the virus was previously incubated with an amount ranging from 1 to 10 ⁇ g of p75-Fc, then with 10 ⁇ g of anti-human immunoglobulin G (Table H).
  • Table II Neutralization of the rabies virus by the soluble protein p75-Fc Neutralizing agents Neutralization
  • 10 cloned populations of CVS 3 were subjected to several passages, in the presence of 5 ⁇ g of p75-Fc and 10 ⁇ g of anti-human immunoglobulin G antibodies.
  • the viral particles are amplified on monolayers of BSR cells which do not express the p75 NTR receptor but express other receptors leading to cell infection and to the amplification of the Srr mutants.
  • Several viral populations have been shown to be more resistant to neutralization by p75-Fc and anti-human immunoglobulin G.
  • the cloned viral populations were titrated by the plaque formation technique in the presence or in the absence of p75-Fc and of anti-Fc antibodies. Individualized plaques were removed, amplified and resubmitted with p75-Fc and the human anti-immunoglobulin G antibody.
  • Clone 1 was still neutralized by p75-Fc + the human anti-immunoglobulin G antibody, even after four passages in the presence of these molecules.
  • the RVG of different Srr mutants is immunoprecipitated by all the antibodies tested, but not by p75-Fc, while the CVS glycoprotein is immunoprecipitated by all the antibodies and by p75-Fc (FIG. 3 A).
  • the antibody 50AD1 specifically for the UT site
  • the antibody 50AD1 is an immunoglobulin M and cannot be followed by immunoprecipitation
  • its binding to the mutants of the rabies virus was followed by immunofluorescence. This fixation was found normal (Fig. 3B).
  • the BSR cells infected with the CVS strain or the srr mutants for 18 hours are incubated with the antibody 50AD1 (dilution 100 in EPT buffer, pH 7.4: 150 mM NaCl, Na 2 HPO 4 7.4 mM, KH 2 PO 4 2.4 mM:) for two hours, then washed and fixed by treatment in presence of 4% paraformaldehyde in EPT for 15 minutes, washed and incubated with the FITC conjugated secondary antibody (Pierce) diluted 100 times in EPT buffer for 1 hour in the dark. The cells are observed with an Olympus B40 fluorescence microscope. These results suggest that mutations 318 and 352 are located outside the previously characterized antigenic site (Table HJ).
  • FIG. 4A Expression of the mutated RVG form of srr was followed by immunoprecipitation with two anti-G antibodies (Fig. 4A).
  • Cells infected with mutants F318V and H342Y express twice as much glycoproteins as cells infected with CVS, while an identical amount of proteins was detected in cells infected with mutants F318S and H352R.
  • No radiolabelled p75-Sf21 cell binds to the cell monolayer that has been infected with any of the Srr mutants even though they contain a normal amount of glycoprotein on their surface. Conversely, a very significant fixation is detected when the monolayer has been infected with CVS (FIG. 4B).
  • amino acid substitutions 318 or 352 abolish the interaction with p75 NTR, whether in soluble form or in the form of a membrane-bound receptor.
  • the migration profiles of the glycoproteins of the mutants F318V and H352 are modified (FIGS. 3A and 4A). RVG migrates as a doublet in CVS (2/3 of molecules carrying two sweet chains and 1/3 of molecules carrying only one sweet chain), while Srr glycoproteins migrate as a triplet. These differences correlate with the plaque phenotype: F318V and H352R producing plaques smaller than CVS. This suggests that the transport / folding of the glycoprotein may be affected in these mutants.
  • Pulse-hunting experiments were used to compare the maturation of RVG in Srr mutants (F318S and H352R) and in CVS.
  • a neosynthesized CVS RVG immunoprecipitated by the antibody 17D2 migrates as a doublet: a band corresponding to the addition of a sweet chain with high mannose content and one corresponding to the addition of two sweet chains.
  • the addition of complex sugars in the Golgi apparatus increases the molecular weight, resulting in the presence of additional bands of high molecular weight and in a decrease / disappearance of the smaller bands.
  • the immature glycoprotein (the smallest band) is still present after 120 minutes of hunting in the Srr mutants (F318S and H352R).
  • EXAMPLE 5 Quantification of the RVG-p75 receptor binding affinity The RVG is radiolabeled (I-RVG), so as to obtain a specific activity of 7.5 ⁇ 10 4 cpm / ng, using the Iactoperoxidase method. (see example 1.5.b).
  • the mutants contain 1, 2 or 3 CRDs connected via an O-glycosylated linker to the TM and cytoplasmic domains of hp75.
  • COS-7 cells are transfected with different plasmids and the expression of the mutants is analyzed by Western blotting with an antibody against the cytoplasmic domain of p75.
  • the different mutants migrate on an SDS-PAGE gel, in accordance with their molecular weight.
  • the protein migrates as a doublet. Expression on the cell surface of all mutants was confirmed by immunofluorescence, although at different rates.
  • RVG binds to all mutants, except the one in which CRDl is deleted.
  • recombinant plasmids in which the signal peptide sequence is that of the viral glycoprotein G were constructed.
  • the recombinant plasmids were obtained in the expression vector pAcYM1 (Matsura et al., J. Gen ,. Virol., 1987, 68, 1233-1250).
  • G- (PV) 1-39 The sequence of the glycoprotein gene (comprising the 19 amino acids of the signal peptide and the 439 of the mature form of the G protein of the PV strain) was amplified by RT-PCR with the pair of primers (x2 and y3) and using the messengers of the G glycoprotein gene of the PV strain as template.
  • G- (CVS) ⁇ -43 The sequence of the glycoprotein gene (comprising the 19 amino acids of the signal peptide and the 439 of the mature form of the G protein of the CVS strain) was amplified by RT-PCR with the pair of primers (CA1 and y3) and using a plasmid containing the entire glycoprotein gene of the CVS strain in the vector pcDNAl (Invitrogen) as template.
  • G- (CVS) ⁇ - 32 The sequence of the glycoprotein gene (comprising the 19 amino acids of the signal peptide and the 432 of the mature form of the G protein of the CVS strain) was amplified by RT-PCR with the pair of primers (CA1 and CB13) and using a plasmid containing the whole gene of the glycoprotein of the CVS strain in the vector pcDNAl (Invitrogen) as template.
  • the nucleotide sequence coding for glycoprotein G was amplified by PCR with the pair of primers (x8 and y7) using the plasmid pcDNAl Gwt (Gaudin et al, 1999; J. Gen. Virol. 80, 1647-1656) containing the whole gene of the glycoprotein G of the strain PV in the vector pcDNAl (Invitrogen) as template.
  • This motif has been shown to be responsible for the trimerization of fibritin (Letarov et al., 1999, Biochemistry 64, 817-823, Tao et al., 1997, Structural 5, 789-798) but was also capable of induce trimerization of recombinant proteins [adenovirus fiber (Krasnikh et al., 2001, J. Virol 75, 4176-4183; gpl20 HIV (Yang et al, 2002, J. Virol. 76, 4634-4642) when it was merged with these.
  • the plasmid pT412wl3 is derived from the plasmid pGEM-T (Promega) by insertion of the genes 12, wac (fibritin) and 13 of the bacteriophage T4; this plasmid was supplied to the inventors by Andrey Letarov.
  • trimerization motif foldon, SEQ ID NO :
  • the sequence of the trimerization motif (foldon, SEQ ID NO :) of fibritin was amplified by PCR using a pair of primers (FA2- and FBI) using the plasmid pT412wl3 as template.
  • the two amplification products were cloned in fusion into the vector pVT-Bac.
  • the sequence of the fibritin trimerization motif preceded by the 8 glycines was amplified by PCR using a pair of primers (F A3 and FBI) using the plasmid pT412wl3 as template. The two amplification products were cloned in fusion into the vector pVT-Bac.
  • b) Obtaining Recombinant Baculoviruses Recombinant baculoviruses were obtained for each plasmid after co-transfection of SF21 lepidopteran cells with the linearized baculovirus lac Z and the plasmids A, B or C as described above (Tuffereau et al., 1998, J Virol 72, 1085-1091).
  • Viral stocks of each of the recombinants were obtained and assayed in Sf21 cells.
  • 2- Production of the recombinant proteins Monolayers of Sf21 cells were infected at a multiplicity of infection of 3 by the different recombinant baculoviruses. After 1 hour of adsorption at room temperature, 10 ml of TC100 medium + 2% S VF is added and the cells are incubated at 28 ° C for 3 days. Three days post-infection, the cells and the medium are recovered, centrifuged (2000 rpm, 10 min, Beckman J6) to remove the cells and cellular debris.
  • the anti-glycoprotein 21H8 monoclonal antibody is an IgG1. It was purified on protein G-Sepharose (Sigma) and then covalently coupled to activated agarose (AminoLink Plus® Immobilization Kit, Pierce) according to the protocol provided. The coupling efficiency is greater than 90%. b) Purification of the Recombinant G Glycoprotein
  • the purification was carried out with the soluble recombinant protein G- (PV) 1-439 and can be applied to the other recombinant proteins because they are also recognized by the antibody 21H8.
  • the supernatant of insect cells containing the soluble glycoprotein is dialyzed against phosphate buffer for a few hours, then incubated with 2 ml of agarose coupled to the antibody 21H8 overnight at 4 ° C. The agarose is then transferred to a column. A washing with 10 ml of 100 mM Tris-HCl buffer pH 8 then another with 10 ml of 10 mM Tris-HCl buffer pH 8 are carried out; the glycoprotein is eluted at acid pH (100 mM glycine, pH 3) and neutralized by adding 100 mM Tris-HCl pH 8.
  • COS7 cells transfected with the plasmid hp75 and expressing p75 on their surface were incubated either with the supernatant of the insect cells infected with the recombinant baculoviruses and containing the soluble glycoproteins G, or with the protein G- (PV) 1- 39 purified.
  • the binding of glycoproteins was demonstrated using the ⁇ -galactosidase staining test as described in the paragraph.
  • the various recombinant proteins are capable of interacting with p75 and the purification by immunoaffinity column does not alter the interaction properties with p75.
  • the nucleotide sequence corresponding to amino acids 291 to 391 of the PV strain glycoprotein was cloned into the expression vector pET22 b (+) (Novagen).
  • the constructions G 2 1 . 391 and G 2 1-391 -H 6 were obtained by PCR amplification with the respective primer pairs (x9 and y8) and (x9 and y9) and using the plasmid pcDNAl G wt (Gaudin et al, 1999) as a matrix.
  • Soluble glycoproteins expressed as baculoviruses are expressed as baculoviruses

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Abstract

Peptides issus de la protéine G du virus de la rage, ligands du récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) et leurs applications comme vecteur pour le transport ciblé de molécules d'intérêt dans des cellules exprimant ce récepteur, utiles pour le traitement des maladies génétiques ou acquises, impliquant un dysfonctionnement de ces cellules, notamment les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer. Ces peptides incluent au moins un fragment constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage.

Description

PEPTIDES ISSUS DE LA GLYCOPROTEINE G DU VIRUS DE LA RAGE, LIGANDS DU RECEPTEUR DE BASSE AFFINITE DES NEUROTROPHINES
(P75 TR) ET LEURS APPLICATIONS
La présente invention est relative à des peptides issus de la glyco- protéine G du virus de la rage, ligands du récepteur de basse affinité des neuro- trophines plS^^) et à leurs applications comme vecteur pour le transport ciblé de molécules d'intérêt dans des cellules exprimant ce récepteur, utile pour le traitement des maladies génétiques ou acquises, impliquant un dysfonctionnement de ces cellules, notamment les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer.
Le virus de la rage (RV) est un virus neurotrope responsable d'une encéphalomyélite mortelle chez l'homme et les mammifères domestiques et sauvages, transmis généralement par la morsure d'un animal infecté présentant des signes cliniques de la maladie. Ce virus est un Lyssavirus (famille des Rhabdoviridaé) ; il est classé dans le génotype 1 (GT1), les génotypes GT2 à GT7 correspondant respectivement au virus Lagos Bat (LB), Mokola (Mok), Duvenhague (Duv) et aux Lyssavirus de chauve-souris d'origine européenne (EBL de types 1 et 2) ou australienne (ABL).
Les Lyssavirus sont des virus enveloppés comprenant une unique glycoprotéine (G), associée en trimères, sous forme de spicules formant des protru- sions à la surface de l'enveloppe lipidique.
La glycoprotéine G a trois fonctions majeures : (i) du fait de son interaction avec des récepteurs cellulaires, elle permet la fixation du virus aux cellules et est le déterminant majeur du neurotropisme des Lyssavirus, (ii) elle induit une immunité protectrice, humorale (anticorps neutralisants) et cellulaire, et (iii) elle permet la fusion de l'enveloppe virale avec la membrane cellulaire, par un processus dépendant du pH.
La glycoprotéine G du virus de la rage (RVG) est une protéine transmembranaire de type I de 505 acides aminés comprenant un domaine externe de 439 acides aminés, un domaine transmembranaire de 22 acides aminés et un domaine
C-terminal de 44 acides aminés. Trois sites potentiels de N-glycosylation ont été loca- lises : le premier situé au niveau de l'acide aminé en position 32 est glycosylé de façon très inefficace, le second en position 204 ou 247 est glycosylé uniquement dans certaines souches et le troisième, situé en position 319 est toujours glycosylé. Le repliement, le transport intracellulaire et l'oligomérisation ont été analysés pour les souches Pasteur et ERA et il a été montré que la glycoprotéine G acquiert une organisation trimérique au niveau du réticulum endoplasmique. Un peptide de fusion potentiel a été localisé dans la région correspondant aux résidus d'acides aminés des positions 102 à 179.
La structure antigénique de la glycoprotéine G a été caractérisée de façon extensive à l'aide d'anticorps monoclonaux dirigés contre cette glycoprotéine. Environ 50 mutants de la glycoprotéine G résistants à la neutralisation par le virus de la rage (souche CVS) ont été isolés et classés en sites antigéniques indépendants en fonction de leur mutation et de leur réactivité avec les anticorps monoclonaux anti-G. Deux sites conformationnels immunodominants (site II et site LÏÏ), deux sites mineurs (site a et épitope linéaire) et plusieurs autres épitopes ont été localisés dans le domaine externe de la glycoprotéine G :
- le site II est un site antigénique majeur, reconnu par 70 % des anticorps monoclonaux ; il est constitué par les résidus d'acides aminés correspondant aux positions 34 à 42 et 184 à 210, reliés par un pont disulfure entre les cystéines en posi- tion 35 et 207,
- le site UI est un site conformationnel constitué par les résidus des positions 330 à 340 ; il joue un rôle essentiel dans la propagation et le pouvoir pathogène du virus : (i) la mutation du résidu Arg333 conduit à une perte de virulence pour les animaux adultes, le mutant Arg333 est capable d'infecter des neurones péri- phériques, mais se propage uniquement dans un nombre limité de catégories de neurones du système nerveux central et (ii) la mutation du résidu Lys330 abolit la pénétration du virus dans les neurones sensoriels et moteurs, après une infection par voie intramusculaire,
- le site a est constitué par les résidus des positions 342 et 343 et l'épitope linéaire est constitué par les résidus correspondants aux positions 251 à 264. La glycoprotéine G du virus de la rage adopte au moins deux conformations, dénommées N (neutre) et I (inactive pour la fusion). La glycoprotéine G en conformation I n'est plus reconnue par les anticorps monoclonaux du site II, mais le virus peut être neutralisé par des anticorps monoclonaux qui ne reconnaissent pas le virus lorsque la protéine est en conformation N. Cette propriété a été utilisée pour isoler des mutants résistants à la neutralisation induite en conditions acides ; les mutations correspondantes ont été localisées dans la région N-terminale de la glycoprotéine (entre les résidus correspondant aux positions 10 à 15) et à d'autres positions contrôlant le changement de conformation (positions 44, 282, 392 et 396). À l'exception des étapes très précoces et finales de l'infection, au cours desquelles ils se multiplient dans des tissus non-neuronaux (glandes salivaires par exemple), les Lyssavirus se multiplient et se propagent exclusivement à l'intérieur des neurones. Le virus pénètre directement au niveau des terminaisons nerveuses du site d'inoculation ou après une multiplication limitée dans les myotubes ; il est ensuite transporté le long des axones, dans les corps cellulaires des neurones moteurs et sensoriels où il se réplique. Le bourgeonnement viral a lieu essentiellement dans les compartiments internes des neurones infectés et le virus est transporté au niveau des synapses par l'intermédiaire de vésicules.
Différents récepteurs potentiels du virus de la rage et de sa glyco- protéine G ont été proposés : des phospholipides (Perrin et al., Annales Virologie, 1982, 133, 403-422 ; Rupprecht et al., Curr. Topics in Microbiol. And Immunol., 1994, 187, 1-339 ; Superti et al., Archives of Virol, 1984, 81, 321-328), des ganglio- sides (Superti et al., J. Gen. Virol., 1986, 67, 47-56) et des protéines spécifiques des neurones, incluant le récepteur nicotinique de l'acétylcholine (Lentz et al., Science, 1984, 226, 847-848 ; Brain Research, 1986, 1, 211-219), la molécule d'adhésion des cellules neurales (NCAM, Thoulouze et al., J. Virol, 72, 7181-7190) et le récepteur de basse affinité des neurotrophines p75NTR (Tuffereau et al. EMBO Journal, 1998, 17, 7250-7259).
La p75NTR est une glycoprotéine de type I de la superfamille des récepteurs du TNF, comprenant un domaine externe (ectodomaine) incluant quatre domaines riches en cystéine (CRD pour Cystein Rich Domain), impliqués dans la liaison du ligand et la dimérisation du récepteur, une tige riche en serine et thréonine qui est très glycosylée, ainsi qu'un domaine intracellulaire incluant un signal de mort cellulaire, potentiellement impliqué dans l'apoptose (Chao et al., J. Neurol., 199 , 25, 1373-1385). La p75NXR est exprimée dans de nombreux tissus neuronaux et non- neuronaux chez le sujet jeune. Chez l'adulte, son expression est plus limitée ; elle est détectée dans plusieurs catégories de neurones, principalement au niveau des synapses, ainsi que dans d'autres tissus tels que le muscle, l'oreille interne, les testicules et les glandes sous-maxillaires.
La p75NTR lie le NGF (Nerve Growth Factor) et d'autres neuro- trophines, telles que le BDNF (Brain-Derived Nerve Factor) et les neurotrophines NT- 3 et NT-4/5. Le domaine de liaison au récepteur des neurotrophmes n'a pas été identifié de façon précise ; il a été montré que quelques acides aminés basiques sont indispensables, suggérant l'existence d'interactions ioniques entre les neurotrophines, chargées positivement, et le domaine externe, riche en résidus cystéine. L'hétéropolymère formé par la liaison des neurotrophines au récepteur p75NTR peut éventuellement s'associer avec une protéine de la famille Trk (TrkA, B ou C, en fonction du ligand) pour former un site de haute affinité pour les neurotrophines ; le complexe p75NTR- NGF-TrkA est internalisé dans des vésicules et transporté de façon rétrograde au niveau des corps cellulaires des neurones (Lalli G. et,al., J. Cell Biol., 2002, 156, 2, 233-239).
Poursuivant leurs travaux, les Inventeurs ont maintenant identifié des fragments peptidiques de la glycoprotéine G du virus de la rage, capables de se lier spécifiquement au récepteur p75NTR. Ces peptides, ligands du récepteur p75NTR représentent des vecteurs capables d'adresser (ou cibler) et d'internaliser (par endocytose) des molécules d'intérêt, de façon efficace, et spécifique dans des cellules exprimant ce récepteur, en particulier dans les neurones.
La présente invention a pour objet un peptide capable de se lier spécifiquement au récepteur p75 , caractérisé en ce qu'il comprend entre 35 et 101 acides aminés et inclut au moins le fragment correspondant aux positions 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage, lesdites positions étant identiques pour toutes les souches du virus de la rage. Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide, il est constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit peptide (peptide PI) correspond aux positions 318-352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage et présente la séquence suivante :
FNKTXιMEADAHYX2X3X4X5X6WX7EX8LPSX9X1oCLX11X12GX13RCH, (SEQ ID NO: 1), dans laquelle : X! représente L ou I, X2 représente K, T ou N, X3 représente S ou P, f représente V ou I, X5 représente R, Q, M, L, I, S, K, G ou E, X6 représente T ou E, X représente N, I, T ou E, X8 représente I ou L, X9 représente K, T ou N, Xι0 représente G ou E,Xπ : R ou E, X12 : A ou V et X13 représente G ou E.
De manière préférée, ledit peptide PI présente la séquence SEQ ID NO:2 : FNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCH.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit peptide (peptide P2), il correspond aux positions 291-391 de la glycoprotéine G du virus de la rage et présente la séquence suivante :
MTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTΓFNKTX1MEADAHYX2X3X4X5X6WX7E X8LPSX9X1OCLX11X12GXΙ3RCHPY1VNGVFFNGY2ILGY3DY4Y5VLFFEMQSSLL
(SEQ ID NO:31), dans laquelle : Y] représente H ou P, Y représente I ou L, Y3 repré- sente P ou S, Y représente G ou D et Y5 représente N ou H.
De manière préférée, ledit peptide P2 présente la séquence SEQ ID
NO :32 :
MTTKSVSFPvRLSHLRKXVPGFGKAYWNJOZ^
LR GGΛCHPHVΝGVFFΝGIILGPDGΝVLff EMQSSLL. La présente invention a également pour objet un peptide chimère, caractérisé en ce qu'il comprend, à son extrémité Ν-terminale, un peptide tel que défini ci-dessus, et à son extrémité C-terminale, un motif de trimérisation.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit peptide chimère, il comprend en outre, entre l'extrémité C-terminale dudit peptide et l'extrémité Ν- terminale dudit motif de trimérisation, un fragment de liaison comprenant entre 1 et 10 aminoacides, de préférence, un fragment comprenant au moins 8 glycines. De manière avantageuse, du fait de leur capacité de liaison avec p75NTR, lesdits peptides permettent un adressage spécifique aux cellules neuronales ainsi qu'une internalisation de molécules d'intérêt dans les cellules neuronales, notamment pour le traitement de maladies neurodégénératives. En effet, ces peptides se lient de manière spécifique au récepteur de basse affinité du NGF (p75NTR) et plus particulièrement au premier domaine riche en cystéines (CRD1) dudit récepteur, alors que les neurotrophines se fixent sur les deuxième et troisième domaines riche en cystéines (CRD2 et 3).
De manière surprenante, le peptide PI selon l'invention présente effectivement des propriétés d'adressage et d'internalisation dans les cellules neuronales, alors que ce n'est pas le cas pour le peptide correspondant strictement au site UI (positions 330-340) ; en effet, le fragment 318-329 de la glycoprotéine mature du virus de la rage, à l'extrémité N-terminale et notamment la présence d'une phénylalanine à l'extrémité N-terminale (correspondant à la position 318 de la glycoprotéine mature) et le fragment 341-352 de la glycoprotéine du virus de la rage mature, à l'extrémité C- terminale et notamment la présence d'une histidine en position C-terminale, dans le peptide selon l'invention sont nécessaires pour obtenir l'activité recherchée.
Il en est de même pour le peptide P2, qui comprend également le fragment 318-352. De manière plus précise, le mécanisme d'action des peptides selon l'invention peut être considéré comme le suivant :
- ciblage de la molécule d'intérêt à des cellules particulières, par l'intermédiaire de sa liaison au peptide selon l'invention ; cette liaison est de préférence (mais non exclusivement) covalente et s'effectue par l'intermédiaire d'un linker clivable, qui après clivage, libérera la molécule d'intérêt dans la cellule ; ledit linker contient avantageusement un pont S-S qui sera réduit, un ester qui sera clivé dans les compartiments acides de la cellule ou un glycane.
- internalisation du complexe peptide selon l'invention + molécule d'intérêt dans des vésicules d'endocytose et - libération de la molécule d'intérêt directement au niveau de son site d'action. De manière avantageuse, dans le cadre de l'invention, un peptide de fusion n'est pas nécessaire.
Les peptides selon l'invention peuvent être obtenus, de manière avantageuse soit par synthèse chimique, soit par expression dans des systèmes d'expression classique (bactéries, baculovirus recombinants, levures...) et purification à l'aide d'anticorps anti-G dirigés contre l'un des sites antigéniques contenus dans le dit peptide.
La présente invention a également pour objet une protéine chimère, caractérisée en ce qu'elle comprend à son extrémité N-terminale, l'ectodomaine de la glycoprotéine G du virus de la rage correspondant aux positions 1-432 ou aux positions 1-439 de ladite glycoprotéine G, lequel ectodomaine inclut le peptide correspondant aux positions 318-352, et à son extrémité C-terminale, un motif de trimérisation.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite protéine chimère, elle comprend en outre, entre l'extrémité C-terminale de l'ectodomaine de la glycoprotéine G du virus de la rage et l'extrémité N-terminale du motif de trimérisation, un fragment de liaison comprenant entre 1 et 10 aminoacides, de préférence, un fragment comprenant au moins 8 glycines.
Conformément à l'invention, ledit motif de trimérisation correspond au domaine de 27 acides aminés provenant de la fibritine du bactériophage T4 et présente la séquence suivante :
G-Y-I-P-E-A-P-R-D-G-Q-A-Y-V-R-K-D-G-E-W-V-F-L-S-T-F-L. (SEQ ID NO: 16) (Fib-foldon).
De manière surprenante, aussi bien le peptide chimère que la protéine chimère selon l'invention interagissent de manière stable avec p75 ; en particulier, la protéine chimère forme des trimères plus stables que l'ectodomaine de la glycoprotéine G du virus de la rage (fragment 1-432 ou fragment 1-439) ; en effet, l'ectodomaine de la glycoprotéine G forme des trimères (à concentration élevée) qui se dissocient sous forme de monomères quand la concentration diminue. La présente invention a également pour objet une molécule complexe, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide ou une protéine chimère, tels que définis ci-dessus, associé, de manière covalente ou non, à une molécule d'intérêt, apte à traiter une maladie neurodegenerative.
Selon un mode de réalisation avantageux de ladite molécule complexe, ledit peptide ou ladite protéine chimère et ladite molécule d'intérêt sont liés de manière covalente par l'intermédiaire d'un lieur convenable.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, ledit lieur est clivable dans la cellule et comprend soit un pont S-S, soit un ester, soit un glycane.
Le peptide ou la protéine chimère selon l'invention est associé à la molécule d'intérêt par toute méthode connue :
- lorsqu'il s'agit de peptides, l'association est réalisée par liaison peptidique ;
- lorsque la molécule d'intérêt n'est pas un peptide, l'association est réalisée à l'aide de systèmes de couplage ; - des associations non covalentes sont également possibles.
La présente invention a également pour objet une molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide ou une protéine chimère, tels que définis ci-dessus.
Selon un mode de réalisation de ladite molécule d'acide nucléique, elle code pour le peptide PI tel que défini ci-dessus (peptide issu de la glycoprotéine G du virus de la rage).
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation ladite molécule d'acide nucléique présente la séquence suivante : ttc aac aaa ace Rj atg gaa gct gat gct cac tac R2 R3 R4 R5 Rό tgg R7 gag R8 atc ecc tca R9 R10 tgt ctg Rπ R12 gga R13 aggtgt cat, dans laquelle : R\ représente un codon L ou un codon I, R2 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R3 représente un codon S ou un codon P, Ri représente un codon V ou un codon I, R5 représente un codon R, un codon, Q, un codon M, un codon L, un codon I, un codon S, un codon K, un codon G ou un codon E, Rβ représente un codon T ou un codon E, R7 représente un codon N, un codon I, un codon T ou un codon E, R8 représente un codon I ou un codon L, R9 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R10 représente un codon G ou un codon E, Rπ représente un codon R ou un codon E, R12 représente un codon A ou un codon V et R13 représente un codon G ou un codon E.
De manière préférée, ladite molécule d'acide nucléique présente la séquence suivante : ttc aac aaa ace ctg atg gaa gct gat gct cac tac aag tca gtc cgg ace tgg aat gag atc atc ecc tca aag ggg tgt ctg aga gtt gga ggg agg tgt cat (SEQ ID NO:3)
Selon un autre mode de réalisation avantageux de ladite molécule d'acide nucléique, elle code pour le peptide P2 tel que défini ci-dessus. Les différentes molécules d'acides nucléiques selon l'invention codant pour les fragments 318-352, 291-391 et 1-439 de la glycoprotéine G peuvent notamment être retrouvées à partir des bases de données de séquences et notamment à partir des numéros d'accès suivants : J02293 (souche ERA), CAD44953 et AJ506997.1 (souche CVS), UI 1748, U03764 ou UI 1758 (souche Ontario). Elles incluent les variants de ces différentes molécules d'acides nucléiques qui codent pour un fragment ayant les mêmes propriétés que celles exposées ci-dessus.
La présente invention a également pour objet des vecteurs contenant une molécule d'acide nucléique codant pour un peptide ou une protéine chimère, tels que définis ci-dessus et des cellules hôtes (bactéries, virus et notamment baculovirus et levures, notamment) comprenant ces vecteurs.
De tels vecteurs, convenablement sélectionnés, sont utiles comme vecteurs de thérapie génique.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement (i) un produit sélectionné dans le groupe constitué par une molécule complexe telle que définie ci- dessus, une molécule d'acide nucléique nue telle que définie ci-dessus ou un vecteur tel que défini ci-dessus, ladite molécule d'acide nucléique ou ledit vecteur étant associés à une molécule d'intérêt et (ii) au moins un véhicule pharmaceutiquement accep- table. La présente invention a également pour objet un outil de criblage spécifique de molécules modulant la liaison entre la glycoprotéine G du virus de la rage et le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) spécifique des cellules neuronales, caractérisé en ce qu'il comprend : - des cellules exprimant un peptide selon l'invention comprenant au moins le fragment correspondant aux résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage et notamment les peptides PI ou P2 selon l'invention, tels que définis ci-dessus, un peptide chimère tel que défini ci-dessus ou une protéine chimère telle que définie ci-dessus (élément de liaison 1) ; et - des cellules exprimant le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR), de préférence, uniquement le CRDl dudit récepteur (élément de liaison 2).
Selon un mode de réalisation avantageux dudit outil de criblage, lesdites cellules expriment un peptide sélectionné dans le groupe constitué par le peptide PI constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage, le peptide P2 constitué par les résidus d'acides aminés 291- 391 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage et une protéine chimère, telle que définie ci-dessus.
Selon un autre mode de réalisation avantageux dudit outil de criblage, il comprend des cellules exprimant le peptide PI constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage tel que défini ci-dessus.
En variante, au moins l'un des deux éléments de liaison est sous une forme soluble. Par exemple :
- la forme soluble du peptide est constituée notamment par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage, obtenue de préférence par synthèse.
- la forme soluble du récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR) est constituée d'au moins le fragment CRDl et d'au plus l'ectodomaine du récepteur p75 fusionné à un fragment Fc d'une immunoglobuline IgGl humaine. La présente invention a en outre pour objet une méthode de sélection de ligands spécifiques du récepteur p75, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement :
- la mise en contact d'un outil de criblage tel que défini ci-dessus, dans un milieu approprié avec un ligand potentiel marqué et
- la mesure du produit marqué éventuellement lié.
La méthode mise en œuvre peut être soit une méthode directe, soit une méthode par compétition.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine chimère ou d'un peptide, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament utile pour le traitement des maladies génétiques ou acquises impliquant un dysfonctionnement des cellules exprimant le récepteur p75NTR, notamment des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'une protéine chimère ou d'un peptide, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné à inhiber les inhibiteurs de la myéline ; de tels produits favorisent ainsi la régénération neuronale, notamment en cas de traumatisme ou de lésion de la moelle épinière. La présente invention a également pour objet, l'utilisation d'une protéine chimère ou d'un peptide, tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament utile dans le traitement des cancers.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du peptide de la présente invention, au Tableau résumant les séquences de la Demande ainsi qu'aux dessins annexés dans lesquels :
- La figure 1 illustre l'expression de la protéine recombinante p75-Fc dans les cellules COS : la figure 1 A illustre la structure du récepteur p75NTR (p75-Fc) soluble dimérique comprenant le domaine externe ou ectodomaine du p75NTR (p75ECD) fusionné au domaine Fc de la chaîne lourde d'une IgGl humaine (hlgdFc) du récepteur soluble p75-Fc ; la figure 1B illustre l'analyse, en Western-blot, de O 2004/000877
12 l'expression de la protéine p75-Fc dans le surnageant de cellules COS transfectées de façon transitoire par le plasmide recombinant (P-p75/Fc), et la figure 1C illustre l'analyse, en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie, de la protéine p75-Fc purifiée en colonne de protéine A-Sépharose. - La figure 2 illustre l'analyse de l'interaction du récepteur soluble p75-Fc avec le virus de la rage : - la figure 2A illustre l'analyse en ELISA ; la figure 2B montre que la protéine p75-Fc neutralise la souche CVS.
- La figure 3 illustre l'interaction entre le mutant srr et la protéine p75-Fc ou des anticorps monoclonaux anti-G (figure 3A) ; les complexes immuns sont analysés par SDS-PAGE et autoradiographie (figure 3B).
- La figure 4 illustre la liaison des mutants srr à une forme membra- naire du récepteur ρ756 : la figure 4A illustre l'expression de la RVG à la surface cellulaire ; la figure 4B illustre la liaison des cellules marquées Sf21-p75 à des monocouches de cellules BSR infectées par le CVS ou des mutants srr. - La figure 5 illustre la maturation des mutants srr.
- La figure 6 la liaison de I25I-RVG aux cellules PC 12 : figure 6A : résultats obtenus par incubation de 20 ng/ml de,25I-RVG ou de 10 ng/ml de 125I-NGF avec des cellules PC 12 en présence de compétiteurs non radioactifs ; figure 6B : plot Scatchard. - La figure 7 illustre la liaison de la RGV aux mutants CRDl : des mutations ponctuelles dans le plasmide CRDl et la protéines est exprimée dans des cellules COS-7 ; les cellules sont biotinylées à leurs surface, lysées et les extraits sont précipités avec des billes de streptavidine, puis le récepteur p75 est détecté par Western-blot. - Les figures 8A et 8B illustrent la liaison de I-RVG aux mutants ponctuels de CRDl.
- La figure 9 représente schématiquement les glycoprotéines G solubles du virus de la rage, exprimées dans le système baculovirus : Fib-foldon correspond au motif de trimérisation et représente la séquence DD NO :16 ; H6 = 6 histidines ; G8 = glycines ; I = Isoleucine ; L = Leucine ; Q = glutamine ; PS-G = peptide signal glycoprotéine ; PS-M = peptide signal de la mellitine. Dans la construc- tion B, le dernier acide aminé de l'ectodomaine de la glycoprotéine G (une lysine) est remplacé par une arginine.
- La figure 10 représente le taux d'expression des protéines solubles A, B et C, telles que définies à la figure 9 : un aliquot des surnageants des cellules d'insectes infectées par les recombinants baculovirus A, B ou C a été analysé en gel de polyacrylamide-SDS en condition réductrice. La présence de glycoprotéine G a été révélée par Western-blot (immunoempreinte) avec l'anticorps 17D2.
- La figure 11 représente l'oligomérisation des glycoprotéines G recombinantes (A, B et C) : analyse par sédimentation à l'équilibre en gradient 5-20 % de saccharose des protéines produites dans le surnageant des cellules d'insectes infectées par le baculovirus recombinants.
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Figure imgf000015_0001
EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES
1) Cellules, virus et anticorps - Les cellules BSR (Sato et al., Arch. Virol., 1977, 53, 269-273), un clone de cellules BHK-21, sont cultivées dans du milieu MEM modifié par Glasgow (GD3CO BRL) supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal, à 37 °C, dans un incu- bateur humide, en présence de 5 % de CO2. Elles sont utilisées pour produire le virus de la rage (RV) et le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) (Thoulouze, J. Virol., 1998, 72, 7181-7190).
- Les cellules COS-7 (fournies par Brian Seed, MGH Boston), sont cultivées dans du milieu DMEM (GIBCO BRL) supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin, à 37 °C, dans un incubateur humide, en présence de 5 % de CO2.
- Les cellules Sf21 de Spodoptera frugiperda (LNVITROGEN) sont cultivées à 28 °C dans du milieu TC100 (GIBCO BRL) supplémenté avec 10 % de sérum fœtal bovin. - Les cellules PC 12 sont cultivées dans un milieu MEM (GIBCO
BRL), en présence de sérum de veau fœtal à 10 %.
- Le virus de la rage de souche CVS (Challenge Virus Strain) est amplifié et titré par la technique des plages, selon les protocoles décrits dans Raux et al., Virology, 1995, 210, 400-408. Dix clones de CVS, qui ont été antérieurement utili- ses pour sélectionner des mutants qui sont neutralisés à pH acide (Raux et al., 1995 précité), ont été utilisés dans cette sélection.
- Un baculovirus recombinant exprimant la p75NTR humaine (Tuffereau et al., J. Gen. Virol., 2001, 82, 2861-2867) a été utilisé pour infecter des cellules Sf21. - Un anticorps polyclonal anti-IgG est utilisé (Jackson Laboratories)
- Des anticorps monoclonaux sont également mis en œuvre :
. les anticorps monoclonaux anti-G 30AA5 et 40DC2 se lient au site H (Préhaud et al., J. Virol., 1988, 62, 1-7),
. Les anticorps monoclonaux 50AD1 et 41BC2 se lient au site III (Tuffereau et al., Virol, 1989, 172, 206-212)
. L'anticorps monoclonal 9B4 se lie au site a (Benmansour et al., J. Virol, 1991, 65, 4198-4203),
. L'anticorps monoclonal 17D2 se lie à l'épitope linéaire (Lafay et al., J. Gen. Virol, 1996, 77, 339-346) et . L'anticorps 21H8 se lie à la conformation spécifique des conditions acides (Raux et al., 1995, précité) O 2004/000877
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Ces anticorps sont préparés et caractérisés, conformément aux méthodes connues de l'homme du métier. 2) Constructions p75
Des mutants dans lesquels le domaine riche en cystéine (CRD) est délété sont obtenus par la technique de PCR-recombinante, utilisant un plasmide p75 comprenant la totalité de la séquence codante du gène p75 humain, amplifié avec des oligonucléotides spécifiques et sous-cloné dans le site BamHI du plasmide pcDNAl [Invitrogen, réf.V490-20, 1992 (bactéries MC1061/P3, sélection ampicil- line+tétracycline)], comme matrice et des amorces spécifiques pour introduire des délétions CRD dans la partie extracellulaire de la protéine.
Le Tableau I ci-après précise les amorces qui ont été utilisées pour obtenir les mutants de délétion. Tableau I : amorces (SEQ H) NO :4 à 13) utilisées pour les mutants de délétion
Figure imgf000017_0001
Dans une première étape, deux fragments de PCR (a et b) sont obtenus puis une PCR de fusion est réalisée en utilisant les amorces RAl et RB5 et les fragments PCR a+b.
Des mutations ponctuelles sont introduites dans CDR1 à l'aide du kit de mutagenèse dirigée QuickChange™ (Stratagene). Les mutations sont introduites dans le gène par amplification à l'aide de l'ADN-polymérase Pfu Turbo™ et de deux amorces synthétiques portant la mutation désirée. L'incorporation des amorces génère un plasmide muté. Après amplification, la matrice d'ADN (méthylée ou hémi-méthylée) est digérée pendant 1 heure à 37°C par l'endonucléase C Dpnl et le produit de digestion est utilisé pour transformer des bactéries MC 1061. 3) Expression d'un récepteur p75 soluble (p75-Fc)
Un vecteur d'expression contenant l'ectodomaine du récepteur p75NTR (acides aminés 1 à 222, numéro d'accession Genbank n° M14764 et Johnson et al., Cell, 1986, 47, 545-554) clone en phase avec le domaine constant de la chaîne lourde d'une IgGl humaine (Aruffo et al., Cell, 1990, 61, 1303-1313 ; Langner et al., Arch. Virol, 1993, 130, 157-170) a été construit (figure 1A) en suivant les étapes suivantes. Un fragment d'ADNc de la p75NTR a été amplifié par PCR à l'aide de la polymérase Tfu (PROMEGA) et d'un couple d'amorces comprenant une amorce sens, complémentaire de la séquence signal, contenant un site Xhol (5'CGCGGGÇTÇGAGATGGACGGGCCGCGC3', SEQ ID NO: 14) et une amorce anti-sens correspondant à la séquence 3' de la tige O-glycosylée, contenant un site BamHI 5' GCGGATCCCATCGGCCAGGGATC3', SEQ ID NO: 15). Le produit d'amplification obtenu est digéré par les enzymes BamHI et Xhol et inséré entre les sites correspondant du plasmide (Langner et al., Arch. Virol, 1993, 130, 157-170) pour donner le plasmide recombinant P-p75/Fc. L'insert clone dans le plasmide recombinant P-p75/Fc a été vérifié par séquençage.
Des cellules COS ont été transfectées de façon transitoire par le plasmide recombinant P-p75/Fc par la technique du DEAE-dextran. Le surnageant de culture a été récolté 72 h après la transfection, clarifié par centrifugation à basse vitesse et chargé sur une colonne de protéine A-Sépharose (SIGMA). La protéine p75- Fc a été éluée dans un tampon 0,1 M glycine pH 3 et neutralisée par addition de 1 M Tris HC1 pH8, à la concentration finale 50 mM. La protéine ainsi obtenue a été dialy- sée contre un tampon PBS (10 mM phosphate (pH 7), 137 mM NaCl, 2,6 mM KC1), à l'aide du système de dialyse FastDialyzer Interbiotech (INTERCHIM) et conservée à - 80°C. La concentration en protéine a été déterminée par la méthode de Bradford à l'aide d'un réactif commercial (PIERCE). La protéine purifiée a été analysée par électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) et colora- tion au Bleu de Coomassie et par Western-blot, à l'aide d'un anticorps polyclonal anti- p75.
4) Préparation de RVG et de VSVG
Les glycoprotéines de RV (RVG) et de VSV (VSVG) sont purifiées en utilisant la méthode décrite par Gaudin Y. et al., (Virology, 1992, 187, 627-632) légèrement modifiée. Brièvement, les virus purifiés sont traités avec 1 % de CHAPS (3-[(3-cholaminopropyl)diméthyl-ammonio-l -propane sulfonate) en présence d'un mélange d'inhibiteurs de protéases (chymostatine, leupeptine, antipapaine et pepstatine à 2 μg/ml chaque et 16 μg d'aprotinine par ml) pendant 30 minutes à 37°C. Les virions solubilisés sont déposés sur un gradient de saccharose à
20 % dans du PBS contenant 1 % de CHAPS et centrifugés pendant 1 heure (SW41, 35K, 4°C). Les surnageants contenant la majorité des glycoprotéines sont concentrés dans un Centricon 30 (Amicon) puis chargés sur gradient de saccharose à 5-20 % dans 10 mM de NaCl, 10 mM de tampon Tris pH8 contenant 1 % de CHAPS et centrifugés pendant 16 heures à 35.000 tours par minute dans un rotor SW41 (Beckman).
Les fractions contenant la glycoprotéine trimérique correspondant au coefficient de sédimentation 9S sont mélangées et chargées sur une colonne DEAE- Trisacryl (IBF, Biotechnics) dans un mélange de NaCl 10 mM, Tris 10 mM pH 8 contenant 1% de CHAPS. Les glycoprotéines sont éluées par un tampon comprenant 250 mM
NaCl, 20 mM Tris 10 mM pH 7,5 contenant 1% de CHAPS. Le détergent est éliminé par des dialyses successives contre du tampon PBS et la concentration en protéine est déterminée par la méthode de quantification de Bradford. Le produit protéique final consiste en des rosettes pures de RVG ou de VSVG, ayant en moyenne 10 trimères par rosette et à une concentration allant de 0,8 à 1 mg/ml.
5) Méthodes d'étude de la liaison RVG ou peptide selon l'invention-récepteur p75 : Tests de liaison de la RVG ou du peptide selon l'invention
5.a. Méthode à la β-galactosidase
Des cellules COS-7 transfectées ont été traitées avec 10 μg de RVG purifié dans 1,5 ml de milieu DMEM contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) pendant 2 heures à température ambiante. Les cellules sont lavées 3 fois et fixées à l'aide de 4 % de para- formaldéhyde froid. Les cellules sont ensuite incubées avec des anticorps spécifiques anti-G et un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à la β-galactosidase (Southern
Biotechnology Associates), en utilisant un substrat X-Gal tel que décrit dans Tuffereau et al., (EMBOJ., 1998, 17, 7250-7259).
5.b. Méthode mettant en œuyre de la RVG ou un peptide selon l'invention radiomarqué
L'iodation de la RVG ou d'un peptide selon l'invention est réalisée par la méthode à la lactoperoxidase jusqu'à obtention d'une activité spécifique moyenne de 7,5 x 107 cpm/μg. La RVG ou le peptide selon l'invention radiomarqué est purifiée par chromatographie d'exclusion de taille en utilisant une colonne
Séphadex G25.
Pour les essais de compétition de fixation, les cellules sont mises en suspension dans des tubes Eppendorf avec 20 ng/ml de I25I-RVG (environ 30 pM, en considérant un trimère accessible à la fixation par rosette) dans du PBS contenant 1 mg/ml de sérumalbumine bovine (BSA), 1 mM de MgCl2, et 0,5 mM de CaCl2, en présence ou en l'absence de compétiteurs non radioactifs (froids). Les tubes sont ensuite soumis à une agitation douce à 4°C pendant au moins 2 heures pour favoriser la fixation, et le ligand lié est séparé du ligand libre par une centrifugation rapide des cellules dans une microcentrifugeuse Eppendorf à 4°C.
La fixation non-spécifique (bruit de fond) est déterminée par l'utilisation d'un excès de RVG non-marquée (400 fois).
5.c. Neutralisation des virus par un anticorps monoclonal anti-G ou par le récepteur soluble p75-Fc Des virus CVS [103 unités formant plage (ufp ou pfu)] sont incubés avec des liquides d'ascites (dilué au 1/100) d'anticorps 30AA5 ou avec différentes quantités de p75-Fc ou d'anticorps anti-G (de 1 à 10 μg). Lorsque cela est spécifié, 10 μg d'anticorps anti-d'IgG humaines sont ajoutés et incubés pendant 1 h à 37°C. L'efficacité de la neutralisation est mesurée par la technique des plages sur des cellules BSR : le titre viral est déterminé par des expériences de formation de plaques sur des monocouches de cellules BSR. 5.d. Immunoprécipitation de la RVG par des anticorps monoclonaux anti-G ou par le p75-Fc
Des cellules BSR (106 cellules dans des boîtes de 35 mm) sont infectées avec chaque virus (multiplicity of infection ou moi 2). 24 heures après l'infection, les cellules sont radiomarquées pendant 1 heure à 37°C avec 50 μCi de 35S-méthionine et de 35S-cystéine (Promix, Amersham) dans un milieu MEM sans méthionine ni cystéine (GIBCO). Des extraits cellulaires dans un tampon TRIS (0,05 M Tris-HCl pH 8 ; 0,15 M NaCl), supplémenté avec 1 % de CHAPS (3-[(3- cholaminopropyl)diméthyl-ammonio-l -propane sulfonate) en présence d'un mélange d'inhibiteurs de protéases (chymostatine, leupeptine, antipapaïne et pepstatine à 2 μg/ml chaque et 16 μg d'aprotinine par ml). Après incubation de 30 min dans de la glace, les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation à 12 000 g, pendant 15 min. Les extraits cellulaires sont incubés 1 heure à 4°C avec différents anticorps monoclonaux (2 μl de liquide d'ascite) ou de p75-Fc (4 μg) pré-adsorbé sur de la protéine A-Sépharose. Les immuns-complexes sont analysés par SDS-PAGE à 12 %. La RVG immunoprécipitée est détectée par autoradiographie (films Kodak Biomax). 5.e. SDS-PAGE et analyse par immunoempreinte Des échantillons de protéine sont portés à ébullition pendant 5 min dans un tampon de Laemmli. L'électrophorèse est réalisée dans un gel SDS-PAGE discontinu. Les protéines sont ensuite colorées au Bleu de Coomassie puis transférées sur des membranes de nitrocellulose (BA85, Schleicher et Schuell). Les membranes sont saturées avec 5 % de lait écrémé dans un tampon, TBS (Tris-buffer saline) contenant 0 ;05 % de Tween 20 pendant 30 min puis incubées pendant 1 heure avec un anticorps de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase (Sigma). Les immuns- complexes sont détectés après lavage dans un tampon TBS-Tween par chemilumines- cence (ECL).
5.f. ELJSΔ
Du virus de la rage (souche CVS), purifié selon les techniques classiques telles que décrites dans Gaudin et al. (Virol., 1992, 187, 627-632), a été dilué dans du tampon TD (137 M NaCl, 5 mM KC1, 0,7 mM NaHPO4, 25 mM Tris- HCl, pH 7,5), réparti dans une plaque à 96 puits (50 ng/puits dans 50 μl), puis les plaques ont été séchées une nuit à 37°C. Les plaques ont été saturées par une solution de PBS contenant 10 % (P/V) de poudre de lait écrémé. Des dilutions sériées de la protéine p75-Fc purifiée ou d'une IgG humaine (JACKSON) ont été ajoutées (50 μl/puits) puis la plaque a été incubée 2 h à 37°C dans un incubateur humide. Les plaques ont été ensuite rincées trois fois avec du tampon PBS contenant 1 % de poudre de lait écrémé. Un anticorps anti-IgG humaine couplé à la phosphatase alcaline (SIGMA), dilué au 1/1000 dans le même tampon a été ajouté dans chaque puits (50 μl) et la plaque a été incubée 1 h à 37°C. Les plaques ont ensuite été rincées trois fois avec du tampon PBS, puis une solution de p-nitrophényl-phosphate (1,33 mM dans 1 M Tris HC1, pH 8) a été ajoutée dans chaque puits (200 μl) et la densité optique a été mesurée à 405 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre (Mini Reader, DYNATECH).
5. g. Fixation des cellules Sf 21 exprimant le récepteur P75 aux cellules BSR infectées par le virus de la rage
Des essais de fixation entre des cellules BSR infectées par différents mutants et des cellules d'insectes (Sf21) infectées par un baculovirus recombinant et exprimant le p75NTR à leur surface (p75-Sf21) ont déjà été décrits (Tuffereau C. et al., J. Gen. Virol, 2001, 82, 2861-2867).
Brièvement, une suspension de cellules p75-Sf21 radiomarquées est ajoutée à une monocouche de cellules BSR infectées par différents mutants (moi de 2 pour 30 h) et incubées pour 30 minutes à température ambiante.
Les cellules p75-Sfil non fixées sont éliminées par trois lavages au PBS et la fixation spécifique est mesurée par comptage de la radioactivité associée aux cellules BSR infectées.
Parallèlement, l'expression de RVG à la surface des cellules BSR infectées par le virus de la rage est déterminée par une immunoprécipitation de surface en utilisant des anticorps anti-G (30AA5 et 21H8) selon la technique décrite dans Tuffereau C. et al., (J. Gen. Virol, 2001, 82 : 2861-2867). 6) Sélection de mutants RVG (mutants srr)
Des clones de virus CVS (106 pfu) sont incubés avec 5 μg de p75- Fc, pendant 1 heure à 37°C, puis avec 10 μg d'IgG anti-humaines pendant 1 heure à 37°C. Le virus non-neutralisé est étalé sur une monocouche de cellules BSR dans des plaques de 24 puits. Après 3 heures à 37°C, les cellules surnageantes sont collectées et soumises à un nouveau cycle de neutralisation-amplification. Chaque clone est amplifié trois ou quatre fois, en présence de p75-Fc et d'IgG anti-humaines et les plaques testées pour la sélection de variants. Les plaques sont prélevées, amplifiées dans des cellules BSR et chaque variant est soumis à un test de neutralisation utilisant du p75-Fc et des IgG anti-humaines. Seuls les variants présentant une résistance à la neutralisation par p75-Fc supérieure à 90 % ont été de nouveau amplifiés et caractérisés. L'ARN total est extrait des cellules BSR infectées à l'aide du kit
RNAgents® total RNA (Promega).
L'ADN complémentaire (ADNc) du gène RVG est obtenu par la technique de RT-PCR : d'abord avec de la transcriptase inverse d'AMV (Promega) puis ensuite avec de la Taq polymerase (Promega) en utilisant des amorces spécifiques du gène RVG. Le fragment d'ADNc est alors purifié et séquence en utilisant un kit de séquençage à la T7 (T7-sequencing kit, Amersham). 7) Expériences d 'impulsion-chasse
Les expériences sont réalisées comme décrit dans Gaudin et al. (Gaudin étal., J. Virol., 1997, 71, 3742-3750). Des monocouches de cellules BSR sont infectées par du virus CSV ou des mutants srr à une moi de 5. Après 24 heures, les cellules sont préincubées dans un milieu sans méthionine ni cystéine pendant 1 heure. Les cellules sont ensuite marquées avec 100 μCi de 35-S-méthionine et 35S-cystéine (Promix, Amersham), pendant 3 min. Un milieu préchauffé contenant un excès de méthionine et de cystéine non marquées est ajouté pour des périodes de chasse. Les cellules sont lysées et la RVG est immunoprécipitée, comme indiqué en 5.d. EXEMPLE 2: Expression d'une forme soluble du récepteur p75
La forme soluble du récepteur p75 est obtenue conformément à l'exemple 1.3).
Les résultats de l'analyse du surnageant cellulaire présentés à la figure IB montrent la présence d'une protéine reconnue par des anticorps anti-p75, qui possède un poids moléculaire apparent d'environ 97,4 kD, correspondant à celui attendu pour une protéine de fusion p75-Fc. La protéine p75-Fc est également reconnue par un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope conformationnel de la p75 (anticorps ME20.4 reconnaissant les domaines riches en cystéine (CRDs 3 et 4) et par un sérum polyclonal anti-IgG humaine. La p75-Fc a été purifiée sur une colonne de protéine A-Sepharose avec un rendement de 5 μg/ml. L'analyse en SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie, de la protéine purifiée montre que la protéine p75-Fc obtenue est pure à 90 % (figure 1C).
EXEMPLE 3 : Analyse de l'interaction entre la protéine soluble p75-Fc et le virus de la rage (Tests ELISA et de neutralisation)
- Analyse en ELISA
La liaison du récepteur soluble avec le virus de la rage a été analysée en ELISA, selon le protocole décrit à l'exemple 1.5.f.
Un test ELISA a été utilisé pour étudier la fixation du récepteur soluble au virus de la rage.
Une boîte est ensemencée avec du virus de la rage (lignée CVS) et incubée avec différentes quantités de p75-Fc ou d'immunoglobulines G humaines.
Une expérience représentative est présentée à la figure 2A. La p75- Fc se fixe au virus de manière concentration-dépendante, avec un Kd estimé de 400 nM. Les immunoglobulines G humaines ne se fixent pas au virus de la rage dans les mêmes conditions. L'interaction spécifique entre la forme soluble du récepteur p75 et le virus de la rage indique qu'aucun cofacteur n'est requis pour cette interaction. Ceci est en accord avec la capacité de la p75-Fc à co-précipiter avec la RVG solubilisée à partir du virus par des détergents sous forme de monomères ou de trimères. - Neutralisation du pouvoir infectieux du virus de la rage
La capacité de la protéine soluble p75-Fc à neutraliser le pouvoir infectieux du virus de la rage a été étudiée, conformément au protocole décrit à l'exemple 1.5.c.
Les titres ne diminuent pas en présence de p75-Fc jusqu'à 20 μg et sont brutalement diminués de moitié en présence de concentrations plus élevées de la molécule. Bien que le test ELISA montre que la p75-Fc interagit avec le virus de la rage, elle ne neutralise pas efficacement son pouvoir infectieux (figure 2B). EXEMPLE 4 : Sélection et caractérisation des mutants Srr A. Sélection des mutants Le but est de cartographier le domaine de la RVG impliqué dans la fixation de la p75 par la sélection de mutants qui ne sont pas neutralisés par la forme soluble du récepteur. Ainsi, on a augmenté l'efficacité neutralisante de la protéine chimère p75-Fc : l'efficacité neutralisante est dépendante du nombre de molécules d'immunoglobulines fixées au virus (Flamand A. et al., Virology, 1993, 194 : 302- 313). L'hypothèse a été faite que la fixation de la p75-Fc au virus ne prévient pas l'interaction entre le virus de la rage et les cellules et dès lors l'infection.
Pour augmenter le pouvoir neutralisant du récepteur soluble p75-Fc, une étape d'incubation avec une immunoglobuline G anti-humaine spécifique de la partie Fc de la chimère a été ajoutée. Cet anticorps ne doit pas interférer avec l'interaction entre le récepteur p75-Fc et la RVG, qui se produit au niveau de la partie N-terminale du récepteur p75.
Le virus a préalablement été incubé avec une quantité allant de 1 à 10 μg de p75-Fc, puis avec 10 μg d'immunoglobuline G anti-humaine (Tableau H). Tableau II : Neutralisation du virus de la rage par la protéine soluble p75-Fc Agents neutralisants Neutralisation
Anticorps monoclonaux anti-G (30 AA5) ( 1 ) > 99,99 % Protéine ρ75-Fc seule (2) < 10 %
Protéine p75-Fc+anticorps anti-Fc humain (3) > 90 % IgG humaine seule (4)
Anticorps anti-Fc humain seule (5) < 10 %
IgG humaine + Anticorps anti-Fc humain (6) < 10 %
(1) dilution au 1/100 de liquide d'ascite de 30AA5
(2) 1 à l0 μg de p75-Fc (3) 1 à 10 μg de p75-Fc et 10 μg d'anticorps anti-Fc (4) 1 à 10 μg d'IgG humaine (5) : 10 μg d' IgG humaine et
(6) : 5 μg d' IgG humaine et 10 μg d'anticorps anti-Fc
Bien que l'anticorps anti-Fc humain seul n'affecte pas le pouvoir infectieux du virus de la rage, une neutralisation significative (> 90 %) a été obtenue quand cet anticorps est ajouté aux complexes virus/p75-Fc. Cependant, une incubation avec un anticorps neutralisant spécifique du site JJ (30AA5) aboutit à un effet neutralisant identique (> 99,99 %) et une augmentation de la concentration en anticorps n'améliore pas significativement la neutralisation.
Pour augmenter la chance de sélection d'un mutant, 10 populations clonées de CVS 3 ont été soumises à plusieurs passages, en présence de 5 μg de p75- Fc et de 10 μg d'anticorps anti-immunoglobuline G humaine. Les particules virales sont amplifiées sur des monocouches de cellules BSR qui n'expriment pas le récepteur p75NTR mais expriment d'autres récepteurs conduisant à l'infection cellulaire et à l'amplification des mutants Srr. Plusieurs populations virales se sont révélées plus résistantes à la neutralisation par la p75-Fc et les immunoglobulines G anti-humaines.
Après trois ou quatre passages en conditions neutralisantes, les populations virales clonées ont été titrées par la technique de formation de plaques en présence ou en l'absence de la p75-Fc et d'anticorps anti-Fc. Des plaques individuali- sées ont été prélevées, amplifiées et de nouveau mises en présence avec la p75-Fc et l'anticorps anti-immunoglobuline G humaine.
Au total, 14 mutants provenant de 8 clones CVS ont été isolés. Neuf ont été totalement caractérisés. Le gène complet de la glycoprotéine a été séquence pour quatre d'entre eux et des séquences partielles ont été obtenues pour les autres (Tableau JO). Tableau III : Caractérisation des variants résistants à la neutralisation par la protéine p75-Fc
Nom du Virus Phénotype des AA n° Nature de la Codon mutant plaques substitution
2-4 CVS clone 2 Petit 352 H→R CAT→CGT
4-1 CVS clone 4 Petit 352 H→R CAT→CGT
5-4 CVS clone 5 Grand 318 F→V TTC→GTC
6-5 CVS clone 6 Petit 318 F→S TTC→TCC
7-5 CVS clone 7 Grand 352 H→Y CAT→TAT
8-2 CVS clone 8 Grand 318 F→V TTC→GTC
8-4 318 F→V TTC→GTC
9-1 CVS clone 9 Petit 352 H→R CAT→CGT
10-5 CVS clone 10 Petit 318 F→S TTC→TCC
Comme supposé, en fonction de la procédure de sélection, les deux mutants issus du même clone (n°8) contiennent la même mutation. Aucun mutant n'a été isolé de deux des clones (n°l et 3), alors qu'un (clone 3) est devenu globalement résistant à la neutralisation.
Le clone 1 était encore neutralisé par la p75-Fc + l'anticorps anti- immunoglobuline G humaine, même après quatre passages en présence de ces molé- cules.
Seules quatre substitutions différentes ont été identifiées sur les huit mutants indépendants. Deux ont été localisées à la position 318 de la glycoprotéine virale (F318V et F318S) à proximité du site de N-glycosylation et deux ont été localisées à la position 352 (H352R et H352Y). Les mutants F318S et H352R conduisent à la formation de petites plaques sur des cellules BSR. Les deux autres mutants donnent des plaques de plus grandes tailles (Tableau ). B. Caractérisation des mutants srr
1. Interaction avec un anticorps anti-G
Aucune mutation n'a été antérieurement décrite aux positions 318 et 352. L'interaction entre les mutants et les anticorps anti-G dirigés contre le site II (30AA5, 40DC2), le site UI (50AD1, 41BC2), le site a (9B4), l'épitope linéaire (17D2) et l'anticorps spécifique de la conformation liée aux conditions acides (21H8) a été étudiée.
Cinq de ces anticorps sont neutralisants et neutralisent les mutants Srr (Tableau IV). Tableau IV : Interaction des mutants srr avec les anticorps monoclonaux anti-G
21H8a Site ïïabc Site ffl Site m Site aac Site P75-Fcac
30AA5- 41BC2ac 50ADlbc 9B4 linéaire8
40DC2 17D2
CVS + + + + + + +
F318V + + + + + + -
F318S + + + + + + -
H352Y + + + + + + -
H352R + + + + + + -
: caractérisation par imunoprécipitation : caractérisation par immunofluorescence c : caractérisation par neutralisation.
La RVG de différents mutants Srr est immunoprécipitée par tous les anticorps testés, mais pas par la p75-Fc, alors que la glycoprotéine CVS est immunoprécipitée par tous les anticorps et par la p75-Fc (Fig. 3 A). Comme l'anticorps 50AD1 (spécifique du site UT) est une immunoglobuline M et ne peut pas être suivie par immunoprécipitation, sa fixation aux mutants du virus de la rage a été suivie par immunofluorescence. Cette fixation a été trouvée normale (Fig. 3B). Pour réaliser l'immunofluorescence, les cellules BSR infectées par la souche CVS ou les mutants srr depuis 18 heures, sont incubées avec l'anticorps 50AD1 (dilution 100 dans un tampon EPT, pH 7,4 : NaCl 150 mM, Na2HPO4 7,4 mM, KH2PO4 2,4 mM : ) pendant deux heures, puis lavées et fixées par traitement en présence de paraformaldéhyde 4 % dans l'EPT pendant 15 minutes, lavées et incubées avec l'anticorps secondaire conjugué FITC (Pierce) dilué 100 fois dans e tampon EPT pendant 1 heure à l'obscurité. Les cellules sont observées avec un microscope à fluorescence Olympus B40. Ces résultats suggèrent que les mutations 318 et 352 sont localisées à l'extérieur du site antigénique préalablement caractérisé (Tableau HJ).
2. Interaction avec le p75NTR fixé à la membrane
La fixation des glycoprotéines de mutants Srr à la forme fixée à la membrane du p75NTR a été étudiée. II a été démontré que la fixation entre des cellules BSR infectées par le virus de la rage et des cellules Sf21 infectées par un virus recombinant et exprimant la p75-Fc à leur surface (p75-Sf21) est spécifique (Tuffereau C. et al., J. Gen. Virol, 2001, 82 : 2861-2867).
L'expression de la forme mutée de la RVG de srr a été suivie par immunoprécipitation avec deux anticorps anti-G (Fig. 4A). Les cellules infectées par les mutants F318V et H342Y expriment deux fois plus de glycoprotéines que les cellules infectées par le CVS, alors qu'une quantité identique de protéines a été détectée dans les cellules infectées par les mutants F318S et H352R. Aucune cellule p75- Sf21 radiomarquée ne se fixe à la monocouche cellulaire ayant été infectée avec n'importe lequel des mutants Srr quand bien même ils contiennent une quantité normale de la glycoprotéine à leur surface. A l'inverse on détecte une fixation très importante quand la monocouche a été infectée avec du CVS (Fig. 4B).
Les substitutions des acides aminés 318 ou 352 abolissent l'interaction avec le p75NTR qu'elle soit sous forme soluble ou sous la forme d'un récepteur fixé à la membrane.
3. Repliement de la RVG des mutants Srr :
Les profils de migration des glycoprotéines des mutants F318V et H352 sont modifiés (Fig. 3A et 4A). La RVG migre comme un doublet chez le CVS (2/3 des molécules portant deux chaînes sucrées et 1/3 des molécules portant une seule chaîne sucrée), alors que les glycoprotéines de Srr migrent comme un triplet. Ces différences corrèlent avec le phénotype des plaques : F318V et H352R produisant des plaques plus petites que CVS. Cela suggère que le transport/repliement de la glycoprotéine puisse être affecté dans ces mutants.
Des expériences d'impulsion-chasse (Gaudin Y., J. Virol, 1997, 71, 3742-3750) ont été utilisées pour comparer la maturation de la RVG chez les mutants Srr (F318S et H352R) et chez le CVS. Immédiatement après l'impulsion une RVG de CVS néo-synthétisée, immunoprécipitée par l'anticorps 17D2, migre comme un doublet : une bande correspondant à l'addition d'une chaîne sucrée à haute teneur en mannose et une correspondant à l'addition de deux chaînes sucrées. L'addition des sucres complexes dans l'appareil de Golgi augmente le poids moléculaire se traduisant par la présence de bandes additionnelles de haut poids moléculaire et par une diminution/disparition des bandes plus petites.
Aucune différence majeure n'est observée entre le CVS et les mutants après 20 minutes de chasse. Les bandes les plus larges apparaissent plus lentement chez les mutants que chez le CVS.
La glycoprotéine immature (la bande la plus petite) est encore présente après 120 minutes de chasse chez les mutants Srr (F318S et H352R). EXEMPLE 5 : Quantification de l'affinité de liaison RVG-récepteur p75 La RVG est radiomarquée ( I-RVG), de manière à obtenir une activité spécifique de 7,5.104 cpm/ng, à l'aide de la méthode à la Iactoperoxydase (voir exemple 1.5.b).
Sa liaison aux cellules PC12 est mesurée en présence d'un excès de RVG froide, de NGF ou de VSVG. Des expériences comparatives sont effectuées en parallèle avec du
NGF froid.
Les deux ligands se lient aux cellules P12 (figure 6A) ; la protéine contrôle VSVG ne déplace aucun des deux ligands. On observe qu'un excès de NGF froid n'entre pas en compétition dans la liaison de I'125I-RVG ; un excès de RVG froid ne déplace pas l'125I-NGF. Des résultats similaires sont obtenus avec des cellules
PC 12 qui expriment le récepteur p75 mais pas trk. Ces résultats illustrent la spécificité de la liaison de RVG pour le récepteur p75.
La liaison de RVG aux cellules PC 12 présente une haute affinité, avec un Kd de 35+5 pM (figure 6B). EXEMPLE 6 : Mise en évidence du site de liaison du récepteur p75
Différents mutants p75 ont été construits pour mettre en évidence le site de liaison. Pour maintenir un repliement correct des mutants, l'intégrité de chaque CRD est préservée.
Les mutants contiennent 1, 2 ou 3 CRD connectés via un linker O- glycosylé aux domaines TM et cytoplasmique du l'hp75.
Des cellules COS-7 sont transfectées avec différents plasmides et l'expression des mutants est analysée par Western-blot avec un anticorps anti-domaine cytoplasmique de p75.
Les différents mutants migrent sur un gel SDS-PAGE, conformé- ment à leur poids moléculaire.
Dans le cas du mutant CRDl, la protéine migre en tant que doublet. L'expression à la surface cellulaire de tous les mutants a été confirmée par immunofluorescence, bien qu'à des taux différents.
RVG se lie à tous les mutants, à l'exception de celui dans lequel CRDl est délété.
Par ailleurs, seul CRDl est nécessaire pour obtenir une liaison de RVG.
L'analyse des différents mutants montre notamment que la glutamine en position 33 est nécessaire pour la liaison à RVG ; en effet, la mutation Q33E abolit complètement la liaison à RVG, alors qu'une mutation en position 32 (N32Q) n'a pas d'effet sur la liaison (figure 7 et figures 8A et 8B). EXEMPLE 7 : Expression de formes solubles de la glycoprotéine du virus de la rage à l'aide de baculovirus recombinants.
1 -Obtention des baculovirus recombinants a) Construction des plasmides : Al) dans le vecteu pAcYMl
Dans un premier temps, des plasmides recombinants chez lesquels la séquence du peptide signal est celle de la glycoprotéine G virale ont été construits. Les plasmides recombinants ont été obtenus dans le vecteur d'expression pAcYMl (Matsura et al., J. Gen,. Virol., 1987, 68, 1233-1250). G-(PV)1- 39 : La séquence du gène de la glycoprotéine (comprenant les 19 acides aminés du peptide signal et les 439 de la forme mature de la protéine G de la souche PV) a été amplifiée par RT- PCR avec le couple d'amorces (x2 et y3) et en utilisant les messagers du gène de la glycoprotéine G de la souche PV comme matrice. G-(CVS)ι-43 : La séquence du gène de la glycoprotéine (comprenant les 19 acides aminés du peptide signal et les 439 de la forme mature de la protéine G de la souche CVS) a été amplifiée par RT- PCR avec le couple d'amorces (CA1 et y3) et en utilisant un plasmide contenant le gène entier de la glycoprotéine de la souche CVS dans le vecteur pcDNAl (Invitrogen) comme matrice. G-(CVS)ι- 32 : La séquence du gène de la glycoprotéine (comprenant les 19 acides aminés du peptide signal et les 432 de la forme mature de la protéine G de la souche CVS) a été amplifiée par RT- PCR avec le couple d'amorces (CA1 et CB13) et en utilisant un plasmide contenant le gène entier de la glycoprotéine de la souche CVS dans le vecteur pcDNAl (Invitrogen) comme matrice. A2) Dans le vecteur pVT-Bac
Dans un deuxième temps, le peptide signal de la glycoprotéine G du virus de la rage a été remplacé par celui de la mellitine ; la séquence (comprenant les acides aminés 1 à 439 de la forme mature de la glycoprotéine G du virus de la rage) a été clonée dans le vecteur d'expression pVT-Bac (Tessier et al., 1991, Gène, 98, 177- 183) derrière le peptide signal de la mellitine. Trois constructions ont été réalisées (Figure 9). 1. Pour la construction A, une séquence de 6 histidines a été ajoutée à l'extrémité C-terminale. La protéine contient 445 acides aminés. La séquence nucléotidique codant pour la glycoprotéine G a été amplifiée par PCR avec le couple d'amorces (x8 et y7) en utilisant le plasmide pcDNAl Gwt (Gaudin et al, 1999 ; J. Gen. Virol. 80, 1647-1656) contenant le gène entier de la glycoprotéine G de la souche PV dans le vecteur pcDNAl (Invitrogen) comme matrice.
Les expériences réalisées avec la protéine G-(PV)1-439 ont montré que le degré d'oligomérisation de la glycoprotéine G dépendait de sa concentration. A haute concentration elle était sous forme de trimères et à basse concentration elle était sous forme de monomères. Or le trimère de glycoprotéine G a une affinité beaucoup plus forte pour p75 que le monomère. Afin de stabiliser le trimère, un motif de trimérisation à l'extrémité C-terminale de l'ectodomaine, a été ajouté. Ce motif (appelé foldon, SEQ JX) NO : ) provient de la fibritine du bactériophage T4. Il a été montré que ce motif était responsable de la trimérisation de la fibritine (Letarov et al., 1999, Biochemistry 64, 817-823, Tao et al., 1997, Structurel 5, 789-798) mais était également capable d'induire la trimérisation de protéines recombinantes [fibre d'adénovirus (Krasnikh et al., 2001, J. Virol 75, 4176-4183 ; gpl20 HIV (Yang et al, 2002, J. Virol. 76, 4634-4642) quand il était fusionné avec celles-ci.
Le plasmide pT412wl3 est dérivé du plasmide pGEM-T (Promega) par insertion des gènes gènes 12, wac (fibritine) et 13 du bactériophage T4 ; ce plasmide a été fourni aux Inventeurs par Andrey Letarov.
2. Pour la construction B, une séquence contenant le motif de trimérisation de 27 acides aminés de la fibritine du phage T4 suivi de 6 Histidines a été ajoutée à l'extrémité C-terminale. Deux acides aminés supplémentaires (Isoleucine et Leucine) apportés par le site de clonage BamHI existent entre la séquence codant la glycoprotéine G et celle de la fibritine. La protéine contient 464 acides aminés. La séquence nucléotidique de G a été amplifiée par PCR avec le couple d'amorces (CA18 et CB18) en utilisant un plasmide contenant le gène entier de la glycoprotéine de la souche CVS dans le vecteur pcDNAl (Invitrogen). La séquence du motif de triméri- sation (foldon, SEQ ID NO :) de la fibritine a été amplifiée par PCR à l'aide d'un couple d'amorces (FA2-et FBI) en utilisant le plasmide pT412wl3 comme matrice. Les deux produits d'amplification ont été clones en fusion dans le vecteur pVT-Bac.
3. Pour la construction C, une séquence de 8 glycines a été introduite entre la séquence codant pour la glycoprotéine G et le motif de trimérisation de la fibritine. Deux acides aminés supplémentaires (Leucine et Glutamine) apportés par le site de clonage (Pstl) existent entre la séquence codant la glycoprotéine G et les 8 glycines. La protéine contient 472 acides aminés. La séquence nucléotidique de G a été amplifiée par PCR avec le couple d'amorces (x8 et CB19) en utilisant le plasmide pcDNAl Gwt (Gaudin et al, 1999) comme matrice. La séquence du motif de trimérisa- tion de la fibritine précédée des 8 glycines a été amplifiée par PCR à l'aide d'un couple d'amorces (F A3 et FBI) en utilisant le plasmide pT412wl3 comme matrice. Les deux produits d'amplification ont été clones en fusion dans le vecteur pVT-Bac. b) Obtention des baculovirus recombinants Des recombinants baculovirus ont été obtenus pour chaque plasmide après co-transfection de cellules de lépidoptères SF21 avec le baculovirus lac Z linéarisé et les plasmides A, B ou C comme décrit précédemment (Tuffereau et al., 1998, J Virol 72, 1085-1091). Des stocks viraux de chacun des recombinants ont été obtenus et dosés en cellules Sf21. 2- Production des protéines recombinantes Des mono-couches de cellules Sf21 ont été infectées à une multiplicité d'infection de 3 par les différents baculovirus recombinants. Après 1 heure d'adsorption à température ambiante, 10 ml de Milieu TC100 + 2 % S VF est ajouté et les cellules sont incubées à 28°C pendant 3 jours. Trois jours post-infection, les cellules et le milieu sont récupérés, centrifugés (2 000 rpm, 10 min, Beckman J6) pour éliminer les cellules et les débris cellulaires.
Les protéines contenues dans le surnageant sont ensuite directement analysées en conditions réductrices par électrophorèse en gel de poly-acrylamide (10%). Après migration, les protéines sont transférées sur une membrane de nitro- cellulose et les glycoprotéines recombinantes sont révélées par Western blot à l'aide d'un anticorps anti-glycoprotéine G (17D2). La figure 10 illustre la production des 3 différentes protéines recombinantes (A, B et C). Comme attendu, leur migration en gel est en accord avec leur poids moléculaire. C est la molécule la plus lourde et migre donc moins vite dans le gel que B et A. D'autre part, on peut remarquer que la quantité de protéine produite n'est pas équivalente. La protéine recombinante A est produite en beaucoup plus grande quantité que les protéines B et C. 3- Purification des protéines recombinantes sur colonne d'immuno-affinité. a) Préparation de la colonne d'immuno affinité
L'anticorps monoclonal anti-glycoprotéine 21H8 est une IgGl. Elle a été purifiée sur protéine G-Sépharose (Sigma) puis couplée de façon covalente à de l'agarose activée (AminoLink Plus® Immobilization Kit, Pierce) selon le protocole fourni. L'efficacité du couplage est supérieure à 90%. b) Purification de la glycoprotéine G recombinante
La mise au point de la purification a été réalisée avec la protéine recombinante soluble G-(PV)1-439 et peut être appliquée aux autres protéines recombinantes car elles sont également reconnues par l'anticorps 21H8.
Le surnageant des cellules d'insectes contenant la glycoprotéine soluble est dialysée contre du tampon phosphate pendant quelques heures, puis incubée avec 2 ml d'agarose couplé à l'anticorps 21H8 pendant une nuit à 4° C. L'agarose est ensuite transférée dans une colonne. Un lavage avec 10 ml de tampon Tris-HCl 100 mM pH 8 puis un autre avec 10 ml de tampon Tris-HCl 10 mM pH 8 sont réalisés ; la glycoprotéine est éluée à pH acide (100 mM glycine, pH 3) et neutralisé par addition de 100 mM de Tris-HCl pH 8. Alternativement, après lavages de la colonne avec du tampon phosphate 10 mM pH 8, elle peut-être éluée à pH basique (diéthylamine, pH 11,5) et neutralisée par addition de tampon Phosphate IM, pH 6,8. Les glycoprotéines recombinantes purifiées sont ensuite dialysées contre du tampon phosphate pH 7,5 et dosées par la méthode de Lowry.
Après purification, les glycoprotéines G solubles interagissent toujours avec p75. 4- Interaction des glycoprotéines G recombinantes solubles avec p75.
Des cellules COS7 transfectées par le plasmide hp75 et exprimant p75 à leur surface ont été incubées soit avec le surnageant des cellules d'insecte infectées par les baculovirus recombinants et contenant les glycoprotéines G solubles, soit avec la protéine G-(PV)1- 39 purifiée. La fixation des glycoprotéines a été mise en évidence en utilisant le test de coloration à la β-galactosidase comme décrit dans le paragraphe.
Les différentes protéines recombinantes sont capables d'interagir avec p75 et la purification par colonne d'immunoaffinité n'altère pas les propriétés d' interaction avec p75.
5- Oligomérisation des protéines (analyse par sédimentation à l'équilibre en gradient de saccharose)
Des gradients de 12 ml de saccharose 5 à 20 % (poids/volume), préparés dans du tampon TD ont été coulés. 400 μL de surnageant contenant les protéines recombinantes ont été déposés à la surface du gradient. Après 16 heures de centrifugation à 32 000 rpm (Rotor SW41, Beckman, 4°C), les gradients sont récoltés en fraction de 1 ml (la fraction 1 correspondant au fond du gradient et la fraction 12 au haut du gradient). Un aliquot de chaque fraction est analysé par PAGE comme décrit précédemment. La présence de G est révélée par immunoblot à l'aide de l'anticorps anti-G 17D2.
La figure 11 illustre les résultats obtenus :
Bien que la forme soluble A soit produite en beaucoup plus grande quantité que la forme C, sa migration en gradient est celle d'un monomère alors que celle de C correspond à un trimère. La forme B, produite en très faible quantité, a un comportement intermédiaire suggérant que les trimères formés ne sont pas très stables et se dissocient comme l'indique leur sédimentation à une position intermédiaire entre le monomère et le trimère.
Ces résultats montrent que la présence de la fibritine à l'extrémité C- terminale de la protéine chimère permet de stabiliser le trimère. Cette stabilisation est plus efficace si un linker de 8 glycines sépare le motif de la fibritine de l'ectodomaine de la glycoprotéine G. EXEMPLE 8 : Expression d'un sous-domaine de la glycoprotéine en bactéries.
Clonage :
La séquence nucléotidique correspondant aux acides aminés 291 à 391 de la glycoprotéine de la souche PV a été clonée dans le vecteur d'expression pET22 b(+) (Novagen).
Les constructions G2 1.391 et G2 1-391-H6 ont été obtenues par amplification par PCR avec les couples d'amorces respectifs (x9 et y8) et (x9 et y9) et en utilisant le plasmide pcDNAl Gwt (Gaudin et al, 1999) comme matrice.
Expression des polypeptides :
Des essais de production après induction par 1 mM d'IPTG dans les bactéries BL21 ont été réalisés selon le protocole fourni (Novagen). Après induction, le polypeptide est synthétisé (en faible quantité) et reconnu par un anti-sérum poly- clonal anti-G.
Glycoprotéines solubles exprimées en baculovirus
Figure imgf000037_0001
Polypeptides exprimés en bactéries
Figure imgf000037_0002
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en œuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'être décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Peptide capable de se lier spécifiquement au récepteur p75NTR, caractérisé en ce qu'il comprend entre 35 et 101 acides aminés et inclut au moins le fragment correspondant aux positions 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage.
2°) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage.
3°) Peptide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il est cons- titué par la séquence SEQ ID NO: 1 suivante :
FNKTX1MEADAHYX2X3X4X5X6WX7EX8LPSX9X10CLX1ιX12GX13RCH, dans laquelle : X] représente L ou I, X2 représente K, T ou N, X3 représente S ou P, X4 représente V ou I, X5 représente R, Q, M, L, I, S, K, G ou E, X6 représente T ou E, X7 représente N, I, T ou E, X8 représente I ou L, X9 représente K, T ou N, X10 représente G ou E,Xπ : R ou E, X12 : A ou V et X13 représente G ou E.
4°) Peptide selon la revendication 2 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence SEQ ID NO:2 :
FNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCH.
5°) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il corres- pond aux positions 291-391 de la glycoprotéine G du virus de la rage et présente la séquence SEQ ID NO: 31 suivante :
MTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTΓFNKTX1MEADAHYX2X3X4X5X6WX7E X8LPSX9X10CLX11X12GX13RCHPY1VNGVFFNGY2ΓLGY3DY4Y5VLΓPEMQSSLL, dans laquelle : Yj représente H ou P, Y2 représente I ou L, Y3 représente P ou S, Y représente G ou D et Y représente N ou H.
6°) Peptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est constitué par la séquence SEQ JD NO: 32. MTTKSVSFPvRLSHLRKLVPGFGKAYTlENiσi ^ LR GOΛCHPHVΝGVFFΝGIJLGPDGΝVLIPEMQSSLL. 7°) Peptide chimère, caractérisé en ce qu'il comprend, à son extrémité N-terminale, un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, et à son extrémité C-terminale, un motif de trimérisation.
8°) Peptide chimère selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre, entre l'extrémité C-terminale dudit peptide et l'extrémité N- terminale dudit motif de trimérisation, un fragment de liaison comprenant entre 1 et 10 aminoacides.
9°) Peptide chimère selon la revendication 7 ou la revendication 8, caractérisé en ce que ledit fragment de liaison comprend au moins 8 glycines. 10°) Protéine chimère, caractérisée en ce qu'elle comprend à son extrémité N-terminale, l'ectodomaine de la glycoprotéine G du virus de la rage correspondant aux positions 1-432 ou aux positions 1-439 de ladite glycoprotéine G, et à son extrémité C-terminale, un motif de trimérisation.
11°) Protéine chimère selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre, entre l'extrémité C-terminale dudit ectodomaine de la glycoprotéine G du virus de la rage et l'extrémité N-terminale du motif de trimérisation, un fragment de liaison comprenant entre 1 et 10 aminoacides.
12°) Protéine chimère selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit fragment de liaison comprend au moins 8 glycines. 13°) Peptide chimère selon l'une quelconque des revendications 7 à
9 ou protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisée en ce que ledit motif de trimérisation correspond au domaine de 27 acides aminés provenant de la fibritine du bactériophage T4.
14°) Peptide chimère selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou protéine chimère selon la revendication 13, caractérisée en ce que ledit motif de trimérisation est constitué par la séquence suivante : G-Y-I-P-E-A-P-R-D-G-Q-A-Y-V-R-K-D-G-E-W-V-F-L-S-T-F-L. (SEQ JJD NO: 16).
15°) Molécule complexe, caractérisée en ce qu'elle comprend un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou une protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, associé à une molécule d'intérêt, apte à traiter une maladie neurodegenerative. 16°) Molécule complexe selon la revendication 15, caractérisée en ce que ledit peptide ou ladite protéine chimère et ladite molécule d'intérêt sont liés de manière covalente par l'intermédiaire d'un lieur convenable.
17°) Molécule complexe selon la revendication 15 ou la revendica- tion 16, caractérisée en ce que ledit lieur comprend soit un pont S-S, soit un ester, soit un glycane.
18°) Molécule d'acide nucléique, caractérisée en ce qu'elle code pour un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou une protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 14. 19°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle présente la séquence suivante : ttc aac aaa ace R-[ atg gaa gct gat gct cac tac R2 R i R5 R^ tgg R7 gag R8 atc ecc tca R9 R10 tgt ctg Rπ R12 gga Rn agg tgt cat, dans laquelle : R\ représente un codon L ou un codon I, R2 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R3 représente un codon S ou un codon P, R4 représente un codon V ou un codon I, R5 représente un codon R, un codon, Q, un codon M, un codon L, un codon I, un codon S, un codon K, un codon G ou un codon E, Rf, représente un codon T ou un codon E, R représente un codon N, un codon I, un codon T ou un codon E, R8 représente un codon I ou un codon L, R9 représente un codon K, un codon T ou un codon N, R1 représente un codon G ou un codon E, Rπ représente un codon R ou un codon E, R12 représente un codon A ou un codon V et R13 représente un codon G ou un codon E.
20°) Molécule d'acide nucléique selon la revendication 18 ou la revendication 19, caractérisée en ce qu'elle est correspond à la séquence SEQ ID NO: 3 suivante : ttc aac aaa ace ctg atg gaa gct gat gct cac tac aag tca gtc cgg ace tgg aat gag atc atc ecc tca aag ggg tgt ctg aga gtt gga ggg agg tgt cat.
21°) Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il inclut une molécule d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 18 à 20.
22°) Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle inclut un vecteur selon la revendication 21. 23°) Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend essentiellement (i) un produit sélectionné dans le groupe constitué par une molécule complexe selon l'une quelconque des revendications 15 à 17, une molécule d'acide nucléique nue selon l'une quelconque des revendications 18 à 20 ou un vecteur selon la revendication 21, ladite molécule d'acide nucléique ou ledit vecteur étant associés à une molécule d'intérêt et (ii) au moins un véhicule pharmaceutique- ment acceptable.
24°) Outil de criblage spécifique de molécules modulant la liaison entre la glycoprotéine G du virus de la rage et le récepteur de basse affinité des neuro- trophines (p75NTR) spécifique des cellules neuronales, caractérisé en ce qu'il comprend :
- des cellules exprimant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, un peptide chimère selon l'une quelconque des revendications 7 à 9 ou une protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 14 (élé- ment de liaison 1) ;
- des cellules exprimant le récepteur de basse affinité des neurotrophines (p75NTR), de préférence, uniquement le CRDl dudit récepteur (élément de liaison 2).
25°) Outil de criblage selon la revendication 24, caractérisé en ce que lesdites cellules exprimant un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, expriment le peptide constitué par les résidus d'acides aminés 318 à 352 de la glycoprotéine G mature du virus de la rage selon la revendication 2.
26°) Outil de criblage selon la revendication 24 ou la revendication 25, caractérisé en ce qu'au moins l'un des deux éléments de liaison est sous une forme soluble.
27°) Outil de criblage selon la revendication 26, caractérisé en ce que la forme soluble du récepteur de basse affinité des neurotrophines ^75^ ) est constituée d'au moins le fragment CRDl et au plus par l'ectodomaine du récepteur p75 fusionné à un fragment Fc d'une immunoglobuline IgGl humaine. 28°) Méthode de sélection de ligands spécifiques du récepteur p75, caractérisée en ce qu'elle comprend : - la mise en contact d'un outil de criblage selon l'une quelconque des revendications 24 à 27, dans un milieu approprié avec un ligand potentiel marqué et
- la mesure du produit marqué éventuellement lié. 29°) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, pour la préparation d'un médicament utile pour le traitement des maladies génétiques ou acquises impliquant un dysfonctionnement des cellules exprimant le récepteur p75NTR, notamment des maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson ou la maladie d'Alzheimer.
30°) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, pour la préparation d'un médicament favorisant la régénération neuronale, notamment en cas de traumatisme ou de lésion de la moelle épinière. 31°) Utilisation d'un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 ou d'une protéine chimère selon l'une quelconque des revendications 10 à 14, pour la préparation d'un médicament utile dans le traitement des cancers.
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