WO2004000863A1

WO2004000863A1 - プロドラッグ、その医薬としての使用、およびその製法

Info

Publication number: WO2004000863A1
Application number: PCT/JP2003/007868
Authority: WO
Inventors: Shinya Yamashita; Jiro Takeo; Takaaki Okita
Original assignee: Nippon Suisan Kaisha, Ltd.
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2003-12-31
Also published as: BR0312442A; US20050203061A1; KR20050027095A; AU2003244088A1; MXPA05000028A; JPWO2004000863A1; CA2490626A1; ZA200500526B; CN1671724A; EP1541579A1; NZ537686A

Abstract

　薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその酵素活性に差がある酵素を利用する、その酵素によって切断される置換基を有し、かつ置換基が切断されることにより活性化されるプロドラッグ。薬物の標的部位としては、例えば、呼吸器官が、副作用発現部位としては、例えば、心臓がそれぞれ挙げられる。薬物の例としては、気管支拡張剤が、酵素の例としては、グリコシダーゼ（例えば、β−グルクロニダーゼ）がそれぞれ挙げられる。更に、置換基は、例えば、単糖又はオリゴ糖からなるグリコシル基である。上記酵素を利用することによって、効果を発生する標的部位と副作用を発現する部位が異なるタイプの薬物の副作用を低減させることが可能となる。

Description

明細書

プロドラッグ、その医薬としての使用、およびその製法技術分野

本発明は、薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその酵素活性に差がある酵素を利用し、薬物の副作用を低減させることのできるプロドラッグに関するものである。背景技術

いわゆる糖置換基を付与したプロドラッグは数多く研究されてきた。その主な目的は、難溶性の親化合物の溶解度を向上させるためのものや、グルクロン酸抱合体の類推から無毒化をねらったものである。とくに、後者は生体の代謝機構を利用しょうとするものである。すなわち、ガン細胞や炎症細胞で j8—ダルクロニダーゼや β -ダルコシダーゼのような糖開裂酵素の活性が向上しているという報告をもとに、患部でのみ親ィヒ合物を発現させ効果を発現しながら、望ましくない副作用を軽減させるという考えに基づいて設計されたプロドラッグである。以下にそれらの詳細を説明する。

月重瘍,組織において —グ^^ク口ニダーゼをはじめいくつかのダリコシダーゼの活性が亢進している研究報告が発表されていた（Fishman, Science 105, 646- 647, 1947, Fishman and Anlyan, Cancer Res. 7, 808-814， 1947， Bollet等、 J. Clin. Invest. 38， 451, 1959)。他の疾患については、喘息患者で、肺胞マクロファージおよびマスト細胞からの β—ダルクロニダーゼ放出による肺胞洗浄液（BALF) 中の β一ダルクロニダーゼ活性が亢進する傾向が報告されていたり (Tonnel等、 Lancet 8339， 1406—1408, 1983， Murray等、 Ν· Engl. J. Med. 315， 800-804, 1986) 、また、 j3—グルクロニダーゼと N—ァセチルー D—グルコサミニダーゼ活性がリュゥマチ患者の滑液中で亢進していること（Stephens 等、 Rheumatol. 2， 393-400， 1975) 、 AIDS患者の血清中の ]3—ダルクロニダーゼ活性が健常人と比較して高いこと等が報告されており（Saha等、 Clin. Chim. Acta. 199, 311-316， 1991) 、各種の疾患時においてもグリコシダーゼの活性が亢進あるいは細胞外への放出されることが示唆されている。この中で特に注目すべき酵素である β一ダルクロニダーゼは、 /3一ダルク口二ドを加水分解して、 D—ダルクロン酸を遊離させる反応を触媒する酵素であり、肝臓、肺、脾臓、腎臓等の広範囲の臓器あるいはマクロファージ、好酸球等の炎症細胞に存在していることが幸艮告されていた（Hayashi、 J. Histochera. Cytochem. 15， 83 - 92， 1967， Conchie等、 Biochem. J. 71， 318-325， 1959) 。

癌の化学治療においては、腫瘍以外の正常組織あるいは正常細胞に対する毒性の軽減が重要な課題である。これを解決するために、腫瘍組織に特異的に作用する抗癌剤の開発が数多くなされたが、いずれも期待されたほどの副作用の軽減が見られていなかった。

De Duveは腫瘍組織におけるダリコシダーゼを含むリソソーム中の加水分解酵素に着目し、これらの加水分解酵素とそれらの酵素で加水分解されて活性化する抗癌剤のプロドラッグによる化学療法の概念を提案した（Biological

approaches to cancer chemotneraph, 101-112, Academic press, Inc. , 1961) 。 Connors and Whissonは、マウスを用いた実験で、抗癌剤ァニリンマスタードの抗癌作用と腫瘍細胞の —ダルクロニダーゼ活性に高い相関があることを示した (Nature 210 866-867, 1966)。 Sweeney らも、抗癌剤ミコフエノール酸の作用機序は、ミコフエノール酸が臓器でグルクロン酸抱合ィ匕され、腫瘍組織において —グルクロニダーゼにより加水分解されることにより活性体であるミコフエノール酸になり抗癌作用を発揮しているとする説を発表した（Cancer Res. 31， 477- 478, 1971) 。 Young らは、ミコフエノール酸の場合と同様に抗癌剤ァニリンマスタードが体内でダルク口ン酸抱合化され、 J3重瘍組織において加水分解されることにより抗癌作用を発揮するという仮説のもとに癌患者で臨床試験を行つたが、抗癌作用と腫瘍組織の酵素活性の間に十分な相関は認められなかつた（Cancer 38， 1887-1895, 1976) 。 Baba らは、マウス乳癌モデルを用い、抗癌剤 5—フルォロウラシルのダルク口ン酸誘導体を静脈内投与して抑制作用を示す報告をしている（Gann 69， 283—284， 1978)。

しかしながら、総じてこれら抗癌剤の糖誘導体プロドラッグは、標的部位での加水分解が不十分なため、臨床上では満足な結果が得られていなレ、。次に、腫瘍特異的抗体と各種酵素を結合させたものをあらかじめ投与しておき、その酵素で開裂されて活性体に変換されるプロドラッグを用いるアプローチがなされた。これは、 ADEPT (Antibody-directed enzyme prodrug therapy) と呼ばれ、数多くの研究開発が行われたが、外因性の抗体一酵素複合体が免疫抗原性を持つことやプロドラッグが生体内で十分に活性ィヒされないといった問題があり、成功には至っていない。

そこで、 Bossletら（Br. J. Cancer 65， 234-238, 1992) は、癌細胞で投与した抗癌剤一糖誘導体という構造のプロドラッグが効率的に加水分解を受けるためには、抗癌剤に直接糖を結合するのではなく、スぺーサーを介した化合物を合成することと酵素を結合させた免疫抗原性の低い融合蛋白質を発明し、上記の問題を改善しようと試みた。その過程で彼らは、ダリコシドースぺーサー誘導体単独でも十分な効果を発揮する誘導体を見出し、抗癌剤以外にも抗炎症剤、免疫抑制剤、 C a拮抗剤、交感神経作動剤等に応用できるプロドラッグとしてグリコシドースぺーサ一一ドラッグという構造を開示している（US (米国特許） 5621002 (family patent (対応特許）： EP (ヨーロッパ特許出願公開） 642799，特開平 7- 149667) , US 5935995 (family patent :EP 795334, 特開平 10- 1495)， US 5955100 (family patent :EP 595133，特開平 6- 293665) ) 。

特開平 6— 2 9 3 6 6 5には、「化合物は、健康な個人においては原則的に細胞の内側に存在するが、上述した病態生理学的条件下においては局所的な細胞外に存在する酵素によって活性ィヒされる。」、「本発明によるプロドラッグは、特に活性ィ匕状態でマク口ファージ、顆粒球おょぴ血小板が存在するすべての非一腫瘍学的疾患に対して使用することができる。活性ィ匕された状態で、上述した細胞は、主として、本発明によるプロドラッグの部位一特異的活十生ィ匕を可能にする細胞内酵素を分泌する。」、と記載されている。

また、抗腫瘍剤を活性薬剤とした場合の本引例の物質が腫瘍モデルだけでなく、数種の炎症モデルでも認められたことを根拠に腫瘍におけるのと同様に、炎症細胞が関与する疾患すべてにおいて想定できると述べている。

その例示するところは、「細胞増殖抑制剤、代鶴す拮抗剤、 D NAに介在する物質、トポイソメラーゼ Ι + Πを阻害するもの、アルキル化剤、リボソーム不活性ィ匕剤、チロシンンホスホキナーゼ阻害剤、分化誘導剤、ホルモン、ホルモンアンゴ-スト、ホルモンアンタゴニスト、細胞増殖抑制剤に対する多面発現抵抗性を変化する物質、カルモジュリン阻害剤、プロテインキナーゼ C阻害剤、 p—ダリコプロティン阻害剤、へキソキナーゼ調節剤、 p -グルタミルシスティンシンセターゼ又はグルタチオン S—トランスフェラーゼ阻害剤、スーパーォキシドジスムターゼ阻害剤、増殖一関連蛋白質阻害剤、免疫抑制作用を有する物質、免疫抑制剤、抗炎症作用を有する物質、非ステロイド性抗炎症物質、抗リウマチ性薬剤、ステロイド、抗炎症作用、鎮痛作用、解熱作用を有する物質、有機酸誘導体、鎮痛剤、局所麻酔薬、抗不整脈剤、 C aアンタゴニスト、抗ヒスタミン剤、ホスホジエステラーゼ阻害剤、副交感神経作動剤、交感神経作動剤、ヒトウ口キナーゼ阻害作用を有する物質」に及んでいる。

すなわち、本引例のプロドラッグが炎症細胞の関与するあらゆる薬物において機能する可能性があるということが示唆されているが、実際にいずれの薬剤が機能し、！/、ずれの薬剤は機能しないのかについては指標も示唆もない。

実施例には、抗癌剤であるドキソルビシン、ナイトロジェンマスタード、キニンの糖誘導体を用いた抗腫瘍作用とドキソルビシン糖誘導体の抗炎症作用ならぴに急性毒性の測定が示されるのみであり、上記のように、数多くの治療薬をあげているものの、抗癌剤以外の薬物についての具体的な薬効薬理を示す実施例は記載されておらず、実際の有効性については未確認であると思われる。例えば、ステロイドの糖誘導体については、これまで多くの研究がなされているけれども、 Sugai ら（W0⁹5/09177) が指摘しているように、その安定性に問題があることと標的器官以外での酵素的な加水分解による活性体への変換による副作用の発現という問題で開発が困難な状況にある。ドキソルビシンでさえ、長く研究されているが、欧州でいまだ前臨床段階であり臨床的な完成に至っていないのである。この他、癌以外への応用としては、先に触れたステロイドのグリコシドを用いたプロドラッグの研究が早くから副作用の軽減のために研究開発されてきた。 Merck社のグループが 1962、 1964、 1966年にステロイドのグリコシド誘導体がステロイドの副腎萎縮、体重減少、骨粗鬆症、白血球数減少等の副作用を軽減させるという可能性を示している（GB1015396, GB1059548, US3185682, Hirschmann 等、 J. Am. Chem. Soc. 86， 3903-3904, 1964) 。し力し、ステロイドのグリコシドプロドラッグは、安定性が極めて悪く、標的組織以外でグリコシド結合が開裂して副作用が発現するといつた問題点が判明し、 Sugai ら（W095/09177) は、糖の水酸基を保護することにより安定性を向上させ、副作用を軽減させることを試みた。し力しながら、これまでに臨床上の成功には至っていない。ステロイドは、非常に微量で作用を発揮でき、且つ生体内の幅広い組織での多彩な生理作用をもっため、グリコシドプロドラッグィ匕しても副作用の軽減を達成することは非常に難しい薬剤と言える。

さらに、 Friend らは、腸内細菌の保有するグリコシダーゼに着目して、潰瘍性大腸炎の治療薬として副作用が問題となるステロイドの糖誘導体という構造のプロドラッグの研究を行っている（EP 123485, (family patent :特表昭 60- 501105、 J. Med. Chem. 27, 261-266, 1984, J. Med. Chem. 28, 51-57， 1985, Pharmaceutical Res. 10, 1553-1562， 1993) 。しかしながら、これらの試みについても、現在までに臨床的な成功は示されていない。

以上のように、一ダルク口ニダーゼをはじめとする生体内の酵素を利用した薬物一糖誘導体というプロドラッグの開発は古く力ら試みられているが、臨床上の成果には結びついていないのが現状である。

患者数の多い呼吸器官疾患の一つである喘息の治療法として、現在のガイドラインでは、長時間作用型 /3 ₂作用薬と吸入ステロイドの併用治療を推奨している。気管支拡張剤である ₂作用薬の開発の歴史は、当初発見された及び j3 ₂の両方の受容体に作用する作用薬から、サルブタモールを代表とする短時間作用型の第 2世代の β ₂選択的作用薬へと進化し、サルメテ口ールを代表とする第 3 世代の長時間作用型 i3 ₂作用薬へと発展している。短時間作用型 |3 ₂作用薬は、喘息の増悪時の治療や運動誘発性気管支攣縮の予防に使用されるべき薬物である力喘息患者に対して原因がはっきり特定されていない突然死を含む、血中カリゥム濃度低下、血圧、心拍、 Q T延長等、骨格筋振戦等の様々な副作用を示す。これらの副作用は、特に、使い過ぎにより発生するものであると考えられている (Burgraff 等、 Thorax 56, 567-569， 2001， Bennett等、 Thorax 49， 771-774， 1994， Raveヽ Respir. Med. 95, 21-25, 2001) 。発明の開示

上述のように、 β ₂作用薬の心拍数増加や血圧変動といった副作用をさらに低減させた薬物の開発は、臨床上極めて重要な課題であると考えられる。一般に短時間作用型 ₂作用薬は、経口投与よりも、吸入薬として使用される場面が多い。これらは局所的投与経路にもかかわらず、上述のような副作用が散見される。本発明は、 ]3 ₂作用薬のような、効果を発生する標的部位と副作用を発現する部位が異なるタイプの薬物の副作用を低減させることを課題とする。

従来の技術の欄において説明したように先行技術はいずれも癌あるいは炎症組織等において亢進した酵素活性を利用し、活性体へ変換させるプロドラッグである。一方、本発明は、組織あるいは臓器にある酵素活性において、正常状態においても臓器間に存在する活性の差を利用するプロドラッグである。

本発明者らは、 11-ェチル -7,9-ジヒドロキシ -10，11-ジヒドロジべンゾ [b，gチェピンのグルクロン酸抱合に関する研究を行ってきた。この化合物は、経口投与後、肝臓で速やかにダルク口ン酸抱合を受け、血中では 9 9 %以上ダルク口ン酸抱合体として存在する。しかし、薬理上のターゲット組織である肺では、薬理活性を示した。研究の結果、この化合物のグルクロン酸抱合体は、肺において脱抱合されることが判明し、 j3—ダルクロニダーゼによって脱抱合された親化合物が活性を示したものと推定された。（詳細は実施例の後に参考例 1として記載した。）ただし、 i3—ダルク口ニダーゼ活 I¹生の局在に関する各臓器あるいは細胞レベルにおける詳細な研究報告はなかった。そこで、気管支における ]3—ダルク口ニダ一ゼの局在を確認したところ、図 1に示すように細気管支の上皮細胞に局在していることを見出した（図 1の黒く染まって見えるのが /3—ダルクロニダーゼである）。（試験法の詳細は実施例の後に参考例 2として記載した。）このように特定の部位に β一ダルクロニダーゼ活性が局在することを見出したことが本発明の基礎となっている。

さらに、 —ダルクロニダーゼが、生体中のどのような臓器に多く含まれるかについて調査した。特に、 j3 ₂作用薬の心臓、血圧への副作用の軽減を考慮した場合、各種臓器の中で肺と心臓における β—ダルクロニダーゼ活性を調べることが ₂作用薬のダルク口二ドプロドラッグイ匕において極めて重要であると考え、モルモットの各臓器における β一ダルク口-ダーゼ活性を測定した。この場合に、実際の喘息状態を想定して、喘息の動物モデルを用いることで喘息状態の時における j8—ダルクロニダーゼ活性の比較も行った。すなわち、抗原で感作したモルモットと非感作モルモット、さらに抗原感作モルモットを抗原刺激により発作を惹起したときの各臓器の β一ダルク口-ダーゼ活性を比較した。その結果を図 2 に示す。（試験法の詳細は実施例の後に参考例 3として記載した。）

図 2の肺の結果から明らかなように炎症状態により亢進する酵素活性はごくわずかであり、正常時から存在している酵素活性が組織毎に大きく異なることがわ力、る。また、 /3 ₂作用薬の副作用発現部位である心臓においては酵素活性が低いことが確認された。さらに、心臓における j8—グルクロニダ一ゼの局在の有無を確認したところ、図 3に示すように全く、 —ダルク口ニダーゼの活性を示す陽性像が認められなかった（図 3の矢印で示した黒い部分は、へマトキシリンによる細胞の核染色像を示す）。（試験法の詳細は実施例の後に参考例 4として記載した。 )

培養上皮細胞では、構成的（constitutive) に ]3—ダルク口ニダーゼを培地中に放出することが報告されている（Scaggiante等， Exp. Cell Res. 195， 194 - 198, 1991) 。同様に培養ヒト肺マクロファージも構成的に ]3—グルクロニダーゼを培地中に放出することが報告されている（Triggiani 等， The J. Immunol. 164, 4908-4915, 2000) 。従って、 j3—グルクロニダーゼが細胞外でその活性を発現するためには、必ずしも、炎症や細胞損傷による放出が必要であるわけではなく、袓織の局所においてどれだけ高濃度に β一ダルク口ニダーゼが存在しているかにかかると思われる。このような観点から細胞組織学的に考察すると、肺の細気管支上皮細胞周辺の ]3—ダルクロニダーゼは、驚くべき局所活性を有する場といえる。

本発明者らは、上記の知見を基に i3 ₂作用薬を予めグルクロン酸抱合した化合物を合成し、本グルクロン酸抱合体を吸入せしめることによって、肺の細気管支部分に多く存在する )3—ダルクロニダーゼにより脱抱合させ、局所での気管支拡張作用を発揮させ、一部が心臓に到達したとしても ]3—ダルク口二ダーゼが殆ど存在しない心臓では、作用薬特有の副作用が殆ど認められないと考え、実際に |8 ₂作用薬のダルクロニドを合成し、頻用されている抗原誘発型モルモット喘息モデルにおいて、吸入投与した結果、見事に気道収縮抑制作用を示し、続いてラットを用いて、心拍数、血圧に対する副作用を調べた結果、全く影響がないことを明らかにして、本発明を完成させた。

本発明は、式（1 )

R—薬物 ( 1 )

(式中、 Rは薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素によって切断されうる置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性化されるものである）

で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩を提供する。

また、本発明は、式（2 )

R ' —薬物（2 )

(式中、 R ' は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素である —ダルク口-ダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性ィ匕される呼吸器官用薬物を意味する）で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩を提供する。

さらに、本発明は、式（1 ) または式（2 ) の化合物の有効量を製薬的に適当でありカゝっ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および/または他の活性ィ匕合物およぴ補助剤と一緒に含有する医薬組成物を提供する。

カロえて、本発明は、薬物の標的部位と副作用が発現する部位間における酵素活性に差がある酵素を利用するプロドラッグであって標的部位のみで効果を発現する医薬組成物を製造するための、式（1 ) または式（2 ) で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の使用を提供する。

さらに、本発明は、アセトン、ァセトニトリル、ジォキサン、テトラヒドロフランのいずれかの溶剤中、塩基の共存下、水酸基を有する ₂作用薬および糖ノヽロゲン化物誘導体を反応させ、これをアルカリ加水分解により脱保護する、糖を置換基として持つ ₂作用薬の製造方法を提供する。

また、本発明は、複数の水酸基を有する ₂作用薬と塩基を含む混合物にハロゲン化べンジル誘導体を添加し、選択的に水酸基を保護したのちダリコシルイ匕し、この中間体をアルカリ加水分解後、水素添加する、糖を置換基として持つ ₂作用薬の製造方法を提供する。

上記式（2 ) で表される本発明の化合物は、吸入法によって投与した場合、肺の細気管支上皮細胞において切断され活性型が気管支平滑筋に直接作用して薬効を示す薬物であり、白血球等の炎症による細胞の活性化に由来する —ダルク口ニダーゼ活性の亢進によらず、主として上皮細胞由来の e -ダルク口ニダーゼ活性によって切断されるプロドラッグである。

したがって、本発明は、式（2 )

R ' —薬物（2 )

(式中、 R ' ば呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素である ]3—ダルク口ニダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによつて活性化される呼吸器官用薬物を意味する）

で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の有効量を呼吸器疾患の治療を必要とする患者に投与することを含む、呼吸器疾患の治療方法をも提供することができる。当該治療方法において、呼吸器官用薬物して気管支拡張剤、 β ₂ 作用薬等が例示され、具体的には、サルプタモール、サノレメテロール、マブテロール、クレンブテロール、ピルブテロール、プロ力テロール、フエノテロール、 V口プテ口一ノレ、フオルモテロール、へキソプレナリン、テノレプタリン、トリメトキノ一ノレ、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフエナミン、メチルエフェドリン、エフェドリン、イソプレナリン等が挙げられる。

本発明の好ましい態様は、水酸基、特にフエノール性水酸基を有する ₂作用薬の Ο—ダルク口ナイドからなる呼吸器官用プロドラッグである。 3- 0- ( - D -グノレクロ二ノレ）サルブタモーノレ、 3-0- ( β -D -ダルク口二ノレ）サルメテ口ール、 3-0- ( β - D-グノレク口ニル）ピルブテ口ール、 3-0- ( β - D -ダルク口ニル）フエノテロ一ノレ、 3-0- ( β _D-ダルク口ニル)ッロブテロール、 4-0- ( β - D-ダルク口二ノレ)フオルモテロール、 3 or 4-0- ( β - D-グノレク口二ノレ）へキソプレンリン、 3 - 0- ( j3 - D -ダルク口-ル）テルブタリン、 6 or 7 - 0- ( j3 _D -ダルクロニル）トリメトキノール、 3-0- ( β - D_ダルク口ニル）オルシプレナリン、 3 or 4-0 - ( β - D -ダルク口エル)イソプレナリン、 8-0- ( j3 _D -ダルク口ニル）プロ力テロ-ルなどが例示される。

背景技術の欄にて説明した従来技術においては、薬物とダルク口ン酸の間にスぺーサ一を挿入するなどの工夫をしなければ、腫瘍細胞において効率的に薬物とグルクロン酸に、 —ダルクロニダーゼによって切断することができなかったが、本発明は、このようなスぺーサー配列を揷入しなくても、肺の細気管支の局所に吸入された薬物のダルク口二ドが効率的に切断することを証明した。

本発明は、腫瘍組織や炎症組織で亢進した |8—グルクロエダーゼ活性を利用するのではなく、正常状態で非常に高い j3—ダルクロニダーゼ活性がある組織を見い出したことにより、完成したものである。細気管支の上皮細胞においては高い ]3—ダルクロニダーゼ活性が存在するので、効率的に切断させる目的でのスぺーサー揷入の必然性はないものと考えられるが、プロドラッグの合成面での簡便性や安定性等のために任意の適切なスぺーサーを揷入することは差し支えない。かかるスぺーサーを式（1 ) の Rと薬物の間に挿入した化合物、あるいはかかるスぺーサ一を式（_{2 )} の R，と薬物の間に挿入した化合物も本発明の範囲に含まれる。図面の簡単な説明

図 1は、モルモット肺の細気管支上皮に強く ]3—ダルク口ニダ一ゼが局在するすることを示す顕微鏡写真（倍率 1 0 0倍）である。

図 2は、モルモットにおける各臓器中の β -ダルク口ニダーゼ活性を示すダラフである。

図 3は、モルモット心臓において β一ダルク口ニダーゼ活性が認められないことを示す顕微鏡写真（倍率 5 0倍）である。

図 4は、モルモットにおける抗原誘発型気道収縮反応に対するサルブタモールグルクロ-ドの抑制作用を示すグラフである。

図 5は、モルモットにおける抗原誘発型気道収縮反応に対するィソプレナリンダルクロニドの抑制作用を示すグラフである。

図 6は、サルブタモールダルク口二ドの血圧及び心拍数に対する影響を示すグラフである。図 7は、イソプレナリンダルク口二ドの血圧及ぴ心拍数に対する影響を示すグラフである。 . 発明を実施するための最良の形態

本発明は、従来の技術に示される、癌組織や炎症組織において亢進した酵素活性を利用するもの、あるいは、腸内細菌の有する酵素活性を利用するものと異なり、標的部位と副作用発現部位間の酵素活性の差を利用したプロドラッグである。したがつて、本発明におレ、て薬物は標的部位と副作用発現部位が異なる薬物でなければならない。特に副作用発現部位が特定され、限定されている薬物が好ましい。その標的部位と副作用発現部位となる受容体が存在する場所が限定されている各種受容体作用薬、遮断薬等は、本発明の対象薬物となる。また、酵素で切断される置換基を結合する必要から、それに適する構造を持つ薬物であることが好ましい。例えば、 —ダルク口ニダーゼで切断される糖を結合する場合には水酸基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基を有する化合物が好ましい。特に、物質としての安定性、ダルクロニダーゼにより切断されやすい点から、水酸基を有する化合物が適しており、フヱノール性の水酸基を有する薬物が最も適している。 ₂作用薬は水酸基、特にフエノール性水酸基を有する構造であるものが多く、本発明の薬物として適している。

薬物の標的部位とは薬物が薬効を発揮する細胞、組織、臓器、器官等を意味する。また、副作用が発現する部位とは薬物の好ましくない効果が発揮される細胞、組織、臓器、器官等を意味する。

本発明において呼吸器官とは気道および肺を意味する。

標的部位が呼吸器官である場合、本発明の薬物は気管支喘息、小児喘息、慢性気管支炎、急性気管支炎、肺炎、肺気 S重、肺結核等の疾患に対する治療剤である。副作用発現部位が心臓である場合、本発明の薬物は] 3 ₂作用薬のように心臓以外の器官を標的器官とし、心臓において副作用を発現する薬物である。

本発明において、気管支拡張剤とは吸入等により、気管支平滑筋に直接あるいは間接的に作用する薬剤である。気管支においては、細気管支の上皮細胞等に j3 一ダルク口ニダ一ゼが局在しており、そこで薬物が遊離されると平滑筋は上皮細胞のすぐ下にあるため効果的に作用させることができる。

本発明において j8 ₂作用薬としては、サルブタモール、サルメテロール、マブテロ一ノレ、クレンブテロール、ピノレブテロ一ノレ、プロ力テロ一ノレ、フエノテロール、ッ口ブテ口一ノレ、フオルモテロール、へキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフヱナミン、メチルエフェドリン、エフヱドリン、ィソプレナリン等が代表的なものとして例示されるが、これらの誘導体に限らず、 ₂作用を有する薬物であればよい。

本発明の酵素としては、 ]3—ダルク口ニダーゼ、ダルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、 Ν—ァセチルー D—ダルコサミニダーゼ、 Ν—ァセチルー D—ガラタトサミニダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ等のグリコシダーゼゃァリノレスノレファターゼが例示される。呼吸器官用剤の場合、特に —ダルク口ニダ一ゼが好ましい。

酵素が、上述したグリコシダーゼの場合、本発明における単糖とは、 D—ダルクロン酸、 D—グルコース、 D—ガラクトース、 N—ァセチルー D—ダルコサミン、 N—ァセチルー D—ガラクトサミン、 D—マンノース、 L—フコース等から選ばれる糖が例示され、オリゴ糖とは前記単糖 2〜5個からなり、それらが互いにまたは一 O—グリコシド結合で結合しているものが例示される。通常、単糖と薬物との結合は α—または3—ダリコシド結合である。酵素が ;3—ダルク口ニダーゼである場合には β -ダルク口ニル結合が好ましレ、。

本発明において置換基とは酵素によって切断される糖残基、硫酸基などを意味する。例えば酵素がグリコシダーゼの場合、酵素で切断される糖残基としては、ダルクロニル、ダルコピラノシル、ガラタトピラノシル、ァセチルーダルコサミル、ァセチノレーガラタトピラノシル、ァセチルービラノシル、マンノピラノシル、フコピラノシルなどが例示される。

薬物と置換基を直接、結合させずに、 J. Med. Chera. 2000, 43， 475に例示されているように —ダルクロニドをトリガーとしスぺーサーを介して結合することも可能である。スぺーサ一とは、薬物と置換基の間に介在させる構造のことである。標的器官において化学的にあるいは酵素的に切断され親化合物がすみやかに発現するものが望ましい。この場合、非選択的に切断されるものが好ましく、単純に加水分解などで切断されるものを用いる。

本発明では、酵素活性の高い標的器官が選択されているので、スぺーサーを使用しなくても、実施例に示すように標的組織で十分に薬物が遊離される。したがって、必ずしもスぺーサーを必要としないが、選択する薬物、器官、酵素によつてはスぺーサーを使用すると有利なことがある。

スぺーサーを介することにより、容易に酵素で切断できるようになったり、立体障害などのため反応性が低い置換基の場合、容易に変換できるなどの効果が考えられる。ただし、スぺーサ一おょぴその代謝物の毒性などの薬理的性質を明らかにしておく必要が生じる。

スぺーサ一としてはエステルやカルパモイルのように化学的には安定でありながら最終的には標的酵素によって分解され親化合物がすみやかに発現するものが古くから汎用されている（H. Bundgaard Ed. , Design of Prodrugs, p. 262-269, 1985, Elsevier) o 薬物によっては (US 5621002 (family patent :EP 642799, 特開平 7-149667) , US 5935995 (family patent :EP 795334, 特開平 10-1495)， US 5955100 (family patent :EP 595133, 特開平 6- 293665) ) などに開示されたものも使用できる。

糖またはスぺーサ一の結合位置としては主として β作用薬の例でいえば、フエノール基、イミノ基またはァミノ基が考えられる。これらの置換基を手がかりとして直接または間接に糖部分もしくは硫酸基を結合させプロドラッグとする。本発明の化合物の具体的な例としては、 3—Ο— （jS—D—グルクロン酸）一サルプタモール、 4— O— —D—グルクロン酸）一イソプレナリン、イソプレナリン一 4 _ 0—サルフエ一ト等が例示される。前二者の製法は実施例に示した。後者はィソプレナリンと三酸化ィォゥ · トリメチルァミン錯体との反応によつて得られる。

本発明のプロドラッグは、局所投与により用いることが好ましい。標的部位、副作用発現部位以外の部位の酵素活性の影響を受ける可能性が低くなり、より効果的なプロドラッグとなる。呼吸器官用剤の場合は、吸入用の医薬組成物として用いるのが好ましい。

本発明のプロドラッグを吸入剤として使用する場合、その吸入剤用添加剤としては、一般に吸入用医薬組成物に使用される添加剤であればいずれのものであつてもよく、例えば、噴射剤、固形賦形剤、液状賦形剤、結合剤、滑沢剤、矯味剤、保存剤、安定化剤、懸濁化剤、分散剤、溶剤、等張化剤、 p H調整剤、可溶化剤などが用いられる。噴射剤としては、液化ガス噴射剤、圧縮ガスなどが用いられる。また、本発明の医薬組成物には、活性成分として本発明プロドラッグ以外の医薬成分を含有していてもよい。

本発明の医薬組成物において、プロドラッグの含有量は、薬物、対象疾患、対象患者の年齢や性別、疾患の状態などによって相違するが、通常医薬組成物全体に対して約 0 . 0 1〜9 9 . 9重量％、好ましくは約 0 . 1〜5 0重量％、さらに好ましくは約 0 . 5〜 2 0重量％程度である。吸入剤用添加剤などの各種添加剤の含有量は、対象疾患、対象患者の年齢や性別、疾患の症状などによって相違するが、通常医薬組成物全体に対して約 0 . 1〜 9 9重量％、好ましくは約 1 0 〜 9 9重量％、さらに好ましくは約 5 0〜 9 9重量％程度、特に好ましくは約 7 0〜9 9重量％程度である。

本発明の医薬組成物を吸入剤として使用する場合、公知の方法を用いて、粉末吸入剤、吸入用懸濁剤、吸入用溶液またはカプセル状吸入剤とし、用時適当な吸入器を用いて適用することができ、特に粉末吸入剤が好ましく用いられる。さらに、本発明の医薬組成物は、エアゾール剤として使用することができる。

本発明の医薬組成物を使用する場合、適用の際に使用する器具としては、市販の吸入器を用いても良く、例えば、ベントリン ' ロタキヤップス（VENTOLIN

R0TACAPS；ダラクソ社）、スピンへラー（登録商標、藤沢薬品工業（株））、ィンタール ·スピンキャップス（INTAL SPINCAPS；フィソンズ社）、ァトロベント .アンド .ベロテック ·インハレッテン（ATROVENT AND BER0TEC

INHALETTEN；ベーリンガー ·ィンゲルハイム社）、フオラディル (F0RADIL；チバ社）、ベントディスク（BENT0DISKS；グラクソ社）、パブライザ一（登録商標、帝人（株））、ブリカニル'ターブハラ一（BRICA YL TURBUHALER；ァストラ社）、ミアト ·インスファレイタ一（MIAT INSUFFLATOR) などが例示される。本発明のプロドラッグは置換基として糖など、通常体内で安全に代謝されるものを結合させただけのものなので、その毒性は薬物自体の毒性以上となる可能性は低い。局所的に投与に適するので、最小有効量の投与で済み、全身的多量投与を避けることができる。したがづて、小児であっても容易に安全に服用することができる。特に、吸入剤やエアゾール剤とした時は、格別の局所作用効果を発揮できる。

静脈内投与、筋肉内投与等を行った場合でもプロドラッグとせずに薬物そのままを投与する場合に比べて、はるかに安全性が向上することはいうまでもない。例えば、喘息発作の緊急時には ₂作用薬を静脈内投与する必要がありうるが、その場合でも心臓ではダルク口ニダーゼの活性が低いので、心臓における ₂作用薬の副作用は薬物そのままを投与する場合と比較してはるかに低減される。本発明の医薬組成物の投与量は、薬物、対象疾患、年令，体重，症状，投与経路, 投与回数などにより異なるが、例えば、 ₂作用薬の場合、プロドラッグにする前の活性薬物の投与量とほぼ同等の効果を発揮する。

本発明のプロドラッグの製造方法としては、有機化学的グリコシル化おょぴ酵素的グリコシルイ匕がある。たとえば、水酸基を保護した糖誘導体を Koenigs- Knorr反応によって代表されるグリコシド反応 (Advances in Carbohydrate Chem. and Biochem. 57， 207, 2001, Academic Press)によって所望のグリコシド結合を形成させたのち、脱保護により目的とするプロドラッグが得られる。

酵素法でも（KIS0 TO RINSH0U, 30, 2403, 1996)糖転移酵素と UDP-糖誘導体の組み合わせにより同様の結果が得られる。実施例

本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。本発明はこれらの実施例によつて何ら限定されない。 ' 実施例 1

サルブタモールダルクロニド（3—0— （ —D—ダルクロニル）ーサルプタモール） _ (実施例 1の化合物）の製造

(1) 2— (4ーメトキシベンジロキシ) 一 5— （2— （N— t e r t—ブチルァミノ）一1— (4—メトキシベンジロキシ）ェチル）ベンジルアルコールの調製

サルブタモール 1.466g， Nal 25mg， THF 5 mLの混合物に NaH 250mg を一 78°Cで少しずつ加えた。 0°Cで 15分撹拌したのちに、 - 78°Cで p—メトキシベンジノレクロリド（p - MeO_benzylchloride) 1.125gを添加後、室温で 16時間撹拌した。反応混合物にアセトンを加えて濾過、濃縮後、カラムクロマトグラフィーにて目的物 1.20g (59%)を得た。

nmr (CDC1₃): 1.19 (9H, s)， 2.60 (2H, m).， 2.62 (2H， m), 3.53 (1H， d， J=10Hz), 3.81 (6H, s), 3.88 (1H, d, J=10Hz), 3.93 (1H, m), 4.60-4.70 (2H, m), 4.99 (1H, s), 7.2—7.8 (11H, m)

( 2 ) glycosidationおよぴ脱保護

2― (4—メトキシベンジロキシ) 一 5— (2 - (N— t e r t—ブチルアミノ）一 1— (4—メトキシベンジロキシ) ェチル）ベンジルアルコール 1.04g，ァセトブロモグルクロン酸メチルエステル（bromo- 2， 3， 4- tri_0- acety卜 - D - glucopyranuroic acid methyl ester) 1.50g，炭酸銀 1.577g， MS4A 1.577gにジクロロメタン 4mLを加え、室温で一晩撹拌した。反応液をセライトで濾過し、濃縮後、カラムクロマ'トグラフィ一で分離し、粗生成物 1.68g (82%)を得た。これを Me0H-THF(5mL， 2 :3)で溶解し、 20%NaOH (2.59mL) を加えて室温で 1時間撹拌した。 TLC(Ac0Et/n- Hex=l/2)で反応を確認後、氷冷下、酢酸で中和した。 Pd- C(100mg)を加え、水素添加（室温、ー晚）した。反応液を濾過後、濃縮し、 LH - 20カラムクロマトグラフィーで目的物（実施例 1の化合物） 138mg (12%)を分離した。 nmr (DMSO- d₆) : 1.25 (9H, s)， 2.80-2.94 (2H, m), 3.05—3.35 (4H, m),

4.25 (1H， m)， 4.60 (1H, m), 4.76 (1H, d， J=10Hz), 4.78 (1H, d, J=8.8Hz) ,

6.80 (1H, d, J=8.2Hz), 7.12 (1H, dd， J=8.2Hz & 1.6Hz)， 7.44 (1H, d, J=l.6Hz)

IR (KBr, cm"¹) 3402, 2980, 1617, 1509， 1406， 1276, 1200, 1118， 1074 実施例 2

イソプレナリングルクロ-ド（4一 0— (13— D—グノレクロニル) 一イソプレナリン） _ (実施例 2の化合物）の製造

'ナリン塩酸塩 1.00g， IN- NaOH (4. OOrnL)の混合物に、ァセトブロモグノレク口ン酸メテノレエステノレ (Bromo - 2， 3， 4一 tri—0 - acetyl - β -D-glucopyranuroic acid methyl ester) 1.28g をアセトン 4.16 mLにとかしたものをすこしずつ 0°Cでカ卩え、室温で静置した。 IN- NaOH (2.46raL)を随時加えながら、 pH7付近に保ち室温で 2日間反応させた。濃縮後、 20%NaOH (2mL) を加えて室温で 30分撹拌した。冷却後、酢酸を注意深く加え、酸性にし HP - 20カラムで分離後、さらに LH- 20カラムで分離し、実施例 2の化合物を得た。収量 81mg (5.2%).

nmr (DMSO- d₆)： 1.22 (6H, d, J=6.5Hz) , 2.82-2.96 (2H, m), 3.05-3.35 (4H, m)， 3.30 (1H， m)， 4.70 (1H, brs), 4.70 (1H, m), 6.80—7.50 (3H, m) IR (KBr, cm一¹): 3402, 1617， 1509, 1400， 1287, 1068,

実施例 3

3— （一D—グルクロエ口キシ）メチルー 4—ヒドロキシー α— {[(4—メトキシー α—メチルフエネチノレ）ァミノ]メチル } ベンジルアルコール OCH

実施例 1と同様の製法にて標記化合物を得た。

nmr (DMS0 - d₆ )： 0.90 (3H, d, J=6.2Hz), 2.82-2.96 (2H, m), 3.05-3.35 (4H, m), 3.30 (1H, m), 3.71 (3H, S)， 4.45 (1H, brs), 4.47 (1H, m), 6.60-7.30 (7H, m)

実施例 4

《 β ₂作用薬ダルク口二ドの薬理活性》

1 . 試験方法

β ₂作用薬であるサルプタモール及ぴィソプレナリンのダルク口 -ドの気管支拡張作用を調べるために、 ovalbuminで感作したモルモットの喘息モデルを用いた。試験は、 Konzett と RSssler の方法に従って実施した (Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. , 195, 71—75, 1940) 。

〈感作〉

感作開始 1および 8日目、モルモットに ovalbumin 500 μ g/0. 5 mLを両足に筋肉内投与、百日咳ワクチン 1. 5 X 10⁵ cell/mL/匹を腹腔内投与するすることにより能動的に感作した。感作開始 15日目に ovalbumin 10および 100 ^u g/siteを背部に皮内投与して感作状態をチェックした。皮内感作 6時間後の感作チェックで陽性になった動物のみ試験に使用した。

〈投与方法〉

被験物質は、超音波ネブライザ一の霧ィ匕量を小にして薬液を霧ィ匕し、エアロゾルを発生させ、エアロゾルを曝露チャンバ一（M. I. P. S.社）に導き、エアーポンプ（SPP- 3GA， TECHNO TAKATSUKI社）を用いて 3 L/minで吸引し、 ovalbuminチヤレンジの 40分前に 10分間モルモットに吸入投与した。

〈気道内圧測定〉

感作開始 19〜23日目、ペントバルビタールナトリウム（50 mg/kg, i. p. ) で麻酔した。気管に力二ユレーシヨンを行った。気管力ニューレを介して人工呼吸器に接続し、人工呼吸（換気量 10 mL/kg, 換気回数 50回/分)下で通気圧の変化. を気管力ニューレに接続した差圧トランスデューサー（Validyne, Gould

Electronics)を介してレコーダー（WT- 645G, 日本光電株式会社)上に気道内圧として記録した。気道内圧は ovalbumin投与 10分後まで気道内圧を測定した。次に '左右の総経静脈内にカニュレーションを行った。左側の力-ュレーションょりガラミン（10 mg/mL)を 1 mL/kgの容量で静脈内投与し、自発呼吸が消失したことを確認した。その後， ovalbuminを静脈内投与（3 0 0 ;U g Z k g ) し，抗原抗体反応を惹起した。気道内圧の測定ポイントは、惹起前、 ovalbumin惹起後 1, 3, 5， 7および 10分とした。気道内圧の増加率は，惹起後の各測定時間の測定値より惹起前の測定値を差し引き、各測定時間における最大閉塞に対する割合を百分率で表した。

〈試験材料〉

被験物質としてサルプタモールダルクロニド、イソプレナリンダルクロニドを使用した。サルプタモールダルク口二ドは白色粉末おょぴィソプレナリンダルク口-ドは茶褐色結晶であり，いずれも- 80°Cで遮光下にて保存した。比較対照物質としては、各々サルブタモール硫酸塩（以後、サルプタモールと表わす）およぴイソプレナリン塩酸塩（以後、イソプレナリンと表わす）を使用した。サルブタモールおょぴィソプレナリンは白色粉末であり、いずれも遮光下で室温保存した。被験物質および比較対照物質は，必要量を秤量して生食塩溶液（大塚製薬工場株式会社， Lot No. 1D78, 1E84)に溶解し、用時調製とした。被験物質と比較対照物質の溶液中の濃度は、モル濃度で等量になるようにした。いずれの溶液も室温で 24時間ほぼ安定であつた。

なお、サルブタモールダルクロニド及ぴィソプレナリンダルクロニドは、調製後 30分以内に使用した。この他， ovalbumin (OVA, Sigma Chemical Company, Lot No. 120K7001) _N gall amine (gallamine triethiodide, Si ma Chemical

Company, Lot No. 76H1106) , ペントパルビタールナトリウム（東京化成株式会社， Lot No. GI01)、百日咳ワクチン（和光純薬工業株式会社， Lot No.

SEK7880)、および生理食塩液（株式会社大塚製薬工場， Lot No. 1D78, 1E84) を使用した。各試験群の構成を表 1に示す。

〈統計学的解析処理方法〉

得られた試験成績は、気道内圧について平均値および標準誤差で表示した。有意差検定は 2群間の比較の場合は対応のない Student の t検定を行った。多群の比較の場合は Dunnett' s multiple test を行った。いずれも有意水準は 5 % とした。気道抵抗の上昇に対する各被験物質の抑制率は、対照群の抑制率を 0 %とした時の対照群に対する抑制率として算出した。

2 . 結果

サルプタモール及びサルプタモールダルクロニドの抗原誘発型即時型喘息反応に対する影響を検討した結果を図 4に示す。結果は、方法に記述したように、抗原である ovalbuminの投与前（pre) の気道内圧に対する増加率で表した。なお、図中の pre とは、ガラミンを投与し、自発張力を消失させ、安定した時点を指し、 ovalbuminの投与開始約 5- 10分前を意味するものである。 ovalbuminの静脈内投与により抗原抗体反応が惹起された対照群のモルモットでは、抗原惹起の 1分後には気道内圧は速やかに上昇し、 3分後に最大約 44% の増加を示した。サルブタモールを 0. 05 % の濃度で吸入させた群では、抗原惹起の 3分後に約 3 %の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して約 92%の有意な抑制を示した。一方、サルプタモールダルクロニドを 0. 072%の濃度で吸入させた群でも同様に、 3分後に約 20%の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して 56%の有意な抑制を示した。

一方、イソプレナリン及ぴィソプレナリングルクロ二ドの抗原誘発型即時型喘息反応に対する影響を検討した結果を図 5に示す。実験条件、結果の表わし方は、サルブタモールの場合と同様である。ィソプレナリンを 0. 1%の濃度で吸入させた群では，抗原惹起の 3分後に約 12%の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して約 73%の有意な抑制を示した。一方、イソプレナリングルクロニドを 0. 157%の濃度で吸入させた群でも同様に、 3分後に約 10%の増加率を示し、気道内圧の上昇を強く抑制した。これは、対照群と比較して 77%の有意な抑制を示した。

以上のことから、サルブタモールダルク口二ド及ぴィソプレナリングルクロ二ドは、吸入投与によりモルモットの即時型喘息反応を有意に抑制することができることを明らかにした。本結果と細気管支の上皮組織に e―ダルク口ニダーゼ活性が強く存在する結果 (図 1 ) から、サルブタモールダルクロニド及びィソプレナリングルクロニドは、吸入投与により気道に入り、肺の細気管支周辺で —グルクロニダーゼにより加水分解され、活性体であるサルブタモール及ぴィソプレナリンに変換されて抗喘息作用を発揮したものと考えられる。

実施例 5

《 ₂作用薬ダルクロニドの副作用に対する影響》

薬物として J3 ₂作用薬のィソプレナリンとサルプタモールを使用し、これらの 2作用薬とそのダルクロニド（実施例 1と実施例 2 ) の心臓に対する影響を確 pj、した。

1 . 試験方法

試験は、 Crj :CD (SD)ラットを用い、各群 6匹にて実施した。〈血圧及ぴ心拍数の測定〉

手術は酸素，笑気及ぴィソフルランの混合ガスの麻酔下で行い、総頸動脈にへノリン（100 U/mL)含有の生理食塩液を満たしたポリエチレン製チューブ（PE50, Becton Dickinson) の一方を挿入して留置し、他方を背中の頸部あたりを通して曝露用チャンパ一の上部に設置した力ニューラシ一ベル（インステック社製）に接続した。この力ニューラシ一ベルからポリエチレン製チューブを介して圧力トランスデューサー（P23XL, Gould Electronics) に接続する。なお、背中から力ニューラシ一ベルに至るポリエチレン製チューブの周りは金属製スプリングの中を通して，動物による損傷を防止した。

薬物の投与は、曝露用チャンパ一を作製し、チャンパ一内で血圧測定用の力二ユーレを総頸動脈に留置した状態のラットに全身吸入曝露で行った。この方法は全身吸入曝露で汎用されているものである。

圧力トランスデューサー（P23XL, Gould Electronics) からの信号をプレツシヤープロセッサーシグナルコンディショナー（Gould Electronics) に導き，サ一マルアレイレコーダー（RS3400, Gould Electronics) 上に記録する。血圧及ぴ心拍数は投与開始前から投与終了後 20分まで連続的に記録した。投与開始は，覚醒後 1時間以上経過し，測定パラメータが安定してから実施した。〈試験材料〉

被験物質は実施例 3と同様に調製した。

各試験群の構成を表 2に示す。表 2 ミストミスト

投与液濃度群内送風量送風時間投与経路性別

(mg/mL)

(L/min) (分）

対照 (媒体） 6 サノレプタモーノレ 5 6 サルブタモーノレ

7 . 2 6 ダルクロニド 3 1 0 全身雄

ィソプレナリン 1 6 イソプレナリン

グノレク 1 . 5 7 6 ロニド〈統計学的解析処理方法〉

各群の代表値は，平均値士標準誤差（S. E. ) で表示した。各群の平均値は， Tukeyの多重比較検定で有意差検定を行った。なお、有意水準は 5 %とした。 2 . 結果

サルプタモール及ぴサルブタモールダルクロニドの心臓機能、特に血圧心拍数に対する影響を検討した結果を図 6に示す。なお、図中の pre とは、薬物の吸入投与開始直前を意味するものである。サルプタモール吸入投与直後から、血圧の低下及ぴ心拍数の上昇が認められた。吸入終了後、 5分後に 75miHgまでの血圧低下を示し、これは、吸入前（pre) の約 26%の低下であった。また、心拍数に関しても同様の傾向が認められ、 5分後に最大約 36%の上昇を示した。経時的に測定した 30分間の中で最大の血圧低下率と心拍数増加率は、各々 27%と 39%であった。このように、サルブタモールの吸入が、血圧及ぴ心拍数に顕著な影響を示すことが明らかとなった。これに対して、同様の試験をサルブタモールダルクロニドで実施した結果、対照群（生理食塩水の吸入）と同様に、全く影響が認められなかった。

一方、イソプレナリンもサルブタモールと同様に、吸入投与直後から血圧の低下及ぴ心拍数の上昇が認められ、吸入終了後、 5分後に 72mraHgまでの血圧低下を示し、これは、処理前の約 27%の低下であった。また、心拍数に関しても同様の傾向が認められ、 5分後に約 49%の上昇を示した（図 7 ) 。経時的に測定した 3 0分間の中で最大の血圧低下率と心拍数増加率は、各々 28%と 50%であった。このように、ィソプレナリンの吸入が、血圧及ぴ心拍数に顕著な影響を示すことが明らかとなった。これに対して、同様の試験をイソプレナリングルクロ二ドで実施した結果、対照群と同様に、全く影響が認められなかった。特にイソプレナリンは、作用を有し、心臓への副作用が強いことが知られている。本発明により、 j3 ₂作用薬ダルク口-ドを用いることによって j3 ₂作用薬の有する心臓への影響を完全になくすことが可能となることが示された。これらの結果から、サルブタモール及ぴィソプレナリンのダルク口二ドは、サルブタモール及ぴィソプレナリンの血圧心拍に対して影響を及ぼすという重篤な副作用を消失させることを明ら力にした。 β—ァゴニストに属するサルブタモール、イソプレナリンを実施例として用いて本特許を説明したが、この概念が実施例に示す二つの化合物だけでなく、他の構造的に全く異なる化合物においても同様の傾向、即ち、グルクロン酸ィ匕された薬物が、標的組織において水解され活性を発現しうるという例を提示する。

11_ェチル -7,9-ジヒドロキシ -10,11-ジヒドロジべンゾ [b，gチェピンは、平滑筋を用いた in vitroの収縮抑制試験で効果を示す化合物である。ブタ気管平滑筋標本を高濃度 KC1 あるいは、カルパコールで誘発した平滑筋収縮を I C _{5 0} ⁵ 程度で抑制する。本化合物を経口投与した場合、 10mg/kgで、即時型喘息モデルで気道収縮抑制作用を示した（実施例 3と同一の実験系）。その後、本ィ匕合物の代謝'に関する検討を開始したところ、本化合物は、経口投与後、吸収され、速やかにグルクロン酸抱合ィ匕を受けることが判明した。マウス、ラット、モルモット、ィヌ、サルにおいて、投与後の血中分析の結果、いずれの動物種においても 99%以上がダルク口ン酸抱合体であつた。この結果から、抱合体に活性が存在する可能性を考慮して、 O—ダルク口二ドを合成した。合成した O—ダルク口二ドは、先に述べた in vitroの平滑筋を用いた収縮抑制試験で全く効果を示さなかった。一方、先に述べた、モルモットの感作モデルを用いて O—ダルクロニドの効果を静脈内投与で確認したところ、気道収縮抑制作用を確認することができた。これは、静脈内に投与された O—ダルク口-ドが、肺の組織に到達した後に、水解されて、未変化体に戻ったために、気道収縮抑制作用を示した結果であると推察される。

このように、 —ァゴニストとは、全く異なる構造の化合物でも、同様の結果が認められたことは、ダルク口ン酸抱合化した化合物が、肺で効率的に水解され活性を発現する可能性を強く示している。

以下に「発明の開示」の欄で説明した図 1、 2、 3について詳細を示す。参考例 2

《図 1 ：肺における ]3—ダルク口ニダ一ゼの局在》

肺及ぴ心臓における j3—ダルク口ニダ一ゼの局在について酵素組織ィ匕学的な手法を用いて解析した。 1 . 試験方法

モルモット肺の組織標本を作成し、 Fishman らの方法（J. Histo. Cytochem. 12, 298-305, 1964) に基づいて、 /3—グルクロ-ダーゼに対する基質 naphthol AS-BI ]3 - glucuronideを用いて活性染色を実施した。摘出した肺を 4%パラフォルムアルデヒド溶液で固定し、クリオスタツトにより 4- 6 μ mの凍結切片を作成した。基質液は、 naphthol AS-BI j3 -glucuronide 28 mgを 0. 05 M重炭酸ソーダ 1. 2 mL に加えて溶解し、 0. 2 N酢酸 ·酉乍酸ナトリゥム緩衝液（p H 5 ) を 100 mL までカロえて作成した。染色液は、 4%亜硝酸ナトリウム液 0. 3 mL にパラロザリン液 0. 3 mLを加えて、ジァゾ化し、この液に基質液 10 mL を加えて、 p H を 5 . 2に調整した後、蒸留水を加えて 20 mL にメスアップし、最後にろ紙でろ過して調整した。切片に染色液をのせて、 37 °C、 2時間反応させた。反応後、常法に従って、洗浄、脱水、封入した。

2 . 結果

肺の凍結切片を作製し、組織を ]3—ダルク口二ダーゼ活性により活性染色した結果を図 1に示す（倍率 1 0 0倍）。図 1において A〜Cは次の細胞を示す。 A：肺の細気管支の上皮細胞

B：平滑筋細胞

C：肺胞マクロファージ

図 1に示すように、肺の細気管支の上皮細胞（図中の Aで示した領域）と肺胞マクロファージ（図中の C) に強い陽性像が認められた（黒く染まってみえる部分が β一ダルク口ニダーゼの活性を示す) 。

肺胞マクロファージの J3—ダルク口ニダ一ゼ活' [·生が高レヽこと（Hayashi、 J Histochem. Cytochem. 15, 83 - 92， 1967, Barry and Robinson^ Histochem. J. 1， 505-515, 1969) は報告されているが、細気管支を構成する上皮細胞に j3—グルクロニダ一ゼが局在するという報告はなかった。一ダルクロニダーゼが、肺の細気管支という外部と接触する領域において特に強く発現していることが示された。

肺の β一ダルクロニダーゼ活性に最も大きく関与する細胞群は、炎症系の細胞ではなく、細気管支の上皮細胞である可能性が示唆された。参考例 3

《図 2 ：各臓器中の β—ダルクロニダーゼ活性に関する検討》

各臓器中の β—ダルクロニダーゼ活性の程度と喘息モデル動物における本酵素活性の変動を調べる目的で、即時型喘息モデルとして確立されている感作モルモットを作成し、未感作モルモットとの各臓器の酵素活性を比較した。また、感作モルモットでは、抗原惹起した個体と惹起しない個体における酵素活性の比較も行った。

1 . 試験方法

〈感作〉

感作開始 1およぴ 8日目、 6週齢の' Std: Hartley系雄性モノレモットに ovalbumin (OVA) 500 μ g/0. 5 mLを両足に筋肉内投与、百日咳ワクチン 1. 5 X 10⁵ cell/mLZ匹を腹腔内投与することにより能動的に感作した。

〈抗原惹起〉

初回の感作後 19- 23日目に感作モルモットに 2%0VA溶液を 5分間吸入させ、抗原惹起を誘導した。惹起後、 4時間後に各臓器を回収した。

< β―ダルクロニダーゼ活性の測定〉

未感作モルモット群、感作モルモット群、感作モルモットの抗原惹起群の 3群 (各々 2個体）力ゝら各臓器を摘出し、生理食塩を 50倍容量加えて、ホモジナイズし、 12000 rpm, 10 min, 4 °Cで冷遠心分離後の上清をサンプルとした。各サンプル中の β一ダルク口ニダーゼ活性は、常法に従つて p- nitrophenyl- β - D- glucuronideを基質として用い、遊離した p- nitrophenol を 405 nmで比色定量する方法で測定した（Haeberlinら、 Pharmaceutical Res. 10， 1553-1562， 1993) 。各サンプル中の蛋白濃度は、市販キットを用いて測定した。 j3—グルクロニダ一ゼの比活性は、各臓器の場合には、蛋白 l mgあたり 1分間に遊離する反応物質量として表した。各臓器の比活性は平均値で示した。未感作モルモット群、感作モルモット群、感作モルモットの抗原惹起群の 3群の各臓器中の β -ダルク口ニダーゼ活性を図 2に示した。未感作モルモット群の各臓器の i3—ダルクロニダーゼ活性は、肺（15 nmol/mg/min) 、肝臓 (20. 7 nmol/mg/min) 、脾臓 (14. 2 nmol/mg/min) で高く、心臓 (1. 9 nraol/mg/min) 、脳（2. 6 nmol/mg/min) 、筋肉（1· 2 nmol/mg/min) で低い値を示した。この結果は、これまで報告されているラットゃマウス等の各臓器における酵素活性の報告と同様の傾向であった（Conchieら、 Biochem. J. 71, 318-325， 1959,

Johnsonら、 Biochemical Genetics 24, 891 - 909， 1986， Hoogerbruggeら、 Transplantation 43, 609-614， 1987) 。

一方、感作モルモット群においては、未感作モルモット群の酵素活性と比較して各臓器の酵素活性に差が認められなかった。この結果は、感作状態においては、未感作の場合と各臓器中の酵素活性には影響がないことを示唆する。さらに、抗原惹起した感作モルモット群にぉレ、ても各臓器の酵素活性は未感作モルモット群、抗原惹起しない感作モルモット群と比較して顕著な差が認められなかった。

これらの結果から、肺は、 |8—ダルクロニダーゼ活性が非常に高い組織であり、肺組織中の β一ダルクロエダーゼは、抗原感作による喘息モデルにおいて上昇しないことを確認した。

参考例 4

《図 3 ：心臓における ]3—ダルク口ニダ一ゼの局在》

1 . 試験方法

試験方法は、《図 1 ：肺における β一ダルク口ニダ一ゼの局在》で記述したものと同様である。ただし、対比染色としてへマトキシリンによる細胞核の染色を行った。

2. 結果

心臓の凍結切片を作製し、組織を Ρ一ダルク口ニダーゼ活性により活性染色した結果を図 3に示す（倍率 5 0倍）。図 3において矢印は、へマトキシリン染色された細胞の核を示す。図 3に示すように、モルモット心臓切片において、 β ダルク口ニダーゼ活性を示す陽性像は認められなかつた。産業上の利用の可能性

薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素活性を利用して、非標的器官に対する薬物の副作用を低減させることのできるプロドラッグを提供することができる。心臓に対する副作用が発現しない |8 ₂作用薬の提供を可能にした。さらに、本発明は、従来 J3作用薬の使用が制限されている心臓疾患を有する患者に対しても作用薬を安心して使用することを可能にした

Claims

請求の範囲

1 . 式（1 )

R -薬物 ( 1 )

(式中、 Rは薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素によって切断されうる置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活个生ィ匕されるものである）

で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩。

2 . 式（2 )

R ' 一薬物 ( 2 )

(式中、 R，は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素である ]3—ダルク口-ダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによつて活性化される呼吸器官用薬物を意味する）で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩。

3 . 標的部位が呼吸器官である請求項 1記載の化合物。

4 . 副作用発現部位が心臓である請求項 1記載の化合物。

5 . 薬物が気管支拡張剤である請求項 1または 2記載の化合物。

6 . 薬物が β ₂作用薬である請求項 1または 2記載の化合物。

7 . 薬物がその構造に水酸基を有する /3 ₂作用薬である請求項 1または 2記載の化合物。

8 . 薬物がサルブタモーノレ、サルメテ口ール、マブテロ一ノレ、クレンブテロール、ピルブテロール、プロ力テロール、フエノテローノレ、ッロブテロール、フオルモテロール、へキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフエナミン、メチルエフェドリン、ェフエドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項 1または 2記載の化合物。

9 . 酵素がグリコシダーゼである請求項 1記載の化合物。

1 0 . 酵素が β一ダルク口-ダーゼである請求項 1記載の化合物。

1 1 . 置換基が単糖またはオリゴ糖のダリコシル基である請求項 1または 2記載の化合物。

1 2 . 置換基がダルクロニル基である請求項 1または 2記載の化合物。

1 3 . ダルク口ニル基と薬物の結合が β結合である請求項 1 1記載の化合物。

1 4 . 請求項 1または 2記載の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および/または他の活性ィ匕合物および補助剤と一緒に含有する医薬組成物。

1 5 . 請求項 1または 2記載の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および/または他の活性ィ匕合物および補助剤と一緒に含有する局所投与用医薬組成物。

1 6 . 請求項 1または 2記載の化合物の有効量を製薬的に適当でありかつ生理学的に許容しうる賦形剤、添加剤、および/または他の活性ィ匕合物および補助剤と一緒に含有する吸入用医薬組成物。

1 7 . 薬物の標的部位と副作用が発現する部位における酵素活性に差がある酵素を利用するプロドラッグであって標的部位のみで効果を発現する医薬組成物を製造するための、式（1 )

R—薬物 ( 1 )

(式中、 Rは薬物の標的部位と副作用が発現する部位間においてその活性に差がある酵素によって切断されうる置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性ィ匕されるものである）

で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の使用。

1 8 . 薬物の標的部位と副作用が発現する部位における酵素活性に差がある酵素を利用するプロドラッグであって標的部位のみで効果を発現する医薬組成物を製造するための、式（2 )

R ' 一薬物（2 )

(式中、 R ' は呼吸器官において活性が高く、心臓において活性が低い酵素である j3—ダルク口ニダーゼで切断される置換基を意味し、薬物は酵素によって置換基を切断されることによって活性ィ匕される呼吸器官用薬物を意味する）で表される化合物またはその生理学的に許容し得る塩の使用。

1 9 . 標的部位が呼吸器官である請求項 1 7記載の使用。

2 0 . 副作用発現部位が心臓である請求項 1 7記載の使用。 2004/000863 ^ 曇 P'CT/JP2003/007868

2 1 . 薬物が気管支拡張剤である請求項 1 7または 1 8記載の使用。

2 2 . 薬物が ₂作用薬である請求項 1 7または 1 8記載の使用。

2 3 . 薬物がその構造に水酸基を有する β ₂作用薬である請求項 1 7または 1 8記載の使用。

2 4 . 薬物がサルブタモール、サルメテロール、マブテロール、クレンブテロ一ノレ、ピノレブテロ一ノレ、プロ力テロ一ノレ、フエノテローノレ、ッロブテロ一ノレ、フオルモテロール、へキソプレナリン、テルブタリン、トリメトキノール、クロルブレナリン、オルシプレナリン、メトキシフエナミン、メチルエフヱドリン、ェフエドリン、イソプレナリンのいずれかである請求項 1 7または 1 8記載の使用。

2 5 . 酵素がグリコシダーゼである請求項 1 7記載の使用。

2 6 . 酵素が —ダルクロニダーゼである請求項 1 7記載の使用。

2 7 . 置換基がグリコシル基である請求項 1 7または 1 8の使用。

2 8 . 置換基がダルク口ニル基である請求項 1 7または 1 8の使用。

2 9 . グルクロニル基と薬物の結合が β結合である請求項 2 8記載の使用。

3 0 . アセトン、ァセトニトリル、ジォキサン、テトラヒドロフランのいずれかの溶剤中、塩基の共存下、水酸基を有する j8 ₂作用薬および糖ハロゲン化物誘導体を反応させ、これをアルカリ加水分解により脱保護する、糖を置換基として持つ ₂作用薬の製造方法。

3 1 · 塩基が水酸ィ匕ナトリゥム、水酸化力リゥムのいずれかである請求項 3 0 記載の製造方法。

3 2 . 複数の水酸基を有する J3 ₂作用薬と塩基を含む混合物にハロゲン化ベンジル誘導体を添カ卩し、選択的に水酸基を保護したのちグリコシルイ匕し、この中間体をアルカリ加水分解後、水素添加する、糖を置換基として持つ /3 ₂作用薬の製造方法。