WO2003097087A1 - Vaccin bcg et utilisation correspondante - Google Patents

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WO2003097087A1
WO2003097087A1 PCT/JP2002/012125 JP0212125W WO03097087A1 WO 2003097087 A1 WO2003097087 A1 WO 2003097087A1 JP 0212125 W JP0212125 W JP 0212125W WO 03097087 A1 WO03097087 A1 WO 03097087A1
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bcg
vaccine
sivgag
antigenic protein
bcg vaccine
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PCT/JP2002/012125
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Mitsuo Honda
Kazuhiro Matsuo
Yasuyuki Izumi
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Japan Science And Technology Agency
Japan As Represented By Director General Of National Institute Of Infectious Diseases
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    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention of this application relates to a BCG vaccine and its use. More specifically, the invention of this application relates to a recombinant BCG vaccine used for priming antigens in the induction of immunity for the prevention and treatment of various infectious diseases and cancer, and a human or animal using the BCG vaccine. And a method for inducing immunity.
  • Mycobacterium bovis BCG BACKGROUND ART Mycobacterium bovis BCG strain
  • BCG Mycobacterium bovis BCG
  • HAV human immunodeficiency virus
  • SIV monkey immunoimmunodeficiency virus
  • Vaccines expressing the HIV gene in BCG have been used for a long period of time (at least for two years). Although induction is possible, such long-term immunity-inducing ability is an excellent feature not found in other DNA vaccines. ⁇ PT / JP02 / 12125
  • Recombinant BCG vaccine is an excellent vaccine candidate in terms of sustained immunity and its safety and ease of supply, and its effective use is an essential issue in the medical field.
  • the invention of this application has been made in view of the circumstances described above, and has as its object to provide a new means for effectively using a recombinant BCG vaccine.
  • This application is directed to a first aspect of the present invention, which is a recombinant BCG vaccine transformed by an expression vector having a polynucleotide encoding a foreign antigenic protein, Provided is a BCG vaccine characterized by being used for primary priming in immunity induction by multiple priming.
  • This application also provides, as a second invention, a method for inducing immunity by stimulating a foreign antigenic protein a plurality of times, wherein the first antigen stimulation is carried out by the BCG vaccine of the second invention,
  • the present invention provides a method characterized by performing one or more booster stimulations with an expressed non-BCG vaccine. 02 12125
  • the vaccine for boosting the additional antigen is a recombinant vaccinia virus vaccine, for example, a recombinant Dls vaccine.
  • the antigenic protein is derived from an immunodeficiency virus. More specifically, the antigenic protein of the immunodeficiency virus is an HIV gene product, for example, Gag.
  • the antigenic protein of the immunodeficiency virus is an HIV gene product, for example, Gag.
  • Each is a preferred embodiment. That is, according to the method of the present invention, for example, it is possible to almost completely prevent the virus from flowing out into the blood, which cannot be obtained by single administration of a recombinant vaccinia virus (eg, a recombinant Dls-gag vaccine). It is also possible to suppress the decrease in CD4 cells. As a result, at least the spread of the pathogenic virus in the body can be suppressed, and the progress of infectious diseases can be prevented.
  • FIG. 1 Aru schematic views illustrating the expression base Kuta one P SO-SIVgag configuration used to create the recombinant BCG strain (rBCG-SIVgag) in Example 1.
  • Figure 2 shows the results of Western blot analysis of the amount of Gag protein produced by rBCG-SIVgag.
  • Figure 3 shows the time course of blood virus RNA copy number (left figure) and the time course of CD4 cell number (right figure) when a control monkey was infected with a pathogenic virus.
  • Figure 4 shows the time course of blood viral RNA copy number after pathogenic virus infection in monkeys vaccinated with rBCG-SIVgag alone (left panel) and CD4 cell counts. He said, ⁇ , ⁇ ⁇ , ⁇
  • Figure 5 shows the time course of blood viral RNA copy number after infection with pathogenic virus (left panel) and the time course of CD4 cell number (right panel) in monkeys vaccinated with rDls-SIVgag alone.
  • Figure 6 shows the time course of blood viral RNA copy number (left figure) and CD4 cell number (right figure) after pathogenic virus infection in monkeys vaccinated with rDls-SIVgag + rBCG-SIVgag. is there.
  • FIG. 7 shows the time course of blood viral RNA copy number after pathogenic virus infection in monkeys vaccinated with rBCG-SIVgag + rDls-SIVgag.
  • Figure 7/1 shows the time course of CD4 cell numbers after infection with pathogenic virus in monkeys vaccinated with rBCG-SIVgag + rDls-SIVgag.
  • Figure 8 shows the time course of the viral viral RNA copy number after infection with a pathogenic virus when a control vaccine (vector) was immunized to monkeys with a history of BCG.
  • Figure 8/1 shows the time course of CD4 cell count after pathogenic virus infection when a control vaccine (vector) was inoculated to monkeys with a history of BCG.
  • Figure 9 shows blood viruses after pathogenic virus infection when monkeys with a history of BCG were vaccinated with rBCG-SIVgag (oral) + rDls-SIVgag (iv).
  • Figure 9/1 shows the time course of CD4 cell count after infection with the pathogenic virus when vaccinated with rBCG-SIVgag (oral) + rDls-SIVgag (intravenous) in monkeys with a history of BCG.
  • Figure 10 shows the blood virus after pathogenic virus infection when monkeys with a history of BCG were vaccinated with rBCG-SIVgag (vein) + rDls-SIVgag (vein).
  • Figure 10/1 shows monkeys with a history of BCG
  • the first invention is a recombinant BCG vaccine transformed with an expression vector having a polynucleotide encoding a foreign antigenic protein. And this recombinant BCG vaccine is characterized in that its use is used for initial antigen stimulation in immunization induction by antigen stimulation multiple times.
  • the inventors of the present application have proposed that even if a recombinant BCG vaccine does not have sufficient immunity-inducing ability when used alone, it can be used as a primary priming (priming) to provide a subsequent booster (booth).
  • the present inventors have found that the present invention enhances the specific immunity induction by Ting) and completed the present invention.
  • a BCG vector for example, plasmid pS0246 or the like
  • An expression vector can be constructed by inserting a polynucleotide encoding any foreign (ie, other than BCG) antigenic protein into the cloning site of this vector.
  • a foreign antigenic protein may be referred to as “foreign polypeptide J”, and a polynucleotide encoding the same may be referred to as “foreign polynucleotide”.
  • an exogenous polynucleotide can be ligated to any of the BCG strain-derived promoter and terminator sequences (eg, the promoter and terminator sequence of the BCG strain-derived heat shock protein Hsp).
  • the foreign polypeptide should be expressed well.
  • the foreign polynucleotide is a polynucleotide (for example, a cDNA fragment) encoding an antigenic protein other than the BCG strain, and the foreign polypeptide may be any as long as it induces an antigen-antibody reaction in vivo. .
  • the gag precursor p55 or p24 protein of the human immunodeficiency virus HIV
  • AIDS human acquired immunodeficiency syndrome
  • env protein gp120 or gp160 the env protein gp120 or gp160
  • po1 precursor protein the env protein gp120 or gp160
  • po1 precursor protein the env protein gp120 or gp160
  • the po1 precursor protein the env protein gp120 or gp160
  • the po1 precursor protein e.gp120 or gp160
  • the po1 precursor protein ef protein
  • Tat protein etc.
  • SIV simian immunodeficiency virus
  • other pathogens other pathogenic viruses or bacteria
  • polynucleotides encoding cancer cell antigen proteins can be used.
  • a polynucleotide which is a substantial sequence, is cut out from a plasmid into which a genomic gene encoding a foreign polypeptide or its cDNA has been cloned, using an appropriate restriction enzyme, or an appropriate sequence. Amplification may be performed by polymerase chain reaction (PCR) using the above primer. If not cloned, the genomic DNA of the bacterium or animal carrying the gene is used, and in the case of a virus, DNA or RNA from animal cells infected with the virus is used as type III, and the DNA fragment is amplified by the above PCR method. Can be obtained.
  • the expression vector thus constructed is introduced into the BCG strain by a known method such as calcium chloride method and electroporation method, and the expression of the foreign polypeptide of the transformed bacterium is determined by Western plot or a known immunoassay (
  • the recombinant BCG of the present invention can be prepared by confirmation by ELISA or the like.
  • a recombinant BCG vaccine can be prepared by suspending the recombinant BCG thus prepared in a liquid carrier similar to a normal BCG vaccine. It can be used in the immunity induction method of the second invention.
  • the method of the second invention is characterized in that priming is performed with the BCG vaccine of the first invention, and one or more booster stimuli are performed with a non-BCG vaccine expressing the same antigenic protein.
  • Vaccines for boosting antigens include known viruses and bacteria used in recombinant vaccines (eg, poliovirus, influenza virus, rhinovirus, varicella virus, vaccinia virus, salmonella, listeria, etc.).
  • BCG vaccine primary vaccine
  • the recombinant BCG vaccine (prime vaccine) of the first invention It can be prepared by transforming with a foreign polynucleotide.
  • the recombinant vaccinia virus Dls vaccine JP-A-2002-017370
  • Administration of the prime vaccine and the booster vaccine can be performed by known methods such as injection or oral administration.
  • the kind of the quarantine individuals human Bok or animal
  • body weight depending on the type of inducing immunized, eg if the plies ⁇ vaccine 0.01 to 10 mg, a booster vaccine 10 5 ⁇ 10 1 Q It can be about PFU.
  • the interval between vaccinations can be about 3 to 12 months.
  • the gag gene of SIV was isolated from plasmid pNL432 ( ⁇ Virol. 59: 284-291, 1986), and the hsp60 promoter and terminator sequence derived from the BCG strain were ligated before and after this gene DNA.
  • the expression vector pSO-SIVgag was constructed by inserting it into the multicloning site of the shuttle vector pS0246 (FEMS Microbiol. Lett. 135: 237-243, 1996) (FIG. 1).
  • rBCG-SIVgag recombinant BCG strain prepared in Example 1 and the recombinant vaccinia Dls (rDls-SIVgag), immunity was induced in Chinese quill.
  • rDls-SlVgag was prepared in the same manner as described in the above publication using the SlVgag gene instead of HIV-1 gag in Example 1 of JP-A-2002-017370.
  • the 14 quiz monkeys were divided into the following 5 groups, and immunized (boosted) at 0, 47, and 54 weeks after the initial antigen stimulation.
  • the first group (4 rats): Control (1 animal naive monkeys, 3 animals intradermal inoculation one rBCG-pS0246 (10 mg) and rDls-LacZ (10 6 PFU) intravenously inoculated twice)
  • mice rDls-SIVgag (10 6 PFU) of the venous inoculation twice + rBCG-SIVgag (10 mg) intradermal inoculation one
  • Group 5 (3 animals): 1 intradermal inoculation of rBCG-SIVgag (10 mg) + 2 intravenous inoculations of rDls-SIVgag (10 6 PFU)
  • pathogenic virus SHIV- KS661: 2000TCID 50
  • HIV- KS661 2000TCID 50
  • Group 1 (3 animals): 2 oral doses of rBCG-pS0246 (80 mg) rDls-LacZ
  • Group 2 (2 animals): 2 oral doses of rBCG-SIVgag (80 mg) + rDls-SIVgag
  • Group 3 (2 animals): 1 intravenous inoculation of rBCG-SIVgag (10 mg) + 1 intravenous inoculation of rDls-SIVgag (10 mg)
  • the invention of this application enables effective immunization induction using a recombinant BCG vaccine, and realizes effective prevention against various infectious diseases, cancer, etc. Is done.

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Description

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明細書
BCGワクチンとその利用
技術分野 この出願の発明は、 BCG ワクチンとその利用に関するものである。 さらに詳 しくは、 この出願の発明は、 各種感染症や癌等の予防や治療のための免疫誘導に おける初回抗原刺激に使用する組換え BCG ワクチンと、 この BCG ワクチンを 用いたヒ卜または動物の免疫誘導方法に関するものである。
背景技術 牛型結核菌弱毒 BCG株 （Mycobacterium bovis BCG。 以下 「BCG」 と記載す る） は、 その安全性から、 最も一般的な生バクテリアワクチンとして知られてい る。 一方、 この十数年来め遺伝子組換え技術の開発、 向上に伴い、 ウィルスや細菌 などの微生物に外来性の抗原性タンパク質を発現させるように改変して、 様々な 感染症や癌の予防および治療に対するワクチンベクターとして応用しょうという '研究が盛んに行われて来ている。 BCG についても、 例えばヒ卜免疫不全ウィル ス （HIV) ゃサル免疫免疫不全ウィルス （SIV) を標的とする組換え BCG ヮクチ ンカ報告されて ( る ( J. Immunol. 164:4968-4978, 2000; J. Virool. 71 :2303- 2309, 1997; I nfect. Immun. 57:283-288, 1989) 。 そして、 BCGに HIV遺伝子を 発現させたワクチンは長期に渡って （少なくとも 2年間は） 免疫の誘導が可能と なるが、 このような長期間の免疫誘導能は他の DNA ワクチンではみられない優 れた特徴である。 ^ P T/JP02/12125
しかしながら、 従来の組換え BCG ワクチンの場合には、 標的となる感染症や 癌等に対する免疫誘導能の点においては必ずしも十分なものではなかった。 例え ば、 HIV-1 を標的とする組換え BCG ワクチンを用いてモルモッ トに免疫誘導を 行った場合には、 通常の BCGワクチンのヒ卜への使用量 （0.05-0.1 mg) の 50〜 1 00倍の量を投与する必要がある （Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92: 10698-10697, 1995) 。 またサルのモデルを用いた試験では組換え BCG単独の投与では病原性 ウィルスの感染防御について好ましい結果は得られていない。 組換え BCG ワクチンは、 免疫の持続性およびその安全性と供給が容易である という点において優れたワクチン候補であリ、 その有効利用は医療分野において 不可欠の課題である。 この出願の発明は、 以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、 組換 え BCG ワクチンの有効利用のための新しい手段を提供することを課題としてい る。
発明の開示 この出願は、 前記の課題を解決するためめ第 1め発明として、 外来性の抗原性 タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現ベクターによって形質 転換された組換え BCG ワクチンであって、 複数回の抗原刺激による免疫誘導に おいて初回抗原刺激用として使用されることを特徵とする BCG ワクチンを提供 する。 またこの出願は、 第 2の発明として、 外来性の抗原性タンパク質を複数回刺激 する免疫誘導方法であって、 前記第〗発明の BCG ワクチンによって初回抗原刺 激を行い、 同一の抗原性タンパク質を発現する非 BCG ワクチンによって 1 回以 上の追加抗原刺激を行うことを特徴とする方法を提供する。 02 12125
この第 2発明の方法においては、 追加抗原刺激用のワクチンが、 組換えワクシ ニァウィルスワクチン、 例えば組換え Dlsワクチンであることを好ましい態様と している。 さらに、 前記第 1発明および第 2発明においては、 抗原性タンパク質が免疫不 全ウィルス由来であること、 さらに詳しくは、 免疫不全ウィルスの抗原性タンパ ク質が HIV遺伝子産物、 例えば Gagであることをそれぞれ好ましい態様として いる。 すなわち、 この発明の方法に従えば、 例えば組換えワクシニアウィルス （例え ば組換え Dls-gagワクチン） の単独投与では得られなウィルスの血中への流出を ほぼ完全に防止することができ、 また CD4 細胞の減少も抑制することが可能と なる。 これによつて、 少なくとも病原性ウィルスの体内での蔓延を抑制し、 感染 性疾患の進行を防止することが可能となる。
図面の簡単な説明 図 1 は、 実施例 1 における組換え BCG 株 （rBCG-SIVgag) の作成に使用した 発現べクタ一 PSO-SIVgagの構成を例示した模式図でぁる。 図 2は、 rBCG-SIVgagの Gag タンパク質産生量を測定したウェスタンブロッ 卜分析の結果である。 図 3は、 コントロールのサルに病原性ウィルスを感染させた場合の血中ウィル ス RNAコピー数の経時的変化 （左図） および CD4細胞数の経時的変化 （右図） である。 図 4は、 rBCG-SIVgag 単独をワクチン接種したサルにおける病原性ウィルス 感染後の血中ウィルス RNAコピー数の経時的変化，（左図） および CD4細胞数の 曰本国特訐厅 ι Ι,ΟΙ
経時的変—化 （右図） である。 図 5は、 rDls-SIVgag 単独をワクチン接種したサルにおける病原性ウィルス感 染後の血中ウィルス RNAコピー数の経時的変化 （左図） および CD4細胞数の経 時的変化 （右図） である。 図 6は、 rDls-SIVgag + rBCG-SIVgag をワクチン接種したサルにおける病原性 ウィルス感染後の血中ウィルス RNAコピー数の経時的変化 （左図） および CD4 細胞数の経時的変化 （右図） である。 図 7は rBCG-SIVgag + rDls-SIVgagをワクチン接種したサルにおける病原性ゥ ィルス感染後の血中ウィルス RNA コピー数の経時的変化である。 図 7 / 1 は rBCG-SIVgag + rDls-SIVgag をワクチン接種したサルにおける病原性ウィルス感 染後の CD4細胞数の経時的変化である。 図 8は BCG 既往反応を有するサルにコントロールワクチン （ベクター） を接 種した場合の、 病原性ウィルス感染後の血中ウィルス RNA コピー数の経時的変 化である。 図 8 / 1 は BCG既往反応を有するサルにコントロールワクチン （べク ター） を接種した場合の、 病原性ウィルス感染後の CD4 細胞数の経時的変化で ある。 図 9は BCG 既往反応を有するサルに rBCG-SIVgag (経口） + rDls-SIVgag (静脈） のワクチン接種をした場合の、 病原性ウィルス感染後の血中ウィルス
RNA コピー数の経時的変化である。 図 9 / 1 は BCG 既往反応を有するサルに rBCG-SIVgag (経口） + rDls-SIVgag (静脈） のワクチン接種をした場合の、 病 原性ウィルス感染後 CD4細胞数の経時的変化である。 図 1 0は BCG 既往反応を有するサルに rBCG-SIVgag (静脈） + rDls-SIVgag (静脈） のワクチン接種をした場合の、 病原性ウィルス感染後の血中ウィルス
RNA コピー数の経時的変化である。 図 1 0 / 1 は BCG 既往反応を有するサルに
差替え用紙（規則 26) rBCG-SIVgag (静脈） + rDls-SIVgag (静脈） のワクチン接種をした場合の、 病 原性ウィルス感染後 CD4細胞数の経時的変化である。
差替え用紙 (規則 26) T JP02/12125
発明を実施するための最良の形態 第 1発明は、 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有 する発現ベクターによって形質転換された組換え BCG ワクチンである。 そして この組換え BCG ワクチンは、 複数回の抗原刺激による免疫誘導において、 その 使用が初回抗原刺激用として使用されることを特徴とする。 すなわち、 この出願 の発明者らは、 単独使用では十分な免疫誘導能を持たない組換え BCG ワクチン であっても、 初回抗原刺激 （プライミング） として使用することによって、 その 後の追加抗原刺激 （ブースティング） による特異的免疫誘導を強化することを見 出してこの発明を完成させた。
BCG 株は、 結核の予防接種等に使用されている公知のものを対象とすること ができる。 発現ベクターは、 従来の組換え BCG ワクチンの作成に使用されてい るような、 BCG 用ベクター （例えばプラスミド pS0246等） を使用することが できる。 このベクターのクローニングサイ 卜に、 外来性 （すなわち、 BCG 以 外） の任意の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することに よって発現ベクターを構築することができる。 なお、 以下の記載では、 外来性の 抗原性タンパク質を 「外来ポリペプチド J 、 これをコードするポリヌクレオチド を 「外来ポリヌクレオチド」 と記載することがある。 また、 外来ポリヌクレオチ ドには、 BCG 株由来の任意のプロ乇一夕一およびターミネータ一配列 （例えば BCG株由来のヒー卜ショックタンパク質 Hspのプロモータ一およびターミネ一 ター配列） 等を連結することによって、 外来ポリペプチドを良好に発現させるよ うにする。 外来ポリヌクレオチドは、 BCG 株以外の抗原性タンパク質をコードするポリ ヌクレオチド （例えば、 cDNA 断片） であり、 外来ポリペプチドは生体内で抗原 抗体反応を惹起するものであれば如何なるものであってもよい。 具体的にはヒ卜 後天性免疫不全症候群 （AIDS ) の原因ウィルスであるヒ卜免疫不全ウィルス ( HIV) の gag前駆体 p55または p24タンパク質、 envタンパク質 gp120また は gp160、 po1前駆体タンパク質、 nef タンパク質、 tatタンパク質等を対象とす ることができる。 また、 サル免疫不全ウィルス （SIV) 由来の同様の抗原性ポリ ペプチドを使用することもできる。 あるいは、 その他の病原体 （他の病原性ウイ ルスや細菌） 、 もしくは癌細胞の抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド 等を用いることもできる。 外来ポリヌクレオチドの取得方法としては、 外来ポリペプチドをコードするゲ ノ厶遺伝子またはその cDNA がクローン化されたプラスミドからその実質的な 配列であるポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切り出すか、 適当な配列のブラ イマ一を用いた polymerase chain reaction ( PCR) により増幅すればよい。 ク ローン化されていない場合は、 その遺伝子を持つ細菌、 動物のゲノム DNA を、 ウィルスの場合はウィルスが感染した動物細胞由来の DNA または RNA を铸型 として、 上記 PCR 法により DNA 断片を増幅することにより得ることができる。 このようにして構築した発現ベクターを、 塩化カルシゥ厶法や電気穿孔法等の 公知に方法で BCG 株に導入し、 形質転換菌の外来ポリペプチドの発現をウェス タンプロットや公知の免疫測定法 （例えば ELISA 法等） によって確認すること によって、 この発明の組換え BCGを作成することができる。 このようにして作成した組換え BCG を、 通常の BCG ワクチンと同様の液状 担体に懸濁するすることのよつて、 組換え BCG ワク ンを作成することができ, このワクチンは、 実際には第 2発明の免疫誘導方法に使用することができる。 第 2発明の方法は、 前記第 1発明の BCG ワクチンによって初回抗原刺激を行 い、 同一の抗原性タンパク質を発現する非 BCG ワクチンによって 1 回以上の追 加抗原刺激を行うことを特徴としている。 追加抗原刺激用のワクチン （ブースターワクチン） は、 組換えワクチンに使用 されている公知のウィルスや細菌 （例えばポリオウイルス、 インフルエンザウイ ルス、 ライノウィルス、 水痘ウィルス、 ワクシニアウィルス、 サルモネラ菌、 リ ステリア菌等） を、 第 1発明の組換え BCG ワクチン （プライ厶ワクチン） と同 一の外来ポリヌクレオチドによって形質転換することによって作成することがで きる。 この発明の方法においては、 この出願の発明者らが先に開発した組換えヮ クシニアウィルス Dls ワクチン （特開 2002-017370号公報） を好ましいブース ターワクチンとしている。 プライ厶ワクチンとブースタ一ワクチンの投与は、 注射または経口投与等の公 知の方法によって行うことができる。 投与量およびスケジュールは、 被検疫個体 の種類 （ヒ卜または動物） 、 体重、 誘導する免疫の種類等によって異なるが、 例 えば、 プライ厶ワクチンを 0.01〜10mg、 ブースターワクチンを 105~ 101 Q PFU 程度とすることができる。 また、 ワクチン接種の間隔は、 3〜12 ヶ月程度とする ことができる。 以下、 実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細かつ具体的に説明す るが、 この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
実施例 実施例 1
組換え BCGの作成
SIVの gag遺伝子をプラスミド pNL432 (丄 Virol. 59:284-291 , 1986) から単 離し、 この遺伝子 DNAの前後に BCG株由来の hsp60プロモーターおよびター ミネーター配列をそれぞれ連結し、 これを大腸菌一 BCG 株シャ トルベクター pS0246 (FEMS Microbiol. Lett. 135:237-243, 1996) のマルチクローニングサイ 卜に挿入して発現ベクター pSO-SIVgagを構築した （図 1 ) 。
この発現ベクターを、 文献 （Pro. Natl. Acad. Sci. USA. 85:6987-6991 , 1988) の記載に従い、 Gene-pulser ( Bio-Rad 社） を用いて BCG 東京株に導入し、 20 g/mlのカナマイシン含有の Middlebrook 7H10寒天培地 （Difco社） 上で形質 転換菌を選択し、 pSO-SIVgaa を保有する組換え BCG 株 （rBCG-SIVgag) を作 P T/JP02/12125
成した。
ウェスタンブロッテイングによって SIV gag 夕ンパク質の産生を確認した結 果、 図 2に示したように、 rBCG-SIVgagの抽出物において 55 kDaタンパク質が 検出された。 一方、 コントロールの rBCG-pS0246 では Gag タンパク質は検出 されなかった。 また SIV Gag タンパク質の濃度は、 rBCG-SIVgag 1 mg 当たり 45 ± 12 ngであり、 この産生レベルは少なくとも 450回の in vitro継代の間維持 されていた。
実施例 2
免疫誘導
実施例 1で作成した組換え BCG株 （rBCG-SIVgag) 、 および組換えワクシニ ァ Dls ( rDls-SIVgag) を用いて力二クイサルに免疫誘導を行った。 なお、 rDls- SlVgag は、 特開 2002-017370号公報の実施例 1 における HIV-1 gagの代わりに SlVgag遺伝子を用いて、 前記公報記載と同様の方法により作製した。
力二クイサル 14匹を以下の 5群に分け、 初回抗原刺激から 0、 47、 54週後の 時点で免疫 （ブースティング） した。
第 1 群 （4匹） ： コントロール （ 1 匹はナイーブサル、 3匹は rBCG-pS0246 ( 10 mg) の皮内接種 1 回と rDls-LacZ ( 106PFU) の静脈接種を 2回）
第 2群 （ 2匹） ： rBCG-SIVgag ( 10 mg) の皮内接種 1 回
第 3群 （2匹） ： rDls-SIVgag ( 106PFU) の静脈接種 2回
第 4群 （ 3匹） ： rDls-SIVgag ( 106PFU ) の静脈接種 2回 + rBCG-SIVgag ( 10 mg) の皮内接種 1 回
第 5群 （ 3 匹） ： rBCG-SIVgag ( 10 mg ) の皮内接種 1 回 + rDls-SIVgag ( 106PFU) の静脈接種 2回
次いで、 2回目のブースター免疫から 10 週間後に、 病原性ウィルス （SHIV- KS661 : 2000TCID50) を粘膜感染させ （チャレンジ） 、 経時的に血中のウィルス RNAコピー数および CD4細胞数を計測した。
コントロール群のサルに SHIV-KS661 を感染させると、 図 3に示したように, CD4は約 2週間後に 1桁から 2桁に減少し、 それに反してウィルス RNAの血中 コピー数は 108-9レベルに増加し、 速やかにセットポイントに達し、 105-6レベル を推移した。 また、 rBCG-SIVgag 単独 （第 2群： 図 4 ) 、 および rDls-SIVgag 単独 （第 3群： 図 5 ) の場合も、 CD4およびウィルス RNA数の経時的変化はコ ン卜ロールと同様であった。 さらに、 rDls-SIVgag (プライミング） + rBCG- SIVgag (ブースティング） を行ったサル （第 4群） の場合もコントロールや単 独免疫と同様の経時的変化を示した。
これに対して、 第 5群 （rBCG-SIVgag + rDls-SIVgag) のサルの場合には、 図 7に示したように、 ウィルス RNAコピー数は顕著に減少し、 強い Gag特異的免 疫が誘導された。 また、 CD4細胞の減少も有意に抑制された。
以上の結果から、 組換え BCG ワクチン （rBCG-SIVgag) でプライミングを行 い、 組換え Dls ワクチン （rDls-SIVgag) でブースティングを行うことによって、 強い特異的免疫が誘導されることが確認された。
実施例 3
BCGの既往症反応の制御 この発明の免疫誘導方法における BCG既往症反応の影響を検討した。 すなわ ち、 ヒ卜での実際の投与の影響を想定して約 2年前に BCG 東京株 （0.1 mg) を 力二クイサルに接種し、 2年後でも DTH が明らかに誘導されていることを確認 した後、 以下の 3群のサルにワクチン接種を行った。
第 1 群 （ 3 匹） ： rBCG-pS0246 ( 80 mg ) の経口接種 2 回十 rDls-LacZ
( 106PFU) の静脈接種を 2回）
第 2群 （ 2 匹） ： rBCG-SIVgag ( 80 mg ) の経口接種 2 回 + rDls-SIVgag
( 106PFU) の静脈接種 2回
第 3群 （ 2匹） ： rBCG-SIVgag ( 10 mg ) の静脈接種 1 回 + rDls-SIVgag ( 10 mg) の静脈接種 1回
なお、 2回のプライミングは- 48 週および 0週時点で、 2回のブースティング は 27 週および 57週後の時点で行った。 また、 第 3群は、 0週時点でブライミ ング、 57週時点でブースティングを行った。 P T/JP02/12125
1 0
最後のワクチン接種から約 3 か月後に病原性ウィルス （ SHIV-C2/1 20TCID50) をチャレンジし、 CD4細胞数およびウィルス RNAコピー数を経時的 に計測した。
結果は図 8— 1 0に示したとおりである。 rBCG-SIVgag プライミング （静 脈） + rBCG-SIVgagブースティング （静脈） （第 3群） のウィルス RNA数およ び CD4 数の経時的変化 （図 1 0 ) はコン卜ロール （第 1群） と同様であった。 これに対して、 rBCG-SIVgag プライミング （経口） + rBCG-SIVgag ブースティ ング （静脈） （第 2群） では、 血中ウィルス量の有意な減少と、 CD4 細胞の減 少抑制が観察された。
以上の結杲から、 rBCG-SIVgag を経口接種によってプライミングを行い、 rBCG-SIVgag を静脈接種によってブースティングすることによって、 免疫誘導 のみならず、 防御免疫においても既往症反応の影響を除外することが可能である ことが確認された。
産業上の利用可能性 以上詳しく説明したとおり、 この出願の発明によって、 組換え BCG ワクチン を用いた効果的な免疫誘導が可能となり、 様々な感染症や癌等に対して、 有効な 予防が実現される。

Claims

1 1 請求の範囲
1 . 外来性の抗原性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを保有する発現 ベクタ一によって形質転換された組換え BCG ワクチンであって、 複数回の抗原 刺激による免疫誘導において初回抗原刺激用として使用されることを特徴とする BCGワクチン。
2 . 抗原性タンパク質が免疫不全ウィルス由来である請求項 1 の BCG ヮクチ ン。
3 . 免疫不全ウィルスの抗原性タンパク質が HIV 遺伝子産物である請求項 2 の BCGワクチン。
4 . 外来性の抗原性タンパク質を複数回刺激する免疫誘導方法であって、 請求 項 1の BCG ワクチンによって初回抗原刺激を行い、 同一の抗原性タンパク質を 発現する非 BCG ワクチンによって 1 回以上の追加抗原刺激を行うことを特徴と する方法。
5 . 追加抗原刺激用のワクチンが、 組換えワクシニアウィルスワクチンである 請求項 4の方法。 "
6 . 抗原性タンパク質が免疫不全ウィルス由来である請求項 4の方法。
7 . 免疫不全ウィルスの抗原性タンパク質が HIV 遺伝子産物である請求項 6 の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006057454A1 (en) * 2004-11-25 2006-06-01 Japan Science And Technology Agency A method of prime-boost vaccination

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002017370A (ja) * 2000-07-07 2002-01-22 Japan Science & Technology Corp 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0023203D0 (en) * 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB9922361D0 (en) * 1999-09-21 1999-11-24 Isis Innovation Generating an immune response to an antigen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002017370A (ja) * 2000-07-07 2002-01-22 Japan Science & Technology Corp 遺伝子組換えワクシニアウイルスワクチン

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KREMER, L. et al:, "Systemic and mucosal immune responses after intranasal administration of recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin expressing glutathione S-transferase from Schistosoma haematobium.", Infect. Immun., 1998, Vol. 66, No. 12, pp. 5669-76 *
LAGRANDERIE, M. et al:, "Oral immunization with recombinant Mycobacterium bovis BCG simian immunodeficiency virus nef induces local and systemic cytotoxic T-lymphocyte responses in mice.", J. Virol., 1997, Vol. 71, No. 3, pp. 2303-9, particularly, abstract, page 2304 *
MARTIN, E. et al:, "Comparative protective effects of recombinant DNA and Mycobacterium bovis bacille Calmette-Guerin vaccines against M. avium infection.", Clin.Exp.Immunol., 2001, Vol. 126, No. 3, pp. 482-7 *
Mitsuo HONDA et al:, "HIV Kozo Idenshi to HIV Seigyo Idenshi no Combination Vaccine no Kaihatsu ni Kansuru Kenkyu (Research on the Development of combination vaccine of HIV controlling gene)", AIDS Iyakuhin Kaihatsu Kenkyu Juten Kenkyu Hokokusho Heisei 13 Nendo, 2002, September, pages 73 to 79 *
Mitsuo HONDA: "HIV-1 Vaccine no Saishu Hyoteki Shudan toshite Boshi Kansenji no Kaiseki to Kekkaku BCG Vaccine no Eikyo (analysis of infection of infant from mother child as a HIV-1 vaccine last target group and effect of tuberculosis BCG vaccine)", AIDS Iyakuhin Kaihatsu Kenkyu Heisei 12 Nendo Kokusai Kenkyu Guran to Jigyo Kenkyu Hokoku, 2001, pages 56 to 61 *
MIYAJI, E.N. et al:; "Induction of neutralizing antibodies against diphtheria toxin by priming with recombinant Mycobacterium bovis BCG expressing CRM197, a mutant diphtheria toxin.", Infect. Immun., 2001, Vol. 69, No. 2, pp. 869-74 *
Shuzo YAMAZAKI et al:, "Seikansen Sho (STD) no Chiryogakuteki Tenbo STD no Ryuko eno Taisaku 29. HIV Vaccine no Kaihatsu (Development of HIV Candidate Vaccines)", Antibiotics & Chemotherapy, 1999, Vol. 15, special extra issue, pages 237 to 246 *
SUPPLY, P. et al:, "Immunogenicity of recombinant BCG producing the GRA1 antigen from Toxoplasma gondii.", Vaccine, 1999, Vol. 17, Nos. 7 to 8, pp. 705-14 *
Takeaki OSU et al:, "AIDS Vaccine no Kaihatsu (Development of AIDS Candidate Vaccines)", Gene & Medicine, 1999, Vol. 3, No. 4, pages 688 to 694 *
Tetsuya NAKASATOMI et al:, "Seitai Bogyo no Saizensen-Nenmaku Men'eki Kiko o Megutte Nenmaku Vaccine ni Mukete HIV Kogen Bunpitsugata Recombinant Vaccine no Oyo Ko HIV Recombinant BCG Vaccine wa Nenmaku Men'eki o Kokateki ni Yudo dekiruka (HIV-1 specific mucosal immune responses induced by secretion of a chimeric soluble protein from a recombinant Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin vector-based vaccine: Can the recombinant BCG vector-based vaccine induce mucosal immunity for HIV-1 effectively)", Igaku no Ayumi, 1996, Nov. separate volume, pages 192 to 195 *
YASUTOMI, Y. et al:, "A vaccine -elicited, single viral epitope-specific cytotoxic T lymphocyte response does not protect against intravenous, cell-free simian immunodeficiency virus challenge.", J. Virol., 1995, Vol. 69, pp. 2279-84 *
YASUTOMI, Y. et al:, "Combined modality immunization for elicitation of SIVmac gag-specific CTLs", Vaccines 94: Mod. Approaches New Vaccines Incl: Prev.AIDS, (Annu.Meet.), 11th, 1994 (Meeting Date 1993), pp. 211-15 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006057454A1 (en) * 2004-11-25 2006-06-01 Japan Science And Technology Agency A method of prime-boost vaccination

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