WO2003094945A1 - Verwendung von hyperforin und derivaten davon zur hemmung der angiogenese - Google Patents

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WO2003094945A1
WO2003094945A1 PCT/EP2003/004748 EP0304748W WO03094945A1 WO 2003094945 A1 WO2003094945 A1 WO 2003094945A1 EP 0304748 W EP0304748 W EP 0304748W WO 03094945 A1 WO03094945 A1 WO 03094945A1
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WO
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adhyperforin
hyperforin
diseases
use according
treatment
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PCT/EP2003/004748
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English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph M. Schempp
Jan C. Simon
Original Assignee
Universitätsklinikum Freiburg
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/38—Clusiaceae, Hypericaceae or Guttiferae (Hypericum or Mangosteen family), e.g. common St. Johnswort

Definitions

  • the invention relates to medicaments for the treatment of diseases in which excessive vascularization occurs.
  • Substances and drugs are provided that can be used to treat such diseases.
  • Pathological angiogenesis can be inhibited by the compounds.
  • the supply of living tissues and organs with intact blood vessels is an important prerequisite for their function. It ensures a balanced supply of nutrients and oxygen. Rapidly growing tissues and tissues of embryonic development depend on good vascular supply.
  • the angiogenesis takes place in different stages and is subject to a complex regulation by pro- and antiangiogenetic signals (review by Jancopoulos GD et al., Nature 2000, 407: 242-248). However, there are a number of diseases which are associated with excessive vascularization (angiogenesis) (review by Carmeliet P et al., Nature 2000, 407: 249-257). Two examples will be discussed in more detail below.
  • RA rheumatoid arthritis
  • pannus tissue a characteristic feature.
  • angiogenesis is one of the first histological findings of RA in the synovium and appears to be necessary for the formation of inflammatory pannus tissue (Colville-Nash et al., Rheum Dis 1992, 51: 919-925).
  • the formation of new vessels not only seems to maintain the chronic morphological changes in the pannus tissue, but it also appears to play an active role in the inflammation itself as a source of cytokines and proteases (Colville-Nash et al., Rheum Dis 1992, 51: 919-925 ).
  • angiogenesis-promoting molecules such as basic fibroblast growth factor (bFGF), interleukin-8 and vascular endothelial growth factor (VEGF-A) were found in the synovialis and synovia in patients with rheumatoid arthritis (Qu Z, Lab Invest 1995 73: 339-346).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • VEGF-A vascular endothelial growth factor
  • tumor growth With a certain size of the primary tumor, the growth of malignant tumors also depends on the formation of new blood vessels.
  • angiogenesis By inhibiting angiogenesis, tumor growth can be inhibited or destroyed (Gullino PM, J Nat Cancer Inst, 1978, 61: 639-643).
  • Tumor angiogenesis is influenced by various endogenous soluble factors (Dettmar, J Invest Dermatol [Symp Proc] 2000, 5: 20-23). It is an important task of oncology to find new natural and artificial inhibitors of angiogenesis. Through their use it is possible to inhibit the growth of tumors and to successfully combat cancer diseases (Carmeliet P et al., 2000, Nature: 407: 249-257.
  • hyperforin can inhibit the growth of endothelial cells in vitro and in an animal model even at a very low concentration.
  • adhyperforin and salts of hyperforin and adhyperforin also have an antiangiogenic effect.
  • adhyperforin in aqueous solution is stable over a longer period of time, whereas hyperforin is almost completely broken down within a few hours. Therefore the use of Adhyperforin solves the known problem of instability of Hyperforin, especially in aqueous solution.
  • Hyperforin is a lipophilic active ingredient of St. John's wort (Hypericum perforatum L.) (Roth L, 1990, Hypericum - Hypericin. Botany, ingredients, effects. Ecomed medicinal plant monograph. Ecomed, Landsberg / Lech. Maisenbacher P, Kovar KA, 1992, Planta Medica 58: 351-354).
  • the formula of Hyperforin and Adhyperforin is given below:
  • WO 98/44936 describes the production of a stable extract of Hypericum perforatum, in which the Hyperforin remains stable over a longer period, and the possible use for depressive disorders.
  • WO 99/41220 describes the production of stable salts of hyperforin and the possible use in Alzheimer's disease.
  • WO 99/64388 describes the production of chemically modified hyperforin derivatives, their galenical processing and use in depressive disorders.
  • WO 00/30660 describes the possible use of hyperforin in cream and ointment form and the cytostatic effect of hyperforin.
  • the present invention therefore relates to the use of hyperforin and / or pharmaceutically acceptable derivatives thereof for the treatment of diseases in which pathological angiogenesis occurs.
  • Preferred derivatives of hyperforin are adhyperforin and salts of hyperforin and adhyperforin.
  • the DCHA (N-, N-dicyclohexylamino) salts of hyperforin and adhyperforin are particularly preferred.
  • the salts of hyperforin and adhyperforin disclosed in WO 99/41220 can also be used.
  • derivatives of hyperforin in which hyperforin has been chemically modified z. B. by derivatization of the hydroxyl group on the central 6-ring, by modification of the hydrocarbon side chains or by oxidation.
  • US 2001/0020040 A1 discloses various derivatives of hyperforin in which the hydroxyl group on the central 6-ring has been acylated or coupled with a sugar. The use of such derivatives for the treatment of diseases in which pathological angiogenesis occurs is also the subject of this application.
  • hyperforin, adhyperforin and / or their salts are particularly preferred, since hyperforin and adhyperforin are natural substances which can be isolated in large quantities from renewable plant material and, on the other hand, when used in effective concentrations, no toxic reactions are observed either in vitro or in vivo become.
  • Pathological angiogenesis occurs in various diseases: These include diseases of the blood vessels (e.g. atherosclerosis, hemangiomas, hemangioendotheliomas), skin diseases (e.g.
  • Hyperforin and its derivatives can also be used to treat cancers with excessive angiogenesis, e.g. B. of tumors, especially malignant tumors.
  • Tumors that are dependent on increased angiogenesis are e.g. renal cell carcinoma, retinoblastoma or any tumor the size of which requires additional oxygen supply.
  • Hyperforin, Adhyperforin and its derivatives are preferably processed in the form of salts, suspensions, aqueous emulsions or in liposomal form.
  • Pharmaceutical dosage forms include infusion solutions, gastric juice-resistant capsules, creams, ointments, lotions, gels and sprays.
  • Preferred concentrations of hyperforin, adhyperforin and related compounds are between 1-100 ⁇ M final concentration, preferably 5-20 ⁇ M.
  • the preferred dose is 5 mg / kg body weight or such concentrations with which effective plasma and tissue levels, e.g. 10-50 ⁇ g / ml.
  • Another aspect of the invention is the use of hyperforin and pharmaceutically acceptable derivatives thereof for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases in which pathological angiogenesis occurs.
  • the preferred embodiments correspond to those already mentioned above.
  • the invention also relates to the use of hyperforin and pharmaceutically acceptable derivatives thereof for the inhibition of pathological angiogenesis.
  • adhyperforin inhibits the growth of tumor cells 5-10 times more effectively than hyperforin and triggers apoptosis in tumor cells.
  • Another aspect of the invention is therefore the use of Adhyperforin and / or pharmaceutically acceptable salts thereof for the treatment of cancer and / or precancerous diseases.
  • adhyperforin is many times more stable in an aqueous solution than hyperforin, which is completely degraded within a few hours (example 9).
  • cancerous diseases are understood to mean in particular malignant tumors as well as lymphomas and leukaemias.
  • Adhyperforin is also particularly effective against metastases, such as metastases from malignant melanoma (black skin cancer).
  • Adhyperforin is also effective against epithelial tumors such as epithelial skin cancer. This is a slowly growing skin cancer that is easily accessible for topical treatment. Epithelial skin cancer is also called spinalioma, squamous cell carcinoma or spiked cell cancer. In addition, Adhyperforin is suitable for the treatment of precancerous stages (precancerosis), such as solar precancerosis.
  • precancerosis precancerous stages
  • Adhyperforin is also suitable for the treatment of breast cancer.
  • Adhyperforin is particularly interesting for lymphomas / leukaemias, poorly operable tumors and for the adjuvant treatment of metastases. In the case of malignant melanoma in particular, all therapies previously used for this purpose have shown only very moderate success.
  • Adhyperforin can be administered intravenously for the treatment of systemic tumors and metastases.
  • the lyophilized or dried active ingredient can, for example, be freshly dissolved in physiological saline and immediately injected or infused. However, the active ingredient can also be administered orally, for example in tablet form.
  • Adhyperforin is also suitable for local use, for example by intra- or peritumoral injection or instillation (e.g. also endoscopically).
  • the active ingredient can be provided, for example, as described above for intravenous administration.
  • the active ingredient can advantageously also be applied by epicutaneous application, for example in cream form, this application form being particularly suitable, for example, for the treatment of solar precancerous diseases.
  • the active ingredient can, for example, be dissolved in ethanol and incorporated into a fat ointment base. This can act on the tumor occlusively (under film), for example for 24 hours. Particularly preferred ointments and creams are described in more detail below.
  • the active ingredient can also be incorporated into a transdermal patch in which the active ingredient is continuously released over a longer period of time (months).
  • the adhyperforin concentration at the site of action should be so high that an antiproliferative or apoptosis-inducing effect occurs.
  • concentration required for this can vary depending on the type of tumor being treated and can easily be determined by a person skilled in the art.
  • an adhyperforin concentration in the administered solution of 10-50 ⁇ g / ml is advantageous and, in the case of epicutaneous application, an active substance concentration of 20-100 ⁇ g / ml.
  • the active ingredient should be injected in amounts such that plasma levels of at least 10-50 ⁇ g / ml are achieved.
  • adhyperforin can advantageously be administered in a pharmaceutical formulation in the form of a topical ointment, cream or lotion which contains at least 2, preferably at least 5 ⁇ g / ml adhyperforin.
  • the invention also relates to a gel or spray with the stated concentrations.
  • the ointment, cream, lotion, gel or spray should contain an active ingredient concentration which is preferably in the range from 2 to 100 ⁇ g / ml adhyperforin, more preferably in the range from 5 to 20 ⁇ g / ml.
  • the active ingredient can either be introduced into the ointment, cream, lotion, gel or spray as a pure substance or in the form of a St. John's wort extract of a defined concentration.
  • the ointment, cream, lotion, gel or spray according to the invention preferably comprises no other plant extracts except St. John's wort extract.
  • the total extract standardized (adjusted) for Adhyperforin should be an ethanolic or an ethanolic extract.
  • these can be commercially available total extracts (tinctures).
  • the ethanol content is preferably between 20 and 60% v / v, preferably 40-50% v / v.
  • aqueous extracts, CO 2 extracts or fresh plant extracts are also suitable, provided that they meet the requirements for the active substance content.
  • the qualitative and quantitative analysis of the St. John's wort extract used for the ointment or cream according to the invention is carried out by means of high pressure liquid chromatography (HPLC) (P. Maisenbacher et al., Planta Med. 58: 351-354 (1992)).
  • HPLC high pressure liquid chromatography
  • DAC German Medicinal Codex
  • the ointment or cream according to the invention can comprise various pharmaceutically acceptable cream or ointment bases.
  • these include, for example, white petroleum jelly, viscous paraffin, wool wax, ascorbyl palmitate, glycerol monostearate 60, tocopherol (vitamin E), cetyl alcohol, medium chain triglycerides, yellow wax, propylene glycol, macrogol 1000 glycerol monostearate, citric acid, ascorbic acid and other preservatives and distilled water.
  • a preferred ointment according to the invention comprises about 15% by weight of St. John's wort extract and white petroleum jelly, viscous paraffin, wool wax and ascorbyl palmitate, each in a suitable amount.
  • a preferred cream according to the invention comprises about 10% by weight of St. John's wort extract and white petroleum jelly, glycerol monostearate 60, cetyl alcohol, medium-chain triglycerides, yellow wax, propylene glycol, macrogol-1000-glycerol monostearate, citric acid and water, each in a suitable amount.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of a topical ointment, cream, lotion, gel or spray, in which adhyperforin or a St. John's wort extract adjusted to adhyperforin is mixed with auxiliaries in such a way that an ointment, cream, lotion, gel or spray is mixed with a minimum content of 2 ⁇ g / ml, preferably 5-20 ⁇ g / ml Adhyperforin.
  • the ointment or cream according to the invention is suitable, for example, for the treatment of cancer or precancerous diseases.
  • the ointment or cream according to the invention has the advantage that it can be adapted to different skin conditions from the base.
  • both fat-soluble (Adhyperforin) and water-soluble active ingredients of St. John's wort can be incorporated into an ointment or cream base.
  • a superior effect can be achieved compared to the known St. John's wort oil.
  • the penetration of the active ingredients from cream and ointment bases is better compared to oils.
  • the invention also relates to the use of adhyperforin and pharmaceutically acceptable salts thereof as a cytostatic.
  • Hyperforin and Adhyperforin can be isolated in large quantities from St. John's wort.
  • St. John's wort special extracts contain up to 30% of a hyperforin-adhyperforin mixture (Erdelmeier CAJ, 1998, Pharmacopsychiatry 31 Suppl: 2-6).
  • St. John's wort is easy and environmentally friendly to cultivate, so that the provision of large amounts of hyperforin and adhyperforin is unproblematic.
  • Adhyperforin has also been found to inhibit tumor cell growth 5-10 times more effectively than Hyperforin.
  • a particular advantage of Adhyperforin is its excellent stability in aqueous solution compared to Hyperforin, which enables its preferred use in biological systems.
  • FIG. 1 shows the inhibition of the proliferation of primary human, dermal, microvascular endothelial cells (HDMEC) by hyperforin, adhyperforin, hyperforin-DCHA and adhyperforin-DCHA.
  • HDMEC microvascular endothelial cells
  • FIG. 2 shows the influence of hyperforin, adhyperforin, hyperforin-DCHA and adhyperforin-DCHA on the apoptosis of HDMEC (concentration of all test substances 5 ⁇ M).
  • FIG. 3 shows a comparison of the proliferation-inhibiting effect of hyperforin, adhyperforin, hyperforin-DCHA and adhyperforin-DCHA on two different tumor cell lines (Jurkat and MT450).
  • FIG. 4 shows the influence of hyperforin, adhyperforin, hyperforin-DCHA and adhyperforin-DCHA on the apoptosis of MT450 tumor cells.
  • HDMEC Primary human dermal microvascular endothelial cells
  • Endothelial cells were incubated with Hyperforin, Adhyperforin and the DCHA salts of Hyperforin and Adhyperforin and after 24 hours the LDH concentration in the supernatant was examined in comparison to untreated controls. Up to a concentration of 10 ⁇ M, there was no increase in the LDH concentration (Table 1).
  • Table 1 Influence of the membrane integrity of HDMEC (LDH release) by Hyperforin, Adhyperforin, Hyperforin-DCHA and Adhyperforin-DCHA.
  • HF Hyperforin
  • AdHF Adhyperforin This means that hyperforin and related compounds do not damage the cell membrane.
  • Example 3 endothelial cells as mentioned above were incubated with hyperforin, adhyperforin and their DCHA salts and the apoptosis rate was measured using a specific oligonucleosome ELISA. In contrast to the positive control camptothecin, there was no induction of apoptosis in the endothelial cells up to a concentration of 10 ⁇ M hyperforin (FIG. 2).
  • Example 4 a cell cycle analysis was used to investigate whether hyperforin in endothelial cells influences the cell cycle.
  • endothelial cells were incubated with Hyperforin for 24 and 36 hours. The cells were then permeabilized and the DNA content of the cells after staining with propidium iodide was determined by means of FACS analysis. It was shown that there was no change in the DNA profile compared to the untreated control by means of Hyperforin (Table 2). These data demonstrate that hyperforin does not result in cell cycle arrest or induction of apoptosis in endothelial cells.
  • Hyperforin 5 ⁇ M; Taxol: 1 ⁇ M.
  • Example 5 demonstrate that the inhibition of proliferation by hyperforin is not based on toxic effects.
  • example 5 it was examined in an angiogenesis model whether hyperforin can inhibit the formation of new vessels.
  • HDMEC were incubated on a complex extracellular matrix with Hyperforin (2 ⁇ M) and filmed for several hours with a video microscope. The images were then evaluated using computer-aided analysis. It was found that the untreated endothelial cells form tubular vessels on the extracellular matrix within a few hours. In contrast, no vascularization was seen in the endothelial cells treated with Hyperforin (Table 3).
  • Table 3 Influence of vascularization and motility of HDMEC by Hyperforin (5 ⁇ M).
  • Example 6 shows the antiangiogenic effect of hyperforin in vivo in an orthotopic tumor model of the rat.
  • MT-450 breast cancer cells were injected subcutaneously in the area of the mammary gland.
  • Each 8 animals were treated with dissolved hyperforin (2mM) or the corresponding amount of solvent over a period of 3 weeks (peritumoral injection).
  • frozen sections of the Tumor material stained with a monoclonal antibody against endothelial cells (anti-CD31).
  • the counting of the mean vascular density showed a significantly reduced number of small vessels per visual field in the tumors treated with Hyperforin (mean 7 +/- 7) compared to tumors treated with the solvent (18 +/- 6).
  • Treatment of the rats with hyperforin showed no toxic effects such as weight loss or reduced motility.
  • Example 7 shows the inhibition of tumor cell proliferation by adhyperforin in comparison to hyperforin and its DCHA salts (FIG. 3).
  • Jurkat human lymphoma cells
  • MT450 breast carcinoma of the rat
  • Endothelial cell proliferation was measured by incorporating tritium thymidine into the DNA. It can be seen that the adhyperforin is superior to the hyperforin in both cell lines: a 50% inhibition of proliferation is achieved by adhyperforin in 3-1 ox lower concentrations than with hyperforin.
  • Adhyperforin is as effective in both cell lines as the stabilized salts of hyperforin and adhyperforin of WO 99/41220.
  • Example 8 shows the induction of apoptosis in MT450 tumor cells by Adhyperforin in comparison to Hyperforin and their DCHA salts (FIG. 4).
  • the tumor cells were incubated with hyperforin, adhyperforin and their DCHA salts and the apoptosis rate after 24 h was measured using a specific oligonucleosome ELISA (Boehringer).
  • Adhyperforin as well as Hyperforin and its DCHA salts induce dose-dependent apoptosis in the tumor cells.
  • the example shows that adhyperforin induces a significantly stronger induction of apoptosis in tumor cells compared to hyperforin.
  • Example 9 shows the better stability of the adhyperforin in aqueous solution compared to hyperforin.
  • Highly purified Adhyperforin or Hyperforin (over 98%, HPLC) was freshly dissolved in a final concentration of 1 mg / mL in pure DMSO or in a mixture of DMSO (200 ⁇ L) and phosphate buffer (800 ⁇ L) and the content of Hyperforin, Adhyperforin and their breakdown products measured using validated HPLC after 1 hour, after 1 day and after 1 week.
  • Table 4 shows the result of this investigation. It can be seen from this that, even after one week, no substantial degradation of the substances has taken place in the organic solvent. The breakdown of Hyperforin is greatest (87.6% after 1 week).
  • hyperforin begins in an aqueous emulsion after one hour (88.8%), 27.5% hyperforin is still detectable after one day and 0% hyperforin after 1 week.
  • adhyperforin in aqueous solution is significantly more stable (96.1% after 1 day and 77.2% after 1 week) (Table 4).

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine pathologische Angiogenese auftritt. Krankheiten, die so behandelt werden können, sind Erkrankungen der Blutgefäße, Hautkrankheiten, Endometriose des Uterus, angioproliferative Retinopathie, Erkrankungen der Knochen und Gelenke und Krebserkrankungen mit überschießender Angiogenese. Adhyperforin ist aufgrund seiner verbesserten Wirksamkeit und seiner überlegenen Stabilität gegenüber Hyperforin bevorzugt.

Description

Verwendung von Hyperforin und Derivaten davon zur Hemmung der Angiogenese
Die Erfindung betrifft Arzneimittel zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine überschießende Gefäßneubildung auftritt. Es werden Stoffe und Arzneimittel bereitgestellt, die zur Behandlung derartiger Erkrankungen verwendet werden können. Durch die Verbindungen kann eine pathologische Angiogenese gehemmt werden.
Die Versorgung lebender Gewebe und Organe mit intakten Blutgefäßen ist eine wichtige Voraussetzung für deren Funktion. Sie gewährleistet eine ausgewogene Zufuhr von Nährstoffen und Sauerstoff. Insbesondere rasch wachsende Gewebe und Gewebe der Embryonalentwicklung sind auf eine gute Gefäßversorgung angewiesen. Die Angiogenese läuft in verschiedenen Stadien ab und unterliegt einer komplexen Regulation durch pro- und antiangiogenetische Signale (Übersicht bei Jancopoulos GD et al., Nature 2000, 407:242-248). Es gibt jedoch eine Reihe von Krankheiten, die mit einer überschießenden Gefäßneubildung (Angiogenese) einhergehen (Übersicht bei Carmeliet P et al., Nature 2000, 407:249-257). Im folgenden soll auf zwei Beispiele näher eingegangen werden. Bei der Rheumatoiden Arthritis (RA) ist die Schädigung peripherer Gelenke, wobei Knochen und Knorpel durch eine proliferative Synovitis zerstört werden, ein charakteristisches Merkmal. Die Bildung von neuen Gefäßen (Angiogenese) ist einer der ersten histologischen Befunde der RA in der Synovialis und scheint für die Bildung des entzündlichen Pannusgewebes erforderlich zu sein (Colville-Nash et al., Rheum Dis 1992, 51 :919-925). Hierbei scheint die Gefäßneubildung nicht nur die chronischmorphologischen Veränderungen des Pannusgewebes aufrecht zu erhalten, sondern sie scheint als Quelle für Zytokine und Proteasen eine aktive Rolle bei der Entzündung selber zu spielen (Colville-Nash et al., Rheum Dis 1992, 51 :919-925). Die durch die Angiogenese erhöhte funktionelle Gefäßdichte fördert die Infiltration der Synovialis mit Entzündungszellen (Paleolog E, Mol Pathol 1997, 50:225-233). So wurden in der Synovialis und der Synovia bei Patienten mit rheumatoider Arthritis erhöhte Spiegel von Angiogenese-fördemden Molekülen wie basic fibroblast growth factor (bFGF), lnterleukin-8 und vascular endothelial growth factor (VEGF-A) gefunden (Qu Z, Lab Invest 1995 73:339- 346).
Auch das Wachstum maligner Tumoren hängt ab einer bestimmten Größe des Primärtumors von der Neubildung von Blutgefäßen ab. Durch Hemmung der Angiogenese kann es zu einer Hemmung des Tumorwachstums oder zu dessen Zerstörung kommen (Gullino PM, J Nat Cancer Inst, 1978, 61 :639-643). Die Tumorangiogenese wird durch verschiedene endogene lösliche Faktoren beeinflusst (Dettmar, J Invest Dermatol [Symp Proc] 2000, 5:20-23). Es ist eine wichtige Aufgabe der Onkologie, neue natürliche und künstliche Inhibitoren der Angiogenese zu finden. Durch deren Einsatz gelingt es, das Wachstum von Tumoren zu hemmen und Krebskrankheiten erfolgreich zu bekämpfen (Carmeliet P et al., 2000, Nature: 407:249-257. Fiedler W et al., 2001 , Deutsches Ärzteblatt, 98:1183-1185). Da bisher die Zahl der wirksamen Angiogenese-Inhibitoren begrenzt ist und die Entwicklung neuer Angiogenese-Inhibitoren aufwendig und teuer ist, besteht ein großes Interesse an der Entdeckung neuer Inhibitoren der Angiogenese.
Eine Aufgabe der Erfindung ist es somit, Verbindungen bereitzustellen, die inhibierend auf die Angiogenese wirken. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst.
Es wurde überraschend gefunden, daß Hyperforin das Wachstum von Endothelzellen in vitro und in einem Tiermodell bereits in sehr niedriger Konzentration hemmen kann. In der vorliegenden Anmeldung wird weiterhin offenbart, daß neben Hyperforin auch Adhyperforin und Salze von Hyperforin und Adhyperforin eine antiangiogenetische Wirkung aufweisen. Darüber hinaus wurde gefunden, daß Adhyperforin in wässriger Lösung über einen längeren Zeitraum stabil ist, wogegen Hyperforin innerhalb weniger Stunden fast vollständig abgebaut wird. Deshalb löst die Verwendung von Adhyperforin das bekannte Problem der Instabilität des Hyperforins insbesondere in wässriger Lösung.
Hyperforin ist ein lipophiler Wirkstoff des Johanniskrauts (Hypericum perforatum L.) (Roth L, 1990, Hypericum - Hypericin. Botanik, Inhaltsstoffe, Wirkungen. Ecomed Arzneipflanzen-Monographie. Ecomed, Landsberg/Lech. Maisenbacher P, Kovar KA, 1992, Planta Medica 58:351-354). Die Formel von Hyperforin und Adhyperforin ist im folgenden wiedergegeben:
Figure imgf000004_0001
R=H: Hyperforin R=CH3: Adhyperforin
Seit langem bekannt ist eine antibiotische Wirkung von Hyperforin (Gurevich AI et al., 1971 , Antibiotiki 16:510-513). In neuerer Zeit wurde die antidepressive Wirkung des Johanniskrauts bei leichten bis mittelschweren Depressionen durch zahlreiche Studien nachgewiesen (Schulz V, Hansel R, 1996: Johanniskraut als Antidepressivum. In: Schulz V, Hansel R [Hrsg.] Rationale Phytotherapie, Ratgeber für die ärztliche Praxis. Springer Berlin, 3. Auflage: 56-71). Die antidepressive Wirkung von Hypericum perforatum wird zumindest teilweise durch Hyperforin vermittelt (Müller WE et al., 1998, Pharmacopsychiatry 31 , Suppl 1 :16-21). Femer sind entzündungshemmende und zytostatische Eigenschaften von Hyperforin bekannt, die auf der Induktion von Apoptose beruhen (Schempp CM et al. 2000, Br J Dermatol 142:979-984. Schempp CM et al., 2002, Oncogene 21 :1242-1250).
WO 98/44936 beschreibt die Herstellung eines stabilen Extraktes von Hypericum perforatum, in dem das Hyperforin über einen längeren Zeitraum stabil bleibt, und die mögliche Anwendung bei depressiven Erkrankungen. WO 99/41220 beschreibt die Herstellung stabiler Salze des Hyperforins und die mögliche Anwendung bei Morbus Alzheimer. WO 99/64388 beschreibt die Herstellung chemisch modifizierter Hyperforin- Derivate, deren galenische Verarbeitung und Anwendung bei depressiven Erkrankungen. WO 00/30660 beschreibt die mögliche Verwendung von Hyperforin in Creme- und Salbenform und die zytostatische Wirkung von Hyperforin.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von Hyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine pathologische Angiogenese auftritt.
Bevorzugte Derivate von Hyperforin sind Adhyperforin sowie Salze von Hyperforin und Adhyperforin. Besonders bevorzugt sind die DCHA- (N-,N-Dicyclohexylamiι ) Salze von Hyperforin und Adhyperforin. Auch die in WO 99/41220 offenbarten Salze von Hyperforin und Adhyperforin können verwendet werden.
Weiterhin sind als Derivate von Hyperforin Verbindungen anzusehen, bei denen Hyperforin chemisch modifiziert wurde, z. B. durch Derivatisierung der Hydroxylgruppe am zentralen 6-Ring, durch Modifikation der Kohlenwasserstoff-Seitenketten oder durch Oxidation. US 2001/0020040 A1 offenbart verschiedene Derivate des Hyperforins, bei denen die Hydroxylgruppe am zentralen 6-Ring acyliert oder mit einem Zucker gekoppelt wurde. Die Verwendung derartiger Derivate zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine pathologische Angiogenese auftritt, ist auch Gegenstand dieser Anmeldung.
Besonders bevorzugt ist aber die Verwendung von Hyperforin, Adhyperforin und/oder deren Salzen, da Hyperforin und Adhyperforin natürliche Substanzen sind, die in großer Menge aus nachwachsendem Pflanzenmaterial isoliert werden können und andererseits bei Anwendung in wirksamen Konzentrationen weder in vitro noch in vivo toxische Reaktionen beobachtet werden. Bei verschiedenen Erkrankungen tritt eine pathologische Angiogenese auf: Hierzu gehören Krankheiten der Blutgefäße (z.B. Atherosklerose, Hämangiome, Hämangioendotheliome), Hautkrankheiten (z.B. Warzen, Granuloma teleangiektatikum, Kaposi-Sarkom, Psoriasis), Endometriose des Uterus, angioproliferative Retinopathie (z.B. Retinopathie der Frühgeborenen, diabetische Retinopathie) und Krankheiten der Knochen und Gelenke (z.B. rheumatoide Arthritis, Synovitis, Osteomyelitis, Pannuswachstum). Die Verwendung von Hyperforin und pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Behandlung dieser Erkrankungen ist besonders bevorzugt. Weitere Krankheiten, die erfindungsgemäß behandelt werden können, sind in Carmeliet P et al., Nature 2000, 407:249-257 offenbart.
Hyperforin und seine Derivate können auch zur Behandlung von Krebserkrankungen mit überschießender Angiogenese verwendet werden, z. B. von Tumoren, insbesondere von malignen Tumoren. Tumoren, die von einer verstärkten Angiogenese abhängig sind, sind z.B. das Nierenzellkarzinom, das Retinoblastom oder alle Tumoren, deren Größe eine zusätzliche Sauerstoffversorgung erfordert.
Hyperforin, Adhyperforin und seine Derivate werden bevorzugt in Form von Salzen, Suspensionen, wässrigen Emulsionen oder in liposomaler Form verarbeitet. Galenische Darreichungsformen umfassen Infusionslösungen, Magensaft-resistente Kapseln, Cremes, Salben, Lotionen, Gele und Sprays. Bevorzugte Konzentrationen des Hyperforins, Adhyperforins und verwandter Verbindungen sind zwischen 1-100 μM Endkonzentration, vorzugsweise 5-20 μM. Bei systemischer Applikation beträgt die bevorzugte Dosis 5 mg/kg Körpergewicht oder solche Konzentrationen, mit denen wirksame Plasma- und Gewebespiegel, z.B. 10-50 μg/ml, erreicht werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von Hyperforin und pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine pathologische Angiogenese auftritt. Die bevorzugten Ausführungsformen entsprechen den oben bereits genannten.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Hyperforin und pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Hemmung einer pathologischen Angiogenese. Darüber hinaus wurde überraschenderweise gefunden, daß Adhyperforin das Wachstum von Tumorzellen 5-10 mal effektiver hemmt als Hyperforin und in Tumorzellen Apoptose auslöst. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher die Verwendung von Adhyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Salzen davon zur Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen.
Außerdem wurde überraschend gefunden, daß Adhyperforin in einer wässrigen Lösung um ein Vielfaches stabiler ist als Hyperforin, welches bereits innerhalb weniger Stunden vollständig abgebaut ist (Beispiel 9).
Unter Krebserkrankungen werden in diesem Zusammenhang insbesondere maligne Tumoren sowie Lymphome und Leukämien verstanden.
Adhyperforin ist jedoch auch gegen Metastasen, wie Metastasen des malignen Melanoms (schwarzer Hautkrebs) besonders wirksam.
Adhyperforin ist auch gegenüber epithelialen Tumoren wie epithelialem Hautkrebs wirksam. Hierbei handelt es sich um einen langsam wachsenden Hautkrebs, der einer topischen Behandlung gut zugänglich ist. Der epitheliale Hautkrebs wird auch Spinaliom, Plattenepithelkarzinom oder Stachelzellkrebs genannt. Darüber hinaus eignet sich Adhyperforin zur Behandlung von Krebsvorstufen (Präkanzerosen), wie beispielsweise solaren Präkanzerosen.
Darüber hinaus eignet sich Adhyperforin zur Behandlung von Mamma-Karzinomen (Brustkrebs).
In der Praxis ist die Verwendung von Adhyperforin insbesondere bei Lymphomen/Leukämien, schlecht operablen Tumoren und für die adjuvante Behandlung von Metastasen interessant. Insbesondere bei dem malignen Melanom zeigen alle bislang hierfür in der Praxis verwendeten Therapien nur sehr mäßige Erfolge. Für die Behandlung systemischer Tumoren und von Metastasen kann Adhyperforin intravenös verabreicht werden. Für die intravenöse Applikation kann der lyophilisierte oder getrocknete Wirkstoff beispielsweise frisch in physiologischer Kochsalzlösung aufgelöst und sofort injiziert bzw. infundiert werden. Der Wirkstoff kann jedoch auch oral, beispielsweise in Tablettenform verabreicht werden.
Adhyperforin eignet sich aber auch für die lokale Anwendung beispielsweise durch intra- oder peritumorale Injektion oder Instillation (z.B. auch endoskopisch). Hierfür kann der Wirkstoff beispielsweise wie vorstehend für die intravenöse Applikation beschrieben bereitgestellt werden. Vorteilhaft kann der Wirkstoff jedoch auch durch epikutane Applikation beispielsweise in Cremeform angewandt werden, wobei sich diese Anwendungsform beispielsweise zur Behandlung von solaren Präkanzerosen besonders eignet.
Für die lokale, epikutane Applikation kann der Wirkstoff beispielsweise in Ethanol gelöst und in eine fette Salbengrundlage eingearbeitet werden. Diese kann okklusiv (unter Folie) beispielsweise für 24 Stunden auf den Tumor einwirken. Besonders bevorzugte Salben und Cremen werden im folgenden genauer beschrieben. Alternativ hierzu kann der Wirkstoff auch in ein transdermal wirkendes Pflaster eingearbeitet werden, bei dem der Wirkstoff über eine längere Zeitdauer (Monate) kontinuierlich abgegeben wird.
Bei der Aufbereitung des Wirkstoffs muß beachtet werden, daß es sich um eine lichtempfindliche Substanz handelt, die sich leicht zersetzt. Daher muß bei der Gewinnung, Lagerung und Verabreichung auf einen entsprechenden Lichtschutz geachtet werden.
Bei der erfindungsgemäßen Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen mit Adhyperforin sollte die Adhyperforinkonzentration am Wirkort so hoch sein, daß eine antiproliferative bzw. Apoptose-induzierende Wirkung eintritt. Die hierfür notwendige Konzentration kann je nach Art des behandelten Tumors variieren und vom Fachmann leicht bestimmt werden. Vorteilhaft ist beispielsweise bei intratumoraler Injektion eine Adhyperforinkonzentration in der verabreichten Lösung von 10-50 μg/ml und bei epikutaner Applikation eine Wirkstoffkonzentration von 20-100 μg/ml. Bei systemischer Anwendung sollte der Wirkstoff in solchen Mengen injiziert werden, daß Plasmaspiegel von mindestens 10-50 μg/ml erreicht werden. Als ein weiterer Aspekt dieser Erfindung wurde gefunden, daß sich Adhyperforin vorteilhaft in einer pharmazeutischen Formulierung in Form einer topischen Salbe, Creme oder Lotion, die mindestens 2, bevorzugt mindestens 5 μg/ml Adhyperforin enthält, verabreichen läßt. Auch ein Gel oder Spray mit den angegebenen Konzentrationen ist Gegenstand der Erfindung.
Die Salbe, Creme, Lotion, das Gel oder Spray sollte eine Wirkstoffkonzentration enthalten, die bevorzugt im Bereich von 2 - 100 μg/ml Adhyperforin, bevorzugter im Bereich von 5 - 20 μg/ml liegt.
Der Wirkstoff kann entweder als Reinsubstanz in die Salbe, Creme, Lotion, in das Gel oder Spray eingebracht werden oder in Form eines Johanniskrautextrakts definierter Konzentration. Die erfindungsgemäße Salbe, Creme, Lotion, Gel oder Spray umfaßt dabei bevorzugt außer Johanniskrautextrakt keine weiteren Pflanzenextrakte.
Der auf Adhyperforin standardisierte (eingestellte) Gesamtextrakt sollte ein ethanolischer oder ein mit Ethanol versetzter Extrakt sein. Hierbei kann es sich beispielsweise um im Handel erhältliche Gesamtextrakte (Tinkturen) handeln. Der Ethanolgehalt liegt bevorzugt zwischen 20 und 60 % v/v, bevorzugt bei 40-50% v/v.
Prinzipiell sind auch wäßrige Extrakte, CO2-Extrakte oder Frischpflanzenauszüge geeignet, insofern sie die Anforderungen an den Wirkstoffgehalt erfüllen.
Die qualitative und quantitative Analyse des für die erfindungsgemäße Salbe oder Creme verwendeten Johanniskrautextrakts erfolgt mittels Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie (HPLC) (P. Maisenbacher et al., Planta Med. 58:351-354 (1992)). Zur Messung der Gesamthypericine wird das photometrische Verfahren nach dem "Deutschen-Arzneimittel-Codex" (DAC) verwendet.
Die erfindungsgemäße Salbe oder Creme kann neben dem Wirkstoff oder den Wirkstoffen verschiedene pharmazeutisch verträgliche Creme- bzw. Salbengrundlagen umfassen. Hierzu gehören beispielsweise weiße Vaseline, dickflüssiges Paraffin, Wollwachs, Ascorbylpalmitat, Glycerolmonostearat 60, Tocopherol (Vitamin E), Cetylalkohol, mittelkettige Triglyceride, gelbes Wachs, Propylenglycol, Macrogol-1000- glycerolmonostearat, Zitronensäure, Ascorbinsäure und andere Konservierungsstoffe und destilliertes Wasser.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Salbe umfaßt etwa 15 Gew.-% Johanniskrautextrakt sowie weiße Vaseline, dickflüssiges Paraffin, Wollwachs und Ascorbylpalmitat jeweils in geeigner Menge.
Eine bevorzugte erfindungsgemäße Creme umfaßt etwa 10 Gew.-% Johanniskrautextrakt sowie weiße Vaseline, Glycerolmonostearat 60, Cetylalkohol, mittelkettige Triglyceride, gelbes Wachs, Propylenglykol, Macrogol-1000-glycerolmonostearat, Zitronensäure und Wasser jeweils in geeigneter Menge.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer topischen Salbe, Creme, Lotion, eines Gels oder Sprays, in dem Adhyperforin oder ein auf Adhyperforin eingestellter Johanniskrautextrakt so mit Hilfsstoffen vermischt wird, daß man eine Salbe, Creme, Lotion, ein Gel oder Spray mit einem Mindestgehalt von 2 μg/ml, bevorzugt 5-20 μg/ml Adhyperforin erhält.
Bei Verwendung eines Johanniskrautextrakts zur Herstellung der erfindungsgemäßen Salbe oder Creme muß dieser zum Schutz des Adhyperforins vor Oxidation bis zu seiner Verarbeitung unter Schutzgas (z.B. Argon) fest verschlossen und lichtgeschützt aufbewahrt werden.
Die erfindungsgemäße Salbe oder Creme eignet sich beispielsweise zur Behandlung von Krebserkrankungen oder Präkanzerosen.
Die erfindungsgemäße Salbe oder Creme hat den Vorteil, daß sie von der Grundlage her an verschiedene Hautzustände angepaßt werden kann. Darüber hinaus können sowohl fettlösliche (Adhyperforin) als auch wasserlösliche Wirkstoffe des Johanniskrauts in eine Salben- bzw. Cremegrundlage eingearbeitet werden. Hierdurch kann eine überlegene Wirkung gegenüber dem bekannten Johanniskrautöl erreicht werden. Außerdem ist die Penetration der Wirkstoffe aus Creme- und Salbengrundlagen im Vergleich zu Ölen besser. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Adhyperforin und pharmazeutisch verträglichen Salzen davon als Zytostatikum.
Zusammenfassend wurde überraschend gefunden, daß Hyperforin, Adhyperforin und deren Salze hochwirksame Inhibitoren der Angiogenese sind. Hyperforin und Adhyperforin lassen sich in großer Menge aus Johanniskraut isolieren. Johanniskraut-Spezialextrakte enthalten bis zu 30 % eines Hyperforin-Adhyperforin-Gemisches (Erdelmeier CAJ, 1998, Pharmacopsychiatry 31 Suppl:2-6). Johanniskraut läßt sich leicht und umweltschonend kultivieren, so daß die Bereitstellung größerer Mengen von Hyperforin und Adhyperforin unproblematisch ist. Die nachstehend beschriebenen Beispiele belegen die antiangiogenetische von Hyperforin, Adhyperforin und verwandten Verbindungen in vitro, in einem Angiogenese-Modell, und in vivo in einem Tumormodell. Diese Beispiele dienen der Veranschaulichung des Wirkprinzipes der Erfindung, schränken aber die Anwendbarkeit von Hyperforin und verwandten Verbindungen zur Hemmung der Angiogenese nicht ein.
Außerdem wurde gefunden, daß Adhyperforin das Wachstum von Tumorzellen 5-10 mal wirksamer hemmt als Hyperforin. Ein besonderer Vorteil des Adhyperforins ist seine im Vergleich zu Hyperforin ausgezeichnete Stabilität in wässriger Lösung, was seine vorzugsweise Verwendung in biologischen Systemen ermöglicht.
Figur 1 zeigt die Hemmung der Proliferation von primären humanen, dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC) durch Hyperforin, Adhyperforin, Hyperforin- DCHA und Adhyperforin-DCHA.
Figur 2 stellt den Einfluss von Hyperforin, Adhyperforin, Hyperforin-DCHA und Adhyperforin-DCHA auf die Apoptose von HDMEC dar (Konzentration aller Testsubstanzen 5 μM).
Figur 3 zeigt einen Vergleich der proliferationshemmenden Wirkung von Hyperforin, Adhyperforin, Hyperforin-DCHA und Adhyperforin-DCHA auf zwei verschiedene Tumorzellinien (Jurkat und MT450).
Figur 4 zeigt den Einfluss von Hyperforin, Adhyperforin, Hyperforin-DCHA und Adhyperforin-DCHA auf die Apoptose von MT450 Tumorzellen. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher.
Beispiel 1
Primäre humane, dermale mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMEC) wurden auf kollagenbeschichteten Mikrotiterplatten in Endothelzellmedium mit oder ohne Zugabe von Hyperforin, Adhyperforin und deren DCHA-Salzen für 24 Stunden inkubiert. Die Proliferation der Endothelzellen wurde mittels Tritium-Thymidin-Einbau in die DNA gemessen. Die Ergebnisse sind in Figur 1 zusammengefasst. Das Wachstum der Endothelzellen wird von allen Substanzen bereits in niedrigen Konzentrationen gehemmt: Hyperforin 2 μM, Hyperforin-DCHA 1 ,5 μM, Adhyperforin 1 μM, Adhyperforin-DCHA 1 μM.
Beispiel 2
Es wurden Endothelzellen mit Hyperforin, Adhyperforin und den DCHA-Salzen von Hyperforin und Adhyperforin inkubiert und nach 24 Stunden die LDH-Konzentration im Überstand im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen untersucht. Hierbei zeigte sich bis zu einer Konzentration von 10 μM keine Zunahme der LDH-Konzentration (Tabelle 1).
Tabelle 1 : Beeinflussung der Membranintegrität von HDMEC (LDH-Release) durch Hyperforin, Adhyperforin, Hyperforin-DCHA und Adhyperforin-DCHA.
HF HF-DCHA AdHF AdH F-DCHA
O μM 8 10 9 8
1 μM 8 8 10 9
2 μM 5 10 9 9
4 μM 6 7 9 10
8 μM 7 11 10 9
16 μM 6 10 8 10
HF = Hyperforin, AdHF = Adhyperforin Dies bedeutet, daß es durch Hyperforin und verwandte Verbindungen zu keiner Schädigung der Zellmembran kommt.
Beispiel 3
In Beispiel 3 wurden Endothelzellen wie oben genannt mit Hyperforin, Adhyperforin und deren DCHA-Salzen inkubiert und die Apoptose-Rate mittels eines spezifischen Oligonukleosomen-ELISA gemessen. Hierbei zeigte sich, im Gegensatz zur Positivkontrolle Camptothecin, bis zu einer Konzentration von 10 μM Hyperforin keine Induktion von Apoptose in den Endothelzellen (Figur 2).
Beispiel 4
In Beispiel 4 wurde mit einer Zellzyklusanalyse untersucht, ob Hyperforin in Endothelzellen den Zelizyklus beeinflußt. Hierzu wurden Endothelzellen für 24 und 36 Stunden mit Hyperforin inkubiert. Anschließend wurden die Zellen permeabilisiert und der DNA-Gehalt der Zellen nach Färbung mit Propidium-Jodid mittels FACS-Analyse bestimmt. Hierbei zeigte sich, daß es durch Hyperforin im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle zu keiner Änderung des DNA-Profils kommt (Tabelle 2). Diese Daten belegen, daß es durch Hyperforin nicht zu einem Zellzyklusarrest oder zur Apoptoseinduktion in Endothelzellen kommt.
Tabelle 2: Beeinflussung des Zelizyklus von HDMEC durch Hyperforin (24h).
Hyperforin Medium Taxol
sub-g1 6% 5% 8%
g1/g0 79% 76% 56%
g2/m 15% 19% 36%
Hyperforin: 5 μM; Taxol: 1 μM.
Die Beispiele 2, 3 und 4 belegen, daß die Proliferationshemmung durch Hyperforin nicht auf toxischen Effekten beruht. Beispiel 5
In Beispiel 5 wurde in einem Angiogenese-Modell untersucht, ob Hyperforin die Gefässneubildung inhibieren kann. Hierzu wurden HDMEC auf einer komplexen extrazellulären Matrix mit Hyperforin (2 μM) inkubiert und über mehrere Stunden mit einem Videomikroskop gefilmt. Anschließend wurden die Bilder mittels Computer-gestützter Analyse ausgewertet. Hierbei zeigte sich, daß die unbehandelten Endothelzellen auf der extrazellulären Matrix innerhalb weniger Stunden schlauchartige Gefäße ausbilden. Im Gegensatz hierzu war bei den mit Hyperforin behandelten Endothelzellen keinerlei Gefäßbildung zu erkennen (Tabelle 3).
Tabelle 3: Beeinflussung der Gefässbildung und der Motilität von HDMEC durch Hyperforin (5 μM).
Gefässe Motilität
ledium HF Medium HF
Oh
3h
6h ++
12h ++
Beispiel 6
Beispiel 6 zeigt die antiangiogenetische Wirkung von Hyperforin in vivo in einem orthotopen Tumormodell der Ratte. MT-450 Mammakarzinomzellen wurden subkutan im Bereich der Brustdrüse injiziert. Je 8 Tiere wurden über einen Zeitraum von 3 Wochen mit gelöstem Hyperforin (2mM) oder der entsprechenden Menge des Lösungsmittels behandelt (peritumorale Injektion). Anschließend wurden Gefrierschnitte des Tumormaterials mit einem monoklonalen Antikörper gegen Endothelzellen (anti-CD31) gefärbt. Die Auszählung der mittleren Gefäßdichte ergab eine signifikant verminderte Anzahl kleiner Gefäße pro Gesichtsfeld in den mit Hyperforin behandelten Tumoren (Mittelwert 7 +/- 7) im Vergleich zu mit dem Lösungsmittel behandelten Tumoren (18 +/- 6). Die Behandlung der Ratten mit Hyperforin ergab keinen toxischen Einfluß wie Gewichtsabnahme oder verringerte Motilität.
Beispiel 7
Beispiel 7 zeigt die Hemmung der Tumorzellproliferation durch Adhyperforin im Vergleich zu Hyperforin und deren DCHA-Salze (Figur 3). Jurkat (humane Lymphomzellen) und MT450 (Mammakarzinom der Ratte) wurden mit Hyperforin, Adyperforin und den DCHA- Salzen von Hyperforin und Adhyperforin inkubiert. Die Proliferation der Endothelzellen wurde mittels Tritium-Thymidin-Einbau in die DNA gemessen. Es zeigt sich, daß bei beiden Zellinien das Adhyperforin dem Hyperforin überlegen ist: eine 50%ige Hemmung der Proliferation wird durch Adhyperforin in 3-1 Ox niedrigeren Konzentrationen als mit Hyperforin erreicht. Adhyperforin zeigt sich in beiden Zellinien als ebenso wirksam wie die stabilisierten Salze aus Hyperforin und Adhyperforin der WO 99/41220.
Beispiel 8
Beispiel 8 zeigt die Apoptoseinduktion in MT450 Tumorzellen durch Adhyperforin im Vergleich zu Hyperforin und deren DCHA-Salze (Figur 4). Die Tumorzellen wurden mit Hyperforin, Adhyperforin und deren DCHA-Salzen inkubiert und die Apoptoserate nach 24 h mittels eines spezifischen Oligonukleosomen-ELISA (Boehringer) gemessen. Durch Adhyperforin wird ebenso wie durch Hyperforin und deren DCHA-Salze eine dosisabhängige Apoptose in den Tumorzellen induziert. Das Beispiel zeigt, daß Adhyperforin im Vergleich zu Hyperforin auch eine deutlich stärkere Apoptoseinduktion in Tumorzellen induziert.
Beispiel 9
Beispiel 9 zeigt die im Vergleich zu Hyperforin bessere Stabilität des Adhyperforins in wässriger Lösung. Hoch aufgereinigtes Adhyperforin bzw. Hyperforin (über 98 %, HPLC), wurde in einer Endkonzentration von 1 mg/mL in reinem DMSO oder in einem Gemisch von DMSO (200 μL) und Phosphatpuffer (800 μL) frisch aufgelöst und der Gehalt von Hyperforin, Adhyperforin und deren Abbauprodukten mittels validierter HPLC nach 1 Stunde, nach 1 Tag und nach 1 Woche gemessen. Tabelle 4 zeigt das Ergebnis dieser Untersuchung. Hieraus geht hervor, daß in dem organischen Lösungsmittel auch nach einer Woche noch kein wesentlicher Abbau der Substanzen stattgefunden hat. Am stärksten ist der Abbau des Hyperforins (nach 1 Woche noch 87,6 %). Dagegen setzt in wässriger Emulsion der Abbau des Hyperforins bereits nach einer Stunde ein (88,8 %), nach einem Tag sind noch 27,5 % Hyperforin und nach 1 Woche 0 % Hyperforin nachweisbar. Im Gegensatz hierzu ist das Adhyperforin in wässriger Lösung bedeutend stabiler (nach 1 Tag noch 96,1 %, nach 1 Woche noch 77,2 %) (Tabelle 4).
Tabelle 4: Untersuchungen zur Stabilität von Hyperforin und Adhyperforin. Chromatographische Reinheit in %, ausgehend von 100 % zum Zeitpunkt 0.
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n.n. nicht nachweisbar

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von Hyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen, bei denen eine pathologische Angiogenese auftritt.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat von Hyperforin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adhyperforin, DCHA-Hyperforin und DCHA-Adhyperforin.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Krebserkrankungen mit überschießender Angiogenese, Erkrankungen der Blutgefäße, Hautkrankheiten, Endometriose des Uterus, angioproliferative Retinopathie und Erkrankungen der Knochen und Gelenke.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung der Blutgefäße ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Atherosklerose, Hämangiom und Hämangioendotheliom.
5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Hautkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, Warzen, Granuloma teleangiektatikum, Kaposi-Sarkom, Angiosarkome und chronischen Venenerkrankungen.
6. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Erkrankung der Knochen und Gelenke ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis, Synovitis und Osteomyelitis.
7. Verwendung von Hyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Derivaten davon zur Hemmung einer pathologischen Angiogenese.
8. Verwendung von Adhyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebserkrankungen und/oder Präkanzerosen.
9. Verwendung nach Anspruch 8 zur Behandlung von Lymphomen und/oder Leukämien und Gefäßtumoren.
10. Verwendung nach Anspruch 8 zur Behandlung von Metastasen.
11. Verwendung nach Anspruch 8 zur Behandlung von epithelialen Tumoren und/oder epithelialen Präkanzerosen.
12. Topische Salbe, Creme, Lotion, Gel oder Spray oder andere galenische Zubereitungen enthaltend mindestens 2 μg/ml Adhyperforin.
13. Topische Salbe, Creme, Lotion, Gel oder Spray oder andere galenische Zubereitungen nach Anspruch 12, enthaltend 2 - 100 μg/ml, bevorzugt 5 - 20 μg/ml Adhyperforin.
14. Verfahren zur Herstellung einer topischen Salbe, Creme, Lotion, eines Gels oder Sprays oder anderer galenischer Zubereitungen nach Anspruch 12 oder 13, in dem Adhyperforin oder ein auf Adhyperforin eingestellter Johanniskrautextrakt so mit Hilfsstoffen vermischt wird, daß man eine Salbe, Creme, Lotion, ein Gel oder Spray mit einem Mindestgehalt von 2 μg/ml, bevorzugt 5 - 20 μg/ml Adhyperforin erhält.
15Nerwendung von Adhyperforin und/oder pharmazeutisch verträglichen Salzen davon als Zytostatikum.
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000030660A2 (de) * 1998-11-25 2000-06-02 Universitätsklinikum Freiburg Hyperforin als zytostatikum sowie hyperforin-salbe oder -creme als applikationsform

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000030660A2 (de) * 1998-11-25 2000-06-02 Universitätsklinikum Freiburg Hyperforin als zytostatikum sowie hyperforin-salbe oder -creme als applikationsform
EP1275382A2 (de) * 1998-11-25 2003-01-15 Universitätsklinikum Freiburg Hyperforin als Zytostatikum sowie Hyperforin-Salbe oder -Creme als Applikationsform

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008071173A1 (de) * 2006-12-12 2008-06-19 Eberhard Karls Universität Tübingen Zubereitungen zur hemmung der prostaglandin e2 synthese

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