WO2003094935A1 - Utilisation de la kininogenase urinaire humaine dans la fabrication d'un medicament pour le traitement et la prevention de l'embolie cerebrale - Google Patents

Utilisation de la kininogenase urinaire humaine dans la fabrication d'un medicament pour le traitement et la prevention de l'embolie cerebrale Download PDF

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WO2003094935A1
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human
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brain
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Heliang Fu
Jindi Wu
Xiaoyan Wang
Yongli Xie
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Techpool Bio-Pharma Co., Ltd.
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    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis

Definitions

  • the invention relates to a new use of biochemical substances in pharmaceutical engineering. More specifically, the use of human urinary kininogenase in the preparation of a medicament for the treatment and prevention of cerebral infarction. Background technique
  • the present invention provides the use of human urokininogenase for the preparation of a medicament for the treatment and prevention of cerebral infarction.
  • Human urokininogenase is a glycoprotein naturally present in human urine with a molecular weight of approximately 54,000 Daltons (gel filtration method), which is a single chain consisting of 238 amino acid residues, N The terminal and C-terminal amino acid residues are isoleucine and serine, respectively, and the molecule contains 5 pairs of S-S bonds, respectively Cys7-Cysl50, Cys26-Cys42, Cys29-Cysl96, Cysl61_Cysl75 and Cysl86-Cys211, etc.
  • the electrical point is approximately 4.0.
  • the molecule contains 14.4% sugar, and the binding sites are located at Asn78, Asn84 and Asnl41, respectively.
  • the sugar composition is 3% mannose, 1.7% galactose, 0.8% fucose, and 5.0% N-acetylglucosamine.
  • Primary structure (amino acid composition sequence) Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu-Cys-.Glu-Gln-His-Ser-Gln-Pro-Trp-Gln-Ala-Ala-Leu-Tyr-His-
  • a human urokininogenase is used as an active ingredient in combination with a pharmaceutically acceptable carrier to prepare an injection for the treatment and prevention of cerebral infarction.
  • Urine male fresh urine is preferred
  • DEAE-Sepharose column equilibrated with 0.05 M Na2HPO4-NaH2PO4, O.lM NaCl, pH 7.4 buffer.
  • the concentrated urine was applied to a DEAE-Sepharose column, rinsed with an equilibration buffer, and eluted with a buffer of 0.05 M Na2HP04-NaH2P04, 0.3 M NaCl, pH 7.4, and the eluted peak was collected; the Aprotinin-Sepharose column was passed through 0.05 M Na2HP04- NaH2P04, equilibrated buffer equilibration at pH 8.0, adjusted to pH 8.0 on the DEAE-Sepharose column and applied to the Aprotinin-Sepharose column with equilibration buffer The solution was washed with 0.1 M HAc-NaAc, pH 4.0 buffer to collect the elution peak; Aprotinin-Sepharose column elution peak was dialyzed against 0.05 M Na2HP04-NaH2P04, 0.1 M NaCl, pH 7.0.
  • the purified human urokininogen can be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier to produce a plurality of dosage forms of the drug.
  • Said pharmaceutical carrier comprises pharmaceutically acceptable diluents, stabilizers, excipients such as glycine, mannitol, pH 7.0 phosphate buffer solution, albumin, dextran, glucose, lactose, sodium chloride, sorbitol, citric acid , gelatin, water for injection, physiological saline, etc., one or more of them may be used at the same time.
  • a preferred combination is glycine, mannitol, pH 7.0 phosphate buffer solution.
  • the medicament of the present invention can be prepared into a dosage form suitable for intravenous injection, intramuscular injection or subcutaneous injection, and includes a dosage form such as a powder needle, a water needle, and an infusion solution.
  • Preferred modes of administration are intravenous drip and I or intravenous bolus.
  • the effective amount of the drug is in the range of 0.0001 to 0.05 PNA/kg body weight, and the preferred amount is 0.002 to 0.011 PNA/kg body weight.
  • the dosage form of the powder or water needle or infusion preparation is 0.1 to 0.2 PNA units per bottle, and the preferred specification is 0.15 PNA unit / tube (bottle).
  • PNA is defined as: 1 hour of hydrolysis of the substrate Val-Leu-Axg-PNA releases 1 ⁇ mol of free PNA at 37 ° C, pH 8.0, which is 1 PNA unit.
  • the right femoral artery was cannulated into the abdominal aorta, and the cannula was connected to the transducer through a three-way needle, and a physiological polygraph was used to monitor blood pressure and a blood reservoir (height 40 mmHg, ie, 54.4 cm H 2 0 column).
  • the bilateral common carotid arteries were separated and threaded for use. Stable for 30 minutes after surgery. Open the three-way needle to the blood reservoir for rapid exsanguination for about 1 ⁇ 2 minutes, up to 40mmHg, and clamp the bilateral common carotid arteries with arterial clips. After 10 minutes, quickly release the bilateral arterial clips, and pressurize about 350mmHg.
  • the blood in the blood reservoir was injected back into the body (about 2 minutes) while oxygen was taken for 30 minutes. Then the ear veins were instilled with the following different drugs, the volume was about 2.5ml/kg, the infusion was maintained for 30 minutes, the arterial cannula was removed, and the incision was sutured. The words were fed separately, and then intravenously infused different doses according to the following grouping. Human urinary kininogenase or control for three consecutive days.
  • I/R Ischemic control group
  • PGEj group PGEj 300ug/kg
  • Brain water content (wet weight to dry weight) / wet weight X 100%. Then, using dry specimens, the content of Na+ and Ca 2+ was measured after acid digestion (determined by atomic absorption spectrophotometry). The latter part of the left hemisphere was rapidly placed at -196 °C for liquid nitrogen freezing to measure MDA (thiobarbituric acid method), cAMP (cyclic adenosine) and cGMP (cyclophosphanoguanine).
  • MDA thiobarbituric acid method
  • cAMP cyclic adenosine
  • cGMP cyclophosphanoguanine
  • the ATP HPLC method
  • the ATP was measured by liquid nitrogen freezing in the first half of the right hemisphere.
  • the second half was placed in 10% formalin solution, sectioned, HE stained, and light microscopy.
  • the test results were expressed as mean soil standard deviation (X-S SD), and the q-test between groups of variance analysis was statistically processed.
  • I layer molecular layer
  • II layer outer layer
  • the ischemic/reperfusion group could not distinguish the layer II, the group II layer and the layer III were unclear, and the human urokinin group I and the human urokininogen group II group II were more obvious.
  • About 1/10 of the leather is thick.
  • Layer III outer cone layer: This layer is not obvious in the ischemia/reperfusion group, PGE ⁇ fi is thin, and there are pyramidal cells. Human urokinin group I and human urokininogen group II were thicker and had pyramidal cells.
  • IV layer inner layer: There was no significant difference between the groups.
  • V layer inner cone layer: The thickness is about 1/5 of the cortex, and there are large pyramidal cells, and there is no difference between the groups.
  • VI layer multi-type layer: There is no difference between the groups.
  • Increased brain water content is an important indication of cerebral edema. Na+ water retention in brain cells after brain tissue injury. Therefore, it is generally considered that Na + is increased in brain tissue after edema, and K + is decreased. Cerebral ischemia and hypoxia cause cell membrane lipid peroxidation, and cell membrane permeability increases, causing intracellular enzymes to leak out. Therefore, brain cells LDH and CPK increased blood, and cerebral venous blood LDH and CPK activity increased.
  • kallikrein human urokininogenase not only exerts its effects through its dilation of blood vessels, but also exerts its anti-rabbit cerebral ischemia/reperfusion injury recovery process through the interaction of renin-angiotensin system. effect.
  • the tracheal intubation respirator controls the breathing, and 1000 u/kg heparin is intravenously injected into the anticoagulation.
  • the right femoral artery was cannulated into the abdominal aorta, the cannula was connected to the transducer through a three-way needle, and the physiological multi-channel was connected to monitor blood pressure.
  • the blood reservoir was connected (height 40 mmHg, ie 54.4 cm H 2 0 column), right The femoral vein was cannulated for drug delivery.
  • the bilateral common carotid arteries were separated for use. After 30 minutes of stabilization, the three-way needle was opened to quickly bleed to the blood reservoir (about 1 to 2 minutes, reaching 40 mmHgBP), and the common carotid artery was clamped with an arterial clip. After 10 minutes, the bilateral arterial clips were quickly released, and the blood in the blood reservoir was injected into the body (about 2 minutes) with pressure (about 300 mmHg), while oxygen was absorbed. Check the experiment for 30 minutes.
  • the experimental animals were divided into the following four groups, and different doses of human urokininogenase or reference substance (capacity 2.5 ml/kg PBS) were instilled 10 minutes before cerebral ischemia, and the perfusion was maintained for 30 minutes, after the instillation was completed 10 End the experiment in minutes.
  • Nicardipine group 10ug/kg
  • the arterial cannula was bled, blood samples were taken, plasma was separated by centrifugation, and blood glucose, lactate, LDH activity, and MDA content were measured.
  • the whole brain was removed, and the left hemisphere was quickly frozen with liquid nitrogen.
  • the first half was ground with liquid nitrogen and homogenized with 6% trichloroacetic acid to determine the ATP content of the tissue.
  • the first half of the right hemisphere is weighed and weighed at 90 °C. After drying thoroughly, the dry weight is measured. The tissue/dry weight ratio is calculated to reflect the degree of brain edema.
  • the posterior half of the right hemisphere of the brain was prepared with PBS (1: 10 W/V), and the tissue MDA content was determined by thiobarbituric acid.
  • the mortality of the animals in each group was 4/10 in the ischemic control group, 4/10 in the human urokininogen group I, and 3/10 in the human urokininogenase group.
  • the above indicators increased by 46.46%, 211.45%, 60.79%, and 397.13% (P values were all less than 0.01).
  • Cerebral ischemia/reperfusion injury in comparison with sham operation group, brain tissue ATP content decreased (-74.71%, P ⁇ 0.01), brain tissue edema (wet weight/dry weight ratio increased by 36.71%, P ⁇ 0.01) and brain MDA production increased (+52.83%, P ⁇ 0.01).
  • the treatment groups showed different degrees of improvement (respectively in each group), reduced brain ATP content (PO.01), human urokininogenase group was superior to human urokininogenase I group (P ⁇ 0.01), wet The weight/dry weight ratio of each group was slightly lower than that of the ischemic control group, but it was not statistically significant (P>0.05).
  • the human urokininogenase group was more effective than the ischemic control group, human urokininogen group I and Nicardipine group (P ⁇ 0.05). Inhibition of MDA production in brain tissue was only statistically significant between the human urokininogen group and the ischemic control group (PO.05), between the human urokininogen group and the human urokininogenase I group and the Nicardipine group. The difference was also significant (P ⁇ 0.05).
  • a human urinary kallikrein group I 2.0X 10- 3 PNA / kg
  • a human urinary kallikrein ⁇ group 10.0 X 10- 3 PNA / kg 5.
  • PGE, (prostaglandin) group 300ug/kg
  • Oral group 2 hours before surgery, oral administration once a day, 56u/kg
  • Infarct size In this study, arachidonic acid was injected into the internal carotid artery to cause extensive infarction in the brain. The infarction group accounted for one-third of the total brain area. Treatment of each group of preventive drug administrations reduced the infarct size of the model (p ⁇ 0.01 compared with the infarct group). The order of strength was human urokininogenase II, human urinary kininogenase ⁇ / ⁇ group, PG ⁇ group, oral group and human urokininogen group I. The area of cerebral infarction in human urinary kininogenase group II was only 39.72% of the infarct size of the infarcted group, and the effect of reducing infarct size was significantly stronger than that of other treatment groups.
  • Plasma MDA content The mechanism of AA-induced infarction includes various mechanisms such as stimulating vasospasm, damaging the vascular endothelium, and promoting platelet activation and aggregation. Among them, AA promoted lipid peroxidation and determined the content of MDA in the final product.
  • the infarction group increased by 2.4 times (p ⁇ 0.01) compared with the sham operation group. In the treatment group, except for the oral group, there was no significant effect (p>0.05), human urokininogenase I group, human urokininogen group II, human urokininogenase I/II group and PGE group.
  • Plasma LDH activity Infarcted tissue ischemic injury, cytosolic enzyme LDH leaks out into the blood circulation.
  • the plasma LDH activity in the infarct group was approximately 3 times higher than that in the sham operation group (p ⁇ 0.01).
  • the plasma LDH activity in the oral group was slightly lower than that in the infarct group, but the difference was not statistically significant (p>0.05); human urokininogenase I group, human urokininogen group II, human urinary kininogenase I / Plasma LDH activity was lower in the sputum group and the PGE _& infarct group by 14.745% (p ⁇ 0.05), -15.77% (p ⁇ 0.05), -24.23% (p ⁇ 0.01), and 21.65% (p ⁇ 0.01), respectively. There was also a significant difference between the human urinary kininogenase II group and the oral group (p ⁇ 0.05).
  • Sham operation group sublingual intravenous injection of normal saline
  • Middle cerebral artery occlusion group intravenous saline
  • Determination of cerebral infarction area The fully excised brain was placed in a small cup of saline containing a refrigerator at 4 ° C. After 10 minutes, the olfactory bulb, cerebellum and lower brain stem were removed, and five slices were cut along the coronal plane. In a tetrazolium (TTC) staining solution, incubate in a 37 ° C water bath for 30 minutes in the dark. Remove the brain slices and place them in 10% formalin. The normal tissue is rose red; the ischemic tissue is white. The area of the blood loss was measured by the weight accumulation method, and the percentage of the ischemic area to the total brain area was calculated.
  • TTC tetrazolium
  • Neurological symptom score judgment methods and criteria :
  • the perfect score is 10 points. The higher the score, the more severe the brain dysfunction.
  • Intravenous injection of human urokininogenase 30 minutes after middle cerebral artery occlusion in the drug-administered group can alleviate cerebral ischemia, cerebral edema and neurobehavioral symptoms caused by middle cerebral artery occlusion in rats, and has a dose-effect relationship;
  • the positive control group (nimodipine) also has a good therapeutic effect.
  • the invention is further illustrated by the following examples.
  • the fresh male urine was ultrafiltered with water to a buffer of not less than 0.05 M Na2HP04-NaH2PO4, O.lM NaCl, pH 7.4 using an ultrafiltration membrane of 10,000 Da.
  • the DEAE-Sepharose column was equilibrated with 0.05 M Na2HP04-NaH2P04, 0.1 M NaCl, pH 7.4 buffer.
  • the concentrated urine was applied to a DEAE-Sepharose column, rinsed with equilibration buffer, and eluted with a buffer of 0.05 M Na2HP04-NaH2P04, 0.3 M NaCl, pH 7.4, and the eluted peak was collected.
  • the Aprotinin-Sepharose column was equilibrated with 0.05 M Na2HP04-NaH2P04, pH 8.0 equilibration buffer.
  • the DEAE-Sepharose column was eluted to pH 8.0 and applied to an Aprotinin-Sepharose column. Rinse with equilibration buffer and use 0.1 M HAc- NaAc, pH 4.0 buffer was eluted and the elution peak was collected.
  • the eluted peak of Aprotinin-Sepharose column was dialyzed against 0.05 M Na2HP04-NaH2P04, 0.1 M NaCl, pH 7.0 buffer for 8 hours, heated in a constant temperature water bath at 60 ° C for 10 hours, and concentrated by ultrafiltration.
  • the Sephadex G-100 column was equilibrated with physiological saline, and a human urokininogenase solution heated at 60 ° C for 10 hours was eluted on a Sephadex G-100 column, physiological saline, and the eluted peak was collected.

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Description

人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用 技术领域
本发明涉及一种生物化学物质在制药工程中的新用途。 更具体说就是人尿 激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞的药物中的应用。 背景技术
当脑部动脉的某分支因血管病变 （如动脉硬化、 动脉炎） ， 或血栓形成， 或栓塞， 使动脉管腔狭窄， 甚或闭塞， 导致急性脑供血不足， 引起局部脑组织 缺血、 缺氧而发生坏死， 出现一系列的临床症状， 谓之脑梗塞。 迄今为止， 国 际医学界尚没有能够阻止脑组织在缺血时发生坏死的方法， 现代医学有的是增 加脑部血流量以减轻局部脑组织缺血、 缺氧， 或以某种化学物质影响脑细胞， 以减缓、 减轻其坏死的进程。
历史上曾有人（如 1926年 Frey)注意到人尿激肽原酶具有扩张血管的作用。 但由于原料尿的收集、 酶的提取、 精制困难， 人尿激肽原酶一直未能得到工业 化利用。 再者， 酶制剂经口服后， 常常在消化道被破坏， 也限制了它的医药用 途。 有报道 （诊疗与新药 Vol.30[10]199-212; 1993 ) 说， 日本三和化学株式会 社正在探讨激肽原酶类静脉注射制剂的制备方法。
目前， 用人尿激肽原酶配制成药物制剂来治疗或预防脑梗塞还未见报道。 发明内容
本发明提供了人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞的药物中的用途。 人 尿激肽原酶是天然存在于人尿中的一种糖蛋白， 分子量约为 54， 000道尔顿（凝 胶过滤法）， 它是由 238个氨基酸残基组成的一条单链， N—末端和 C一末端氨 基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸， 分子中含有 5对 S—S键， 分别为 Cys7— Cysl50， Cys26-Cys42, Cys29— Cysl96， Cysl61 _Cysl75以及 Cysl86— Cys211， 等电点约为 4.0。 分子中含有 14.4%的糖， 结合位点分别位于 Asn78， Asn84及 Asnl41， 其糖的组成为甘露糖 3%， 半乳糖 1.7%， 岩藻糖 0.8%， N—乙酰葡糖 胺 5.0%。 一级结构 （氨基酸组成序列） 见下式 Ile-Val-Gly-Gly-Trp-Glu-Cys-.Glu-Gln-His-Ser-Gln-Pro-Trp-Gln-Ala-Ala-Leu-Tyr-His-
30 40
Phe-Ser-Thr-Phe-Gln-CysrGly-Gly-Ile-Leu-Val-His-Arg-Gln-Trp-Val-Leu-Thr-Ala-Ala-
50 60
His-Cys-Ile-Ser-Asp-Asn-T r-Gln-Leu-Trp-Leu-Gly-Arg-His-Asn-Leu-Phe-Asp-Asp-Glu-
70 CHO 80
Asn-Thr-Ala-Gln-Phe-Val-His-Val-Ser-Glu-Ser-Phe-Pro-His-Pro-Gly-Phe-Asn-Met-Ser-
CHO 90 100
Leu-Leu-Glu-Asn-His-Thr-Arg-Gln-Ala-Asp-Glu-Asp-Tyr-Ser-His-Asp-Leu-Met-Leu-Leu-
110 120
Arg-Leu-Thr-Glu-Pro-Ala-Asp-Thr-Ile-Thr-Asp-Ala-Val-Lys-Val-Val-Glu-Leu-Pro-Thr-
130 140
Gln-Glu-Pro-Glu-Val-Gly-Ser-Thr-Cys-Leu-Ala-Ser-Gly-Trp-Gly-Ser-Ile-Glu-Pro -Glu-
CHO 150 160
Asn-Phe-Ser-Phe-Pro-Asp-Asp-Leu-Gln-Cys-Val-Asp-Leu-Lys-Ile-Leu-Pro-Asn-Asp-Glu-
Glu 170 180
Cys- -Lys-Ala-His-Val-Gln-Lys-Val-Thr-Asp-Phe-Met-Leu-Cys-Val-Gly-His-Leu-Glu-
I Lys I
190 200
Gly-Gly-Lys-Asp-Thr-Cys-Val-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Leu-Met-Cys-Asp-Gly-Val-Leu-
210 220
Gln-Gly-Val-Thr-Ser-Trp-Gly-Tyr-Val-Pro-Cys-Gly-Thr-Pro-Asn-Lys-Pro-Ser-Val-Ala-
230
Val-Arg-Val-Leu-Ser-Tyr-Val-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser 本发明提供一种人尿激肽原酶的医药新用途： 以人尿激肽原酶为活性成分， 配以制药可接受的载体， 制作成注射给药的制剂， 用以治疗和预防脑梗塞。
人尿激肽原酶提取与纯化的工艺步骤为， 将尿液 （男性新鲜尿液为佳） 用 超滤膜对水超滤至电导不高于 0.05M Na2HP04-NaH2P04， 0.1M NaCl， pH7.4 的缓冲液； DEAE-Sepharose柱经 0.05MNa2HPO4-NaH2PO4， O.lMNaCl, pH7.4 的缓冲液平衡。将浓缩尿液上 DEAE-Sepharose柱，用平衡缓冲液冲洗，用 0.05M Na2HP04-NaH2P04 , 0.3M NaCl， pH7.4 的缓冲液洗脱， 收集洗脱峰； Aprotinin-Sepharose柱经 0.05M Na2HP04-NaH2P04, pH8.0的平衡缓冲液平衡， 将 DEAE-Sepharose柱洗脱峰调 pH8.0后上 Aprotinin-Sepharose柱， 用平衡缓冲 液冲洗， 用 0.1M HAc-NaAc, pH4.0的缓冲液洗脱， 收集洗脱峰； Aprotinin- Sepharose柱洗脱峰对 0.05M Na2HP04-NaH2P04, 0.1M NaCl, pH7.0的缓冲液 透析 8小时， 恒温水浴 60°C加热 10小时， 超滤浓缩； Sephadex G-100柱经生理 盐水平衡， 将加热过的溶液上 Sephadex G-100柱， 生理盐水洗脱， 收集洗脱峰； 洗脱峰经 0.22um膜过滤除菌， 超滤浓缩， 可得人尿激肽原酶精制品。
提纯后的人尿激肽原酶可与制药可接受的载体混合， 制成多种剂型的药物。 所说的制药载体包括药用稀释剂、稳定剂、赋形剂，如甘氨酸、甘露醇、 pH7.0 磷酸盐缓冲溶液、 白蛋白、 右旋糖酐、 葡萄糖、 乳糖、 氯化钠、 山梨醇、 柠檬 酸、 明胶、 注射用水、 生理盐水等， 可同时使用其中的一种或多种。 优选的组 合为甘氨酸、 甘露醇、 PH7.0磷酸盐缓冲溶液。
本发明药物可制作成适合于静脉注射用、 肌肉注射用、 皮下注射用剂型， 包括粉针、 水针、 输液等剂型。
优选的给药方式为静脉滴注和 I或静脉推注。药物有效用量范围为 0.0001〜 0.05PNA/kg体重， 优选的用量为 0.002〜0.011PNA/kg体重。 粉针或水针或输液 制剂的剂量规格为每支（瓶） 0.1〜0.2PNA单位， 优选的规格为 0.15PNA单位 / 支（瓶）。
PNA的定义为： 在 37°C， pH8.0的条件下， 1分钟水解底物 Val— Leu—Axg -PNA释放 1 μ mol游离 PNA, 即为 1PNA单位。
对本发明所进行的药效学研究表明， 以人尿激肽原酶作预防处理对于 AA (花生四烯酸）引起的脑梗塞， 具有缩小梗塞面积、抑制 MDA (丙二醛）生成、 减少细胞 LDH (乳酸脱氢酶）漏出等效应； 脑缺血 /再灌注损伤恢复期， 连续应 用人尿激肽原酶治疗可以减轻脑水肿， 增加组织 ATP (三磷酸腺苷）贮备， 对 脑细胞具有一定保护作用。 具体实施方式
针对本发明所进行的药效学研究表明， 本发明对治疗和预防脑缺血、 脑梗 塞可以取得意想不到的有益效果， 记载动物实验结果如下。 实验实施例 1 人尿激肽原酶对家兔急性脑缺血 /再灌注损伤恢复期的治疗作用 实验方法 取 1.8〜2.2kg雄性大耳白兔， 术前禁食过夜， 自由饮水。 背部固定， 制备 急性脑缺血 /再灌注损伤模型。 静注戊巴比妥钠 （30mg/kg) 并配合局麻（1%普 鲁卡因 3〜5ml)， 手术。 静脉注射肝素（1000u/kg)抗凝血。 右股动脉插管进入 腹主动脉， 插管通过三通针头分别连接换能器， 接生理多导仪以监测血压和贮 血器（高度 40mmHg， 即 54.4cmH20柱）。 分离双侧颈总动脉， 穿线备用。 术 后稳定 30分钟。 开启三通针头向贮血器快速放血约 1〜2分钟， 达 40mmHg， 同时用动脉夹夹闭双侧颈总动脉， 持续 10分钟后， 迅速松解双侧动脉夹， 同时 加压约 350mmHg将贮血器内血液推注回体内 (约 2分钟）， 同时吸氧， 观察 30 分钟。 然后耳缘静脉滴注下述不同药物， 容量约为 2.5ml/kg,维持滴注 30分钟， 去除动脉插管， 并缝合切口， 单独词喂， 以后按下述分组每天一次静脉滴注不 同剂量人尿激肽原酶或对照品， 连续三天。
实验分组（每组 n=6)
1. 缺血对照组 （I/R): 生理盐水
2. 人尿激肽原酶 I组： 2X 10- 3 PNA/kg
3. 人尿激肽原酶 1 / 组： 5 X 10-3 PNA/kg
4. 人尿激肽原酶 组： 10X 10_3 PNA/kg
5. PGEj组： PGEj 300ug/kg
另取 4只动物， 不作任何特殊处理， 作为正常对照组。
观察指标
1. 持续用药 3天， 停药 24小时后， 第 4日从颈内静脉取血 2ml (抗凝）， 在生化自动分析仪上测定 LDH和 CPK活性。 然后心内注射 10%KC1快速处死 动物。
2. 摘取全脑， 取左半球前半部称湿重， 90°C烘干， 彻底烘干后测干重， 计算水含量。 脑水含量= (湿重一干重） /湿重 X 100%。 然后用干标本， 酸消化 后测 Na+、 Ca2+含量 （原子吸收分光光度仪测定）。 左半球后半部迅速放入 -196 °C液氮冰冻测 MDA (硫代巴比妥酸法）、 cAMP (环磷腺苷）和 cGMP (环磷鸟 苷）。 取右半球前半部液氮冰冻测 ATP (HPLC法）。 后半部 即放入 10%福尔 马林液固定， 切片， H-E染色， 光镜检査。 试验结果以均数土标准差 （X士 SD) 表示， 方差分析组间 q检验作统计学处理。 实验结果
1. 脑组织水和钠含量的改变： 缺血对照组与正常对照组比较， 脑组织水含 量、 钠含量明显增加， 中剂量和大剂量人尿激肽原酶组脑组织水含量降低 （与 缺血对照组比较分别为 p<0.05和 p<0.01)。 小剂量人尿激肽原酶组和 PGE,组脑 组织水含量与缺血对照组无明显差异。 治疗各组脑组织钠含量虽略低于缺血对 照组， 但无统计学意义 （P>0.05)。
2. 脑组织 ATP和环核苷酸含量的改变： 脑缺血后， 脑组织 ATP含量较正 常动物降低 32%(p<0.01)。 人尿激肽原酶不同剂量组 ATP含量较对照组分别增 加 11.9%(p>0.05)、 23.6%(p<0.05)和 18.8%(p<0.05)； cAmp 含量分别降低 11·2%(ρ>0.05)、 26.5%(ρ<0.01)和 32%(p<0.01); 然而 cGmp含量分别增加 2倍、
3倍和 4倍。 PGE^i ATP含量增加 17.3%(p<0.05); cAmp含量降低 9.3%,cGmp 含量增加 22.5%， 但均无统计学意义 (p>0.05)。
3.脑静脉血酶活性改变；脑缺血对照组脑静脉血 LDH、CPK活性增加 76.7% 和 226%.大剂量人尿激肽原酶治疗后， LDH活性降低 21%(p<0.05)。 其他各治疗 组 LDH活性与缺血对照组比较无统计学差异。 人尿激肽原酶各剂量组 CPK活 性较缺血对照组降低 1.4%、 7.9%和 10.6%， 但无统计学意义 (p>0.05)。 PGE, 组 CPK活性较缺血对照组降低 17% (p<0.01
4. 脑组织钙与脂质过氧化物含量改变： 脑组织缺血后， 脑组织脂质过氧化 终产物 MDA和组织钙含量分别增加 62%和 147%。 各治疗组脑组织 MDA和钙 含量与缺血对照组比较虽有降低， 但无统计学意义。
5. 形态学改变： Nissl染色鼠脑切片， 细胞排列可分六层， I层（分子层）： 少量神经细胞排列， 各组之间没有差异。 II层 （外粒层）： 缺血 /再灌注组无法 分清 II层， 组 II层与 III层分界不清， 人尿激肽原 I组和人尿激肽原酶 II组 II层较明显， 约占皮质 1/10厚。 III层 （外锥体层）： 缺血 /再灌注组该层不明显， PGE^fi较薄， 有锥体细胞。 人尿激肽原 I组和人尿激肽原酶 II组较厚， 有锥体 细胞。 IV层（内粒层）： 各组之间无明显差异。 V层（内锥层）： 厚约占皮质 1/5， 有大锥体细胞， 各组之间无差异。 VI层（多型层）： 各组之间无差异。
讨论
本实验通过兔双侧颈总动脉夹闭合并失血性低血压， 低压、 低灌流， 成功 地复制了急性脑缺血动物模型， 观察手术后第 3天的损伤表现， 发现脑组织水、 钠含量增加， ATP贮备量减少， 环核苷酸含量增加， 脑静脉血 LDH及 CPK活 性显著升高， 脑组织脂质过氧化物和钙含量增加。 形态学检查发现大脑皮层第 Π层和第 III层不明显， 无法分清。
脑组织水含量增加是反映脑水肿的重要指征。 脑组织损伤后脑细胞 Na+水 潴留。 因此， 一般认为水肿后脑组织 Na+增加， K+减少。 脑组织缺血缺氧引起 细胞膜脂质过氧化， 细胞膜通透性增加， 使胞内酶漏出。 因此， 脑细胞 LDH和 CPK入血增多， 脑静脉血 LDH和 CPK活性增加。
本实验观察到， 人尿激肽原酶对脑缺血再灌注损伤恢复过程有一定疗效。 上述观察指标有不同程度的改善， 尤其是高剂量组减轻脑组织水肿， 增加了脑 组织 ATP含量， 降低静脉血中 LDH活性。 人尿激肽原酶对脑组织脂质过氧化 虽有改善，但无统计学意义。？0^具有扩张血管的作用，增加了脑组织能量 ATP 贮备， 降低脑静脉血 CPK活性， 其他指标无明显改善。 因而推测激肽释放酶人 尿激肽原酶不仅通过其扩张血管的作用发挥疗效， 而且可能通过于肾素-血管紧 张素系统相互作用发挥其抗兔脑缺血 /再灌注损伤恢复过程的损伤作用。
结论
脑缺血 /再灌注损伤恢复期， 连续应用人尿激肽原酶治疗可以减轻脑水肿， 增加组织 ATP贮备， 对脑细胞具有一定保护作用。 实验实施例 2 人尿激肽原酶对家兔脑缺血再灌注损伤的影响
实验方法
取 1.8--2.2kg雌性大耳白兔， 术前禁食过夜， 自由饮水。 背部固定， 3%氯 垸加 97%氮再加 3%氧麻醉， 灯光保温（室温 25°C )。 气管插管人工呼吸机控制 呼吸, 1000u/kg肝素静脉注射抗凝血。 右股动脉插管进入腹主动脉， 插管通过三 通针头分别连换能器， 接生理多导仪以监测血压， 连接贮血器（高度 40 mmHg， 即 54.4cm H20柱）， 右股静脉插管以输药物。 分离双侧颈总动脉穿线备用。 术 后稳定 30分钟，开启三通针头向贮血器快速放血（约 1〜2分钟，达 40mmHgBP), 同时用动脉夹夹闭双颈总动脉。 持续 10分钟后， 迅速松解双侧动脉夹， 同时加 压 （约 300mmHg)将贮血器内血液推注回体内 （约 2分钟）， 同时吸氧， 再观 察 30分钟结束实验。
实验分组（每组 n=10)
实验动物分为以下四组， 分别于脑缺血前 10分钟开始滴注不同剂量人尿激 肽原酶或对照品 （容量 2.5ml/kg PBS)， 维持灌注 30分钟， 于滴注完毕后 10分 钟结束实验。
1. 缺血对照组： 用单纯 PBS
2. 人尿激肽原酶 I组： 2.0 X 10-3 PNA/kg
3. 人尿激肽原酶 II组： 10.0X 10_3 PNA/kg
4. Nicardipine组： 10ug/kg
另取 4只动物， 仅作麻醉和不缺血的假手术处理， 称为 " 5.sham组"。
观察指标
1. 动物死亡数；
2. 脑缺血前和再灌注 30分钟时血压；
3. 结束实验时动脉插管放血， 取血样， 离心分离血浆， 测定血糖、乳酸盐、 LDH活性、 MDA含量。
4. 摘取全脑， 取左半球迅速置液氮冷冻， 前一半用液氮研磨， 6%三氯乙 酸下制备匀浆， 测定组织 ATP含量。 右半球前半部称湿重， 90°C烘干， 彻底干 燥后测干重， 计算组织 /干重比值， 反映脑水肿程度。 大脑右半球后一半组织用 PBS制备勾浆 （1： 10W/V), 用硫代巴比妥酸测定组织 MDA含量。
实验结果
脑缺血 10分钟 /再灌注 30分钟期间内，各组动物死亡率为：缺血对照组 4/10、 人尿激肽原酶 I组 4/10、 人尿激肽原酶 组 3/10、 Nicardipine组 3/10、 假手术 组 0/4。 脑！/ R损伤， 动物出现血糖增加， 血桨 MDA含量和 LDH活性都增加。 缺血对照组与假手术组比较， 上述指标分别增加 46.46%、 211.45%、 60.79%和 397.13%(P值都小于 0.01)。 治疗各组的上述指标都呈不同程度改善， 但与缺血 对照组比较， 血糖仅 Nicardipine组降低， 有统计学意义 (P<0.001)。 血浆乳酸盐 降低在各组表现为， 人尿激肽原酶 组和 Nicardipine组与缺血对照组间差异均 有显著性 (P<0.01)， 人尿激肽原酶 组较人尿激肽原酶 I组明显 (P<0.01)。 血浆 MDA含量和 LDH活性各治疗组比缺血对照虽略低， 但无统计学意义（P>0.05)。 脑缺血 /再灌注损伤 （缺血对照组与假手术组比较）， 脑组织 ATP含量减少 (-74.71%,P<0.01),脑组织水肿（湿重 /干重比值增加 36.71%,P<0.01 )和脑 MDA生 成增加 (+52.83%,P<0.01)。各治疗组呈不同程度改善（各组均显著）， 减轻脑 ATP 含量的降低（PO.01),人尿激肽原酶 组优于人尿激肽原酶 I组（P<0.01)， 湿重 / 干重比值各组较缺血对照组都略有降低， 但无统计学意义 (P>0.05)。
抑制脑 MDA的生成， 人尿激肽原酶 Π组较缺血对照组、 人尿激肽原酶 I 组和 Nicardipine组作用更强 (P<0.05)。 抑制脑组织 MDA生成， 仅人尿激肽原 酶 组与缺血对照组比较有统计学意义（PO.05),人尿激肽原酶 组与人尿激肽 原酶 I组和 Nicardipine组间差异也有显著性（P<0.05)。
结论： 人尿激肽原没对减轻家兔脑缺血 /再灌注损伤有一定疗效， 表现为减 轻血浆乳酸盐水平的增加， 保持脑组织 ATP贮备， 减轻脑组织脂质过氧化程度。 实验实施例 3 人尿激肽原酶对家兔脑梗塞的影响
实验方法
动物选择和术前处理、 麻醉方法、 呼吸控制均与实验 2同。 分离左颈总动 脉， 从颈外动脉插管抵近颈内动脉分叉， 动脉夹夹闭颈总动脉， 从插管快速推 注花生四烯酸 （AA) 0.5mg/kg (容量 0.05ml/kg)， 从颈内动脉入脑循环， 然后 去除动脉夹， 上述操作 5秒内完成 （给药摘夹）。 注入 AA后 15分钟， 开胸， 左心房插管 lOmmHg压力下灌注温生理盐水（37°C ) 20ml, 随之印度 ink5.0ml (灌注时于近腹主动脉下动脉夹）。 断头， 取脑， 固定于 10%甲醛内横切成 5片， 切面照像， 经计算机图像处理， 计算梗塞区面积 （白色区 / [黑色区十白色区])。 AA注射前和注射后 15分钟（开胸前)， 分别从动脉插管收集血样， 测定 MDA 含量和 LDH活力。 实验分为 6组， 分别于制作脑梗塞模型前 30分钟耳缘静脉 滴注下述不同剂量药物（容量为 2.5ml/kgPBS)。 滴注完毕后， 立即制作模型。
实验分组（每组 n=10)
1. 梗塞组： 单纯 PBS
2. 人尿激肽原酶 I组： 2.0X 10— 3 PNA/kg
3. 人尿激肽原酶 I /II组： 5.0 X 10— 3 PNA/kg
4. 人尿激肽原酶 Π组： 10.0 X 10—3 PNA/kg 5. PGE, (前列腺素）组： 300ug/kg
6. 口服组： 术前 2小时口服剂灌胃一次 56u/kg
实验结果
梗塞面积： 本实验经颈内动脉注射花生四烯酸后引起脑内广泛梗塞， 梗塞组 脑梗塞区占全脑面积的三分之一。 治疗各组防治性给药， 都能使模型缩小梗塞 面积 （与梗塞组比较， 均为 p<0.01 )。 效果强弱顺序为人尿激肽原酶 II组、 人尿 激肽原酶 Ι /Π组、 PG^组、 口服组和人尿激肽原酶 I组。 人尿激肽原酶 II组脑 梗塞面积仅为梗塞组梗塞面积的 39.72%， 其减少梗塞面积的效果明显强于其他 各治疗组。
血浆 MDA含量： AA引起梗塞的机理包括刺激血管痉挛、 损伤血管内皮、 促进血小板活化聚集等多种机制。 其中 AA促进脂质过氧化， 测定终产物 MDA 含量， 梗塞组较假手术组增加约 2.4倍（p<0.01 )。 治疗各组， 除口服组无明显 作用外 （p>0.05)， 人尿激肽原酶 I组、 人尿激肽原酶 II组、 人尿激肽原酶 I /II 组和 PGE,组都明显抑制 MDA生成，血浆 MDA含量较梗塞组分别低一 21.97%， -40.81%, 一 38.12%和一 30.94% (p均 <0.01 )。 人尿激肽原酶 I /II组、 人尿激 肽原酶 II组和 PG^组较口服组差异亦显著。
血浆 LDH活性： 梗塞组织细胞缺血损伤， 胞浆内酶 LDH漏出释放进入血循 环。 梗塞组血浆 LDH活性较假手术组增加约 3倍（p<0.01 )。 口服组血浆 LDH 活性虽略低于梗塞组， 但差异无统计学意义 （p>0.05); 人尿激肽原酶 I组、 人 尿激肽原酶 II组、 人尿激肽原酶 I /Π组和 PGE _&较梗塞组血浆 LDH活性分别 低一 14.745% (p<0.05)、 —15.77% (p<0.05)、 —24.23% (p<0.01 ) 和一23.65% (p<0.01 )。 人尿激肽原酶 II组与口服组间差异也显著 （p<0.05)。
结论： 人尿激肽原酶预防处理对于 AA引起的脑梗塞， 具有缩小梗塞面积、 抑制 MDA生成、 减少细胞 LDH漏出等效应， ？6 亦有相似效应。 本实验未观 察到口服剂的作用。 实验实施例 4 人尿激肽原酶对大鼠局灶性脑缺血的影响（实验研究）
实验方法
取雄性大鼠， 腹腔注射水合三氯乙醛 350mg/kg麻醉， 右侧位固定。 手术 暴露颧弓， 用咬骨钳咬去颧弓， 剪断筋膜， 暴露聂前窝， 用小牵张器将磷状骨 和下颔骨间距撑开， 于颅骨底开一 2cmX 2cm颅窗， 撕开硬脑膜， 暴露大脑中 动脉， 用高频电刀烧断， 以阻断血流， 造成局部脑缺血， 逐层缝合切口。 30分 钟后进行舌下静脉给药， 回笼饲养。 室温严格控制在 24〜25°C。 24小时后对动 物进行神经症状评分， 断头取脑， 测定脑含水量。 .
另取雄性大鼠， 分组及给药同前， 在阻断一侧大脑中动脉后 24小时， 断头 取脑， 参照文献方法测定脑梗塞面积。
试验分组（每组 n=10)
1. 假手术组： 舌下静脉注射生理盐水
2. 中脑动脉阻断组： 静脉注射生理盐水
3〜5.中脑动脉阻断 +静脉注射人尿激肽原酶
17.5PNAX 10— Vkg静脉注射组
8.75PNAX 10_3/k 静脉注射组
3.5 PNAX 10~3/kg静脉注射组
6. 中脑动脉阻断 +静脉注射尼莫地平 0.5mg^g组
观察指标
脑梗塞面积测定： 将剥离完整的大脑放入 4°C冰箱内盛有生理盐水的小杯 中， 10分钟后去嗅球、 小脑及低位脑干， 沿冠状面切为五片， 立即放入红四氮 唑（TTC)染色液中， 避光在 37°C水浴中温孵 30分钟。 取出脑片放入 10%福 尔马林中固定。 正常组织为玫瑰红色； 缺血组织呈白色。 用重量求积法测量缺 血面积， 计算缺血区域占全脑面积的百分比。
神经症状评分判断方法和标准：
(1)提起鼠尾， 正常鼠两前肢向前伸直并且对称。 手术鼠， 缺血脑半球对侧 的前肢肩内旋和内收， 观察其程度不同评为 0〜4分。
(2)牵拉两肢， 正常大鼠肌力对称， 手术后脑缺血半球的对侧前肢肌无力， 观察其程度不同评为 0〜3分。
(3)推两肩， 正常大鼠双侧肩阻力对称， 手术后脑缺血半球的对侧肩阻力下 降； 观察其程度不同评为 0〜3分。
按以上标准， 满分为 10分。 分数越高， 说明脑功能障碍越严重。 脑水份含量的测定： 于中脑动脉阻断后 24小时处死鼠， 取出全脑。 将剥离 完整的大脑去小脑及低位脑干后称重 （湿重）， 后置箱中 120°C约 18小时烤至 恒重， 再称重（干重）。 脑水份含量 = (脑湿重一脑干重） /脑湿重 X 100%; t检 验法。
实验结果
给药组在中脑动脉阻断后 30分钟静脉注射人尿激肽原酶， 可减轻因大鼠中 脑动脉阻断引起的脑缺血、 脑水肿及神经行为症状， 并有剂量效应关系； 阳性 对照组（尼莫地平） 也有很好的治疗作用。 以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例 1提取并纯化人尿激肽原酶
将新鲜男性尿液用 1 万 Da的超滤膜对水超滤至电导不高于 0.05M Na2HP04-NaH2PO4, O.lM NaCl, pH7.4的缓冲液。
DEAE-Sepharose柱经 0.05M Na2HP04-NaH2P04, 0.1M NaCl, pH7.4的 缓冲液平衡。 将浓缩尿液上 DEAE-Sepharose柱， 用平衡缓冲液冲洗， 用 0.05M Na2HP04-NaH2P04, 0.3M NaCl, pH7.4的缓冲液洗脱， 收集洗脱峰。
Aprotinin-Sepharose柱经 0.05M Na2HP04-NaH2P04, pH8.0的平衡缓冲液 平衡， 将 DEAE-Sepharose柱洗脱峰调 pH8.0后上 Aprotinin-Sepharose柱， 用平 衡缓冲液冲洗， 用 0.1M HAc-NaAc， pH4.0的缓冲液洗脱， 收集洗脱峰。
Aprotinin-Sepharose柱洗脱峰对 0.05M Na2HP04-NaH2P04, 0.1M NaCl, pH7.0的缓冲液透析 8小时， 恒温水浴 60°C加热 10小时， 超滤浓缩。
Sephadex G-100柱经生理盐水平衡， 将 60°C 10小时加热过的人尿激肽原 酶溶液上 Sephadex G-100柱， 生理盐水洗脱， 收集洗脱峰。
洗脱峰经 0.22um膜过滤除菌， 超滤浓缩成为人尿激肽原酶精制品。 实施例 2 制备供静脉注射用的人尿激肽原酶冻干粉针
取人尿激肽原酶 150PNA、 甘氨酸（药用） 5克、 甘露醇 （药用） 7.5克， 加 0.02M磷酸盐缓冲溶液 pH7.0至 1升， 搅匀并除菌过滤， 分装至 1000支安瓶 中。 经冻干、 熔封、 制得人尿激肽原酶冻干粉针。 实施例 3制备人尿激肽原酶水针
取 150PNA的人尿激肽原酶精制品， 加注射用水到 1000ml, 调 pH到 6.8， 搅匀并除菌过滤,分装 1000支安瓶中,熔封,制得人尿激肽原酶水针。 实施例 4制备人尿激肽原酶输液制剂
取 150PNA的人尿激肽原酶精制品，加生理盐水到 250000ml, 调 pH到 6.8， 搅匀并除菌过滤,分装 1000支输液瓶中，加盖,制得人尿激肽原酶输液。 说明书中涉及若干英文缩写， 注解如下：
I/R急性脑缺血 /再灌注损伤 PBS磷酸盐缓冲溶液 MDA丙二醛
LDH乳酸脱氢酶 ATP三磷酸腺苷 CPK肌苷激酶
PGE1前列腺素 cAMP环磷腺苷 cGMP环磷鸟苷
AA花生四烯酸 HPLC 高效液相色谱

Claims

权 利 要 求 书
1. 人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞的药物中的用途。
2. 根据权利要求 1的用途， 其中所述人尿激肽原酶是天然存在于人尿中的 一种糖蛋白， 分子量约为 54， 000道尔顿， 由 238个氨基酸残基组成一条单链， N—末端和 C一末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸， 分子中含有 _ 5对 S— S键， 分别为 Cys7—Cysl50， Cys26-Cys42, Cys29—Cysl96， Cysl61 -Cysl75 以及 Cysl86— Cys211， 等电点约为 4.0， 分子中含有 14.4%的糖， 结合位点分 别位于 Asn78、 Asn84及 Asnl41， 其糖的组成为甘露糖 3%， 半乳糖 1.7%， 岩 藻糖 0.8%， N—乙酰葡糖胺 5.0%， 一级结构如下式所示：
10 20
Figure imgf000014_0001
230
Val-Arg-Val-Leu-Ser-Tyr-Val-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser
3. 根据权利要求 1所述的用途， 其中所述药物含有一种或多种制药可接受 的载体。
4. 根据权利要求 3所述的用途， 其中所述制药可接受的载体选自甘氨酸、 甘露醇、 pH7.0磷酸盐缓冲溶液中的一种或多种。
5. 根据权利要求 1所述的用途， 其中所述药物的剂型为粉针剂型。
6. 根据权利要求 1所述的用途， 其中所述药物的剂型为水针剂型。
7. 根据权利要求 1所述的用途， 其中所述药物的剂型为输液剂型。
8. 根据权利要求 5-7 中任何一项所述的用途， 其中所述药物的剂量为 0.0001〜0.05PNA/kg体重。
9. 根据权利要求 5-7中任何一项所述的用途， 其中所述药物的单位剂量为 0.1〜 2PNA单位/支（瓶）。
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