CN101134106B - 一种用于治疗脑梗塞的含有人尿激肽原酶的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶作为活性成分在制备治疗急性脑梗塞药物组合物的应用研究。本发明的人尿激肽原酶为首次从人尿中分离的SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶，对急性脑梗塞有明显的治疗作用。本发明的人尿激肽原酶通常以药物组合物如冻干粉针剂或注射液的形式使用。

Description

一种用于治疗脑梗塞的含有人尿激肽原酶的药物组合物

技术领域

本发明涉及生物化学和药物化学领域。具体而言，本发明涉及单一组分的人尿激肽原酶(Human Urinary Kallidinogenase)的制备和酶学性质，以单一组分的人尿激肽原酶为活性组分的药物组合物及该药物组合物在治疗急性脑梗塞的应用研究。

背景技术

1909年，Abelous和Bardier观察到：将人尿中一种水不溶成分注射到麻醉的犬中，其血压下降，1929年，Frey和Kraut从尿液中分离出该物质，还发现其在胰腺中有较高的浓度，认为胰腺为其主要合成场所，被命名为“kallikrein”。1937年发现kallikrein的蛋白酶功能，认为其为一种新蛋白，不是单独起作用，而是一个系统的一部分(Werle et al.，1937)。研究表明，从人尿中来源的该物质为组织型的激肽原酶。

众多研究者从人尿中分离制备了人尿激肽原酶，并进行了大量研究，但其多为两个或者两个以上组分的混合物。

现有技术纯化的人尿激肽原酶采用十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳(即SDS-PAGE电泳)测定有两条带，一条约43,000Da，一条约39,000Da。(根据电泳的条件或计算方法的不同，得到的两个SDS-PAGE电泳条带分子量也有所不同，有40000Da和34000Da；41000Da和31000Da等，实际上是相同的人尿激肽原酶人两种组分)这两种组分的理化性质非常相似，分离十分困难，无论用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制剂作配基的亲和层析，还是用离子交换层析，均无法将两个组分完全分离；当两个组分混合在一起时HPLC图谱显示出一个单峰，所以用凝胶过滤的方法也无法将两个组分分开。在以前的纯化人尿激肽原酶方法中，一些研究未提及有两个组分。用HPLC的方法或不敏感的电泳方法无法分辨两个组分。

人尿激肽原酶具有激活人血浆激肽原转化为激肽、扩张血管增加血流量、改善血液循环的作用，促进缺血区新生血管生成，并且还有增加红细胞的变形性和抑制血小板聚集、延长再钙化时间改善血液粘稠的作用。本申请人的在先专利申请“ZL02116783.4人尿激肽原酶在制备治疗和预防脑梗塞药物中的应用”、“ZL200410088441.8人尿激肽原酶在制备脓毒症药物中的应用”、“ZL200410088440.3人尿激肽原酶在制备急性冠脉疾病药物中的应用”公开了它的三种医药用途。在“ZL200410096060.4一种用于提高人尿激肽原酶稳定性的药物组合物”中公开了它制备药物制剂的一种方法。

由于以上的研究均采用抑肽酶或慈菇蛋白酶抑制剂作配基的亲和层析，得到的人尿激肽原酶产品为两种以上蛋白组分的混合物，对研究和应用带来很多限制。

临床研究表明含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品会引起血压的明显下降，即用现有技术获得的表明含有SDS-PAGE电泳单两条带的人尿激肽原酶药品临床使用是会有更大的副作用。

药品的活性成份如果含有两个组分，而这两个组分的比例无法控制，对于药品的疗效和安全性也就无法控制。因此，生产SDS-PAGE电泳单一条带的药品活性成份是非常重要的。

日本株式会社三和化学研究所是世界上最先将人尿激肽原酶用于人的临床研究的公司，他们的人尿激肽原酶药物仍然含有SDS-PAGE电泳测定的两个条带；比活性不低于5PNA单位/毫克·蛋白(PNA U/mg·protein)。他们的人尿激肽原酶药物最终没能获得批准。(特開平5—163158.人尿性キニノゲナ—ぜを有効成分とすゐ皮膚潰瘍の予防及び治料劑.)

能够发现人尿激肽原酶SDS-PAGE电泳测定有两条带，并且能有效地将这两种物质分离，得到SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶的研究未见报导。

本发明用特定的分离方法制备SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶，并配以一种或多种制药可接受的载体组成的药物组合物，含有单一条带的人尿激肽原酶药物组合物用于治疗脑梗塞，副作用更小。

发明内容

本发明的目的是从人尿中分离出SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶，提供一种含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物。

本发明含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物可有效用于治疗和/或预防脑梗塞。这种组合物在临床使用时副作用更小。

本发明的目的是通过以下技术方案实现：

一种含有单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的单一条带人尿激肽原酶和可药用辅料，活性成分与药用辅料重量比例为1:1～1:15000，其中所述单一条带人尿激肽原酶含有238个氨基酸；含有5对S-S键；含有3个糖基化位点，N—末端和C—末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，并具有以下特征：

1.SDS-PAGE电泳测定的分子量为43000±3000Da(见附图1)；

2.高效液相层析(HPLC)仅得到单一峰(见附图2)；

3.比活性不低于8PNA单位/毫克·蛋白(PNA U/mg·protein)，其主要活性成分的氨基酸序列：

Val-Arg-Val-Leu-Ser-Tyr-Val-Lys-Trp-Ile-Glu-Asp-Thr-Ile-Ala-Glu-Asn-Ser

本发明通过一种层析材料，并结合其他层析技术，从人尿中分离出SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶。

发明人采用苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(Benzamidine Sepharose)亲和层析的方法。人尿激肽原酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，能够与苯扎嘧啶(Benzamidine)、抑肽酶、慈菇蛋白酶抑制剂等配基结合，抑肽酶、慈菇蛋白酶抑制剂等配基与人尿激肽原酶的结合力较强，洗脱条件剧烈，无法达到分离两个组分的目的，而苯扎嘧啶是小分子化合物，空间位阻小，人尿激肽原酶与其结合后，还会受到介质上其他电荷的影响，结合力较弱，洗脱条件温和，在此条件下两个组分有所差别。利用这一差别，我们用电导值较低的溶液将高分子组分洗脱下，低分子组分仍结合在介质上。用电导值较高的溶液将低分子组分洗脱下。这样可以获得SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶。

这种SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶具体制备方法如下：

1.新鲜的男性尿液中加入3％脱乙酰甲壳素吸附，调节pH至4.5～5.5，用1～25％的硫酸铵溶液，调节pH至5.0～13.0洗脱，优选用8～12％的硫酸铵溶液，调节pH至7～9洗脱，加入50％硫酸铵，沉淀蛋白，得到人尿激肽原酶粗品；此步骤的特点是洗脱条件温和，得到的粗品质量好，有利于后面的纯化.

2.将人尿激肽原酶溶解，经扩张床强阴离子交换(Streamline Q XL，GEHealthcare公司)柱层析；再经苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose6Fast Flow，GE Healthcare公司)柱层析；人尿激肽原酶溶液60℃恒温加热10小时，得到纯度较高的、去除病毒的人尿激肽原酶中间体。

3.将上述人尿激肽原酶中间体溶液上亲和层析柱，作为亲和层析的介质为苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(Benzami dine Sepharose6B，GE Healthcare公司)，用平衡缓冲溶液冲洗柱子，去除杂蛋白，使用的平衡缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液，优选，Tris-HCl缓冲溶液；缓冲溶液的pH值为3—11，优选，7—9。利用不同浓度的盐洗脱液，分别将人尿激肽原酶的两个组分洗脱下来，洗脱是在电导值5-50ms/cm和20—80ms/cm分别进行；分别洗脱得到高分子组分和低分子组分，高分子组分即本发明的人尿激肽原酶。

研究表明，含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品会引起血压的明显下降，即用现有技术获得的表明含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品临床使用是会有更大的副作用。

本发明采用的制备方法所获得SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶，其也是一种混合物，但几乎不引起血压下降，其同现有技术获得的含有SDS-PAGE电泳两条带的人尿激肽原酶药品相比副作用明显降低。

本发明的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶一般以药物组合物的形式使用，这种组合物含有治疗有效量的作为活性成分的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶和可药用辅料，活性成分与药用辅料重量比例为1:1～1:15000，其中优选比例为1:1～1:2500。这种药物组合物优选以静脉注射途径给药，主要剂型包括冻干粉针剂和注射液剂。

经静脉注射给药的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶组合物，一般是固体的灭菌组合物形式，即冻干粉针剂。这些组合物还可以含有药用辅料，特别是甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸或聚乙二醇等中的一种或其任意混合物，在使用时可以溶解于灭菌注射用水或各种其它注射用灭菌介质中。

经静脉注射给药的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶组合物也可以是水溶液形式，即注射液剂、输液剂。组合物还可以含有药用辅料，特别是甘露醇、氯化钠、葡萄糖或聚乙二醇等中的一种或其任意混合物。

SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶冻干粉针的制备方法：取过滤灭菌的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶150PNA单位，加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克柠檬酸钠(枸橼酸钠)溶解，调节PH至中性，加注射用水至500毫升，无菌过滤，分装1000个安瓿中，无菌条件下冷冻干燥，即得。

SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶注射液的制备方法：取过滤灭菌SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶水溶150PNA单位，调节PH至中性，加注射用水至500毫升，加氯化钠调节等渗，无菌过滤，分装1000个安瓿中，即得。

应用SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶组合物治疗脑梗塞的剂量根据病情的严重程度、治疗时间而定，一般静脉注射给药量是每天给药1—3次，每次0.005—2.5PNA单位。优选，药物的给药量是每天1次，每次0.1—0.2PNA单位。

PNA的定义为：在37℃、pH8.0条件下，1分钟水解底物Val-Leu-Arg-PNA释放1umol游离PNA，即为1PNA单位。

对本发明所进行的试验研究表明，含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物对脑梗塞患者的疗效显著，副作用极小。

附图说明：

附图1：SDS-PAGE电泳图。图中1为高分子人尿激肽原酶和低分子人尿激肽原酶的混合物，(采用现有的技术方法制备，即慈菇蛋白酶抑制剂方法制备的人尿激肽原酶，详见实施例8)；2为低分子人尿激肽原酶(含有部分高分子人尿激肽原酶)；3为分子量标准品；4为高分子人尿激肽原酶(采用本发明方法制备，即苯扎嘧啶亲和层析法，详见实施例1)。高分子和低分子人尿激肽原酶分子量分别约为43000Da和39000Da。

附图2：SDS-PAGE电泳单一条带(高分子)的人尿激肽原酶HPLC图。

附图3：人尿激肽原酶对大鼠脑血栓24h后的神经功能障碍的影响。图中1为假手术组，2为对照组，3为人尿激肽原酶17.5×10-3PNA U/kg组，4为人尿激肽原酶8.75×10-3PNA U/kg组，5为人尿激肽原酶3.50×10-3PNAU/kg组，6为维脑路通50mg/kg组。

附图4：人尿激肽原酶对大鼠脑血栓24h后的脑梗塞面积的影响。图中1为对照组，2为人尿激肽原酶17.5×10-3PNA U/kg组，3为人尿激肽原酶8.75×10-3PNA U/kg组，4为人尿激肽原酶3.50×10-3PNA U/kg组，5为维脑路通50mg/kg组。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1SDS-PAGE电泳测定显示单一条带的人尿激肽原酶的制备

其由以下步骤制备(苯扎嘧啶亲和层析法)得到：

1.将10吨新鲜的男性尿液泵入搅拌池中，调节pH至4.5～5.5，加入300kg脱乙酰甲壳素吸附，用10％的硫铵溶液调节pH至7.0～9.0洗脱；洗脱液用硅藻土作过滤介质，进行抽滤，将盐析溶液全部抽干，抽干产品1kg为人尿激肽原酶粗制品；

2.将150kg人尿激肽原酶粗品倒入搅拌罐中，加入750L的0.15M EDTA溶液溶解，将pH调至9.0，搅拌至粗品完全溶解即可；3000转/分离心20分钟，取上清，过滤0.45μm的膜，超滤得到超滤液45L，从中取样品A(人尿激肽原酶粗品溶解掖)；

3.将超滤液调pH8.0，上扩张床强阴离子交换柱(Streamline Q XL，GEHealthcare公司)，用含0.15M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲液冲洗柱子至OD280<0.2；用含0.3M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲液洗脱柱子；收集洗脱溶液20L；

4.洗脱收集液加入1800g(NH4)2SO4，用HCl调整pH7.0±0.1，上苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose 6 Fast Flow，GE Healthcare公司)柱，用0.7M(NH4)2SO4缓冲液冲洗柱子，用0.4M(NH4)2SO4缓冲液进行洗脱柱子，收集洗脱液40L，用10000MWCO膜超滤至3L；

5.将超滤后加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时，得到加热后人尿激肽原酶溶液；

6.将加热后溶液调pH8.0±0.1，上苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶(BenzamidineSepharoseTM6B，GE Healthcare公司)柱，用含0.1M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲进行冲洗，用含0.4M NaCl及0.02mol/L Tris缓冲进行洗脱，收集洗脱峰；

7.将洗脱收集液调pH7.0，用10000MWCO膜超滤至体积溶液1L，从中取样品B(SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶)。

将样品液A、B进行活性检测，结果如下表1。

表1样品液A、B活性检测结果。

 

检测项目	样品A	样品B
			总活性(PNA U)	150000	69000

样品B各项检测指标结果如下表2。

表2样品B(SDS-PAGE电泳单一条带的人尿激肽原酶)的检查结果

 

检查项目	检查结果
		性状	无色澄清液体

 

酸碱度	6.8
		纯度	99％
分子量	43400
		比活力(PAN单位/毫克蛋白)	10.0

实施例2人尿激肽原酶结构确定

人尿激肽原酶的氨基酸组成分析：

1.仪器名称及型号：日立835—50型高速氨基酸分析仪

2.样品制备：

准确量取样品入水解管中，加入6mol/L盐酸，于110℃水解24小时，冷却定容，过滤，蒸发去掉过量的盐酸，用0.02mol/L定容，上机分析。

3.测定条件：

离子交换柱：2.6×150mm；树脂规格：No.2619；柱温：53℃；泵流速：0.225ml/min；泵压力：90kg/cm2，洗脱液IPH—1，2，3，4；分析时间：72min；进样体积：50μl。

4.测定结果：与理论推导值基本一致(表3)。

表3氨基酸组成分析结果

对一级结构的研究证明，人尿激肽原酶的初级结构为含有238个氨基酸残基的单链，分别在Cys7-Cys150、Cys26-Cys42、Cys129-Cys196、Cys161-Cys175和Cys186-Cys211有五对二硫键，在Asn78、Asn84及Asn141处存在糖基化，糖组成为甘露糖3％、半乳糖1.7％、岩藻糖0.8％、N-乙酰葡萄糖胺5.0％，另外还检出少量唾液酸(0.4％)，人尿激肽原酶的总糖含量约为14.4％。

用TSK-GEL G3000SW凝胶测定本品分子量约54,000Da，呈单峰(如附图2)，电泳测定主要组分分子量约43,000Da，为单一条带(如附图1)。

实施例3人尿激肽原酶酶学性质研究

取小试管(2×20cm)2支，各加入人尿激肽原酶溶液0.2ml，分别加入0.2mol/L Tris缓冲液(pH8.0)4.0ml，混匀，置37℃保温5分钟，于第1管中加入50％醋酸溶液0.4ml，第2管中加入底物溶液(S-2266(HD-Val-Leu-Arg-PnA·2HCl)，1.5mM)0.4ml，混匀，于37±0.5℃水浴中反应15分钟，然后在第1管中加入底物溶液0.4ml，第2管中加入50％醋酸溶液0.4ml，在405nm波长处测定，以第1管为空白，测定吸收值A，A值应控制在0.1～0.2之间。将A值代入下式计算：

PNA U/ml＝173.6×A×T/1000(T为稀释倍数)

1PNA U(p-nitroaniline单位)：相当于37℃，pH8.0条件下以H-D-Val-Leu-Arg-p-nitronilide为底物，1分钟水解产生1μmolp-nitroaniline时的人尿激肽原酶的酶量。

结果显示，上述人尿激肽原酶制品其比活大于8PNA U/mg蛋白。

实施例4人尿激肽原酶的药物组合物的制备

1.1500PAN U人尿激肽原酶(按实施例1的方法制备)，甘露醇150克，枸橼酸钠50克，加注射用水至5000毫升，经混合，除菌过滤，灌装到10000瓶中，得到人尿激肽原酶水针。

2.1500PAN U人尿激肽原酶(按实施例1的方法制备)，甘露醇150克，枸橼酸钠50克，加注射用水至5000毫升，经混合，除菌过滤，灌装到10000个瓶中，冻干，得到人尿激肽原酶冻干粉针。

3.1500PAN U人尿激肽原酶(按实施例1的方法制备)，甘露醇150克，枸橼酸钠50克，加生理盐水至2500000毫升，经混合，除菌过滤，灌装到10000瓶中，得到人尿激肽原酶输液。

实施例5人尿激肽原酶药效学性质研究

1.大鼠大脑中动脉血栓模型

试验用雄性大鼠腹腔注射水合三氯乙醛350mg/kg麻醉，仰卧位固定在鼠板上，切开颈部皮肤、肌肉，分离颈总动脉：做动脉插管联接压力换能器、二导生理记录仪(测定给药前、给药中及给药后血压变化)。再将大鼠左侧位固定在鼠板上，于手术显微镜下沿外耳道与眼眦连线中点切开皮肤，暴露出颧弓，用小牵张器将磷状骨和下颌骨间距撑开，于颅骨底开一2cm×2cm的骨窗，撕开硬脑膜，暴露出右侧位于嗅束和大脑下静脉之间的一段大脑中动脉，置一小片塑料薄膜保护血管周围组织，将吸有50％三氯化铁溶液(1mol/L盐酸)10μl的小片定量滤纸(2×2mm)敷在此段大脑中动脉上，30min后取下滤纸，用生理盐水冲洗局部组织，逐层缝合，回笼饲养。术中术后室温严格控制在24～25℃。

假手术组除在大脑中动脉敷生理盐水外，其余同对照组。给药组在手术30min后由舌下静脉给人尿激肽原酶(由实施例1的方法制备)，24h后参照文献方法判断神经症状，然后断头取脑，测定脑梗塞面积。

2.大脑中动脉血栓及脑组织形态学观察

取栓塞侧大脑中动脉及脑组织，按常规固定、包埋、染色、切片，在光学显微镜下观察并摄片。

3.神经症状的评分判断标准

a)提起鼠尾，观察两前肢情况，正常动物两前肢向前伸直并且对称。手术后，脑缺血半球的对侧前肢肩内旋和内收，观察其程度不同评为0～4分。

b)牵拉两肢，正常大鼠肌力对称，手术后脑缺血半球的对侧前肢肌无力，观察其程度不同评为0～3分。

c)推两肩，正常大鼠双侧肩阻力对称，手术后脑缺血半球的对侧肩阻力下降，观察其程度不同评为0～3分。

根据以上标准，满分为10分，分数越高，说明脑功能障碍越严重，以此作为脑功能障碍的指标。

4.脑梗塞面积的测定

动物经本次行为评分后，断头取脑。剔除嗅脑、低位脑干及小脑，剩余部分立即称取湿重，在冰上将脑沿冠状面切成厚度基本相同的5片，于37℃TTC染料中温浴30min，正常脑组织呈玫瑰红，梗塞区呈白色。然后将脑片置10％的甲醛中固定，将白色组织仔细挖下称重，以梗塞重量占总脑重量的百分比作为梗塞面积。

实验结果

1.人尿激肽原酶对行为缺陷程度的影响

对照组大鼠麻醉清醒后即有偏瘫样症状出现，主要表现为手术对侧前肢内收、肩内旋、前肢肌张力下降，向手术对侧推动时抵抗阻力下降。人尿激肽原酶17.5×10^-3、8.75×10^-3、3.5×10^-3PNA U/kg可剂量依赖地改善神经症状。维脑路通50mg/kg的改善神经症状的作用与大剂量人尿激肽原酶(17.5×10^-3PNAU/kg)的作用相比，二者无显著差异(P>0.05)(如附图3)。

2.人尿激肽原酶对脑梗塞范围的影响

如附图4示，人尿激肽原酶17.5×10^-3、8.75×10^-3、3.5×10^-3PNA U/kg可剂量依赖地缩小大鼠脑栓塞24h后的脑梗塞面积，与对照组比较有显著差异。维脑路通50mg/kg的缩小脑梗塞面积的作用与人尿激肽原酶8.75×10^-3PNA U/kg的作用相比，二者无显著差异(P>0.05)。

3.人尿激肽原酶对大鼠脑组织形态学变化的影响

对照组大鼠中脑动脉血栓形成24小时后，病灶侧大脑中动脉皮层供血区苍白、无光、软化，脑表面血管较对侧充血，受损段大脑中动脉颜色变暗，光镜下观察此段血管切片，其内有血栓形成。血栓成分主要是血小板、红细胞、白细胞和纤维蛋白，呈混合血栓特性，且形成的血栓坚实、致密，血管壁及周围有大量白细胞浸润。人尿激肽原酶17.5×10-3、8.75×10-3PNA U/kg组经大脑中动脉血栓形成24h后，病灶侧脑表面未见明显的苍白、无光，肉眼可见受损段大脑中动脉较对照组明显红润，光镜下观察，此段血管及周围汇聚大量的白细胞，表明血管表面受化学物质的损伤，血管内血栓溶解、断裂，溶解后残留的血栓成空洞状、峰窝状，白色血栓及纤维蛋白成分明显减少。维脑路通50mg/kg能部分溶解、断裂大鼠大脑中动脉内血栓，残留的血栓成空洞状、峰窝状，脑组织缺血病变较轻，其作用强度与人尿激肽原酶中剂量的作用相当。

光镜下观察脑组织切片，对照组大脑皮层大片浅染，神经细胞崩溃解体，神经细胞变稀疏，出现大片软化灶。人尿激肽原酶17.5×10^-3、8.75×10^-3PNA U/kg组未出现明显的大脑皮层大片浅染，软化灶明显变小，表明脑缺血程度明显轻于对照组。

4.人尿激肽原酶对麻醉大鼠血压的影响

大鼠颈总动脉插管，人尿激肽原酶17.5×10^-3PNA U/kg于40～50秒内从舌下静脉给予，测定给药前、给药中及给药后(观察10min)血压的变化。结果显示，大鼠给药前、给药中及给药后的血压分别为104±22、101±26及102±20mmHg(n＝7)。这表明，人尿激肽原酶17.5×10^-3PNA U/kg于40～50秒内从舌下静脉给予，对麻醉大鼠血压无明显影响。

试验结论

1.本实验用三氯化铁局部涂抹损伤血管，从脑梗塞范围、行为障碍、脑组织病理改变为观察指标判断，形成了大鼠大脑中动脉血栓模型。

2.人尿激肽原酶17.5×10^-3、8.75×10^-3PNA U/kg于术后30min静脉注射，能明显缩小脑栓塞24h的脑梗塞范围，改善行为障碍。脑组织病理检查显示，大脑中动脉内血栓溶解、断裂，溶解后残留的血栓成空洞状、峰窝状，白色血栓及纤维蛋白成分明显减少，脑组织缺血病变较轻。维脑路通50mg/kg能部分溶解、断裂大鼠大脑中动脉内血栓，残留的血栓成空洞状、峰窝状，脑组织缺血病变较轻，其作用强度与人尿激肽原酶中剂量的作用相当。

3.人尿激肽原酶可能通过抑制脑血栓形成，从而减轻血栓形成所致的局部脑缺血性损伤。

实施例6人尿激肽原酶对血压的影响

试验药品：

1.人尿激肽原酶样品1(由实施例1的方法制备，即苯扎嘧啶亲和层析法制备，43KD组分大于99％)

2.人尿激肽原酶样品2(由慈菇蛋白酶抑制剂方法制备，43KD组分约60％，39KD组分约40％)

3.氯化钠注射液。

人尿激肽原酶样品2制备方法(慈菇蛋白酶抑制剂方法制备)如下：

人尿激肽原酶粗制品的提取：将新鲜尿泵入搅拌池中，调节pH至4.5～5.5，加入3％甲壳素吸附，用10％的硫铵溶液调节pH至7.0～9.0洗脱。洗脱液用硅藻土作过滤介质，进行抽滤，将盐析溶液全部抽干。抽干产品为人尿激肽原酶粗制品。

粗制品的溶解：取1kg人尿激肽原酶粗品。加入1：3的0.15mol/L EDTA溶液溶解，3000转/分离心20分钟，取上清。

溶解液上清每升加5mol/L ZnCl2溶液30ml，调节pH至5～7，用95％预冷酒精：处理好的溶解液上清为1：1.2的比例，加95％预冷酒精沉淀。

阴离子交换层析：酒精沉淀用0.15mol/L EDTA-0.2mol/L NaOH溶液溶解，超滤调pH8.0，超滤液上扩张床强阴离子交换柱(Streamline Q XL，GE Healthcare公司)，用含0.15mol/L NaCl及0.02mol/L Tris缓冲冲洗柱子至OD280<0.2；用含0.3mol/L NaCl及0.02mol/L Tris缓冲洗脱柱子；收集洗脱溶液蛋白峰。

疏水层析：洗脱收集液加入(NH4)2SO4使其终浓度为1.3mol/L，用HCl调整pH7.0±0.1，上苯基交联琼脂糖快速流凝胶(phenyl Sepharose6Fast Flow，GE Healthcare公司)柱。用0.7mol/L(NH4)2SO4缓冲液冲洗柱子。用0.4mol/L(NH4)2SO4缓冲液进行洗脱柱子，收集洗脱蛋白峰。用10000MWCO膜超滤至3L。

将超滤后加入90g柠檬酸钠，用HCl调pH值至7.0±0.2，然后60℃恒温加热10小时。得到加热后人尿激肽原酶溶液。

慈菇蛋白酶抑制剂为配体的亲和层析：用溴化氰法将300mg慈菇蛋白酶抑制剂与50gSepharos CL-4B填料偶联，装柱。将超滤液调整pH8.0上已平衡的亲和柱，用含0.05mol/L磷酸缓冲液及0.5mol/L NaCl进行平衡冲洗。再用0.05mol/L磷酸缓冲液及20％乙醇及0.4mol/L盐酸胍进行洗脱。收集洗脱蛋白峰。

凝胶过滤：用Superdex200填料装柱，用含0.05mol/L磷酸缓冲液及0.15mol/L NaCl，pH7.0±0.1的溶液进行平衡冲洗，收集蛋白峰。

将洗脱蛋白峰调pH7.0，用10000MWCO膜超滤浓缩。得到纯化的人尿激肽原酶。

试验动物：

新西兰大白兔，体重1.8～2.5kg。在光照充足、通风和空调设备良好动物室饲养，室温控制在20-25℃，湿度为40-65％。

将新西兰大白兔随机分为4组，每组6只兔子(雌雄各半)。

用乌拉坦(1000mg/kg)静脉注射麻醉后，切开气管，插入气管套管。一侧颈动脉插管并与压力换能器相连，经AP-601G放大器测量股动脉血压。

在血压指标稳定后记录5分钟作初始对照，然后静脉注射给药(2ml/Kg)，对照组给予等体积氯化钠注射液，静脉注射给药用定时匀速推注器在20分钟注完。分别记录给药前及给药后在5、15、30、45、60min时间点的平均动脉压。

注射前将样品1—3按照每Kg试验动物一次注射量为2ml，一次注射人尿激肽原酶剂量0.0065PNA/Kg，用氯化钠注射液注射液进行稀释。对照组按照每Kg试验动物一次注射氯化钠注射液为2ml。

结果：

各组不同时间点平均动脉压值如下表3，其中0组为氯化钠注射液对照组，1组为人尿激肽原酶样品1组，2组为人尿激肽原酶样品2组。数据显示：0组和1组，从注射开始到注射结束的整个观察时间内，平均动脉压较稳定，未出现明显波动，而组2则在给药5分钟即出现血压明显下降，给药结束后40分钟恢复注射前的平均动脉压。

表4不同人尿激肽原酶制品对平均动脉压(Kpa)的影响(x±SD，n＝6)

注：*和**分别表示各组内各时间点压力与初始压力比较，P<0.05和P<0.01

上述结果显示：人尿激肽原酶样品1组和样品2组之间对血压的影响有明显差异，样品1组在上述给药条件下对血压没有明显影响，而样品2组则表现出短期的对血压的下降作用。

实施例7人尿激肽原酶治疗急性脑梗死临床疗效和安全性研究

选择起病48小时以内的轻度和中度颈动脉系统首发性完全型血栓性脑梗死患者(≥18岁的住院病人，性别不限；NIHSS评分≥4分，≤22分，脑CT排除出血可能)随机分为人尿激肽原酶(由实施例1的方法制备，即苯扎嘧啶亲和层析法制备，43KD组分大于99％)治疗组和维脑路通对照组，对照组用维脑路通针0.6g加入生理盐水500ml静滴，每日1次连用14d。试验组采用人尿激肽原酶制剂治疗(由实施例4的方法制备，0.15PNAU静脉滴注1次/日，在30分钟—60分钟内滴完)，疗程14天。疗效评价指标：(1)神经功能缺损(NDS)指标：采用美国国立卫生研究院脑卒中量表(NIHSS)；(2)生活质量采用牛津病残量表(OHS)(Modified Rankin Scale)。

本研究共入组60例临床试验，药物试验组共30例，对照组30例。比较其0天、7天、14天临床NDS及mRS评分，并观察用药前及用药后血常规、尿常规、肝肾功能变化。

结果：

两组比较：治疗组14天的神经功能缺损及mRS评分改善均优于维脑路通组，有显著性差异(结果如下表5和表6)。两组用药前后血常规、尿常规及肝功能比较均无统计学意义。

表5人尿激肽原酶治疗组、维脑路通组治疗7、14天NIHSS评分减分值比较(x±S)

注：^★★表示p<0.01

结果显示：人尿激肽原酶治疗急性脑梗死有效、安全，临床神经功能缺损及社会参与能力改善方面均明显优于对照组。综上所述，尤瑞克林用于急性脑梗塞的治疗是安全有效的。

Claims (8)

1.一种含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，其含有治疗有效量的作为活性成分的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶和可药用辅料，活性成分与药用辅料重量比例为1∶1～1∶15000，其中所述SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶是由238个氨基酸残基组成一条单链，N-末端和C-末端氨基酸残基分别为异亮氨酸和丝氨酸，同时具有下列特征：

1)SDS-PAGE电泳测定的分子量为43000±3000Da；

2)高效液相层析仅得到单一峰；

3)比活性不低于8PNA单位/毫克·蛋白，其主要活性成分的氨基酸序列为：

其中所述的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶是由以下步骤制备得到：

1)新鲜的男性尿液中加入3％脱乙酰甲壳素吸附，调节pH至4.5～5.5，用1～25％的硫酸铵溶液，调节pH至5.0～13.0洗脱，加入50％硫酸铵，沉淀蛋白，得到人尿激肽原酶粗品；此步骤的特点是洗脱条件温和，得到的粗品质量好，有利于后面的纯化。

2)将人尿激肽原酶溶解，经扩张床强阴离子交换柱层析；再经苯基交联琼脂糖快速流凝胶柱层析；人尿激肽原酶溶液60℃恒温加热10小时，得到纯度较高的、去除病毒的人尿激肽原酶中间体。

3)将上述人尿激肽原酶中间体溶液上亲和层析柱，作为亲和层析的介质为苯扎嘧啶交联琼脂糖凝胶，用平衡缓冲溶液冲洗柱子，去除杂蛋白，使用的平衡缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、醋酸盐缓冲溶液、柠檬酸钠缓冲溶液，缓冲溶液的pH值为3～11；利用不同浓度的盐洗脱液，分别将人尿激肽原酶的两个组分洗脱下来，洗脱是在电导值5～50ms/cm和20～80ms/cm分别进行；分别洗脱得到高分子组分和低分子组分，高分子组分即SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶。

2.根据权利要求1所述的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，所述的SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶分子中含有5对S-S键，分别为Cys7-Cys150，Cys26-Cys42，Cys29-Cys196，Cys161-Cys175以及Cys186-Cys211，等电点为4.0，分子中含有14.4％的糖，结合位点分别位于Asn78、Asn84及Asn141。

3.根据权利要求2所述的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，其中SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶和可药用辅料的重量比例为1∶1～1∶2500。

4.根据权利要求3所述的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，其为冻干粉针剂，可药用辅料为甘露醇、右旋糖苷、水解明胶、柠檬酸钠、甘氨酸或聚乙二醇中的一种或其任意混合物。

5.根据权利要求3所述的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，其为注射液剂，可药用辅料为甘露醇、氯化钠、葡萄糖或聚乙二醇中的一种或其任意混合物。

6.根据权利要求4-5任意一项权利要求所述的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，所述药物的规格为0.1～0.2PNA单位/支或瓶。

7.根据权利要求4所述的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物，其是由SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶150PNA单位，加15克甘露醇、2克右旋糖酐40和5克柠檬酸钠溶解，调节pH至中性，加注射用水至500毫升，无菌过滤，分装1000个安瓿中，无菌条件下冷冻干燥，即得。

8.权利要求1的含有SDS-PAGE电泳单一条带人尿激肽原酶的药物组合物用于制备预防和/或治疗脑梗塞的药物的用途。

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