WO2003093287A1 - Nouveau procede de preparation d'alpha-glycosylceramides, nouveaux derives alpha-glycosylceramide et leurs applications. - Google Patents

Nouveau procede de preparation d'alpha-glycosylceramides, nouveaux derives alpha-glycosylceramide et leurs applications. Download PDF

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WO2003093287A1
WO2003093287A1 PCT/FR2003/001362 FR0301362W WO03093287A1 WO 2003093287 A1 WO2003093287 A1 WO 2003093287A1 FR 0301362 W FR0301362 W FR 0301362W WO 03093287 A1 WO03093287 A1 WO 03093287A1
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WO
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linear
hydrogen atom
radical
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PCT/FR2003/001362
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Yen Vo-Hoang
Martine Bonin
Laurent Micouin
Gabriel Gachelin
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Institut Pasteur
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale
Centre National De La Recherche Scientifique
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical

Definitions

  • the invention relates to new glycosylceramide compounds and in particular to new galactosylceramide compounds, to a new process for the preparation of ⁇ -glycosylceramide derivatives, to pharmaceutical compositions and to biological reagents comprising them, as well as to the invention.
  • use of these derivatives as regulators of the activity of NKT cells ("Natural Killer T cells").
  • NKT cells have been shown to be important effectors in the mechanisms of metastasis control of liver and lung tumors in mice (Hashimoto, W. et al., J. Immunol., 154, 4333 (1995)); Anzai R. et al., Immunol., 88, 82 (1996)).
  • NKT cells are likely to play an important role in the eradication of cancers. In addition to this activity, it is also believed that they are likely to play a role in the eradication of parasites, protozoa and intracellular bacterial infections such as Listeria monocytogenes and Mycobacterium tuberculosis (Seki S. et al., Clin. Immunol., 28, 1069 (1996)).
  • NKT cells are closely associated with rejection in bone marrow transplants (Yankelevich, B. et al., J. Immunol., 142, 3423 (1989)) and with the control of the production of IgE antibodies by the control of the differentiation of T cells into Th1 and Th2 (Yoshimoto, T. et al., J. Exp. Med., 179, 1285 (1994)).
  • NKT Va 14+ cells are a subcategory of NKT cells. They have been shown to be closely associated with the development of autoimmune diseases in mice (Mieza, MA et al.; J. Immunol., 156, 4035 (1996); Makino, Y. et al, Clin Immunol, 28, 1487 (1996)). In humans, it has been shown that V ⁇ 24J ⁇ Q ⁇ cells, homologs of mouse NKTV ⁇ l4 + cells, are involved in various autoimmune diseases such as multiple sclerosis, lupus erythematosus (Sumida, T. et al, J. Exp. Med., 182, 1163 (1995) or autoimmune diabetes (SHARIF S. et al, Nature Médecine, 2001, 7, 1057-1062). confirm the pivotal role played by these cells in the homeostasis of the immune system.
  • ⁇ -galactosylceramide-type molecules interact with a major CDld-type histocompatibility complex allowing the recruitment and proliferation of NKT lymphocytes (ZH Zeng, AR Castano, BW Segelke, EA Stura, PA Peterson, LA. Wilson, Science, 1997 , 277, 339). They are remarkable for their quality of potential biological tools for decrypting and controlling immune responses.
  • Certain derivatives of the ⁇ -galactosylceramide type have a therapeutic effect on viral diseases, in particular AIDS, hepatitis B, cytomegalovirus infections
  • the authors of the present invention have set themselves the objective of designing and developing a new synthetic route for ⁇ -glycosylceramide derivatives, in particular ⁇ -galactosylceramide derivatives, this synthetic route allowing, from a same intermediary, to lead to molecules with various functionalities, in particular molecules capable of serving as a marker in tests of biological activity.
  • This intermediate has the basic structure characteristic of ⁇ -glycosylceramides, in particular ⁇ -galactosylceramides and it is also endowed with an amino residue onto which various functional fragments can be grafted.
  • the proposed synthetic route therefore makes it possible to prepare, by a single process, an amino ⁇ -glycosylceramide intermediate, in particular amino-galactosylceramide intermediate, and to then decline it into multiple molecules at the end of one or two stages of additional summary.
  • This synthetic route therefore has the advantage of being extremely rational, and therefore more easily extrapolable on a large, economical scale. In addition, it provides access to new molecules, which can be used for their immunoregulatory, antiinfectious, anti-tumor and anti-diabetic properties.
  • This synthetic route makes it possible to use any sugar in the glycosidic part of the molecule, such as for example ⁇ -galactose, ⁇ -glucose, ⁇ -mannose and their derivatives.
  • this synthetic route makes it possible to produce mono- or di- ⁇ -glycosylceramides, the sugars used for a di-glycosylceramide being identical or different.
  • the present invention relates to new ⁇ -glycosylceramide derivatives corresponding to the general formula (SI):
  • Su represents a glycoside residue which can, for example, be chosen from glucose, mannose, galactose and certain glycoside derivatives;
  • - X represents a radical alkanediyl-C 1 -C 3 0 linear or branched, or an aryl group;
  • x is an integer equal to 0 or 1;
  • - y is an integer equal to 0 or 1;
  • - A represents a hydrogen atom; a linear or branched C 1 -C 2 o alkyl group, or an aryl group;
  • glycoside derivatives represented by the symbol Su there is denoted in particular glycosides, such as for example galactose, glucose, mannose, the hydroxyl functions of which are protected, in particular by groups protecting the sugars traditionally used such as acetyl, benzyl residues etc.
  • glycosides and glycoside derivatives used in the present invention are molecules of ⁇ configuration.
  • the present invention relates to new ⁇ -galactosylceramide derivatives corresponding to the general formula (I):
  • Y 2 , Y 3 and Y 4 represent a hydrogen atom, a benzyl group or a monosaccharide which may, for example, be chosen from glucose, mannose, galactose, fiicose, glucosamine and galactosamine;
  • X represents a linear or branched C 1 -C 30 di-yl alkane radical, or an aryl group;
  • x is an integer equal to 0 or 1;
  • y is an integer equal to 0 or 1;
  • A represents a hydrogen atom; a linear or branched C ⁇ -C 2 o alkyl group, or an aryl group;
  • R represents a hydrogen atom or an ⁇ -galactosyl radical corresponding to formula (II) below:
  • K represents a pharmacophore group, such as a fluorescent group, a photoactivable group, a radiolabelled group or any other group allowing the detection and quantitative evaluation of the product corresponding to formula (I) in a biological sample without degradation of the biological sample.
  • a pharmacophore group such as a fluorescent group, a photoactivable group, a radiolabelled group or any other group allowing the detection and quantitative evaluation of the product corresponding to formula (I) in a biological sample without degradation of the biological sample.
  • pharmacophoric groups which can be used within the meaning of the present invention, there may be mentioned in particular: the fluorescent compound known under the trade name of BODIPY® (Boron Dipyrromethene difluoride or dipyrromethene boron difluoride, sold by the company Molecular Probes, Eu relie, Oregon, USA ), nitrobenzoxadiazole (NBD, azirine-functional groups, iodinated heterocyclic groups, radioactive groups and also dansyl groups.
  • BODIPY® Boon Dipyrromethene difluoride or dipyrromethene boron difluoride, sold by the company Molecular Probes, Eulegi, Oregon, USA
  • NBD nitrobenzoxadiazole
  • NBD nitrobenzoxadiazole
  • halogen is meant in the sense of the present invention an atom preferably chosen from fluorine, chlorine, bromine, iodine.
  • aryl in the sense of the present invention an unsaturated cyclic hydrogen carbon derivative, such as a phenyl radical for example, this derivative being optionally substituted by one or more alkyl, alkenyl, C ⁇ -C 6 alkynyl, C ⁇ haloalkyl radicals -C 6 , halogen, -OH, -NH 2 , -COOH or -CONH 2 .
  • heteroaryl groups which can be used within the meaning of the present invention, mention may, for example, be made of pyridine, pyrimidine, imidazole, indole, thiazole, thiophene, oxazole, carboline and quinoline groups.
  • heterocycles comprising from 5 to 10 members and one or more hetero atoms chosen from O, N, S, which can be used in the present invention, mention may be made, for example, of the piperazine, morpholine, oxazolidine, thiazolidine and quinolizidine groups.
  • the molecule thus obtained, and in which the other parameters have the same definition as above, can be represented by the formula (S-Ia) or respectively by the formula (la) below:
  • - X represents a linear or branched C 6 -C 15 di-yl alkane radical or an aryl group
  • - x is an integer equal to 0 or 1;
  • - y is an integer equal to 0 or 1;
  • - A represents: a linear or branched C 4 -C 15 alkyl group or an aryl group;
  • - R represents a hydrogen atom or an ⁇ -galactosyl radical:
  • - K represents a pharmacophore group, such as a fluorescent group, a photoactivatable group, a radiolabelled group chosen from: BODIPY®, NBD, groups with azirine function, iodinated heterocyclic groups, radioactive groups and also dansyl groups .
  • Y 2 , Y 3 and Y 4 represent the hydrogen atom - X represents a C 6 -C 15 alkane di-yl radical, linear or branched;
  • A represents: an alkyl group C 4 -C 15 linear or branched
  • R represents a hydrogen atom or an ⁇ -galactosyl radical:
  • K represents a BODIPY® group.
  • Y 2 , Y 3 and Y 4 represent the hydrogen atom
  • - X represents a linear C 6 -C 15 alkane diyl radical
  • - x is equal to 1;
  • - y is an integer equal to 0 or 1;
  • - A represents a linear alkyl group in C lo -C 15 alkyl
  • - Z represents -CH 2 -CH 2 -;
  • - R represents a hydrogen atom
  • K represents a BODIPY® group.
  • K represents a BODIPY® group
  • this is coupled to (S-Ia) or to (la) by reacting an activated ester of BODIPY® with (S-Ia) or (la), in particular the N-hydroxysuccinimide ester.
  • the invention also relates to a process for the preparation of molecules corresponding to the formula (SI), respectively (I).
  • the process according to the invention is broken down into several distinct stages, one of these stages consisting in preparing a product according to formula (la), this process comprising at least one stage (coupling stage in the SD or D scheme) at during which a glycoside (S-III), respectively an ⁇ -galactoside (III), is reacted with a ceramide (IV) then a step of deprotection of the functional groups:
  • Y′i, Y ′ 2 , Y ′ 3 , Y ′ 4 represent a hydroxyl protecting group or a monosaccharide protected by appropriate protecting groups so that the galactoside (III) hydroxyls do not intervene in the reaction coupling with ceramide (IV).
  • Y′i, Y ′ 2 , Y ′ 3 , Y ′ 4 can be chosen from benzyl, acetyl groups or benzylated, acetylated monosaccharides, etc.
  • the same strategy can be envisaged for the glycosyl residue designated Su in the formula (S-III).
  • Y ′ 5 represents a protective group for the amines so that the amine of the ceramide (IV) does not intervene in the coupling reaction with the glycoside (S-III), respectively the galactoside (III).
  • Y ′ 5 can be chosen from benzyloxycarbonyl, terbutyloxycarbonyl groups;
  • - X and A have the same definition as in the formula (SI), respectively (I).
  • X or A contain a functional group capable of reacting during the coupling reaction of galactoside with ceramide, the latter is protected by an appropriate protective group.
  • the protecting groups for the galactoside, Y'i, Y ' 2 , Y' 3 are particularly preferred.
  • Y ' 4 , and ceramide, Y' 5 are chosen so that they can be removed simultaneously in a single step.
  • protective groups are preferably chosen which can be removed by hydrogenation in the presence of an appropriate catalyst, such as the benzyl and benzyloxycarbonyl groups.
  • an appropriate catalyst such as the benzyl and benzyloxycarbonyl groups.
  • protective groups are chosen which can be removed without damaging the integrity of the molecule, such as as for example: the acetyl group.
  • R and A have the same definition as in formulas (S-I) and (I) above;
  • Y'i, Y ', Y' 3 , Y ' 4 represent, as in formula (III), a protective group for hydroxyls or a monosaccharide protected by appropriate protective groups;
  • the galactoside (III) (or glycoside (S-III)) and ceramide (IV) are coupled with a mixture in equimolar amounts of the galactoside (III) (or glycoside (S-III) ) and ceramide (IV).
  • R represents an ⁇ -galactosyl radical
  • the reaction is carried out by introducing an at least double molar amount of galactoside (III) relative to the ceramide (IV).
  • the coupling of the glycoside (S-III) or of the galactoside (III) with the ceramide (IV) is carried out under conditions described by Mukayama et al, Chem. Lett., 1981, 431-432, in the presence of AgClO 4 and SnCl 2 .
  • the reaction is carried out in a mixture of tetrahydrofuran (THF) and diethyl ether. It is found by NMR analysis that the configuration of the glycosidic cycle is in accordance with what was expected.
  • the group X has the same meaning as in the formula (I).
  • Y ' 5 has the same meaning as in formula (IV) and represents a protective group for the amines so that the amine of (VI) does not react in the reaction with the compound (VII) and that the amine ceramide (IV) does not intervene in the coupling reaction with galactoside (III).
  • Y ′ 5 can be chosen from benzyloxycarbonyl, terbutyloxycarbonyl groups
  • the activated derivative (VI) can be an acid chloride, an ester or an amide.
  • it is an activated ester, such as for example a para-nitrophenyl ester.
  • W represents any activating group as described for example in Protective Groups in Organic Synthesis, TW Green, PGM, Wuts, 3 rd Ed., 1999, JohnWiley & sons, Ltd.
  • W is chosen from nitrophenyl groups and activated succinimidyl esters.
  • Compounds corresponding to formula (VI) can be easily prepared by methods well known to those skilled in the art, these are compounds comprising a protected ine function and an activated acid function, as well as possibly one or more other functions which must not intervene in the coupling reaction with (VII).
  • - A represents: a hydrogen atom; a linear or branched C 1 -C 30 alkyl group, or an aryl group;
  • - X represents an alkane di-yl radical, C ⁇ -C 3 o, linear or branched, or an aryl group;
  • - Y ' 5 is chosen from: the hydrogen atom, a benzyloxycarbonyl group, a ter butyloxycarbonyl group.
  • - A represents: a linear or branched C 4 -C 15 alkyl group, or an aryl group;
  • - X represents an alkane di-yl radical in C 6 -C ⁇ 5 , linear or branched;
  • - Z represents -CH 2 -CH 2 - or -CH ⁇ CH-;
  • - Y ' 5 is chosen from: the hydrogen atom, a benzyloxycarbonyl group.
  • - A represents: a C 4 -C 15 alkyl group, linear or branched
  • - X represents a linear or branched C 5 -C 15 di-yl alkane radical
  • - Y ' 5 is chosen from: the hydrogen atom, a benzyloxycarbonyl group.
  • - A represents: a linear alkyl group in o-Cis
  • - X represents a linear di-yl alkane radical in C 6 -C ⁇ 5 ;
  • - Z represents -CH ⁇ CH-
  • Y ' 5 represents a benzyloxycarbonyl group.
  • R ' represents an ethyl radical and R "represents an ethyl or isopropyl radical.
  • the iminoester (VIII) derived from (+) - hydroxypinanone is condensed with the aldehyde (IX) via an aldolization reaction to give the compound (X).
  • a mixture of esters can be obtained, which is of no importance for the rest since the acid function is deprotected two steps later.
  • the reagent ClTi (OiPr) 3 was used combined with triethylamine, a system which gives better yields than ClTi (OEt) 3 and gives the mixture of ethyl and propyl esters (X) in a ratio 7 / 3.
  • the imine (X) is then hydrolyzed to the amine (XI) and the ester function of (XI) is reduced to alcohol (VII).
  • the hydrolysis reaction is carried out in known manner in an acid medium, preferably in a dilute acid medium.
  • reaction for reducing the ester (XI) to alcohol (VII) is carried out in the presence of a mixed hydride, preferably lithium and boron.
  • (-T -) - hydroxypinanone is a commercial product, like 2-amino ethyl acetate.
  • the reaction is carried out in the presence of BF 3 Et 2 O in an aromatic solvent, such as benzene or toluene for example, preferably at reflux of the solvent.
  • Compound (XIII) is then subjected to a double treatment: a) reduction in alcohol by treatment with DIBAH (di-isobutyl aluminum hydride), then b) oxidation to aldehyde by cl pyridinium lorochromate.
  • DIBAH di-isobutyl aluminum hydride
  • a subject of the invention is also pharmaceutical compositions characterized in that they comprise at least one compound corresponding to the formula (SI) or (I) described above.
  • a molecule of formula (SI) or (I) according to the invention which is provided with an activity for regulating the activity of NKT lymphocytes (orientation TH1 or TH2, cytotoxicity, release of cytokines), can be used for the preparation of a medicament intended for the treatment or prevention of a disease which can be chosen from autoimmune diseases, cancer and in particular metastases from melanomas localized in the lungs or the liver, infectious diseases, especially infections with parasites, protozoa, viruses and bacterial intracellular infections, diabetes, especially type 1 diabetes, chronic and acute inflammatory diseases.
  • autoimmune diseases there may be mentioned in particular uveitis, arthritis, atherosclerosis, lupus erythematosus, Hashimoto's thyroiditis, multiple sclerosis and autoimmune diabetes.
  • These compounds can also be used as a radioprotective agent, to prevent or treat the pathological effects of irradiations, such as irradiation with ⁇ , ⁇ , ⁇ rays, ultraviolet irradiation or X-ray irradiation, irradiation with protons, neutrons or electron beams that are commonly used in the treatment of cancer.
  • irradiations such as irradiation with ⁇ , ⁇ , ⁇ rays, ultraviolet irradiation or X-ray irradiation, irradiation with protons, neutrons or electron beams that are commonly used in the treatment of cancer.
  • These compounds can also be used to prevent or treat deterioration of the bone marrow, as an accelerator of the proliferation of spinal cells.
  • compositions according to the invention can also comprise other therapeutic active agents.
  • the compounds according to the invention are generally formulated in the form of a sterile, pharmaceutically acceptable composition.
  • This pharmaceutical composition can be in any form, provided that it is suitable for the chosen mode of administration.
  • Such a composition can for example be administered parenterally, for example intravenously, intramuscularly or subcutaneously; it can be given orally or nasally by means of a spray, in the form of drops or suppositories etc .... It can be formulated in the form of solutions in water or in oil or in the form of emulsions.
  • excipients which can be used, mention may be made of: water, alcohol, polyols, glycerin, vegetable oils, preserving agents, stabilizing agents, solubilizing agents, wetting agents, emulsifiers, dyes, salts, buffers, antioxidants.
  • the dosage of the compound (S-I) or (I) according to the invention varies according to different factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age and the weight of the individual to be treated.
  • the invention further relates to a reagent for the in vitro evaluation of the activity of NKT lymphocytes, characterized in that it contains at least one compound of formula (S-I) or (I) as described above.
  • the invention also relates to the use of such a reagent for carrying out, in vitro, a test for evaluating the activity of NKT lymphocytes, as well as the kit used during this use and comprising at least one compound of formula (SI) or (I) as defined above.
  • Said evaluation test generally comprises the following steps: the preparation of hepatic or splenic cell suspensions from a mammal, such as for example mice,
  • the invention further relates to the use of a product of formula (S-I) or (I) for sorting active products in the modulation of lymphocyte activity.
  • S-I formula (S-I) or (I) for sorting active products in the modulation of lymphocyte activity.
  • Other advantages and characteristics of the invention will appear on reading the additional description which follows and which refers to examples of the preparation of substituted quinolines falling within the scope of the invention and of demonstration of their biological activity, as well as 'to the appended figures in which: - Figure 1 shows the structure of the product KRN 7000 1,
  • FIG. 2 represents the number of NKT cells measured after injection of 1, 5 or 10 ⁇ g of fluorescent ⁇ -galactosylceramide 4 or of NKR 7000 1,
  • FIG. 3 represents the cellular and sub-cellular distribution of the fluorescent ⁇ -galactosylceramide 4 compound in the macrophages of the peritoneum in mice
  • FIG. 4 represents the image cytometry of adherent fluorescent spleen and liver cells after intravenous injection of the fluorescent ⁇ -galactosylceramide 4 compound in mice
  • FIG. 5 shows the histological location of fluorescent cells on mouse liver sections after intravenous injection of the fluorescent ⁇ -galactosylceramide compound 4 or the compound KRN 7000 1 in mice.
  • the synthesis method used takes up certain known preparation methods ((a) A. SoUadié-Cavallo, JL Koessler, J. Org. Chem., 1994, 59, 3240; b) T. Sakai, OV Naidenko, H. Iijima , M. Kronenberg, Y. Koezuka, J. Med. Chem., 1999, 42, 1836). They have been modified to simplify or improve performance.
  • the formation of the ester 11 is carried out here at ambient temperature but could be carried out at a lower temperature (provision may be made for this reaction between 0 ° C and 30 ° C, preferably between 10 ° C and 25 ° C).
  • the addition of tetradecanal to the ylide derived from triethylphosphonoacetate then ensures almost instantaneous and practically total conversion to trans olefin.
  • the addition of celite to the reaction medium makes it possible to significantly improve the yield by facilitating the treatment. The overall yield over the 3 stages is thus 35%.
  • Another major improvement compared to the methods of the prior art, consists in reducing the mixture of aminoesters 15a, b resulting from the hydrolysis of imines 14a, b by lithium borohydride suspended in THF (2M). Compared to the use of sodium borohydride, the slow addition of hydride is perfectly controlled, which ensures the homogeneity of the reaction medium and the good reproducibility of the results.
  • D-er ⁇ tbro-sphingosine 6 is obtained with an overall yield of 28% compared to the commercial (+) - 2-hydroxy-3-pinanone 13 (Diagram 1).
  • the second reaction is carried out under a hydrogen atmosphere in the presence of a palladium catalyst. It provides direct conversion to the sought-after glycolipid 3.
  • the solubility problems of this derivative require the use of a dichloromethane / methanol mixture gradient for its purification on silica.
  • Diagram 7 The final product sought 4 is directly purified by high performance liquid chromatography (HPLC), (Column Cl 8, solvent gradient: (methanol / water).
  • the solvents are purified and dried by distillation in the presence of
  • Thin layer chromatographies are carried out on 0.2 mm thick silica gel plates 60-F-254 (Merck, Art. 5554), then observed under UV light and revealed by a Dragendorff solution (in optionally combining acid treatment for amino compounds) or with a solution of potassium permanganate.
  • the samples are deposited in film on a plate
  • BRUKER® AC-300P 300.13 MHz.
  • the chemical shifts ⁇ are expressed relative to tetramethylsilane (TMS).
  • TMS tetramethylsilane
  • the 13 C NMR spectra are recorded on the same device (75.43 MHz).
  • the chemical shifts ⁇ are expressed relative to the deuterated chloroform (77.14 ppm).
  • the analyzes and purifications by HPLC were carried out on Waters 2690 and 996 devices (module separation and photodiode array detector).
  • the crude product is purified by flash chromatography on a silica column (eluent: cyclohexane / ethyl acetate 80/20) to yield pure compound 23 in the form of white wax (30 mg, yield 27%) .
  • a solution of ⁇ -galactosylceramide 23 (30 mg, 0.046 mmol) is prepared from a mixture of 4 ml of methanol and 2 ml of tetrahydrofuran. After the addition of 30 mg of 5% palladium on carbon, the mixture is stirred for 3 days at room temperature under a hydrogen atmosphere. The reaction medium is then filtered through celite and the solid residue washed with chloroform. After distilling off the solvents, the crude product is purified by flash chromatography on silica (dichloromethane / methanol mixture 98/2 then mixture 95/5). Compound 3 is thus obtained pure in the form of a white wax (16 mg, yield 85%). MS (IC) 647 1 H NMR ( ⁇ , CD 3 OD): 0.8 (t, 3H, Me), 1.11-1.61 (m, 44H), 2.05 (m,
  • mice used are 6 to 8 weeks old and are supplied by IFF A-Credo (L'Arbresle, France).
  • the ⁇ -galactosylceramide 4 fluorescent probe (1, 5, 10 or 50 ⁇ g in 150 ml of a PBS 0.025% Tween® 20 solution) or the vehicle alone (PBS 0.025% Tween® 20) are injected intraperitoneally. The mice are sacrificed 15 hours after the injection.
  • Preparation of cell suspensions They are prepared from the liver of the injected mice. The liver cells are resuspended in an 80% isotonic Percoll solution (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and then are covered with a 40% isotonic Percoll solution.
  • Antibodies are supplied by PharMingen (San Diego, CA, USA). The cells are pre-incubated for 10 minutes with anti-FC ⁇ III / II antibodies (Fcblock, 2.4G2), then they are exposed for 15 minutes to anti-TCR ⁇ -FITC (H57-597) and NK1.1-PE ( PK136). After washing, the cells are resuspended in a PBS solution and analyzed by flow cytometry using a FACS Calibur® BD Becton Dickinson 5San Jose, CA, USA).
  • lymphocytes NK1.1 + and TCR ⁇ + .
  • the biological activity of the ⁇ -galactosylceramide_4 molecule was tested in vivo and compared with that of the product KRN 7000 1, the structure of which is shown in Figure 1.
  • the control KRN 7000 1
  • Tween® 20 polysorbate
  • This test is based on the property that ⁇ -galactosylceramides have in inducing apoptosis of NKT cells of liver and spleen, restricted by the molecule CDldl, in the hours following the intraperitoneal injection.
  • BODIPY® 4 on the number of NKT cells 1, 5 or 10 ⁇ g of the fluorescent ⁇ -galactosylceramide derivative 4 was injected intraperitoneally, while identical concentrations of KRN 7000 1 were injected as a control.
  • the monocytes from the liver were isolated according to the method described above and analyzed for NK1.1 + TCR ⁇ int + cells by analysis by flow cytometry.
  • FIG. 3 shows the cellular and subcellular distribution of the fluorescent cc-galactosylceramide compound 4 in the macrophages of the peritoneum.
  • Non-adherent cells (NK, NKT and lymphocytes) gave a negative response: they had not absorbed a significant amount of the labeled molecule.
  • the location of the fluorescent marker in the liver was examined using a fluorescence microscope and frozen sections counter-marked with Evans blue, and also by confocal microscopy using counter-marking with rhodamine-phalloidin-PI. The results of these tests are shown in Figure 5. These results show that no labeling of hepatocytes could be noted, as well as no labeling of the endothelial cells lining the blood vessels.
  • the marked cells are assimilated to macrophages or adherent cells, which can be Kupffer cells.
  • the fluorescent marker is stored in vesicles, in the same way as in macrophages of the peritoneum, some of the particles being located near the nucleus.
  • the fluorescent ⁇ -galactosylceramide compound 4 in accordance with the invention does not behave in the same way depending on the mode of injection used.
  • a fraction of the molecules injected into the peritoneum reach the liver (directly or indirectly through the macrophages), which explains the biological activity observed, most of the product injected into the peritoneum remains stored in the macrophages of the peritoneum.
  • the product injected intravenously was found massively in cells of the Kuppfer cell type in the liver and in APC or "Antigen Presenting Cells" (dendritic cells and probably macrophages) of the spleen.

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux dérivés alpha-glycosylcéramide répondant ô la formule générale (S-I), un procédé pour leur préparation ainsi que les compositions pharmaceutiques les comprenant et leurs utilisations.

Description

NOUVEAU PROCÉDÉ DE PRÉPARATION D'α-GLYCOSYLCÉRAMIDES, NOUVEAUX DÉRIVÉS α-GLYCOSYLCÉRAMIDE ET LEURS APPLICATIONS
L'invention se rapporte à de nouveaux composés -glycosylcéramide et en particulier à de nouveaux composés -galactosylcéramide, à un nouveau procédé de préparation de dérivés α-glycosylcéramide, à des compositions pharmaceutiques et à des réactifs biologiques les comprenant, ainsi qu'à l'utilisation de ces dérivés comme régulateurs de l'activité des cellules NKT ("Natural Killer T cells"). II a été démontré que les cellules NKT sont des effecteurs importants dans les mécanismes de contrôle des métastases des tumeurs hépatiques et pulmonaires chez la souris (Hashimoto, W. et al., J. Immunol., 154, 4333 (1995)) ; Anzai R. et al., Immunol., 88, 82 (1996)). Ces données suggèrent que les cellules NKT sont susceptibles de jouer un rôle important dans l'éradication des cancers. Outre cette activité, on pense aussi qu'elles sont susceptibles de jouer un rôle dans l'éradication des parasites, des protozoaires et des infections bactériennes intracellulaires telles que Listeria monocytogenes et Mycobacterium tuberculosis (Seki S. et al., Clin. Immunol., 28, 1069 (1996)).
On sait également que les cellules NKT sont étroitement associées au rejet dans les transplantations de moelle osseuse (Yankelevich, B. et al., J. Immunol., 142, 3423 (1989)) et au contrôle de la production des anticorps IgE par le contrôle de la différenciation des cellules T en Thl et Th2 (Yoshimoto, T. et al., J. Exp. Med., 179, 1285 (1994)).
Les cellules NKT Va 14+ constituent une sous catégorie des cellules NKT. Il a été démontré qu'elles étaient étroitement associées à l'apparition de maladies auto-i munes chez la souris (Mieza, M.A. et al. ; J. Immunol., 156, 4035 (1996) ; Makino, Y. et al, Clin. Immunol, 28, 1487 (1996)). Chez l'homme, il a été montré que les cellules Vα24JαQα, homologues des cellules NKTVαl4+ de la souris, sont impliquées dans différentes maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, le lupus érythémateux (Sumida, T. et al, J. Exp. Med., 182, 1163 (1995) ou le diabète auto-immun (SHARIF S. et al, Nature Médecine, 2001, 7, 1057-1062). Ces données confirment le rôle de pivot joué par ces cellules dans l'homéostase du système immunitaire.
Des composés extraits d'épongés (famille des agélasphines) ont été isolés en 1993 par une équipe japonaise puis testés. Certains de ces dérivés ont été sélectionnés pour leurs activités antitumorales et immunorégulatrices (T. Natori, Y.
Koezuka; T. Higa, Tetrahedron Lett., 1993, 34, 5591 ; EP-0 609 437). Des analogues ont ensuite été synthétisés et testés par ces auteurs (M. Morita, K. Motoki, K.
Akimoto, T. Natori, T. Sakai, E. Sawa, K. Yamaji, Y. Koezuka, E. Kobayashi, H.
Kukushima, J Med. Chem., 1995, 38, 2176 ; H. IIjima, K. Kimura, T. Sakai, A. Ichimura, T. Shimizu, H. Ueno, T. Natori, Y. Koezuka, Bioorg. Med. Chem. , 1998, 6,
1905 ; US-5,849,716 ; US-5,780,441 ; EP-0 666 268 ; US-5,936,076 ; EP-0 694 558).
Des propriétés anti-tumorales, immunostimulantes ont été décrites pour ces composés.
Certains ont été testés pour leurs propriétés radio-protectrices, et pour le traitement des maladies dues à la destruction ou à l'affaiblissement des cellules de la moelle osseuse et pour le traitement de la thrombocytopénie (EP-650-0 650 732 ;
US-6,017,892 ; US-6,071,884).
Ces molécules de type α-galactosylcéramide interagissent avec un complexe majeur d'histocompatibilité de type CDld permettant le recrutement et la prolifération de lymphocytes NKT (Z.H. Zeng, A.R. Castano, B.W. Segelke, E.A. Stura, P.A. Peterson, LA. Wilson, Science, 1997, 277, 339). Ils sont remarquables par leur qualité d'outils biologiques potentiels permettant de décrypter et contrôler les réponses immunitaires.
Des dérivés de type α-galactosylcéramide ont été synthétisés et décrits, notamment dans, EP-0 988 860, et il a été démontré qu'ils stimulaient l'activité cytotoxique anti-cancéreuse des cellules NKT, qu'ils prévenaient l'apparition de l'encéphalomyélite auto-immune chez la souris et du diabète chez la souris Nod.
Certains dérivés de type α-galactosylcéramide ont un effet thérapeutique sur les maladies virales, notamment le SIDA, l'hépatite B, les infections à cytomégalovirus
(voir notamment la demande de brevet EP-A-0 957 161). Toutefois, les composés décrits dans l'art antérieur ont été obtenus par des voies de synthèse longues et difficiles. L'obtention de molécules optiquement actives comportant plusieurs carbones asymétriques et plusieurs fonctionnalités réactives sur la même molécule rend la synthèse de ces composés compliquée et difficilement rationalisable.
Les auteurs de la présente invention se sont donnés pour objectif la conception et la mise au point d'une nouvelle voie de synthèse de dérivés α-glycosylcéramide, en particulier de dérivés α-galactosylcéramide, cette voie de synthèse permettant, à partir d'un même intermédiaire, d'aboutir à des molécules aux fonctionnalités variées, notamment des molécules susceptibles de servir de marqueur dans des tests d'activité biologique. Cet intermédiaire possède la structure de base caractéristique des α-glycosylcéramides, en particulier des α-galactosylcéramides et il est en outre doté d'un résidu aminé sur lequel peuvent être greffés des fragments fonctionnels variés. La voie de synthèse proposée permet donc de préparer, par un seul procédé, un intermédiaire α-glycosylcéramide aminé, en particulier α- galactosylcéramide aminé, et de le décliner ensuite en de multiples molécules à l'issue d'une ou de deux étapes de synthèse supplémentaire. Cette voie de synthèse présente donc l'avantage d'être extrêmement rationnelle, et donc plus facilement extrapolable à une grande échelle, économique. En outre, elle permet d'accéder à des molécules nouvelles, susceptibles d'être utilisées pour leurs propriétés immunorégulatrices, antiinfectieuses, anti-tumorales, anti-diabétiques. Cette voie de synthèse permet d'utiliser tout sucre dans la partie glycosidique de la molécule, tel que par exemple l'α- galactose, l'α-glucose, l'α-mannose et leurs dérivés. De plus, cette voie de synthèse permet de réaliser des mono- ou des di-α-glycosylcéramides, les sucres utilisés pour un di-glycosylcéramide étant identiques ou différents.
La présente Invention a pour objet de nouveaux dérivés α-glycosylcéramide répondant à la formule générale (S-I) :
Figure imgf000005_0001
(S-I) dans laquelle :
Su représente un résidu glycoside qui peut, par exemple, être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose et certains dérivés de glycoside ; - X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; x est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C2o, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH==CH- ;
- R représente un atome d'hydrogène ou un résidu glycoside qui peut, par exemple, être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose et leurs dérivés ; R peut être identique ou différent du radical Su ; - B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ; B peut également représenter une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en Cι-C3o, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, -NH2, halogène, -COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; B peut être un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; B peut aussi représenter une chaîne peptidique ou pseudopeptidique comprenant par exemple de 2 à 20 acides aminés, de préférence de 2 à 10 acides aminés ; - K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection et l'évaluation quantitative du produit répondant à la formule (I) dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique.
Parmi les dérivés de glycoside représentés par le symbole Su, on désigne en particulier les glycosides, tels que par exemple le galactose, le glucose, le mannose, dont les fonctions hydroxyles sont protégées, notamment par des groupements protecteurs des sucres traditionnellement employées tels que les résidus acétyle, benzyle etc .. On désigne également les composés di-glycoside et polyglycoside, protégés ou non sur leurs fonctions hydroxyle. Préférentiellement, les glycoside et dérivés de glycoside employés dans la présente invention sont des molécules de configuration α.
Dans une mise en œuvre préférée, la présente Invention a pour objet de nouveaux dérivés α-galactosylcéramide répondant à la formule générale (I) :
Figure imgf000006_0001
(I) dans laquelle :
- Yl5 Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosaccharide qui peut par exemple être choisi parmi le glucose, le mannose, le galactose, le fiicose, la glucosamine et la galactosamine ; X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ; x est un entier égal à 0 ou à 1 ; y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en Cι-C2o, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :
Figure imgf000007_0001
(II) dans laquelle Yls Y2, Y3, Y4 ont les mêmes définitions que celles indiquées ci- dessus dans la formule (I) ;
B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ; B peut également représenter une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C Cso, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, -NH2, halogène, -COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; B peut être un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; B peut aussi représenter une chaîne peptidique ou pseudopeptidique comprenant, par exemple, de 2 à 20 acides aminés, de préférence de 2 à 10 acides aminés ;
K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué ou tout autre groupement permettant la détection et l'évaluation quantitative du produit répondant à la formule (I) dans un échantillon biologique sans dégradation de l'échantillon biologique.
Parmi les groupements pharmacophores utilisables au sens de la présente invention, on peut notamment citer : le composé fluorescent connu sous le nom commercial de BODIPY® (Boron Dipyrromethene difluoride ou dipyrrométhène difluorure de bore, vendu par la société Molecular Probes, Eugène, Oregon, USA), le nitrobenzoxadiazole (NBD, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs ainsi que les groupements dansyle. Par halogène, on entend au sens de la présente invention un atome choisi de préférence parmi le fluor, le chlore, le brome, l'iode.
Par aryle, on entend au sens de la présente invention un dérivé hydrogénocarboné cyclique insaturé, tel qu'un radical phényle par exemple, ce dérivé étant éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux alkyle, alcényle, alcynyle en Cι-C6, halogénoalkyle en Cι-C6, halogène, -OH, -NH2, -COOH ou -CONH2.
Parmi les groupements hétéroaryles utilisables au sens de la présente invention, on peut citer par exemple les groupements pyridine, pyrimidine, imidazole, indole, thiazole, thiophène, oxazole, carboline et quinoline.
Parmi les hétérocycles comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S, utilisables dans la présente invention, on peut citer par exemple les groupements pipérazine, morpholine, oxazolidine, thiazolidine et quinolizidine.
Selon une première variante de l'invention, la molécule répondant à la formule (S-I) ou à la formule (I) se caractérise en ce que : x=y=0 et B=H. La molécule ainsi obtenue, et dans laquelle les autres paramètres ont la même définition que ci-dessus peut être représentée par la formule (S-Ia) ou respectivement par la formule (la) ci-dessous :
Figure imgf000009_0001
(S-Ia)
Figure imgf000009_0002
(la) Conformément à l'invention, les molécules répondant à la formule (S-I) ou plus particulièrement (I) dans laquelle x=l ou y=l, et B≠H sont obtenues par un procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir le composé (S-Ia), respectivement (la), avec un composé répondant à la formule (Ib) ci-dessous :
O
T [ - • ] B-+K] x y
(Ib) suivant le schéma S-E, respectivement E, ci-dessous
Figure imgf000010_0001
Schéma S-E
Schéma E
Figure imgf000010_0002
Dans la formule (Ib), x, y, B et K ont la même définition que ci- dessus et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction aminé libre de (S-Ia), respectivement (la).
De telles réactions sont bien connues de l'homme du métier. Dans le cas où x=l, on peut notamment se reporter à J. March, Advanced Organic Chemistry, Third Edition, 1985, 370-377. L'acylation de la fonction aminé de (la) peut de façon connue être faite par réaction avec un acide activé sous forme de chlorure d'acide, d'amide, d'ester activé ou d'anhydride. Des exemples de réalisation seront donnés ultérieurement dans la description. Dans le cas où x=0, on peut se reporter à J. March, pré-cité, pages 798-800 (alkylation réductrice d'aminés). De préférence, dans la formule (S-I), respectivement (I), et dans les formules (S-Ia) et (la) ci-dessus l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies :
- Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène
- X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- x est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
- R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle :
Figure imgf000011_0001
- B représente un groupement choisi parmi : l'atome d'hydrogène, et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle ou alcényle en Cι-Cι2, linéaire ou ramifié,
- K représente un groupement pharmacophore, tel qu'un groupement fluorescent, un groupement photoactivable, un groupement radiomarqué choisi parmi : le BODIPY®, le NBD, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs ainsi que les groupements dansyle.
De manière particulièrement préférée dans la formule (S-I), respectivement (I), ou la formule (S-Ia), respectivement (la) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies :
- Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène - X représente un radical alcane di-yle en C6-C15, linéaire ou ramifié ;
- x est un entier égal à 0 ou à 1 ; y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ;
Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH-;
R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle :
Figure imgf000012_0001
- B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle en CrC12, linéaire ou ramifié ;
- lorsque B ≠ H, K représente un groupement BODIPY®.
Encore plus préférentiellement, au sens de la présente invention, les produits de formule (S-I), respectivement (I), ou (S-Ia) ou (la), se caractérisent en ce que l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies :
- Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène,
- X représente un radical alcane diyle linéaire en C6-C15 ;
- x est égal à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- A représente un groupement alkyle linéaire en Clo-C15 ;
- Z représente -CH2-CH2- ;
- R représente un atome d'hydrogène ;
B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0, un groupement alkyle linéaire en C Cβ ;
- lorsque B ≠ H, K représente un groupement BODIPY®.
Dans le cas où K représente un groupement BODIPY®, celui-ci est couplé à (S-Ia) ou à (la) en faisant réagir un ester activé de BODIPY® avec (S-Ia) ou (la), notamment l'ester de N-hydroxysuccinimide. L'invention a également pour objet un procédé de préparation des molécules répondant à la formule (S-I), respectivement (I). Le procédé selon l'invention se décompose en plusieurs étapes distinctes, l'une de ces étapes consistant à préparer un produit selon la formule (la), ce procédé comportant au moins une étape (étape de couplage dans le schéma S-D ou D) au cours de laquelle on fait réagir un glycoside (S-III), respectivement un α- galactoside (III), avec un céramide (IV) puis une étape de déprotection des groupements fonctionnels :
Figure imgf000013_0001
(S-III) (IV) (S-V)
déprotection
Figure imgf000013_0002
(S-la)
Schéma S-D
Figure imgf000014_0001
déprotectlon
Figure imgf000014_0002
Schéma D
Dans la formule (III) :
- Y'i, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement protecteur des hydroxyle ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés de façon à ce que les hydroxyle du galactoside (III) n'interviennent pas dans la réaction de couplage avec le céramide (IV). De façon connue, Y'i, Y'2, Y'3, Y'4 peuvent être choisis parmi les groupements benzyle, acétyle ou les monosaccharides benzylés, acétylés ....La même stratégie peut être envisagée pour le résidu glycosyle désigné Su dans la formule (S-III).
Dans la formule (IV) : - Y'5 représente un groupement protecteur des aminés de façon à ce que l'aminé du céramide (IV) n'intervienne pas dans la réaction de couplage avec le glycoside (S-III), respectivement le galactoside (III). De façon connue, Y'5 peut être choisi parmi les groupements benzyloxycarbonyle, terbutyloxycarbonyle ;
- Z représente le groupement -CH=CH- ou -CH2-CH2- ; - X et A ont la même définition que dans la formule (S-I), respectivement (I). Lorsque X ou A comportent un groupe fonctionnel susceptible de réagir au cours de la réaction de couplage du galactoside avec le céramide, celui-ci est protégé par un groupe protecteur approprié. De préférence les groupes protecteurs du galactoside, Y'i, Y'2, Y'3,
Y'4, et du céramide, Y'5, sont choisis de façon à pouvoir être ôtés simultanément en une seule étape. Lorsque la molécule (IV) ne comporte pas d'insaturations, on choisit de préférence des groupes protecteurs susceptibles d'être ôtés par hydrogénation en présence d'un catalyseur approprié, comme les groupements benzyle et benzyloxycarbonyle. Lorsque la molécule (IV) comporte une ou plusieurs insaturations que l'on désire conserver dans le composé final (S-I) ou (I), on choisit des groupes protecteurs qui peuvent être ôtés sans porter atteinte à l'intégrité de la molécule, tels que par exemple : le groupement acétyle. Dans les formules (S-V) et (V) : - Z représente le groupement -CH≈CH- ou -CH2=CH2- ;
- X, R et A ont la même définition que dans les formules (S-I) et (I) ci-dessus ;
- Y'i, Y' , Y'3, Y'4, représentent, comme dans la formule (III), un groupement protecteur des hydroxyles ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés ;
- Y'5 représente, comme dans la formule (IV) ci-dessus un groupement protecteur des aminés.
Lorsque R=H, on réalise le couplage du galactoside (III) (ou du glycoside (S-III)) et du céramide (IV) avec un mélange en quantités équimolaires du galactoside (III) (ou du glycoside (S-III)) et du céramide (IV). Lorsque R représente un radical α-galactosyle, la réaction est faite en introduisant une quantité molaire au moins double de galactoside (III) par rapport au céramide (IV).
De façon avantageuse, le couplage du glycoside (S-III) ou du galactoside (III) avec le céramide (IV) est fait dans des conditions décrites par Mukayama et al, Chem. Lett., 1981, 431-432, en présence de AgClO4 et SnCl2. De façon préférentielle, la réaction se fait dans un mélange de tétrahydrofurane (THF) et d'éther diéthylique. On constate par analyse RMN que la configuration du cycle glycosidique est conforme à ce qui était attendu.
Dans les formules (S-Ia) et (la) : les groupements Su, Yi, Y2, Y3, Y4, X, R, Z et A ont la même définition que dans les formules (S-I), respectivement (I).
Les composés répondant à la formule (III) sont connus dans l'art antérieur, leur mode de préparation a été décrit, notamment par K. L. Nicolaou, R. E. Dolle, P. P. Papahatjis, (J Am. Chem. Soc, 1984, 106, 4189 et références citées).
Dans le cas où Y'i, Y' , Y'3 et Y'4 représentent un groupement benzyle, le schéma de synthèse est le suivant (schéma C) :
Figure imgf000016_0001
22 rdt 44%, 2 étapes 9 rdt 55%
Schéma C Dans ce schéma, les abréviations DAST et NBS signifient respectivement : DiethylAminoSulfurTrifluoride et N-BromoSuccinimide (Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, Ed : Paquette, 1995, JohnWiley & sons, Ltd, p.1787 et 768). Dans le cas où l'on souhaite obtenir le composé α- galactoside 6-fluoré peracétylé, on procède de la même façon que ci-dessus en supprimant les étapes de désacétylation et de benzylation.
Dans le cas des produits de formule (S-I), l'homme du métier saura adapter la préparation du dérivé fluoré au cycle glycosidique concerné. Dans les cas où l'un ou plusieurs des substituants Y'i, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement monosaccharide benzyle ou acétyle, on procède de la même façon.
Les produits répondant à la formule (IV) ont été préparés par un procédé caractérisé en ce que l'on fait réagir un dérivé activé (VI) avec un analogue ou un dérivé de la D-érythro-sphingosine (VII) ou avec la D-érythro-sphingosine elle- même suivant le schéma B ci-dessous :
Figure imgf000017_0001
(VI) (VII) (IV)
Schéma B
Dans la molécule (VI), le groupement X a la même signification que dans la formule (I). Y'5 a la même signification que dans la formule (IV) et représente un groupement protecteur des aminés de façon à ce que l'aminé de (VI) ne réagisse pas dans la réaction avec le composé (VII) et que l'aminé du céramide (IV) n'intervienne pas dans la réaction de couplage avec le galactoside (III). Y'5 peut être choisie parmi les groupements benzyloxycarbonyle, terbutyloxycarbonyle
Le dérivé activé (VI) peut être un chlorure d'acide, un ester ou un amide. Préférentiellement, c'est un ester activé, tel que par exemple un ester de para- nitrophényl. W représente tout groupe activateur tel que décrit par exemple dans Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. Green, P.G.M., Wuts, 3ème Ed., 1999, JohnWiley & sons, Ltd. De préférence, W est choisi parmi les groupements nitrophényle et les esters activés de succinimidyle. Des composés répondant à la formule (VI) peuvent être aisément préparés par des méthodes bien connues de l'homme du métier, ce sont des composés comprenant une fonction a iné protégée et une fonction acide activée, ainsi qu'éventuellement une ou plusieurs autres fonctions qui ne doivent pas intervenir dans la réaction de couplage avec (VII). Pour la préparation de telles molécules, on pourra se référer aux ouvrages concernant la chimie des acides aminés, notamment aux chapitres concernant la protection, la déprotection et l'activation des groupes fonctionnels. La préparation de composés répondant à la formule (VI) est illustrée plus loin dans la description.
Dans la molécule (VII), A a la même définition que dans la formule (I), Z représente le groupement -CH=CH-
Le composé répondant à la formule (IV) ci-dessous, dans laquelle Z et A ont la même définition que dans la formule (I) et Y'5 représente un groupement choisi parmi l'atome d'hydrogène et les groupements protecteurs des aminés, constitue un autre objet de l'invention :
Figure imgf000018_0001
(IV)
Selon l'invention :
- A représente : un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en C1-C30, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
- X représente un radical alcane di-yle, en Cι-C3o, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
- Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle, un groupement ter butyloxycarbonyle.
De préférence :
- A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié, ou un groupement aryle ;
- X représente un radical alcane di-yle en C6-Cι5, linéaire ou ramifié ; - Z représente -CH2-CH2- ou -CH≈CH- ;
- Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle.
Encore plus préférentiellement :
- A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ;
- X représente un radical alcane di-yle en C5-C15, linéaire ou ramifié ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH-=CH- ;
- Y'5 est choisi parmi : l'atome d'hydrogène, un groupement benzyloxycarbonyle.
Avantageusement :
- A représente : un groupement alkyle linéaire en o-Cis ;
- X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-Cι5 ;
- Z représente -CH≈CH- ;
Y'5 représente un groupement benzyloxycarbonyle.
Le composé (Vlla) (composé (VII) avec Z = -CH≈CH-) est obtenu par une voie de synthèse qui est décrite dans le schéma A ci-dessous :
Figure imgf000019_0001
Schéma A
Dans ce schéma A, R' représente un radical éthyle et R" représente un radical éthyle ou isopropyle.
L'iminoester (VIII) dérivant de la (+)-hydroxypinanone est condensé avec l'aldéhyde (IX) via une réaction d'aldolisation pour donner le composé (X). En fonction du réactif employé pour la réaction d'aldolisation (SoUadié-Cavallo et al, J. Org. Chem., 1994, 59, 3240-3242), on peut obtenir un mélange d'esters, ce qui est sans importance pour la suite puisque la fonction acide est déprotégée deux étapes plus loin.
De façon préférentielle, on a utilisé le réactif ClTi(OiPr)3 associé à de la triéthylamine, système qui donne de meilleurs rendements que le ClTi(OEt)3 et donne le mélange d'esters éthylique et propylique (X) dans un ratio 7/3.
L'imine (X) est ensuite hydrolysée en aminé (XI) et la fonction ester de (XI) est réduite en alcool (VII). La réaction d'hydrolyse est faite de façon connue en milieu acide, de préférence en milieu acide dilué.
La réaction de réduction de l'ester (XI) en alcool (VII) se fait en présence d'un hydrure mixte, de préférence de lithium et de bore.
Le composé répondant à la formule (VIII) est préparé suivant un procédé résumé dans le schéma de synthèse F ci-dessous et dans lequel R' a la même signification que celle indiquée ci-dessus dans le schéma A :
Figure imgf000020_0001
Schéma F
La (-t-)-hydroxypinanone est un produit commercial, de même que l'amino-2 acétate d'éthyle. La réaction est effectuée en présence de BF3Et2O dans un solvant aromatique, tel que le benzène ou le toluène par exemple, de préférence au reflux du solvant.
Le composé de formule (IX) peut être aisément préparé par des moyens bien connus de l'homme du métier, notamment en suivant le schéma de synthèse G décrit ci-dessous : OHC A * EtOOC
Figure imgf000021_0001
(XII) (XIII) (IX)
Schéma G Le composé (XII) est traité par du triéthylphosphonoacétate d'éthyle en présence d'un hydrure mixte, de préférence un hydrure de lithium et de bore, dans un solvant anhydre, pour donner l'ester (XIII). La conversion en oléfine de configuration trans est quasi totale.
Le composé (XIII) est ensuite soumis à un double traitement : a) une réduction en alcool par traitement au DIBAH (di-isobutyl aluminium hydride), puis b) oxydation en aldéhyde par le cl lorochromate de pyridinium.
L'invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins un composé répondant à la formule (S-I) ou (I) décrite ci-dessus. Une molécule de formule (S-I) ou (I) selon l'invention, qui est dotée d'une activité de régulation de l'activité des lymphocytes NKT (orientation TH1 ou TH2, cytotoxicité, libération de cytokines), peut être utilisée pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie qui peut être choisie parmi les maladies auto-immunes, le cancer et en particulier les métastases de mélanomes localisées dans les poumons ou le foie, les maladies infectieuses, notamment les infections par des parasites, des protozoaires, des virus et les infections bactériennes intracellulaires, le diabète, notamment le diabète de type 1, les maladies inflammatoires chroniques et aiguës. Parmi les maladies auto-immunes on peut citer en particulier l'uvéite, l'arthrite, l'athérosclérose, le lupus érythémateux, la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques et le diabète auto-immun. Ces composés peuvent en outre être utilisés comme agent radioprotecteur, pour prévenir ou traiter les effets pathologiques d'irradiations, telles que les irradiations par les rayons α, β, γ les irradiations ultraviolettes ou les irradiations par rayons X, les irradiations par des protons, des neutrons ou des faisceaux d'électrons qui sont couramment utilisés dans le traitement des cancers. Ces composés peuvent être également utilisés pour prévenir ou traiter les dégradations de la moelle osseuse, comme accélérateur de la prolifération des cellules médullaires. Parmi les maladies infectieuses susceptibles d'être traitées par le produit selon l'invention, on peut citer notamment le SIDA, l'hépatite B et les infections à cytomégalo virus.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent également comprendre d'autres agents actifs thérapeutiques. Les composés selon l'invention sont généralement formulés sous forme d'une composition stérile, pharmaceutiquement acceptable. Cette composition pharmaceutique peut être sous n'importe quelle forme, pourvu qu'elle soit appropriée au mode d'administration choisi. Une telle composition peut par exemple être administrée par voie parentérale, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire ou sous-cutanée ; elle peut être donnée oralement ou par voie nasale au moyen d'un spray, sous forme de gouttes ou de suppositoires etc.... Elle peut être formulée sous forme de solutions dans l'eau ou dans l'huile ou sous forme d'émulsions. Parmi les excipients utilisables, on peut citer : l'eau, l'alcool, les polyols, la glycérine, les huiles végétales, les agents conservateurs, les agents stabilisants, les agents solubilisants, les agents mouillants, les émulsionnants, les colorants, les sels, les tampons, les agents antioxydants.
Le dosage du composé (S-I) ou (I) selon l'invention varie en fonction de différents facteurs tels que la maladie à traiter, la voie d'administration, l'âge et le poids de l'individu à traiter. L'invention a en outre pour objet un réactif pour l'évaluation in vitro de l'activité des lymphocytes NKT, caractérisé en ce qu'il renferme au moins un composé de formule (S-I) ou (I) telle que décrite précédemment.
L'Invention a également pour objet l'utilisation d'un tel réactif pour la réalisation, in vitro, d'un test d'évaluation de l'activité des lymphocytes NKT, ainsi que le kit mis en oeuvre au cours de cette utilisation et comportant au moins un composé de formule (S-I) ou (I) telle que définie précédemment.
Ledit test d'évaluation comprend généralement les étapes suivantes : - la préparation de suspensions cellulaires hépatiques ou spléniques à partir d'un mammifère, tel que par exemple des souris,
- l'introduction d'un composé de formule (S-I) ou (I) telles que décrites précédemment dans cet échantillon de cellules, - l'évaluation de l'activité des composés de formule (S-I) ou (I) par mesure de l'apoptose des lymphocytes NKT hépatiques ou spléniques.
L'invention a en outre pour objet l'utilisation d'un produit de formule (S-I) ou (I) pour effectuer le tri de produits actifs dans la modulation de l'activité lymphocytaire. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture du complément de description qui suit et qui se réfère à des exemples de préparation de quinoléines substituées entrant dans le cadre de l'invention et de démonstration de leur activité biologique, ainsi qu'aux figures annexées dans lesquelles : - la Figure 1 représente la structure du produit KRN 7000 1,
- la Figure 2 représente le nombre de cellules NKT mesuré après injection de 1, 5 ou 10 μg d'α-galactosylcéramide fluorescente 4 ou de NKR 7000 1,
- la Figure 3 représente la distribution cellulaire et sub-cellulaire du composé α-galactosylcéramide fluorescent 4 dans les macrophages du péritoine chez la souris,
- la Figure 4 représente la cytométrie d'image de cellules de rate et de foie adhérentes fluorescentes après injection intraveineuse du composé α- galactosylcéramide fluorescent 4 chez la souris,
- la Figure 5 représente la localisation histologique de cellules fluorescentes sur des sections de foie de souris après injection intraveineuse du composé α-galactosylcéramide fluorescent 4 ou du composé KRN 7000 1 chez la souris.
Il va de soi, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustrations de l'invention et n'en constituent nullement une limitation. EXEMPLES
Les préparations détaillées ci-dessous reposent sur le principe du mode de synthèse convergent (Schéma 1). Par comparaison avec les travaux antérieurs de T. Sakai et al, (Org. Lett. 1999, 1, 359) l'originalité du procédé décrit ci-dessous tient à l'approche synthétique convergente, aux formes de protection, d'activation et d'introduction du bras espaceur, aux variations apportées au mode de synthèse de la D-eryt îro-sphingosine 6 et aux optimisations avec modifications des protocoles expérimentaux dans l'ensemble du schéma synthétique.
Figure imgf000024_0001
α-D-galactose 8 D-ery/Zz-O-sphingosine 6
-**<
Figure imgf000024_0002
Schéma 1
Dans le schéma 1 sont décrites les quatre grandes étapes A-D du procédé selon l'invention de préparation d'un composé particulier répondant à la formule (la). Le composé clé de ce projet, le glycolipide 3 peut ainsi être utilisé pour réaliser une extension moléculaire via la fonctionnalisation de l'aminé primaire. La transformation E est un exemple de dérivatisation destiné à fournir de nouvelles sondes biologiquement actives.
I - PRÉPARATION DE L'α-GALACTOSIDE CÉRAMIDE 3 ET DU GLYCOLIPIDE FLUORESCENT 4 : 1- Synthèse du glycolipide 4
La méthode de synthèse employée reprend certains modes de préparation déjà connus ((a) A. SoUadié-Cavallo, J. L. Koessler, J. Org. Chem., 1994, 59, 3240; b) T. Sakai, O. V. Naidenko, H. Iijima, M. Kronenberg, Y. Koezuka, J. Med. Chem., 1999, 42, 1836). Ils ont été modifiés par souci de simplification ou d'amélioration du rendement.
1.1- Séquence A : Préparation de la D-e yt/iro-sphingosine 6 Elle s'effectue via une réaction d'aldolisation de l'iminoester 5 dérivant de la (+)-hydroxypinanone 13, avec le 2-(E)-hexadécénal 12 conformément à l'enseignement de A. SoUadié-Cavallo, J. L. Koessler, (J. Org. Chem., 1994, 59, 3240) (Schémas 2 et 3). L'aldéhyde insaturé 12 est obtenu en 3 étapes à partir du tétradécanal 10 (Schéma 2). La formation de l'ester 11 est ici réalisée à température ambiante mais pourrait être réalisée à une température plus basse (on peut prévoir de faire cette réaction entre 0°C et 30°C, préférentiellement entre 10°C et 25°C). L'ajout du tétradécanal sur l'ylure dérivé du triéthylphosphonoacétate assure alors une conversion quasi instantanée et pratiquement totale en oléfine trans. Au cours de l'oxydation de l'alcool correspondant par le chlorochromate de pyridinium, l'addition de célite au milieu réactionnel permet d'améliorer significativement le rendement en facilitant le traitement. Le rendement global sur les 3 étapes est ainsi de 35%.
NaH l)DIBAH/toluène
C13H27CH0 (ΕtO)2POCH2CQ 2Εtt C13H27^^ THF, Ih, 20°C > C^7^^^
THF, 20°C, lh 2 2) PCC,CH2C12
10 11 rdt 73% 3h, 0°C 12 2 étapes, rdt 48%
Figure imgf000025_0001
13 5 rdt 83%
Schéma 2 En ce qui concerne l'aldolisation de l'iminoester 5, la modification du protocole consiste à remplacer le chlorotriéthoxyde de titane par son équivalent wopropoxy, plus facile à préparer et à utiliser (Schéma 3).
Figure imgf000026_0001
14a,b R = zsoPr, Et 14a/14b 73/27 rdt 56%
Figure imgf000026_0002
Schéma 3
On obtient alors un mélange d'esters 14a,b, l'ester wopropylique 14a étant nettement majoritaire. La stéréochimie des 2 centres asymétriques créés est respectée et le mélange peut être traité de la même façon que l'ester éthylique 14b dans la suite du schéma réactionnel.
Une autre amélioration majeure, par rapport aux procédés de l'art antérieur, consiste à réduire le mélange d'aminoesters 15a,b résultant de l'hydrolyse des imines 14a,b par le borohydrure de lithium en suspension dans le THF (2M). Comparativement à l'emploi du borohydrure de sodium, l'addition lente de l'hydrure est parfaitement contrôlée ce qui assure l'homogénéité du milieu réactionnel et la bonne reproductibilité des résultats.
Selon ce procédé, la D-erμtbro-sphingosine 6 est obtenue avec un rendement global de 28% par rapport à la (+)-2-hydroxy-3-pinanone commerciale 13 (Schéma 1).
1.2- Séquence B : Préparation du céramide 7 à fonction carbamate
Le composé 7 est obtenu via la condensation de la sphingosine 6 avec un ester activé 18 (Schéma 4). HO
Figure imgf000027_0001
17 rdt 15%
Figure imgf000027_0002
Schéma 4
Selon un objectif synthétique proche, Sakai et al. (Org. Lett., 1999, 1, 359) a précédemment utilisé un dérivé trifluoroacétamide sous forme d'ester activé. Selon l'invention, la fonction aminé du composé 18 est protégée sous forme de carbamate ; ce qui permet d'assurer en fin de synthèse et en une seule étape, toutes les O- et N-déprotections, ainsi que la réduction de la double liaison. L'amidification de la sphingosine 6 et la purification du céramide résultant 7 sont effectuées dans des conditions classiques.
1.3- Séquence C : Préparation du D-Galactose perbenzylé α-fluoré 9
La séquence réactionnelle décrite dans l'art antérieur par Nicolaou et al. (J. A . Chem. Soc, 1984, 106, 4189) a été modifiée ( Schéma 5).
Figure imgf000028_0001
19 20 rdt 72% 21
Figure imgf000028_0002
22 rdt 44%, 2 étapes 9 rdt 55%
Schéma 5
L'ajout de résine amberlite acide au cours de la déprotection des acétates du dérivé 20 assure une conversion totale et permet un traitement basique successif direct pour l'O-benzylation de 21. Dans cette même réaction réalisée dans le diméthylformamide, l'addition d'une quantité sωbstœchiométrique d'iodure de potassium améliore considérablement la réaction. Le rendement global de la transformation du D-galactose 8 en dérivé fluoré 9 conformément à ce procédé est de 14%.
1.4- Séquence D : Obtention de Pα-galactocéramide 3 Pour la première étape de l'O-glycosylation, il est indispensable d'introduire dans le milieu réactionnel des microtamis pulvérulents préactivés. Un changement de solvant a du être opéré par rapport aux conditions déjà décrites sur ce type de couplage (T. Sakai, O. V. Naidenko, H. Iijima, M. Kronenberg, Y. Koezuka, J. Med. Chem., 1999, 42, 1836), (Schéma 6). Une étape de purification est nécessaire à ce stade (chromatographie sur silice). Composé 9 SnCCll22 // AAggCC1l0C 4 Microtamis poudre Et20/THF 9/1.5, 4h, 20°C
Figure imgf000029_0002
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0003
Schéma 6
La deuxième réaction est conduite sous atmosphère d'hydrogène en présence d'un catalyseur palladié. Elle assure la conversion directe en glycolipide 3 cherché. Les problèmes de solubilité de ce dérivé nécessitent d'utiliser un gradient de mélange dichlorométhane / méthanol pour sa purification sur silice.
1.5- Séquence E : Obtention du glycolipide fluorescent 4 Cette étape finale nécessite une simple agitation des deux composants 3 et 24 dans la diméthylformamide.
Figure imgf000029_0004
Schéma 7 Le produit final cherché 4 est directement purifié par chromatographie liquide haute performance (HPLC), (Colonne Cl 8, gradient de solvant : (méthanol/eau).
2- Évaluation biologique de la sonde fluorescente 4 Testée dans des conditions expérimentales similaires à celles utilisées pour des α-galactosylcéramides, cette sonde montre une activité équivalente à celle du composé KRN 7000 décrite par Y. Osman, et al, Eur. J. Immunol, 2000, 30, 1919.
II- DONNÉES EXPÉRIMENTALES : 1- GENERALITES SUR LES METHODES DE SEPARATION ET
D'ANALYSE
Les solvants sont purifiés et séchés par distillation en présence de
LiAlF_4 pour le tétrahydro urane (THF), de sodium et de benzophénone pour l'éther diéthylique (Et2O), en présence de pentachlorure de phosphore pour le dichlorométhane (CH2C1 ), en présence d'hydrure de calcium pour le méthanol, l'acétonitrile et le toluène.
Les chromatographies sur couche mince (CCM) sont réalisées sur plaques de silicagel de 0,2 mm d'épaisseur 60-F-254 (Merck, Art. 5554), puis observées sous la lumière U.V. et révélées par une solution de Dragendorff (en associant éventuellement un traitement acide pour les composés aminés) ou par une solution de permanganate de potassium.
Les séparations préparatives sont réalisées en suivant des techniques de chromatographie éclair, sous moyenne pression sur des colonnes de silice Kieselgel
60 (230-400 Mesh, Merck). Les spectres infrarouges (IR) sont enregistrés sur un appareil Nicolet
205 à transformée de Fourier. Les échantillons sont déposés en film sur plaque de
NaCl.
Les spectres de masse (SM) par ionisation chimique ont été obtenus à l'aide d'un spectromètre NERMAG® RI 0-10, le gaz réactif étant l'ammoniac. Les spectres RMN du 1H sont enregistrés sur un appareil
BRUKER® AC-300P (300,13 MHz). Les déplacements chimiques δ sont exprimés par rapport au tétraméthylsilane (TMS). Les spectres RMN du 13C sont enregistrés sur le même appareil (75,43 MHz). Les déplacements chimiques δ sont exprimés par rapport au chloroforme deutéré (77,14 ppm).
Les analyses et purifications par HPLC ont été réalisées sur des appareils Waters 2690 et 996 (séparation module et photodiode array detector).
2- MODES OPÉRATOIRES ET DONNÉES SPECTRALES
L'ensemble des données spectrales correspondant à l'aldéhyde 12, à la D-erytbrosphingosine 6, à l' p/.αfluorogalactose perbenzylé 9 et à leurs précurseurs sont similaires à celles décrites dans la littérature. Ne seront présentés ici que les composés entièrement originaux.
2.1- Préparation de l'aminoacide N-protégé 1
10 g (49,75 mmol) d'acide 11-amino-undécanoïque 16 et 4,25 g (25 mmol) de chloroformiate de benzyle sont ajoutés à 200 mL de dichlorométhane. Le mélange est laissé sous agitation à reflux du solvant pendant une nuit. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié sur colonne de silice (éluant : cyclohexane 50% - AcOEt 50%) pour conduire à 2.5g de carbamate 17 pur sous forme d'un solide blanc (rendement 15%).
RMN 1H (δ, CDC13) : 1,15-1,6 (m, 16H), 2,28 (t, J=7,5Hz, 2H, H-2), 3,12 (q, J=6,3Hz, 2H, H-l l), 4,62 (s, 2H, OCH2Ph, 5,05 (s, 1H, NH), 7,20-7,45 (m, 5H, Ph).
RMN 13C (δ, CDC13) : 24,7 ; 26,7 ; 29,0 - 29,3 ; 29,8 ; 34,0 ; 41,2 ; 66,7 (CH2) ; 127,0 - 128,4 (CH) ; 136,5 (Cq) ; 156,5 (Cq) ; 178,1 (Cq).
2.2- Préparation de l'ester activé 18
A une solution de 2,5g (7,46 mmol) de carbamate 17 dans 90 mL de dichlorométhane sont ajoutés lg (7,46 mmol) de -nitrophénol, 1,54 g (7,46 mmol) de dicyclohexylcarbodiimide et 30 mg de diméthylaminopyridine. Le mélange est laissé sous agitation pendant 24 heures à température ambiante. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange cyclohexane / acétate d'éthyle : 70/30) pour conduire à l'ester activé 18 pur sous forme de solide blanc (1,6 g, rendement 47 %). RMN 1H (δ, CDC13) : 1,15-1,60 (m, 16H), 2,55 (t, J=7,5 Hz, 2H, H- 2), 3,12 (q, J=6,3 Hz, 2H, H-l l), 4,95 (s large, 1H, NH), 5,10 (s, 2H, OCH2Ph), 7,20 (d, J=9,l Hz, 2H, arom.), 7,30 (m, 5H, arom.), 8,20 (d, J=9,lHz, 2H, arom.).
RMN 13C (δ, CDC13) : 24,4 ; 26,6 ; 28,9 - 29,3 ; 29,8 ; 34,2 ; 41,0 ; 66,4 (CH2) ; 122,3 ; 125,0, 127,9, 128,4 (CH) ; 136,7 ; 145,1 ; 155,4 (Cq) ; 156,5 (Cq) ; 171,2 (Cq).
2.3- Préparation du céramide 7
A une solution de 110 mg (0,37 mmol) de sphingosine 6 et 170 mg (0,37 mmol) d'ester activé 18 dans 15 mL de THF sont additionnés 5 mg de diméthylaminopyridine. Le mélange est laissé sous agitation à température ambiante pendant 48h. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange dichlorométhane/méthanol 95 / 5) pour conduire au céramide 7 pur sous forme de cire blanche (160 mg, rendement 70%).
SM (IC) : 617
RMN 1H (δ, CDC13) : 0,90 (t, J=6 Hz, 3H, Me), 1,2 - 1,65 (m, 30H), 1,80 (m, 1H, OH), 2,07 (q, J=7 Hz, 2H, H-6), 2,25 (t, J=7,5 Hz, 2H), 3,10 (m, 1H, OH), 3,18 (q, J=6,5 Hz, 2H), 3,7 (m, 1H), 3,95 (m, 2H), 4,30 (m, 1H), 4,80 (m, 1H, NH), 5,11 (s, 2H), 5,52 (dd, J=15,3 ; 6,4 Hz, 1H), 5,75 (dt, J=15,3 ; 6,6 Hz, 1H), 6,35 (d, J=7 Hz, 1H, NH), 7,35 (m, 5H, arom.).
RMN 13C (δ, CDC13) : 14,2 (CH3) ; 22,8 ; 25,7 ; 26,7 ; 29,2 ; 29,7 ; 30,0 ; 32,0 ; 32,4 ; 36,9 ; 41,2 (CH2) ; 54,7 (CH) ; 62,6 (CH) ; 66,7 (CH2) ; 74,6 (CH2) ; 127,2 (CH) ; 128,6-128,9 (CH arom.) ; 134,2 (CH) ; 156,5 (Cq) ; 174,1 (Cq).
Analyse élémentaire pour C37H64N O5 ;
Figure imgf000032_0001
2.4- Préparation de l' α-galactosyl-céramide protégé 23
A 3 ml d'éther diéthylique fraîchement distillés et placés sous argon sont ajoutés 80 mg (0,15 mmol) du glycoside fluoré 9 puis 350 mg de microtamis 4Â préalablement activés. Sont ensuite introduits 60,5 mg (0,30 mmol) de perchlorate d'argent, 55,4 mg (0,30 mmol) de chlorure d'étain puis 60 mg (0,097 mmol) de céramide 7 dans 3,5 mL d'un mélange Et2O / THF (3/0,5). Le mélange est laissé sous agitation pendant 4 heures à température ambiante puis dilué avec 10 ml d'acétone. Après 15 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est filtré sur célite. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur colonne de silice (éluant : mélange cyclohexane/acétate d' éthyle 80/20) pour conduire au composé 23 pur sous forme de cire blanche (30 mg, rendement 27%).
RMN 1H (δ, CDC13) : 0,87 (t, J=6,8 Hz, 3H, Me), 1,20 - 1,60 (m, 42H), 1,95 (m, 2H), 2,12 (td, J=7,4 ; 2,4 Hz, 2H), 3,17 (q, J=6,6 Hz, 2H), 3,50 (m, 2H), 3,68 (dd, J=10,5 ; 3,8 Hz, IH), 3,75 - 3,88 (m, 3H), 3,95 (m, 2H), 4,03 (dd, J=9,9 ; 3,6 Hz, IH), 4,13 (m, IH), 4,35 ; 4,45 (2d, J=l l,7 Hz, 2H), 4,55 ; 4,90 (2d, J=l l,4 Hz, 2H), 4,20 ; 4,85 (2d, J=l l,l Hz, 2H), 4,73 (m, 3H), 5,10 (s, 2H), 5,42 (dd, J=15,4 ; 5,4 Hz, IH), 5,66 (dt, J=16,4 ; 6,7 Hz, IH), 6,38 (d, J=8,l Hz, IH, NH), 7,30 (m, 5H, arom.). RMN 13C (δ, CDC13) : 14,2 (Me) ; 22,8 ; 25,7 ; 26,7 ; 29,2-29,9
31,9 ; 32,4 ; 36,7 ; 41,1 (CH2) ; 52,8 (CH) ; 66,7 (CH2) ; 68,7 (CH2) ; 69,1 (CH2) 69,8 (CH) ; 72,7 ; 73,4 ; 74,0 ; 74,5 (CH2) ; 74,2 ; 74,8 (CH) ; 75,9 ; 79,3 ; 99,1 (CH) 127,4-128,5 (CH arom.) ; 129,2 (CH ène) ; 133,0 (CH ène) ; 136,7 ; 137,7 ; 138,1 138,4 ; 138,5 (Cq) ; 156,4 (Cq) ; 173,2 (Cq). 2.5- Préparation de l' α-galactosyl-céramide 3
Une solution de l' α-galactosylcéramide 23 (30 mg, 0,046 mmol) est préparée à partir d'un mélange de 4 ml de méthanol et de 2 ml de tétrahydrofurane. Après addition de 30 mg de palladium sur charbon à 5 %, le mélange est agité 3 jours à température ambiante sous atmosphère d'hydrogène. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur célite et le résidu solide lavé avec du chloroforme. Après distillation des solvants, le produit brut est purifié par chromatographie éclair sur silice (mélange dichlorométhane/méthanol 98/2 puis mélange 95/5). Le composé 3 est ainsi obtenu pur sous forme d'une cire blanche (16 mg, rendement 85 %). MS (IC) 647 RMN 1H (δ, CD3OD) : 0,8 (t, 3H, Me), 1,11-1,61 (m, 44H), 2,05 (m,
2H), 2,70 (m, 2H), 3,5-3,85 (m, 10H), 4,8 (d, J=3 Hz, IH), 7,2 (d, J=8 Hz, IH, NH). RMN 13C (δ, CD3OD) : 24,2 (CH3) ; 27,0 - 32,4 ; (CH2) ; 37,7 (CH2) ; 41,2 (CH) ; 48,3 (CH2) ; 55,8 (CH) ; 63,2 (CH2) ; 68,7 (CH2) ; 70,7-72,8 ; 101,6 (CH) ; 176,6 (Cq).
2.6- Préparation de l'α-galactosyl-céramide-BODIPY® 4 7 mg (0,011 mmol) d' α-galactosyl-céramide 3 sont dissous dans 0,5 ml de diméthylformamide (DMF). Après introduction de l'ester activé 24 (5 mg, 0,011 mmol dissous dans 0,2 m de DMF), le mélange est agité pendant 36 heures sous atmosphère inerte. Après évaporation du solvant, le produit brut est purifié directement par chromatographie liquide haute performance, (colonne Novapak® Cl 8, méthanol puis gradient méthanol/eau, 80/20). On isole ainsi 2,5 mg d'un solide rouge (rendement 25 %) qui doit être conservé au froid (-20°C) et à l'abri de la lumière.
MS (FAB) M+23 : 943
Masse exacte, Analyse Haute Résolution 943,6107 pour C49H83O9N4F2BNa
RMN 1H (δ, CD3OD) : 0,8 (t, J=6 Hz, 3H, Me), 1,20-1,60 (3m, 44H), 2,15 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,60 (m, 2H), 3,05-3,15 (m, 2H), 3,40- 3,90 ( 5m, 8H), 6,20 (s large, IH), 6,30 (s large, IH), 7,0 (s large, IH), 7,40 (s large, IH). III- Mise en évidence de l'activité biologique du produit fluorescent α-galactosylcéramide 4
3.1 Matériel et méthodes
Les souris C57BL/6 utilisées sont âgées de 6 à 8 semaines et sont fournies par IFF A-Credo (L'Arbresle, France). La sonde fluorescente α-galactosylcéramide 4 (1, 5, 10 ou 50 μg dans 150 ml d'une solution PBS 0,025% Tween® 20) ou le véhicule seul (PBS 0,025% Tween® 20) sont injectés par voie intrapéritonéale. Les souris sont sacrifiées 15 heures après l'injection.
Préparation des suspensions cellulaires : Elles sont préparées à partir du foie des souris injectées. Les cellules du foie sont resuspendues dans une solution isotonique de Percoll à 80 % (Pharmacia, Uppsala, Suède) puis sont recouvertes avec une solution isotonique de Percoll à 40 %.
Une centrifugation pendant 20 minutes à 3000 tours/min permet de concentrer les cellules mononucléées à l'interface 40-80 %. Les cellules collectées sont enfin lavées une fois avec une solution de PBS.
Marquage et analyse en cytométrie de flux :
Les anticorps sont fournis par PharMingen (San Diego, CA, USA). Les cellules sont pré-incubées pendant 10 minutes avec des anticorps anti-FCγIII/II (Fcblock, 2.4G2), puis elles sont exposées pendant 15 minutes aux anticorps anti- TCRαβ-FITC (H57-597) et NK1.1-PE (PK136). Après un lavage les cellules sont resuspendues dans une solution de PBS et analysées par cytométrie de flux au moyen d'un appareil FACS Calibur® BD Becton Dickinson 5San José, CA, USA).
Résultats : La proportion relative de lymphocytes NK1.1+ et TCRαβ+ du foie est évaluée par analyse en cytométrie de flux :
• souris témoin : 23,65 ± 10,26
• souris traitée : 1,13 ± 0,54
Aucune différence significative n'est trouvée entre les proportions relatives de ces lymphocytes (NK1.1+ et TCRαβ+) préparées à partir des souris traitées par 1, 5 ou 10 μg de la sonde fluorescente 4.
Tout d'abord, l'activité biologique de la molécule α-galactosylcéramide_4 a été testée in vivo et comparée à celle du produit KRN 7000 1 dont la structure est représentée sur la Figure 1. En tant que réactif pour l'activation in vivo des cellules NKT, le témoin (KRN 7000 1) est habituellement injecté intra- péritonéalement sous forme d'une suspension dans 0,5% de Tween® 20 (polysorbate) dans le PBS. Ce test est fondé sur la propriété qu'ont les α-galactosylcéramides à induire l'apoptose des cellules NKT de foie et de rate, restreintes par la molécule CDldl, dans les heures qui suivent l'injection intrapéritonéale. 3.2 Influence du KRN 7000 1 et du α-galactosylcéramide
BODIPY® 4 sur le nombre des cellules NKT 1, 5 ou 10 μg du dérivé α-galactosylcéramide fluorescent 4 a été injecté intrapéritonéalement, tandis que des concentrations identiques de KRN 7000 1 ont été injectées à titre de contrôle. Les monocytes du foie ont été isolés selon la méthode décrite ci-dessus et analysés à la recherche de cellules NK1.1+ TCR αβ int+ par analyse en cytométrie de flux.
Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 2 annexée sur laquelle le nombre de cellules NKT est exprimé en fonction de la concentration d'α- galactosyl céramide fluorescent 4 ou de KRN 7000 1 injectée en μg.
Ces résultats montrent qu'une quantité injectée aussi faible que 1 μg de la molécule α-galactosylcéramide fluorescente 4 est capable d'induire la disparition de presque toutes les cellules NKT du foie, tout comme le témoin KRN 7000 1. Il est remarquable que les cellules restantes NK1.1+ TCR αβ int+ ne sont pas restreintes à la molécule CDldl et ne répondent donc pas à la définition originale des cellules NKT. La molécule α-galactosylcéramide fluorescente 4 conforme à l'Invention possède donc une activité comparable à celle de KRN 7000 1 dans le test d'apoptose in vivo et dans cette gamme de concentrations.
3.3 Capture des cellules après injection intra-péritonéale
Dans un second temps, on a recherché les premières cellules ayant capturé le composé fluorescent après injection intra-péritonéale de 10 μg du composé α-galactosylcéramide fluorescent 4. Les cellules du péritoine ont été récupérées par lavage de la cavité péritonéale et la recherche du composé marqué fluorescent a été effectuée.
Les résultats obtenus sont représentés sur la Figure 3 annexée sur laquelle est représentée la distribution cellulaire et sub-cellulaire du composé cc- galactosylcéramide fluorescent 4 dans les macrophages du péritoine.
Ces résultats montrent qu'une heure après l'injection presque tous les macrophages ont fourni une réponse positive à la recherche de fluorescence ; le marquage étant soit constitué de taches discrètes le long de la membrane soit situé dans des vésicules dans le cytoplasme. Ces résultats montrent également que le marqueur se lie à un récepteur, et que le complexe migre ensuite vers la membrane où il est absorbé. Des monocytes ont été récupérés du foie et de la rate des souris auxquelles on avait administré le marqueur α-galactosylcéramide fluorescent 4 de façon intra-péritonéale. Les cellules adhérentes et non-adhérentes ont été récupérées séparément et analysées à la recherche d'un marquage. Aucune cellule marquée n'a pu être détectée dans aucun des deux organes. Ceci montre que la molécule α-galactosylcéramide fluorescente 4 a été majoritairement capturée par les macrophages du péritoine. On peut formuler deux hypothèses expliquant l'activité biologique observée sur le foie soit par le fait qu'une quantité indétectable de cette molécule échappe à la capture par le péritoine et migre jusqu'au foie et aux organes périphériques, soit par le fait que des macrophages ayant absorbé la molécule migrent jusqu'au foie où ils libèrent le composé α-galactosylcéramide fluorescent 4. Cette hypothèse est soutenue par l'observation qui a pu être faite que des macrophages du péritoine lavés et réinjectés par voie intraveineuse peuvent induire une activation dans ces organes. 3.4 Etude de la capture cellulaire après injection par voie intraveineuse
Dans un troisième temps, on a recherché quelles étaient les cellules susceptibles de capturer le composé α-galactosylcéramide fluorescent 4 après injection intraveineuse de 50 μg de ce produit chez des souris. Les monocytes du foie et de la rate ont été isolés une heure après l'injection et les cellules adhérentes ont été séparées des cellules non-adhérentes. La fraction des cellules répondant positivement a été déterminée par cytométrie d'image. Les résultats sont exposés sur la Figure 4.
Ces résultats montrent qu'environ 10 % des cellules adhérentes ont donné une réponse positive dans les deux organes avec une localisation sub-cellulaire similaire à celle observée dans les macrophages du péritoine. Les cellules non- adhérentes (NK, NKT et les lymphocytes) ont donné une réponse négative : elles n'avaient pas absorbé de quantité significative de la molécule marquée. La localisation du marqueur fluorescent dans le foie a été examinée à l'aide d'un microscope à fluorescence et de sections congelées contre-marquées à l'aide de bleu d'Evans, et également par microscopie confocale en utilisant un contre-marquage à la rhodamine- phalloidine-PI. Les résultats de ces essais sont exposés sur la Figure 5. Ces résultats montrent qu'aucun marquage des hépatocytes n'a pu être noté, de même qu'aucun marquage des cellules endothéliales bordant les vaisseaux sanguins. Par leur apparence et leur localisation dans les sinusoïdes, les cellules marquées sont assimilées à des macrophages ou à des cellules adhérentes, pouvant être des cellules de Kupffer. Le marqueur fluorescent est stocké dans des vésicules, de la même façon que dans les macrophages du péritoine, certaines des particules étant situées près du noyau.
Par conséquent, on peut en déduire que le composé α- galactosylcéramide fluorescent 4 conforme à l'Invention ne se comporte pas de la même façon en fonction du mode d'injection employé. Bien qu'une fraction des molécules injectées dans le péritoine atteignent le foie (directement ou indirectement par l'intermédiaire des macrophages), ce qui explique l'activité biologique observée, la plus grande partie du produit injecté dans le péritoine reste stockée dans les macrophages du péritoine. Au contraire, le produit injecté par voie intraveineuse a été retrouvé massivement dans les cellules de type cellule de Kuppfer dans le foie et dans les APC ou "Antigen Presenting Cells" (cellules dendritiques et probablement macrophages) de la rate.
Finalement, toutes les cellules n'ayant pas été atteintes par le composé α-galactosylcéramide fluorescent 4, on peut conclure à l'existence d'une spécificité dans la capture des composés de type α-galactosylcéramides conduisant à leur intégration en quantités significatives dans les APC.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivé α-glycosylcéramide répondant à la formule générale (S-I)
Figure imgf000039_0001
(S-I)
dans laquelle :
Su représente un résidu choisi parmi les glycosides et les dérivés de glycoside ; - X représente un radical alcane di-yle en Ci-C3o, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- x est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en Ci-C o linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
- R représente un atome d'hydrogène ou un résidu glycoside qui peut être identique ou différent du radical Su ;
- B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ; ou B représente un groupement choisi parmi : une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en C1-C30, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, -NH2, halogène, -COOH, -CONH , par un groupement aryle éventuellement substitué ou par un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; une chaîne peptidique ou pseudopeptidique.
- K représente un groupement pharmacophore.
2. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est un α- galactosylcéramide répondant à la formule générale (I) :
Figure imgf000040_0001
(I) dans laquelle : - Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosaccharide ;
- X représente un radical alcane di-yle en Ci-C-30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- x est un entier égal à 0 ou à 1 ; - y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en Cι-C2o linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH≈CH- ;
- R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :
Figure imgf000041_0001
(II) dans laquelle Yls Y2, Y3, Y4 ont les mêmes définitions que celles indiquées ci- dessus dans la formule (I),
- B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0 ; ou B représente un groupement choisi parmi : une simple liaison, un radical alkyle, alcényle ou alcynyle en Cι-C3o, linéaire, ramifié ou cyclique, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements -OH, -NH2, halogène,
-COOH, -CONH2, par un groupement aryle éventuellement substitué ou par un groupement hétéroaryle, par un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O, N, S ; un groupement aryle éventuellement substitué ou un groupement hétéroaryle, un hétérocycle comprenant de 5 à 10 chaînons et un ou plusieurs hétéro atomes choisis parmi O,
N, S ; une chaîne peptidique ou pseudopeptidique.
- K représente un groupement pharmacophore.
3. Dérivé selon la revendication 1, caractérisé en ce que x=y=0 et B=H et en ce qu'il répond à la formule (S-Ia) :
Figure imgf000041_0002
(S-Ia) dans laquelle
- Su représente un résidu choisi parmi les glycosides et les dérivés de glycoside ;
- X représente un radical alcane di-yle en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en Cι-C2o linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
- R représente un atome d'hydrogène ou un résidu glycoside qui peut être identique ou différent du radical Su.
4. Dérivé selon la revendication 2, caractérisé en ce que x=y=0 et B-=H et en ce qu'il répond à la formule (la) :
Figure imgf000042_0001
(la) dans laquelle : Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent un atome d'hydrogène, un groupement benzyle ou un monosacchari.de ;
X représente un radical alcane di-yle en Ci-C3o, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
A représente un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en Ci-C2o linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle répondant à la formule (II) ci-dessous :
Figure imgf000043_0001
(II) dans laquelle Yi, Y2, Y3, Y ont les mêmes significations que celles indiquées ci-dessus dans la formule (la).
5. Dérivé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies : - Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène ;
- X représente un radical alcane di-yle, en C6-C15, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- x est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle en C4-C15, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH=CH- ;
- R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle :
Figure imgf000043_0002
B représente un groupement choisi parmi : l'atome d'hydrogène, et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle ou alcényle en Cι-C12, linéaire ou ramifié. „__,__,,
PCT/FR03/01362
43
6. Dérivé selon la revendication 5, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies :
- Yi, Y2, Y3 et Y4 représentent l'atome d'hydrogène ; - X représente un radical alcane di-yle en C6-Cι5, linéaire ou ramifié;
- x est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- y est un entier égal à 0 ou à 1 ;
- A représente : un groupement alkyle en -C15, linéaire ou ramifié ;
- Z représente -CH2-CH2- ou -CH≈CH-; - R représente un atome d'hydrogène ou un radical α-galactosyle ;
B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène et alors x=zy=0, ou B représente un groupement alkyle en Cι-Cn, linéaire ou ramifié.
7. Dérivé selon la revendication 6, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) l'une ou plusieurs des conditions ci-dessous sont remplies :
- Yi, Y2, Y3 et Y représentent l'atome d'hydrogène ;
- X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-C15 ;
- x est égal à 1 ;
- y est un entier égal à 0 ou à 1 ; - A représente : un groupement alkyle linéaire en Cio-C15 ;
- Z représente -CH2-CH2- ;
R représente un atome d'hydrogène ;
B représente un groupement choisi parmi : un atome d'hydrogène, et alors x=y=0, ou B représente un groupement alkyle linéaire en Ci-C6.
8. Dérivé selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) :
- y=i ;
- K représente un groupement pharmacophore choisi parmi : le dipyrrométhène difluorure de bore, le nitrobenzoxadiazole, les groupements à fonction azirine, les groupements hétérocycliques iodés, les groupements radioactifs et les groupements dansyle.
9. Dérivé selon la revendication 8, caractérisé en ce que dans la formule (S-I) ou dans la formule (I) :
- y=i ;
- K représente un groupement dipyrrométhène difluorure de bore.
10. Procédé de préparation d'un dérivé répondant à la formule (S-I) selon la revendication 1 dans laquelle x=l ou y=l, et B≠H, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule (S-Ia) selon la revendication 3, dans laquelle les paramètres Su, X, Z et A ont la même signification que celle indiquée dans la formule (S-I), avec un composé répondant à la formule (Ib) ci-dessous :
T [ " 1 B-t-K] x y
(Ib) dans laquelle x, y, B et K ont la même signification que celle indiquée dans la formule (S-I) et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction aminé libre de (S-Ia), suivant le schéma S-E ci- dessous :
Figure imgf000045_0001
(S-la) (Ib)
(S-I)
Schéma S-E
11. Procédé de préparation d'un dérivé répondant à la formule (I) selon la revendication 2 dans laquelle x=l ou y=l, et B≠H, ce procédé étant caractérisé en ce que l'on fait réagir un composé répondant à la formule (la) selon la revendication 2, dans laquelle les paramètres Yi, Y2, Y3, Y4, X, Z et A ont la même signification que celle indiquée dans la formule (I), avec un composé répondant à la formule (Ib) ci-dessous :
T [ " ] B-t-K ]
(Ib) dans laquelle x, y, B et K ont la même signification que celle indiquée dans la formule (I) et T est choisi pour réaliser l'alkylation (x=0) ou l'acylation (x=l) de la fonction aminé libre de (la), suivant le schéma E ci-dessous :
Figure imgf000046_0001
Schéma E
12. Procédé selon la revendication 10 caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (S-Ia), est préparé par un procédé comportant au moins une étape au cours de laquelle on fait réagir un α-glycoside répondant à la formule (S-III) dans laquelle Su a la même signification que dans la formule (S-I), avec un céramide répondant à la formule (IV) dans laquelle Y'5 représente un groupement protecteur des aminés ; Z représente le groupement -CH=CH- ou -CH2- CH2- ; X et A ont la même définition que dans la formule (S-I), cette étape de couplage étant suivie par une étape de déprotection des groupements fonctionnels selon le schéma S-D :
Figure imgf000047_0001
(S-la)
Schéma S-D
13. Procédé selon la revendication 11 caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (la), est préparé par un procédé comportant au moins une étape au cours de laquelle on fait réagir un α-galactoside répondant à la formule (III) dans laquelle Y'i, Y'2, Y'3 et Y'4 représentent un groupement protecteur des hydroxyle ou un monosaccharide protégé par des groupements protecteurs appropriés, avec un céramide répondant à la formule (IV) dans laquelle Y'5 représente un groupement protecteur des aminés ; Z représente le groupement -CH=CH- ou -CH2- CH - ; X et A ont la même définition que dans la formule (I), cette étape de couplage étant suivie par une étape de déprotection des groupements fonctionnels selon le schéma D :
Figure imgf000048_0001
déprotection
Figure imgf000048_0002
(la)
Schéma D
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que Y'i, Y'2, Y'3, Y'4 et Y'5 sont choisis de façon à pouvoir être ôtés simultanément en une seule étape.
15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que Y'l5 Y'2, Y'3, Y'4 et Y'5, sont choisis parmi les groupements benzyle et benzyloxycarbonyle.
16. Produit répondant à la formule (IV) :
Figure imgf000048_0003
(IV) dans laquelle :
- A représente : un atome d'hydrogène ; un groupement alkyle en Cι-C2o, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ; - X représente un radical alcane di-yle, en C1-C30, linéaire ou ramifié ou un groupement aryle ;
- Z représente -CH=CH- ;
- Y'5 est un groupement benzyloxycarbonyle.
17. Produit selon la revendication 16, caractérisé en ce que :
- A représente : un groupement alkyle linéaire en Cιo-Cι5 ;
- X représente un radical alcane di-yle linéaire en C6-C15 ;
- Z représente -CH=CH-;
Y'5 représente un groupement benzyloxycarbonyle.
18. Procédé selon la revendication 12 ou la revendication 13, caractérisé en ce que le produit répondant à la formule (IV) est préparé par réaction d'un dérivé activé répondant à la formule (VI) dans laquelle W représente un groupe activateur avec un analogue ou un dérivé de la D-érythro-sphingosine répondant à la formule (VII) ou avec la D-érythro-sphingosine, suivant le schéma B ci-dessous :
Figure imgf000049_0001
(VI) (VII) (IV)
Schéma B dans lequel X, Y'5, Z et A ont la même définition que dans la formule (IV).
19. Procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (Vlla), est obtenu par réaction d'un iminoester répondant à la formule (VIII) dans laquelle le radical R' représente un radical éthyle et R" représente un radical éthyle ou isopropyle avec l'aldéhyde répondant à la formule (IX) via une réaction d'aldolisation pour donner le composé (X) puis que l'imine (X) est ensuite hydrolysée en aminé (XI) et la fonction ester de (XI) est réduite en alcool (VII) suivant le schéma A ci-dessous :
Figure imgf000050_0001
Schéma A
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (VIII) est préparé par réaction de la (+)- hydroxypinanone avec l'amino-2 acétate d'éthyle, en présence de BF3Et2O dans un solvant aromatique, de préférence au reflux du solvant, conformément au schéma de synthèse F ci-dessous :
Figure imgf000050_0002
(VIII)
Schéma F dans lequel R' représente un radical éthyle.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que le composé répondant à la formule (IX) est préparé par réaction du composé (XII) par du triéthylphosphonoacétate d'éthyle en présence d'un hydrure mixte de lithium et de bore, dans un solvant anhydre, pour donner l'ester (XIII), qui est ensuite soumis à un double traitement : a) une réduction en alcool par traitement au DIBAH, puis b) oxydation en aldéhyde par le chlorochromate de pyridinium, suivant le schéma de synthèse G décrit ci-dessous :
Figure imgf000051_0001
(XII) (XIII) (IX)
Schéma G
22. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé répondant à la formule (S-I) selon la revendication 1 dans un support pharmaceutiquement acceptable.
23. Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un composé répondant à la formule (I) selon la revendication 2 dans un support pharmaceutiquement acceptable.
24. Utilisation d'un composé de formule (S-I) ou de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné à la régulation de l'activité des lymphocytes NKT.
25. Utilisation d'un composé de formule (S-I) ou de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement ou à la prévention d'une maladie qui peut être choisie parmi les maladies auto-immunes, le cancer, les maladies infectieuses, le diabète, notamment le diabète de type 1, les maladies inflammatoires chroniques et aiguës.
26. Utilisation selon la revendication 25, caractérisée en ce que le médicament est destiné au traitement d'une maladie choisie parmi : l'arthrite, l'athérosclérose, le lupus érythémateux, la thyroïdite d'Hashimoto, la sclérose en plaques, et le diabète auto-immun.
27. Réactif pour l'évaluation in vitro de l'activité des lymphocytes NKT, caractérisé en qu'il renferme au moins un composé de formule (S-I) ou de formule (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
28. Utilisation d'un réactif selon la revendication 27, pour la réalisation, in vitro, d'un test d'évaluation de l'activité des lymphocytes NKT.
29. Utilisation selon la revendication 28, caractérisée par le fait que ledit test comprend les étapes suivantes : - la préparation de suspensions cellulaires hépatiques ou spléniques à partir d'un mammifère,
- l'introduction d'un composé de formule (S-I) ou (I) dans cet échantillon de cellules, - l'évaluation de l'activité des composés de formule (S-I) ou (I) par mesure de l'apoptose des lymphocytes NKT hépatiques ou spléniques.
30. Utilisation selon la revendication 28 ou 29, pour effectuer le tri de produits actifs dans la modulation de l'activité lymphocytaire.
31. Kit pour la mise en œuvre d'un test in vitro d'évaluation de l'activité des lymphocytes NKT, caractérisé en ce qu'il comporte au moins un composé de formule (S-I) ou (I) selon l'une quelconque des revendications 1 à 9.
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