WO2003087376A1

WO2003087376A1 - Cafeine synthase et utilisation correspondante

Info

Publication number: WO2003087376A1
Application number: PCT/JP2003/004601
Authority: WO
Inventors: Hirotaka Uefuji; Hiroshi Sano; Nozomu Koizumi; Atsuhiko Shinmyo
Original assignee: Nara Institute Of Science And Technology
Priority date: 2002-04-17
Filing date: 2003-04-11
Publication date: 2003-10-23
Also published as: AU2003236091A1; JP2003304879A

Description

明細書カフユイン合成酵素及びその用途技術分野

本発明は、コーヒーノキにおける、キサントシンから 7 — メチルキサントシン、 7 —メチルキサンチン、テオプロミン ( 3， 7 —ジメチルキサンチン）を経てカフェイン（ 1， 3， 7 — トリメチルキサンチン）が生合成される一連の反応において、テオプロミンからカフヱインを生成する活性を有するカフェイン合成酵素（ 3， 7—ジメチルキサンチンメチル化酵素）及びその変異体、これらのいずれかをコードする塩基配列を有する DNA分子又は RNA分子、これらの分子を用いたベクタ一、該ベクタ一による形質転換生物及びこれらの用途に関する。背景技術

コーヒーノキ (Cof fea)、チヤノキ (Camel lia sinensis)^ コラ (Cola acuminataリ、マテ (Ilex paraguariensisノは丄， 3， 7 — トリメチルキサンチン（カフェイン）を、カカオ（The obroma cacao)、コラは 3， 7 —ジメチルキサンチン（テオプ口ミン）を生合成する植物である。これらの植物種の葉ゃ果実は嗜好品として飲料や食品に加工され、人々に摂取されている。また、これらの植物種から抽出されたカフヱインは、中枢神経興奮作用などの様々な薬理作用を有するため医薬品として利用されている。

カフヱインは世界中で莫大な需要があるが、これらを生合成する植物種の多くは特定の地域でのみ栽培される。そこで、遺伝子組換え技術を利用して微生物や栽培の簡単な植物種にそれらを生合成させる技術の開発が望まれている。

他方、カフユインの過剰な摂取は不眠、不整脈、震顫などの副作用を引き起こすため、遺伝子組換え技術を利用して力フユイン生合成機能を抑制した植物種を育種し、カフェイン含量の低い飲料や食品を製造する技術が望まれている。これらの技術を開発するためには、力フユインの生合成に関与する遺伝子あるいはその cDNAを単離することが必要である。コーヒーノキ及びチヤノキでは、アデニンヌクレオチド及びグァニンヌクレオチドの異化代謝中間産物であるキサントシンを出発材料とし、 7 —メチルキサントシン、 7—メチルキサンチン、テオプロミンを経てカフヱインが生合成される (後述の文献（1)、図 1参照）。

コーヒーノキから 7 —メチルキサンチンメチル化酵素（テォプロミン合成酵素）をコ— ドする CaMXMT cDNA (後述の文献 (2) )、はすでに単離されている。

また、特開 2 0 0 1 — 3 7 4 9 0号公報には、カフヱイン生合成の最終反応である 7 —メチルキサンチン—テオプロミン—カフヱインの 2段階のメチル化反応を触媒する N —メチル小ランスフヱラ一ゼのァミノ酸配列及びそのァミノ酸配列をコードするチヤノキ由来の DNA配列が記載されている。更に同公報では、該発明にかかる DNAをアンチセンスの形で植物に導入し、ホスト細胞の代謝を改変してメチルキサンチン類（ 7—メチルキサンチン、パラキサンチン、テオプロミン及びカフ · イン）の生成比を改変することができると述ベられており、そのための植物細胞、植物組織又は植物体の供給源として、チヤノキなどのツバキ（Came l l ia) 属植物の他にコ一ヒ一ノキ（Cof fea) 属植物を好ましいものとして例示している。

しかし、ツバキ属植物とコーヒーノキ属植物は系統的に遠縁であり、 N —メチルトランスフヱラーゼのァミノ酸配列及びそのアミノ酸配列をコードする MA配列も両者の間で著しく異なっていることが予測されている。従って、同公報に記載の MAをァンチセンスの形でコーヒーノキ属植物に導入した場合、メチルキサンチン類の生成比を改変できるかどうかは疑わしく、できたとしても効果は非常に弱いものと考えられる。本発明は、コーヒーノキにおける、キサントシンから 7— メチルキサントシン、 7 —メチルキサンチン、テオプロミンを経てカフヱインが生合成される一連の反応において、テオプロミンからカフェインを生成する活性を有するカフヱイン合成酵素、微生物や植物におけるメチルキサンチン類（本明細書において、 7 —メチルキサントシン、 7 —メチルキサンチン、テオプロミン、ハ°ラキサンチン、カフヱインを「メチルキサンチン類」と呼ぶ）の生産制御に有用なカフェイン合成酵素をコ一ドする DNA又は RNA分子、及びそれを用いたべクター等を提供することを目的とする。例えば、本発明による DNA分子の全部もしくは一部を、微生物又は植物に、センス又はアンチセンスの形で組み込むことにより、以下の目的を達成することが可能になる。（1) 工業用、食品用、医療用として利用できるカフェイン合成酵素を効率よく生産し、これを用いて酵素反応によってカフェインを製造する。（2) メチルキサンチン類を生合成する植物体、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代謝を改変して、カフェインを効率よく生産する。（3) メチルキサンチン類を生合成する植物体、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代謝を改変して、カフヱインの生産を抑制又は停止、及びメチルキサンチン類の生成比を変化させる。発明の開示

本発明者らは、上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、配列表の配列番号： 2 に示す MA断片を PCE法により増幅し、次に、この DM分子を発現ベクターに組み込んだ後、大腸菌に導入し、当該 DNA分子に由来するポリペプチドを大量に発現させ、発現したポリべプチドを回収してその酵素学的性質を調べたところ、これが、テオプロミンのメチル化による力フェインの生成反応を触媒することを認めた。すなわち、当該 MA分子が力フェイン合成系を構成する酵素の一つであるカフェイン合成酵素をコードすることが確認された。

上記発現べクタ一に上記 DNAを組み込む方法には、既知のいずれの方法も適用し得る。例えば適当な制限酵素を選択し、これで該 DNAを処理して切断し、次いで同様に処理した発現ベクタ一と混合し、リガーゼによつて再結合する方法が用いられる。この様にして得られた該 DNAと発現べクタ一の結合物を、形質転換法によつて微生物の菌体、好ましくは大腸菌に導入し、遺伝形質として安定するまで増殖すると、目的の遺伝形質とべクタ一 DNAの形質を併せもつ形質転換株が得られる。形質転換株の培養、形質転換株から組換えタンパク質の取得（必要ならばその精製）は、いずれも常法に従って行つてよい。

S —アデノシルメチォニン（SAM) をメチル基供与体としてメチルキサンチン類を生合成する植物であれば、本発明によるカフヱイン合成酵素あるいはそれと同一の酵素活性を有するポリペプチド、更にはこれらをコ一ドする DNAが含まれていると推測され、本発明に記載の方法を用いれば、それらの植物からも、本発明によるカフユイン合成酵素あるいはそれと実質的に同一の酵素、更にはこれらをコ一ドする MA分子又は RNA分子を得ることができる。

本発明は以上の様な知見に基づいて完成されたものである。以下、本発明を説明する。

本発明による DNA分子は、下記の塩基配列（a) (b)のいずれかを有する DNA分子である。

(a)配列表の配列番号： 1 に示すアミノ酸配列を有し、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有するポリべプチドであるカフエイン合成酵素をコ一ドする塩基配列、

(b)上記塩基配列（a)に、該塩基配列（a)がコードするポリべプチドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。

変異塩基配列（b)としては、上記塩基配列（a)とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得るものが好ましい。本発明による DNA分子の具体例は、配列番号： 2 の塩基配列からなる。

本発明による RNA分子は、下記の塩基配列（a) (b)のいずれかを有する ENA分子である。

(a)配列表の配列番号： 1 に示すアミノ酸配列を有し、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有するポリべプチドであるカフヱイン合成酵素をコードする塩基配列、

変異塩基配列（b)としては、上記塩基配列（a)とストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得るものが好ましい。本発明による RNA分子の具体例は、配列番号： 3 の塩基配列からなる。

本発明による DNA分子の他の態様は、上記の DM分子の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列であつて、前記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る。

本発明による RNA分子の他の態様は、上記の RNA分子の有する塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列であつて、前記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る。

本発明によるベクターの一態様は、上記の DNA分子及び ENA 分子のいずれかを含む。このベクターは、例えば、微生物及び Z又は植物の細胞内で、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有するカフユイン合成酵素を発現させることができるか、もしくは該カフヱイン合成酵素の発現を阻害する機能を有するものとして提供することができる。このベクターを用いて、微生物、植物細胞、植物組織又は植物体を形質転換することができ、得られた形質転換体も本発明に含まれる。

また、上記の微生物、植物体、植物組織又は植物細胞を用いてカフヱイン合成酵素を製造することができる。

また、上記の植物体、植物組織又は植物細胞を用いてカフヱインを効率よく生成することができる。

また、上記の植物体、植物組織又は植物細胞を用いてカフエインの生成を抑制又は停止すること、及びメチルキサンチン類の生成比を改変することができる。本明細書において、メチルキサンチン類とは、 7 —メチルキサントシン、 7 —メチルキサンチン、パラキサンチン、テオプロミン及びカフヱインからなる群から選ばれる少なくとも 1つの化合物を言う。

力フインを効率よく生成するために用いる植物体、植物組織又は植物細胞の供給源としては、コーヒーノキ（Coffea) 属植物、ツバキ（Came l l ia) 属植物、コラノキ（Col a) 属植物、モチノキ（I l ex) 属植物、ネエア（Neea) 属植物、ァォギリ（Fi rmiana) 属植物、ポーリニア（Pau l l inia ) 属植物又はカカオノキ（Theobroma ) 属植物を挙げることができる。

カフェインの生成を抑制又は停止するため、及びメチルキサンチン類の生成比を改変するために用いる植物体、植物組織又は植物細胞の供給源としては、上記の力フユインを効率よく生成するために用いるものと同一の群を挙げることができるが、コーヒーノキ属植物が最も適している。

本発明によるカフエイン合成酵素は、下記のァミノ酸配列 (a) (b)のいずれかを有するタンパク質からなり、かつ、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有する。

(a)配列表の配列番号： 1 に示すアミノ酸配列、

(b)配列表の配列番号： 1 に示すアミノ酸配列に、上記酵素活性を損なわない範囲内でのァミノ酸の置換、挿入又は欠失を行つて得られた変異ァミノ酸配列。

この変異ァミノ酸配列（b)としては、上記ァミノ酸配列（a) をコ— ドする塩基配列及び上記変異ァミノ酸配列（b)をコ一ドする塩基配列がストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズし得るものが好ましい。本発明は、上記力フヱイン合成酵素と、テオプロミンと、

S —アデノシルメチォニンとを含む混合液をィンキュベ一シヨンして、カフェインを生成させる、カフヱインの製造法を含む。

この様に、本発明により、カフヱインの生産に用いるカフェイン合成酵素の製造、植物において生産されるメチルキサンチン類の組成の改変などに有用な、カフェイン合成酵素をコ一ドする DNA分子及び RNA分子が提供される。本発明の力フェイン合成酵素は、配列番号： 1 に示したァミノ酸配列を有しているもの、又は、配列番号： 1 のァミノ酸配列に、目的とするカフイン合成酵素活性を損なわない範囲で、アミノ酸の置換、挿入又は欠失を行って得られた変異アミノ酸配列を有しているものである。本明細書では、上記力フユイン合成酵素活性を有する配列番号： 1 のアミノ酸配列及びその変異配列を有するポリペプチドをカフェイン合成酵素と総称する。

上記の変異ァミノ酸配列を有するポリペプチドは、好ましくは、それ自身が実質的にコーヒーノキ由来の力フユイン合成酵素と同等の機能を有し、且つ配列番号： 1のアミノ酸配列と酵素活性に関する部位において高い相同性を有しているものである。

一般に同等の機能を有する複数の酵素間において、酵素活性に必須である部位以外のァミノ酸配列の相同性は非常に低いこと力ある ( Kawagoe et al . , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 93， 12082- (1996)参照）。従って、全体としての相同性が低い場合でも、活性に関する部位において高い相同性を有するものは本発明によるカフイン合成酵素として分類できる。ァミノ酸配列全体として比較した場合における変異アミノ酸配列は、この、配列番号： 1のアミノ酸配列に対して、 1 5 %以上の相同性、好ましくは 3 0 %以上の相同性、より好ましくは 4 5 %以上の相同性、更に好ましくは 6 0 %以上の相同性、更により好ましくは 7 5 %以上の相同性、更により一層好ましくは 9 0 %以上の相同性、最も好ましくは 9 5 % 以上の相同性を有し、かつ目的のカフェイン合成酵素活性を有するポリペプチドを提供できる変異アミノ酸配列である。

なお、配列番号： 1 のアミノ酸配列を基準とした変異を、これらをコ— ドする塩基配列のレベルで表現した場合、変異ァミノ酸配列をコ— ドする変異塩基配列は、配列番号： 1 のァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列に対して、 3 5 %以上の相同性、好ましくは 6 0 %以上の相同性、より好ましくは 7 5 %以上の相同性、更に好ましくは 9 0 %以上の相同性、更に好ましくは 9 5 %以上の相同性を有する変異塩基配列である

本発明によるカフイン合成酵素をコ一ドする塩基配列、すなわちカフイン合成酵素遺伝子としては、配列番号： 1 のァミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を挙げることができ、その具体例としては、配列番号： 2 の DNA配列、配列番号： 3の RNA配列を挙げることができる。これらのカフェイン合成酵素遺伝子に対して、上記で規定される相同性を有する塩基配列も本発明におけるカフユイン合成酵素をコードする遺伝子に含まれる。

目的とするカフユイン合成酵素活性を維持した変異ァミノ酸配列としては、この変異アミノ酸配列をコードする変異塩基配列と、配列番号： 1 のアミノ酸配列をコードする塩基配列とがストリンジェントな条件下でハイブリダィズし得るものが実用上好適に利用し得る。

また、変異カフイン合成酵素遺伝子としても、配列番号：

1のアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列とストリンジントな条件下でハイプリダイズし得るものが実用上好適に利用し得る。その具体例としては、配列番号： 2の塩基配列にストリンジヱントな条件下でハィブリダイズし得る DNA分子及び配列番号： 3の塩基配列にストリンジユントな条件下でハイプリダイズし得る RNA分子を挙げることができる。

このストリンジヱントな条件下でのハイプリダイゼ一ションは、例えば、 Molecular Cloning： Cold Spring Harbor La boratory Press, Current Protocols inMolecular Biology； Wiley Interscience に記載の方法によって行うことができ、市販のシステムとしては、 Gene Image システム（アマシャム）を挙げることができる。具体的には以下の操作によってハイプリダイゼーションを行うことができる。

試験すべき DM分子又は RNA分子を転写した膜を、製品プロトコ一ルに従つて、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダィゼーションパ、ッファー中でハィプリダィズさせる。ノヽィプリダイゼ一シヨンノッファーの組成は、 0. 1重量％ S D S、 5重量％デキストラン硫酸、 1 Z2 0容のキット添付のブロッキング試薬及び 2〜 7 S S Cからなる。プロッキング試薬としては、例えば、 1 0 0 xDenhardt's sol ution ヽ 2 % (重量 Z容量リ Bovine serum albumin 2 % 愈量/容量） FicllTM400、 2 % (重量 Z容量）ポリビニルピロリドンを 5培濃度で調製したものを 1Z2 0に希釈して使用することができる。 2 0 X S S Cは、 3 M塩化ナトリウム、 0. 3 Mクェン酸溶液であり、 S S Cは、より好ましくは、 3〜 6 X S S C、更に好ましくは、 4〜 5 X S S Cの濃度で

0 使用する。

ハイプリダイゼーシヨンの温度は、 4 0〜 8 0で、より好ましくは 5 0〜 7 0 °C、更に好ましくは 5 5〜 6 5 °Cの範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファ一で洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイプリダイゼ一シヨン時の温度である。洗浄バッファーの組成は、 6 X S S C + 0. 1重量％ S D S溶液、より好ましくは 4 X S S C + 0. 1重量％ S D S溶液、更に好ましくは 2 X S S C + 0. 1重量％ S D S溶液、更に好ましくは 1 X S S C + 0. 1重量％ S D S溶液、最も好ましくは 0. 1 X S S C + 0. 1重量％ S D S溶液である。この様な洗浄バッファーで膜を洗浄し、プロ一プがハイプリダィズした DNA分子又は ENA分子を、プロープに用いた標識を利用して識別することができる。

なお、変異は、自然界において生じたものでもよく、塩基配列における部位突然変異により人工的に起こしたものでも良い。

本発明の力フェイン合成酵素遺伝子を有する MA分子は、例えば、カフユイン合成酵素をコードする DNA分子に特異的にハイプリダイズするォリゴ塩基をプライマーとして用いた PCR技術（植物の PCR実験プロトコール（細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ 2 ) 秀潤社（1995)) を利用して、本発明によるカフニイン合成酵素を生産する細胞から分離することができる。

具体的には、 mRNAから合成した cDNAにリンカ一を結合させ、カフエイン合成酵素を構成するアミノ酸配列をコードする DN Aとリンカ一間で PCRを行うこと等により、目的 cDNAの全長配列を単離することができる。

1 この様なハイブリダィゼ一ション技術や PCE技術により得られるカフヱイン合成酵素をコ一ドする DNA分子は、少なくとも単離に使用した部位においては、配列番号： 2に記載の力フユイン合成酵素遺伝子と相同性を有する。ここで相同性とは、それぞれのカフヱイン合成酵素遺伝子がコードするァミノ酸配列の比較において 1 5 %以上の相同性、好ましくは 3 0 %以上の相同性、より好ましくは 4 5 %以上の相同性、更に好ましくは 6 0 %以上の相同性、更により好ましくは 7 5 %以上の相同性、更により一層好ましくは 9 0 %以上の相同性、最も好ましくは 9 5 %以上の相同性を指す。ただし、得られるカフヱイン合成酵素遺伝子によっては、コードするァミノ酸の複数の残基が欠失、付加、置換された結果として、カフイン合成酵素との相同性が 1 5 %以下となってもなお、カフイン合成酵素の機能に必須な領域を保持し、実質的にカフユイン合成酵素と同等の機能を有するタンパク質をコードしていることも想定される。

本発明によるカフニイン合成酵素をコ一ドする塩基配列 (遺伝子）を有する DNA分子又は A分子を単離するために用いる生物は、メチルキサンチン類を生成する生物であればいずれも使用できるが、中でもコーヒーノキなどのァカネ科コ —ヒ一ノキ（Coffea) 属植物、チヤノキなどのツバキ科ツバキ（Came l l ia) 属植物、コラノキなどのァオギリ科コラノキ ( Col a) 属植物などが好ましい。

本発明によるカフイン合成酵素遺伝子を有する RNA分子は、 S p 6 プロモーターや T 7プロモータ一といった BNAポリメラーゼが認識するプロモータ一の下流に、上記方法で得たカフェイン合成酵素 DNAを所望の向きで、機能し得る位置に接続して組換え分子を調製し、これを S p 6 ENAポリメラ

2 ーゼゃ T 7 RNAポリメラ一ゼなどの RNAポリメラーゼで転写させて得ることができる。また、植物ウィルスにカフェイン合成酵素 Aないし RNAを導入するか、後で述べる様に適当な DN A発現カセットにカフエイン合成酵素遺伝子を有する DNAを所望の向きで機能し得る位置に接続して組換え分子を形成し、この組換え分子を微生物や植物等の宿主に導入することにより宿主の転写活性を利用して得ることもできる。

カフイン合成酵素遺伝子を有する DNA分子の全部又は一部と相補性を有する DNA分子、あるいはカフェイン合成酵素遺伝子を有する RNA分子の全部又は一部と相補性を有する RNA 分子であって、カフ Xインを生成する宿主細胞中において発現した際に宿主細胞におけるカフエイン合成酵素の発現を阻害する機能を有するものは、宿主細胞におけるカフイン合成酵素発現の阻害又は抑制用の A分子又は ENA分子として用いることができる。

ここで、カフェイン合成酵素遺伝子の一部とは、その部分に相補性を有する配列を基礎として得られる阻害用の mRNA、すなわちアンチセンス Aが宿主細胞中で形成された際に、これが宿主細胞におけるカフイン合成酵素を発現させるための mENAと結合して、宿主細胞におけるカフヱイン合成酵素の発現が阻害される部分である。この部分としては、この様なアンチセンス m Aの形成に必要となる部分であり、例えば少なくとも 1 4塩基長の長さの部分を挙げることができる。

アンチセンス mRNA形成用の MA分子としては、例えば、配列番号： 2の塩基配列の全部又は一部と相補性を有している MA分子を挙げることができ、アンチセンス分子としては、配列番号： 3の塩基配列の全部又は一部と相補性を有している A分子を挙げることができる。これらの塩基配列とスト

3 リンジユントな条件下でハイプリダイズし得る変異配列の全部又は一部と相補性を有している]) NA分子又は BNA分子もこの様な目的に用いることができる。

なお、これらの阻害用の DNA分子又は RNA分子に対して、高い相同性を有し、目的とする阻害又は抑制機能を発揮できるものも利用できる。ここで高い相同性とはそれぞれの塩基配列の比較において 6 0 %以上の相同性、好ましくは 7 5 %以上の相同性、更に好ましくは 9 0 %以上の相同性、最も好ましくは 9 5 %以上の相同性を指す。

これらの阻害用の MA分子又は RNA分子自体は、必ずしも本発明によるカフエイン合成酵素をコ一ドするものでなくてもよい。

本発明によるカフイン合成酵素阻害用の塩基配列の他の態様としては、力フユイン合成酵素遺伝子と相同性を有する部分を有するが、カフェイン合成酵素をコードしていない塩基配列で、宿主細胞の有するカフェイン合成酵素遺伝子と置換されることで、宿主のカフヱイン合成酵素活性を消失させ得るものを挙げることができる。

これらカフユイン合成酵素遺伝子又は力フェイン合成酵素の発現を阻害又は抑制する機能を有する DNA分子の宿主細胞内での発現について、宿主細胞として植物細胞を利用した例について以下に説明する。

植物細胞での発現は、（ i ) 宿主細胞内での DNAから mKNA への転写を可能とするプロモーター、（ii) プロモーターの下流にセンス方向又はアンチセンス方向に連結したカフエイン合成酵素遺伝子を含む DNA断片、又はカフェイン合成酵素の発現を阻害する機能を有する DNA断片、（iii) 必要に応じてこれら MA断片の下流に連結された転写産物の安定化に必

4 要なポリアデニレーション部位を含むタ一ミネ一ター配列、などを含む発現カセットを宿主である植物細胞に導入して、これを形質転換する方法が利用できる。

この様な発現カセット、及びこれを含むベクターも本発明の対象である。

発現カセットは、揷入されている DNAを恒常的又は誘導的に発現させるためのプロモーターを含有し得る。また、この発現カセットは、必要に応じて、植物細胞内での複製のための複製オリジンを有することができる。

恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモータ一、イネのァクチンプロモーターなどが挙げられる。また、誘導的に発現させるためのプロモータ一としては、例えば糸状菌、細菌、ウィルスの感染や侵入、低温、高温、乾燥、嫌気的条件、特定の化合物の散布等の外因によつて発現することが知られているプロモーター等が挙げられる。この様なプロモータ一としては、例えば、糸状菌、細菌、ウィルスの感染や侵入によつて発現するィネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターゃタノコの P Rタンパク質遺伝子のプ口モータ一、低温によって誘導されるイネの「 l i p l 9」遺伝子のプロモータ一、高温によって誘導されるシロイヌナズナの「H S P 1 8 . 2」遺伝子のプロモータ一、乾燥によって誘導されるイネの「 r a b」遺伝子のプロモータ—、嫌気的条件で誘導されるトゥモロコシのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のプロモータ一等が挙げられる。またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターとタノコの P Rタンパク質遺伝子のプ口モータ一はサリチル酸等の特定の化合物によって、イネの「 r a b」遺伝子プロモーターは植物ホルモンのァプシジン酸の散布によって

5 も誘導される。

或いはまた、発現カセットに揷入されている DNAを発現させるためのプロモーターとしては、カフヱイン合成酵素遺伝子のプロモータ一を単離して利用する方法も挙げられる。

具体的なプロモータ一の単離方法の一例には、カフヱイン合成酵素遺伝子の少なくとも一部をプロ一プとしたハイブリダイゼ一ション技術の利用により、ゲノム] NA断片を選択し、該遺伝子の上流部 DNAを特定する方法を挙げることができる。

発現カセット中の組み換え DNA分子の植物への導入に備えるために、大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の細胞を選抜するためのマー力一遺伝子を含むクローニングべクタ一が数多く利用できる。この様なベクタ一の例には、 P B R 3 2 2、 p U C系、 M 13 m p系等がある。適当な制限酵素切断部位で、目的の配列をべクタ一に導入することができる。得られたプラスミド DNAの特徴を明らかにするため、制限酵素切断部位分析、ゲル電気泳動、及びその他の生化学的一分子生物学的方法が一般に用いられる。各々の操作を終えた後、プラスミド DNAを切断して、別の MAに結合させることができる。各プラスミド DNAの配列を、同じプラスミド又は別のプラスミド中にクローニングすることができる。

植物細胞の中に発現カセットを導入するためには、さまざまな手法を用いることができる。これらの手法には、形質転換因子としてァグロバクテリウム · ッメファシエンス（Agro bacterium tumefaciens ) 又は、ァグ、クテリウム · リゾゲネス ( Agrobacterium rhizogenes) 用ヽた T一 DNA }こよる植物細胞の形質転換、プロトプラストへの直接導入（インジェクシヨン法、エレクトロポレーシヨン法等）、テイクルガン法等やその他の可能性が含まれる。

6 4601 プロトプラス卜への直接導入では、特別に必要とされるベクタ一はない。例えば、 p U C誘導体の様な単純なプラスミドを用いることができる。目的の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、他の DNA配列が必要になることもある。例えば T i 又は R i プラスミドを植物細胞の形質転換に用いる場合には、 T i及び R i プラスミドの T- DNA領域の少なくとも右端の配列、大抵は両端の配列を、導入されるべき遺伝子の隣接領域となる様に接続するのが好ましい。

ァグロパクテリゥム属菌を形質転換に用いる場合には、導入すべき発現カセットを、特別のプラスミド、すなわち中間ベクター又はバイナリーベクター中にクローニングする必要がある。中間べクタ一はァグロバクテリウム属菌の中では複製されない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドあるいはエレクト口ポレーシヨンによってァグロノクテリウム属菌の中に移行される。中間べクタ一は、 T - DNAの配列と相同な領域をもっため、相同組換えによって、ァグロバクテリウム属菌の T i又は R i プラスミド中に取り込まれる。宿主として使われるァグロバクテリウム属菌には、 V i r領域が含まれている必要がある。通常 T i 又は R i プラスミドに V i r領域が含まれており、その働きにより、 T- MAを植物細胞に移行させることができる。

一方、バイナリーベクターはァグロバクテリゥム属菌の中で複製、維持され得るので、ヘルパープラスミドあるいはェレクトロポレーション法によってァグロバクテリウム属菌中に取り込まれると、宿主の V i r領域の働きによって、バイナリ一ベクタ一上の T-DNAを植物細胞に移行させることがでさる。

この様にして得られた発現カセットを含む中間ベクター又はバイナリーベクタ一、及びこれを含む大腸菌ゃァグロバクテリゥム属菌等の微生物も本発明の対象である。

形質転換された植物細胞は、再生過程を経ることにより植物組織又は植物体に変換することができる。再生の方法は植物細胞の種類により異なるが、例えばコーヒーノキでは Hata nakaら（Plant Cell Rep. , 19， 106- ( 1999) ) の方法、ィネでは Fujimuraら (Plant Tissue Culture Lett. , 2, 74— (1995) ) の方法、トウモロコシでは、 Shillitoら（Bio/Te chnology, 7, 581- (1989) ) の方法、シロイヌナズナでは Akama らの方法（Plant Cell Rep.， 12, 7- (1992) ) など力ある。

本発明において、「植物体」とは植物に分類される生物個体の全体もしくは一部の器官（例えば、葉、茎、根、花、果実、種子等）を指す。

これらの方法により作出された植物体又はその繁殖媒体 (例えば種子、塊茎、切穂など）から得た植物体は、メチルキサンチン類を生成する野生型の植物体と比較して本発明の力フイン合成酵素の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサンチン類の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサンチン類の生成比の変化が起こる。この様にして得られた形質転換植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織又は細胞も含まれる。

また、近年植物のポストトランスレ一ショナルなジーンサィレンシングの研究から、ウィルス等の外来核酸に対して植物が本来備えている防御機能を利用して、目的遺伝子の発現を抑制することが可能なことがわかってきた（Cell, 95， 177 - 187(1998) 、化学と生物、 37、 532 -（1999)、蛋白質核酸酵素、

8 44、 1396 -（1999) ) 。これによれば、 DNAウィルスや RNAウイルス等が植物に進入した場合、植物はこれらの铸型からアベラント RNAを転写し、植物が本来持っている配列の転写産物と配列特異的に二本鎖 RNAを形成する。この二本鎖 RNAは R N a s e により分解されることにより、目的の遺伝子の発現を抑制することが可能となる（Ce l l , 96， 303- C1999) ) 。本方法の重要な特徴のひとつは、発現を抑制したい配列を目的植物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。また本方法のさらなる特徴は、植物の一部（下位葉等）に目的の核酸を感染等により導入すれば、その効果が植物体全体に広がることである。具体的な発現抑制方法は、目的遺伝子の配列又はそれと高い相同性を持つ配列の全部又は一部を含む二本鎖 RNAや、二本鎖 DNAを持つァグロバクテリウムを植物の下位葉に感染させる。ここで高い相同性とはそれぞれの塩基配列の比較において 6 0 %以上の相同性、好ましくは 7 5 %以上の相同性、更に好ましくは 9 0 %以上の相同性、最も好ましくは 9 5 %以上の相同性を指す。

この方法を施された植物体は、メチルキサンチン類を生成する野生型の植物体と比較して本発明のカフイン合成酵素タンパク質の発現量が変化し、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサンチン類の生成量の変化や、ホスト植物の代謝の改変によるメチルキサンチン類の生成比の変化が起こる。この様にして得られた植物は本発明の対象である。本発明でいう植物には、葉、花、果実、種子などの植物の特定の組織又は細胞も含まれる。

上記のメチルキサンチン類を生成する植物としては、コ一ヒ一ノキなどのァカネ科コーヒーノキ（Coffea) 属植物、チヤノキなどのツバキ科ッパキ（Came l lia) 属植物、コラノキ

9 などのァオギリ科コラノキ（Cola) 属植物などを例示することができる。図面の簡単な説明

図 1 はコーヒーノキ及びチヤノキにおける主要なカフエイン生合成経路を示すフローシ一トである。右側に各化合物の名称を併記し、左側に各反応を触媒する酵素の名称を併記する。 SAMは S —アデノシル一 L —メチォニン、 SAHは S —アデノシル一 L —ホモシスティンを意味する。

図 2 は pGEX- N1ベクタ一（図 2 A) 及び pGEX-TCSlベクタ一 (図 2 B) を模式的に示す図である。前者は tacプロモーター (Ptac) によって制御されるダルタチオン S — トランスフエラーゼ遺伝子（GST) の下流に Nl cDNA (配列番号： 2 ) を連結して構築したベクターであり、後者は同ダルタチオン S— トランスフヱラーゼ遺伝子（GST) の下流に TCS1 cDNA ( DDBJ /GenBank/EMBL accession number AB031280 ; 特開 200ト 3749 0号公報に記載の配列）を連結して構築したベクタ一である。アンピシリン耐性遺伝子（Amp 、ラックリプレサ一遺伝子 ( lacl ^q) 、 pBR322複製起点（pBR322ori) 、制限酵素認識部位（Smal、 NotI、 EcoRI及び Xhol) を図中に示す。

図 3 は薄層クロマトグラフィー（TLC) による酵素反応生成物の検出を示もので、展開後、 TLCプレートをパネル（A) とパネル（B) に 2分した。パネル（A) は、展開後、オートラジオグラフィ一によつてメチル基（メチルー ^{1 4} C ) が付加された酵素反応生成物のスポットを検出した状態を示す。パネル（A) の左側には各生成物の位置を示す。パネル（B) は、展開後、紫外光によって標品のスポットを検出した状態を示す。パネル（A) とパネル（B) の間にスポットの原点と移動率（B値）を示す。 GSTはグルタチォン S — トランスフェラ一ゼ、 N1は GSTと N1の融合タンパク質（GST- Nl) 、 TCS1は GSTと TCS1の融合タンパク質（GST-TCS1) 、 SAMは S —アデノシル - L - (メチルー ^{1 4} C ) メチォニン、 Tbはテオプロミン、 Cf はカフェイン、星印は非特異的生成物をそれぞれ意味する。発明を実施するための最良の形態

本発明を下記の実施例により具体的に説明する。ただし、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。

(1)コーヒーノキ由来 mRNAからの二重鎖 cMAの合成

5gのコーヒーノキ（Coffea arabica) 未熟果実から CTAB法 ( Chang et a l .， P lant Mo l. Biol. Rep.， 11, 113- ( 1993) 参照）を用いて total RNAを抽出した。 100 /z g の tota l RNA から PolyATtract mRNA Isolation System II I (Promega ) を用いて mRNAを精製した。 5〃 gの mRNAと ZAP- cDNA Synthesi s Kit ( Stratagene) を'用いて二重鎖 cMAを合成した。

(2) CaMXMT cDNA及び CaMTL3 cDNAと相同性を有する新規 cDNA の単離

CaMXMT cDNA ( DDBJ/GenBank/EMBL accession number AB04 8794 ) 及び CaMTL3 cDNA ( DDBJ/GenBank/EMBL accession nu mber AB048793 ) の保存配列を基に設計した CaCS- N2プライマ一（5— ATGGAGCTCCAAGAAGTCCT— 3) と CaCS-Clプライマー ( 5-CTTTTACACGTCTGACTTCTCTG-3 ) を合成した。上記 cDNAヽ上記プライマー及び Pyrobest DNA Po lymerase (宝酒造）を用いて PCRを行い、 cDNA断片を増幅した。この cDNA断片を pBl uescript II KS - ( Stratagene) の EcoRVサイ卜へ挿入しヽプラスミドクローンを作成した。無作為に選択したクローンについて塩基配列決定を行い、 CaMXMT cDNA及び CaMTL3 cMAと

2 相同性を有する新規な cDNA (配列番号： 2 ) が揷入されたクローンを選抜した。新規な cDNAには便宜的に N1と命名した。

(3) GST- N1融合タンパク質発現べクタ—の構築

Nl cDNA断片を、制限酵素 Smal 及び制限酵素 Not l を用いて pBl uescript II KS-から切り出し、ダル夕チオン S-トランスフェラ一ゼ（GST) 発現ベクターである pGEX- 4T- 2 ( Ame rsham Biosciences) © Smal/Notl サイ卜へ挿入した o 以上の操作によつて、 GSTタンパク質と Nl cDNAがコ一ドするタンパク質との融合タンパク質（GST - N1)を大腸菌において発現させるための pGEX- N1ベクター（図 2 A参照）を構築した。

(4) GST- TCS1融合タンパク質発現べクタ一の構築

カフヱイン合成酵素をコードするチヤノキ由来 TCS1 cDNA ( DDBJ/GenBank/EMBL accession number AB031280 ; 特開 200 1 - 37490号公報に記載の配列）のコード配列を Pyrobest MA Polymeraseを用いて PCRによって増幅した。铸型には TCS1 cD NAが挿入されたプラスミドクローンを用いた。プライマーは制限酵素の認識配列を付加した TCSl-EcoRIブライマ— （5-GA ATTCATGAACAGGGGGGAAG-3) 及び TCS1- Xholプライマ— （5- CT CGAGTGGCATATATGTGATAGGGAC-3 ) を用いた。増幅した TCS1 c DNA断片を pBluescript II KS-の EcoRVサイトへ揷入し、塩基配列決定を行うことによって塩基置換や欠失が無いことを確認した。 TCS1 cDNA断片を、制限酵素 EcoRI及び制限酵素 Xh olを用いて pB l uescript I I KS-から切り出し、 pGEX - 4T- 1 ( Amersham Biosciences; の EcoRI/XhoIサイ卜へ揷入した ₀ 以上の操作によって、 GST タンパク質と TCS1タンパク質の融合タンパク質（GST-TCS1)を大腸菌において発現させるための pGEX- TCS1ベクター（図 2 B参照）を構築した。

(5)組換えタンパク質の生産各べク夕一pGEX - Nl、 pGEX- TCS1及び pGEX- 4T- 2によって大腸菌 BL21株を形質転換した。いずれの形質転換株も 3mlの 2χΥ Τ液体培地（100 mg/1のアンピシリンを含む）において、培養の吸光度（A600)が約 0.8になるまで 37°Cで振盪培養を行つた。この培養に終濃度が 1 mM になるようにイソプロピル - ^ チォガラクトシドを添加し、更に 20°Cで 6時間の振盪培養を行った。以上の操作によって、大腸菌において組換えタンパク質（GST - Nl、 GST - TCS1、 GST) の生産を行った。

(6)組換え夕ンパク質試料の調製

組換えタンパク質を生産した大腸菌を遠心分離によつて回収し、 300 ^ 1の破砕液（50mM Tris-HCl [ H 8.0]、 ImM EDTA、 5mM ジチオスレィトール）に懸濁した。以降の操作は氷上あるいは 4°Cで行った。懸濁液を超音波破砕し、終濃度が 1 になるように Triton X- 100 を加えて 30分間ィンキュベーシヨンした。破砕液を遠心分離によって上清と沈殿に分離し、この上清を組換えタンパク質試料とした。

(7)薄層クロマトグラフィー（TLC) による酵素反応生成物の検出

lOOmM Tris-HCl [pH 8.0]、 200 M MgCl₂ 、 200 M テオプ口ミン（メチル基受容体）、 16.8 « M S-アデノシル- L - [メチノレ]メチォニン [SAM] [2.2GBq/mmQl； Amersham Biosciences] (メチル基供与体）、及び 5 1の組換えタンパク質試料（GS T-N1を含む）からなる混合液 25 1を 27°Cで終夜ィンキュベーションした。得られた酵素反応液をフィルターカップ（ϋ LTRAFREE-MC 10, 000 NMWL; illipore) によって濾過した。

2 1の酵素反応液を 2^ 1のメタノールと混合して、得られた混合液を TLCプレート（Silicagel 60 F254; erck) に点着した。 GST- Nlを含む組換えタンパク質試料の代わりに、 GST- TCS1 を含む組換えタンパク質試料、 GSTを含む組換えタンパク質試料を用いた点を除いて、それぞれ上記と同様の操作を行つた。

酵素反応液の代わりに標品としてカフェイン（ImM水溶液）を用いた点を除いて、上記と同様に標品 2 1とメタノール 2 β 1の混合液を TLCプレートに点着した。 TLCプレートに SAMを含むメタノ一ル溶液も点着した。

その後、展開溶媒として水/酢酸 /n-プタノ一ル（2 : l : 4，v/v /v)を用いて 1. 5時間展開を行った。酵素反応液を展開した部分に増感剤（En³ Hance ; Dupont NEN) を噴霧し、 X線フィルム ( BioMax MS ; Kodak) を用いてオートラジオグラフィ一（マィナス 80 °Cで 3日間の露光）を行い、 ^{1 4} Cレーベル化されたメチル基が付加された酵素反応生成物のスポットを検出した。標品を展開した部分に紫外光を照射して標品のスポットを検出した。 TLCによる解析の結果を図 3 に示す。

図 3から分かるように、カフエイン合成活性を有する対照タンパク質試料として用いた融合タンパク質 GST- TCS1は、テォプロミンをメチル基受容体としてカフヱインを生成する活性を示した。これと同様に、融合タンパク質 GST- N1もテオブ口ミンをメチル基受容体としてカフヱインを生成する活性を示した。すなわち、 GST-N1は、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する。これに対し、タンパク質 GSTはその様な活性を示さなかった。以上の結果から、コーヒーノキ由来 Nl cDNAはカフェイン合成酵素（3，7-ジメチルキサンチンメチル化酵素）をコードしていることが明らかになった。産業上の利用可能性

本発明によれば、下記の様な効果が発揮される。

(1) 工業用、食品用、医療用として利用でき.る力フイン合成酵素を効率よく生産し、これを用いて酵素反応によって力フェインを製造することが可能になる。

(2) メチルキサンチン類を生合成する植物、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代謝を改変して、カフエインを効率よく生産することが可能になる。

(3) メチルキサンチン類を生合成する植物、植物組織、植物細胞のメチルキサンチン類生合成代謝を改変して、カフエインの生産を抑制又は停止させること、及びメチルキサンチン類の生成比を変化させることが可能になる。引用文献

U_) Ashihara, H. and Crozier, A. (2001) Caffeine： a wel 1 known but little mentioned compound in plant science. Trends Plant Sci. 6, 407-413

(2) Ogawa, M.， Herai, Y.， Koizumi, N.， usano, T. and Sano, H. (2001) 7-Methy lxanthine methyl transferase of coffee plants. Gene isolation and enzymatic properties. J. Biol. Chem. 276, 8213-8218

Claims

請求の範囲

1 · 下記の塩基配列（a) (b)のいずれかを有する DN

A分子。

(b)上記塩基配列（a)に、該塩基配列（a)がコ― ドするポリべプチドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、欠失又は挿入を行つて得られた変異塩基配列。

2 . 上記塩基配列（a)及び上記変異塩基配列（b)がストリンジユントな条件下でハイブリダィズし得るものである請求項 1 に記載の DNA分子。

3 . 上記塩基配列（a)が、配列表の配列番号： 2 の塩基配列からなる請求項 1又は 2に記載の DM分子。

4 . 下記の塩基配列（a) (b)のいずれかを有する RN

A分子。

(a)配列表の配列番号： 1 に示すアミノ酸配列を有し、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有するポリべプチドであるカフエイン合成酵素をコードする塩基配列、

(b)上記塩基配列（a)に、該塩基配列（a)がコ一ドするポリべプチドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、塩基の置換、欠失又は挿入を行つて得られた変異塩基配列。

5 . 上記塩基配列（a)及び上記変異塩基配列（b)がストリンジェントな条件下でハイプリダイズし得るものである請求項 4に記載の A分子。

6 . 上記塩基配列（a)が、配列表の配列番号： 3 の塩基配列からなる請求項 4又は 5に記載の RNA分子。

7 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の DNA分子の有する塩基配列の少なくとも一部に相捕的な塩基配列であつて、上記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る DNA分子。

8 . 請求項 4〜 6のいずれかに記載の RNA分子の有する塩基配列の少なくとも一部に相補的な塩基配列であつて、上記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る RNA分子。

9 . 請求項 1 〜 8のいずれかに記載の DNA分子又は BNA分子を含むべク夕一。

1 0 . 微生物及び植物の少なくとも一方の細胞内で、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有するカフイン合成酵素を発現させることができるか、もしくは該カフェイン合成酵素の発現を阻害する機能を有する請求項 9 に記載のベクタ一。

1 1 . 請求項 9又は 1 0 に記載のべクタ—で形質転換された微生物、植物体、植物組織又は植物細胞。

1 2 . 請求項 9又は 1 0 に記載のベクターが、感染により導入された微生物、植物体、植物組織又は植物細胞。

1 3 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、植物体、植物組織又は植物細胞を用いて、カフェイン合成酵素を製造する方法。

1 4 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、植物組織又は植物細胞を培養するか、植物体を栽培して、カフイン合成酵素を製造する方法。

1 5 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、植物体、植物組織又は植物細胞を用いて力フインを製造する方法。

1 6. 請求項 1 1又は 1 2 に記載の微生物、植物組織又は植物細胞を培養するか、植物体を栽培して、カフインを製造する方法。

1 7. 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、植物体、植物組織又は植物細胞を用いてメチルキサンチン類の組成を改変する方法。

1 8. 請求項 1 1又は 1 2 に記載の微生物、植物組織又は植物細胞を培養するか、植物体を栽培して、メチルキサンチン類の組成を改変する方法。

1 9. メチルキサンチン類が、 7 —メチルキサントシン、 7 —メチルキサンチン、ハ。ラキサンチン、テオプロミン及びカフェインからなる群から選ばれる少なくとも 1つの化合物である請求項 1 7又は 1 8 に記載の方法。

2 0. 上記形質変換体が、コーヒーノキ（Coffea) 属植物、ツバキ（Camellia) 属植物、コラノキ（Cola) 属植物、モチノキ（Ilex) 属植物、ネエア（Neea) 属植物、ァォギリ（Firmiana) 属植物、ポーリニア（Paullinia ) 属植物又はカカオノキ（Theobroma ) 属植物である請求項 1 7又は 1 8に記載の方法。

2 1. 下記のアミノ酸配列（a) (b)のいずれかを有するタンパク質からなり、かつ、プリン環の 1位でのテオプロミンのメチル化を触媒する酵素活性を有するカフェイン合成酵素。

(a)配列表の配列番号： 1 に示すアミノ酸配列、

(b)配列表の配列番号： 1に示すアミノ酸配列に、上記酵素活性を損なわない範囲内でのアミノ酸の置換、揷入又は欠失を行って得られた変異アミノ酸配列。

2 2 . 上記アミノ酸配列（a)をコードする塩基配列及び上記変異ァミノ酸配列（b)をコ— ドする塩基配列がストリンジェン卜な条件下でハイプリダィズし得るものである請求項 2 1 に記載のカフユイン合成酵素。

2 3 . 請求項 2 1又は 2 2 に記載のカフヱイン合成酵素と、テオプロミンと、 S —アデノシルメチォニンとを含む混合液をインキュベーションして、カフェインを生成させる、カフヱインの製造法。