WO2003087376A1 - Cafeine synthase et utilisation correspondante - Google Patents
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- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
Definitions
- the present invention relates to a method for producing caffeine (1,3,7-trime) from xanthosine via xanthosine through 7-methylxanthin, 7-methylxanthine and theopromin (3,7-dimethylxanthine) in coffee tree.
- Caffeine synthase (3,7-dimethylxanthine methylating enzyme) and its variants, which have the activity of producing caffeine from theopromin in a series of reactions in which tilxanthin) is biosynthesized.
- the present invention relates to a DNA molecule or RNA molecule having a base sequence encoding any of the above, a vector using these molecules, a transformed organism using the vector, and uses thereof. Background art
- Coffee tree (Cof fea), Chestnut tree (Camel lia sinensis) ⁇ Kola (Cola acuminata ri, mate (Ilex paraguariensis ⁇ , 3, 7) — Trimethyl til xanthin (caffeine), cacao (The obroma cacao) ), Kora is a plant that biosynthesizes 3,7-dimethylxanthine (theop mouth min) The leaves and fruits of these plant species are processed into beverages and foods as luxury items and consumed by people. In addition, caffeine extracted from these plant species has various pharmacological effects such as central nervous system excitability and is used as a pharmaceutical.
- the CaMXMT cDNA (7) which encodes 7-methylxanthine methyltransferase (teupromin synthase) from coffee tree, has already been isolated.
- Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-37490 discloses a N-catalyst that catalyzes a two-step methylation reaction of 7-methylxanthine-theopromine-caphain, which is the final reaction of caffeine biosynthesis.
- the publication discloses that the DNA according to the invention is introduced into plants in the form of antisense, and the metabolism of host cells is modified to modify methylxanthine (7-methylxanthine, paraxanthine, theopromin and cuffyin). It is stated that the production ratio of Camellia can be modified.
- the present invention relates to a series of reactions in which coffee is biosynthesized from xanthosine through 7-methylxanthosine, 7-methylxanthine and theopromin in coffee tree, and from theopromin to caffeine in a series of reactions.
- Synthases having the activity of producing methylxanthine in microorganisms and plants (7-methylxanthosine, 7-methylxanthine, theopromin, melaxanthin, and caffeine in microorganisms and plants) It is an object of the present invention to provide a DNA or RNA molecule encoding a caffeine synthase useful for controlling the production of “methylxanthines”, and a vector using the same.
- the following objects can be achieved by incorporating all or a part of the DNA molecule according to the present invention into a microorganism or a plant in the form of sense or antisense.
- the present inventors amplified the MA fragment shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing by the PCE method, and then incorporated this DM molecule into an expression vector.
- the expressed polypeptide was recovered and its enzymatic properties were examined. It was recognized that it catalyzes the reaction reaction of the power phase due to the formation. That is, it was confirmed that the MA molecule codes for caffeine synthase, which is one of the enzymes constituting the force phane synthesis system.
- Any known method can be applied to the method of incorporating the DNA into the expression vector.
- a method is used in which an appropriate restriction enzyme is selected, the DNA is treated and cleaved with the selected restriction enzyme, then mixed with an expression vector similarly treated, and religated with ligase.
- the thus obtained conjugate of the DNA and the expression vector is introduced into the cells of a microorganism, preferably Escherichia coli, by a transformation method, and grown until it is stabilized as a genetic trait.
- a transformed strain having both the desired genetic trait and the vector DNA trait is obtained.
- the cultivation of the transformed strain and the acquisition of the recombinant protein from the transformed strain may be carried out according to a conventional method.
- Any plant that biosynthesizes methylxanthine using S-adenosylmethionine (SAM) as a methyl group donor may be used in the present invention. It is presumed that they contain caffeine synthase or polypeptides having the same enzymatic activity as described above, and also DNAs encoding them. In addition, it is possible to obtain the cafuin synthase according to the present invention or an enzyme substantially the same as that, and an MA molecule or an RNA molecule encoding them.
- SAM S-adenosylmethionine
- the DNA molecule according to the present invention is a DNA molecule having any one of the following base sequences (a) and (b).
- Caffeine which is a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and having an enzymatic activity to catalyze the methylation of theopromin at position 1 of the purine ring Nucleotide sequence coding for the enzyme synthase,
- mutant base sequence (b) those capable of hybridizing with the above base sequence (a) under stringent conditions are preferable.
- a specific example of the DNA molecule according to the present invention comprises the base sequence of SEQ ID NO: 2.
- the RNA molecule according to the present invention is an ENA molecule having any one of the following base sequences (a) and (b).
- the base sequence (a) is coded by the A mutated base sequence obtained by performing substitution, deletion or insertion of bases within a range in which the peptide can maintain the above enzyme activity.
- mutant base sequence (b) those capable of hybridizing with the above base sequence (a) under stringent conditions are preferable.
- a specific example of the RNA molecule according to the present invention consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3.
- DNA molecule according to the present invention is a nucleotide sequence complementary to all or a part of the nucleotide sequence of the DM molecule, which is expressed by being introduced into a plant cell having the enzymatic activity. In some cases, the enzyme activity of the plant cell may be inhibited.
- RNA molecule according to the present invention is a nucleotide sequence complementary to all or a part of the nucleotide sequence of the above RNA molecule, which was expressed by being introduced into a plant cell having the enzymatic activity. In some cases, the enzyme activity of the plant cell may be inhibited.
- One embodiment of the vector according to the present invention comprises any of the above DNA molecules and ENA molecules.
- this vector can express, for example, cafuin synthase having an enzymatic activity to catalyze the methylation of theopromin at position 1 of the purine ring in microorganisms and Z or plant cells, Alternatively, it can be provided as having a function of inhibiting the expression of the caffeine synthase.
- a microorganism, a plant cell, a plant tissue or a plant can be transformed, and the obtained transformant is also included in the present invention.
- caffeine synthase can be produced using the above-mentioned microorganism, plant, plant tissue or plant cell.
- caffeine can be efficiently produced using the above-mentioned plant, plant tissue or plant cell.
- cuffs can be obtained by using the above-mentioned plant, plant tissue or plant cell. It is possible to suppress or stop the production of aine and to modify the production ratio of methylxanthine.
- methylxanthines refer to at least one compound selected from the group consisting of 7-methylxanthosine, 7-methylxanthine, paraxanthine, theopromin, and caffeine.
- Sources of plants, plant tissues or plant cells used for efficient production of force fin include plants of the genus Coffea, plants of the genus Camellia and plants of the genus Cola. And genus plants of the genus Ilex, plants of the genus Neea, plants of the genus Firmiana, plants of the genus Paulinia and plants of the genus Thekaroma.
- a plant tissue or a plant cell used for suppressing or stopping the production of caffeine and for modifying the production ratio of methylxanthines is used efficiently.
- the same groups that can be used to produce the plant can be mentioned, but coffee genus plants are most suitable.
- the caffeine synthase according to the present invention comprises a protein having any one of the following amino acid sequences (a) and (b), and further comprises methylation of theopromin at position 1 of the purine ring. It has an enzyme activity to catalyze
- mutant amino acid sequence (b) a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence (a) and a nucleotide sequence encoding the mutant amino acid sequence (b) are used. Those that can hybridize under stringent conditions are preferred.
- the present invention provides the above-mentioned force fin synthase, theopromin,
- a caffeine synthase useful for producing a caffeine synthase used for caffeine production, modifying the composition of methylxanthines produced in plants, and the like is provided.
- DNA and RNA molecules are provided.
- the force phase synthase of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; It has a modified amino acid sequence obtained by amino acid substitution, insertion or deletion as long as the enzyme activity is not impaired.
- a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 having the above-mentioned fuine synthase activity and a mutant sequence thereof is collectively referred to as caffeine synthase.
- the polypeptide having the above-mentioned mutant amino acid sequence itself has substantially the same function as a coffee husk synthase derived from coffee tree, and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It has high homology at sites related to the acid sequence and enzyme activity.
- the mutated amino acid sequence has at least 15% homology, preferably 30%, to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
- More than 45% homology more preferably more than 60% homology, even more preferably more than 75% homology, even more preferably more than 9
- the mutant nucleotide sequence encoding the mutated amino acid sequence is: SEQ ID NO: 35% or more homology, preferably 60% or more homology, more preferably 75% or more to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of 1
- a base sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be mentioned. Specific examples thereof include the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 and the RNA sequence of SEQ ID NO: 3. Base sequences having the homology defined above with respect to these caffeine synthase genes are also included in the gene encoding the caffeine synthase in the present invention.
- mutant amino acid sequence maintaining the desired cafuin synthase activity a mutant base sequence encoding this mutant amino acid sequence and the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 are encoded.
- Base sequences that can hybridize under stringent conditions. Can be suitably used in practice.
- RNA molecules that can be hybridized can be mentioned.
- Hybridization under stringent conditions can be performed, for example, by the method described in Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Current Protocols in Molecular Biology; Wiley Interscience; As the system, a Gene Image system (Amersham) can be mentioned. Specifically, high-pridization can be performed by the following operations.
- the membrane onto which the DM or RNA molecule to be tested has been transferred is hybridized according to the product protocol in a labeled probe and hybridization protocol or buffer specified in the protocol.
- the composition of the nodiprydinase buffer is 0.1% by weight of SDS, 5% by weight of dextran sulfate, 1Z20 volumes of the blocking reagent attached to the kit, and 2 to 7SSC.
- As a blocking reagent for example, 100 x 100% Denhardt's solution ⁇ 2% (weight Z volume) Bovine serum albumin 2% added amount / volume FicllTM400, 2% (weight Z volume) polyvinylpyrrolidone
- the medium prepared at the culture concentration can be diluted to 1Z20 before use.
- 20X SSC is a 3M sodium chloride, 0.3M citrate solution, and SSC is more preferably at a concentration of 3-6XSSC, even more preferably at a concentration of 4-5XSSC.
- the temperature of the hybridisation is between 40 and 80, more preferably between 50 and 70 ° C, even more preferably between 55 and 65 ° C, and can range from several hours to overnight. After the incubation, wash with the washing buffer.
- the temperature of the washing is preferably room temperature, more preferably the temperature at the time of hybridization.
- the composition of the washing buffer is 6 XSSC + 0.1% by weight SDS solution, more preferably 4 XSSC + 0.1% by weight SDS solution, and even more preferably 2 XSSC + 0.1% by weight.
- SDS solution more preferably 1 XSSC + 0.1 wt% SDS solution, most preferably 0.1 XSSC + 0.1 wt% SDS solution.
- the membrane can be washed with such a washing buffer, and the DNA or ENA molecule hybridized by the probe can be identified using the label used for the probe.
- the mutation may be caused in the natural world or artificially caused by site mutation in the base sequence.
- the MA molecule having a force phase synthase gene of the present invention can be obtained, for example, by a PCR technique (a plant plant) using, as a primer, an oligo base that specifically hybridizes to a DNA molecule encoding cafuin synthase. Using a PCR experiment protocol (Cell Engineering Supplement, Plant Cell Engineering Series 2) Shujunsha (1995)), it can be isolated from cells that produce the cafninin synthase according to the present invention.
- the target cDNA is synthesized. Can be isolated.
- a DNA molecule encoding caffeine synthase obtained by such a hybridization technique or a PCE technique has at least a site represented by SEQ ID NO: 2 at the site used for isolation. It has homology to fuin synthase gene.
- the homology refers to a homology of 15% or more, preferably 30% or more, more preferably a homology of amino acid sequences encoded by the respective caffeine synthase genes. Is more than 45% homology, even more preferably more than 60% homology, even more preferably more than 75% homology, even more preferably more than 90% phase Homosexuality, most preferably greater than 95% homology.
- the homology with caffeine synthase is 15% or less as a result of deletion, addition, or substitution of multiple residues of the amino acid to be coded.
- the protein retains a region essential for the function of caffeine synthase and encodes a protein having substantially the same function as caffeine synthase.
- Any organism that can be used to isolate a DNA molecule or an A molecule having a nucleotide sequence (gene) encoding a cafniin synthase according to the present invention can be used as long as it produces methylxanthine.
- plants belonging to the genus Araceae such as coffee trees, plants belonging to the genus Coffea, plants belonging to the genus Camellia, such as the camellia (Came ll ia), and plants belonging to the genus Alanthaceae, such as the Japanese lantern (Cola). I like it.
- the RNA molecule having a caffeine synthase gene according to the present invention is located downstream of a promoter recognized by a BNA polymerase such as an Sp6 promoter or a T7 promoter, and a caffeine synthase DNA obtained by the above method.
- the recombinant molecule is prepared by connecting the desired orientation and functioning position to prepare a recombinant molecule, which is
- RNA polymerase such as T7 RNA polymerase.
- the recombinant molecule can be obtained by utilizing the transcription activity of the host.
- Those that have the function of inhibiting the expression of caffeine synthase in the host cell when expressed in the host cell that produces cuff Xin are those that inhibit or suppress the expression of caffeine synthase in the host cell.
- a part of the caffeine synthase gene is defined as an inhibitory mRNA obtained based on a sequence complementary to the part, that is, when antisense A is formed in a host cell.
- this is a part that binds to mENA for expressing caffeine synthase in the host cell and inhibits the expression of caffeine synthase in the host cell.
- This portion is a portion necessary for forming such antisense mA, and includes, for example, a portion having a length of at least 14 bases.
- Examples of the MA molecule for forming antisense mRNA include MA molecules having complementarity with all or a part of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
- Examples of the antisense molecule include: A molecule having complementarity to all or a part of the base sequence of SEQ ID NO: 3 can be mentioned.
- NA molecules or BNA molecules can also be used for such a purpose.
- high homology refers to a homology of 60% or more, preferably 75% or more, more preferably 90% or more in the comparison of the base sequences. Preferably, it indicates a homology of 95% or more.
- inhibitory MA molecules or RNA molecules themselves need not necessarily encode the caffeine synthase according to the present invention.
- a salt having a portion having homology to the raffle synthase gene but not encoding caffeine synthase is used.
- Those that can replace the caffeine synthase activity of the host by replacing the caffeine synthase gene of the host cell with the base sequence can be mentioned.
- Expression in plant cells includes (i) a promoter that enables transcription of DNA to mKNA in the host cell, and (ii) a caffeine synthase gene linked downstream of the promoter in sense or antisense direction. DNA fragments or DNA fragments that have the function of inhibiting the expression of caffeine synthase; (iii) if necessary, for stabilizing the transcript linked downstream of these MA fragments.
- a method can be used in which an expression cassette containing a promoter sequence containing important polydenidation sites and the like is introduced into a plant cell as a host, and then transformed.
- Such expression cassettes and vectors containing the same are also an object of the present invention.
- the expression cassette may contain a promoter for constitutively or inducibly expressing the inserted DNA.
- the expression cassette can have a replication origin for replication in a plant cell, if necessary.
- promoters for constitutive expression include the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus and the actin promoter of rice.
- promoters for inducible expression include, for example, infection and invasion of filamentous fungi, bacteria, and viruses, low temperatures, high temperatures, drying, anaerobic conditions, and spraying of specific compounds. Examples include promoters that are known to be expressed.
- a promoter of a rice chitinase gene expressed by infection or invasion of a filamentous fungus, a bacterium, or a virus examples include, for example, a promoter of a rice chitinase gene expressed by infection or invasion of a filamentous fungus, a bacterium, or a virus; Low temperature induced rice lipl9 gene promoter, high temperature induced Arabidopsis thaliana HSP18.2 gene promoter, drought induced rice rab gene promoter —, A promoter of the alcohol dehydrogenase gene of Tumor sorghum induced under anaerobic conditions.
- the promoter of the rice chitinase gene and the promoter of the PR protein gene of the octopus are stimulated by a specific compound such as salicylic acid, and the rice ⁇ rab '' gene promoter is stimulated by spraying the plant hormone apsidic acid.
- a method of isolating and using a promoter of a caffeine synthase gene can also be used.
- a genomic] NA fragment is selected by using a hybridization technique in which at least a part of a caffeine synthase gene is used as a promoter.
- a method for identifying the upstream DNA of a gene can be mentioned.
- cloning vectors including the replication signal of E. coli and the gene for selection of transformed bacterial cells, are used in preparation for the introduction of recombinant DNA molecules in expression cassettes into plants. It can. Examples of such vectors include the PBR322, pUC system, M13mp system, and the like.
- the desired sequence can be introduced into the vector. Restriction enzyme cleavage site analysis, gel electrophoresis, and other biochemical and single molecule biological methods are commonly used to characterize the resulting plasmid DNA. After each operation, the plasmid DNA can be cut and ligated to another MA. The sequence of each plasmid DNA can be cloned into the same plasmid or another plasmid.
- Various techniques can be used to introduce the expression cassette into plant cells. These techniques include the use of Agrobacterium tumefaciens as a transforming factor or ⁇ T DNA for Agrobacterium rhizogenes as a transforming factor. This includes transformation of plant cells, direct introduction into protoplasts (injection method, electroporation method, etc.), take-gan method, and other possibilities.
- a simple plasmid such as a pUC derivative can be used.
- other DNA sequences may be required.
- T i or R i plasmids are used for transformation of plant cells, at least the sequence at the right end of the T-DNA region of T i and R i plasmids, usually the sequences at both ends, are used. It is preferable to connect them so that they are adjacent to the gene to be introduced.
- the expression cassette to be introduced When Agrobacterium is used for transformation, the expression cassette to be introduced must be cloned into a special plasmid, ie, an intermediate vector or a binary vector. Intermediate vectors are not replicated in Agrobacterium spp.
- the intermediate vector is transferred into the genus Agrobacterium by helper plasmid or electoral por- tion. Since the intermediate vector has a region homologous to the sequence of T-DNA, it is incorporated into Ti or Ri plasmid of Agrobacterium by homologous recombination.
- Agrobacterium used as a host must contain a Vir region. Normally, Ti or Ri plasmid contains a Vir region, and by this action, T-MA can be transferred to plant cells.
- An intermediate vector or vector containing the expression cassette thus obtained is directed to a binary vector and a microorganism containing the same, such as Escherichia coli.
- the transformed plant cells can be converted into plant tissues or plants by undergoing a regeneration process.
- the method of regeneration depends on the type of plant cells. For example, the method of Hatanaka et al. (Plant Cell Rep., 19, 106- (1999)) for coffee tree and the method of Fujimura et al. (Plant Tissue Culture Lett., 2, 74— (1995)), in corn, Shillito et al. (Bio / Technology, 7, 581- (1989)), and in Arabidopsis, Akama et al. (Plant Cell Rep., 12, 7- ( 1992))
- plant refers to all or a part of the organisms classified as plants (for example, leaves, stems, roots, flowers, fruits, seeds, etc.).
- Plants produced by these methods or plants obtained from their propagation medium are compared with wild-type plants that produce methylxanthine in the present invention.
- Changes in the expression of power fin synthase cause changes in the amount of methylxanthine produced by altering the metabolism of the host plant, and changes in the production ratio of methylxanthine caused by alteration in the metabolism of the host plant. Occur.
- the transformed plant thus obtained is the subject of the present invention.
- the plant in the present invention also includes specific tissues or cells of the plant, such as leaves, flowers, fruits, and seeds.
- a further feature of this method is that if the target nucleic acid is introduced into a part of a plant (lower leaf or the like) by infection or the like, the effect is spread to the whole plant.
- a method for suppressing expression involves infecting lower leaves of a plant with double-stranded RNA or Agrobacterium having double-stranded DNA containing all or a part of the sequence of the gene of interest or a sequence with high homology to the target gene.
- high homology refers to a homology of 60% or more, preferably 75% or more, more preferably 90% or more in the comparison of the respective nucleotide sequences, and most preferably. Or 95% or more homology.
- Plants that have been subjected to this method have altered expression levels of the caffeine synthase protein of the present invention compared to wild-type plants that produce methylxanthines, and Changes in the amount of methylxanthine produced by the alteration and changes in the production ratio of methylxanthine due to alteration in the metabolism of the host plant occur.
- the plants obtained in this way are the subject of the present invention.
- the plant in the present invention also includes specific tissues or cells of the plant, such as leaves, flowers, fruits, and seeds.
- Plants that produce the above-mentioned methylxanthines include plants belonging to the genus Coffea (Coffea), such as Japanese cypress, plants belonging to the genus Camellia (Camellia), such as Japanese cypress, and Japanese lantern.
- Coffea Coffea
- Camellia Camellia
- Figure 1 is a flow chart showing the major caffeine biosynthetic pathways in coffee trees and cypress trees. The names of each compound are shown on the right, and the names of enzymes that catalyze each reaction are shown on the left.
- SAM means S-adenosyl-L-methionine
- SAH means S-adenosyl-L-homocysteine.
- FIG. 2 is a diagram schematically showing a pGEX-N1 vector (FIG. 2A) and a pGEX-TCSl vector (FIG. 2B).
- the former is a vector constructed by linking Nl cDNA (SEQ ID NO: 2) downstream of daltathione S—transferase gene (GST) controlled by the tac promoter (Ptac), and the latter is daltathione S—
- GST daltathione S—
- This is a vector constructed by ligating a TCS1 cDNA (DDBJ / GenBank / EMBL accession number AB031280; a sequence described in JP-A-200-37490) downstream of a transcriptase gene (GST).
- a Npishiri down resistance gene (Amp, rack Li Presa monogenic (lacl q), pBR322 origin of replication (pBR322 ori), indicating restriction enzyme recognition unit position the (Smal, NotI, EcoRI and Xhol) in FIG.
- FIG 3 shows the detection of enzymatic reaction products by thin-layer chromatography (TLC).
- TLC thin-layer chromatography
- Panel (A) after deployment, showing the state detected the spot of auto La Geography foremost Yotsuteme methyl group (main Chiru 1 4 C) is added in the enzyme reaction product. The position of each product is shown on the left side of panel (A).
- Panel (B) shows spots of the specimen detected by ultraviolet light after deployment. Move the spot origin between panel (A) and panel (B) Shows the rate (B value).
- GST glutathione S—transferase
- N1 is a fusion protein of GST and N1 (GST-Nl)
- TCS1 is a fusion protein of GST and TCS1 (GST-TCS1)
- SAM is S—adenosyl-L - (main Chiru 1 4 C) main Chionin
- Tb is Teopuro Mi emissions
- Cf is cafes Lee down the asterisk means a non-specific product respectively.
- CaCS-N2 primers (5-ATGGAGCTCCAAGAAGTCCT-3) and CaCS designed based on the conserved sequences of CaMXMT cDNA (DDBJ / GenBank / EMBL accession number AB04 8794) and CaMTL3 cDNA (DDBJ / GenBank / EMBL accession number AB048793)
- a -Cl primer (5-CTTTTACACGTCTGACTTCTCTG-3) was synthesized.
- PCR was performed to amplify the cDNA fragment.
- This cDNA fragment was inserted into the EcoRV site of pBluescript II KS-(Stratagene) to prepare a plasmid. Nucleotide sequencing was performed on randomly selected clones to determine CaMXMT cDNA and CaMTL3 cMA.
- the new cDNA was named N1 for convenience.
- the Nl cDNA fragment was excised from pBluescript II KS- using the restriction enzymes Smal and Notl, and dalyuthione S-transferase (GST) expression vector, pGEX-4T-2 (Ame rsham Biosciences) ⁇ Inserted into the Smal / Notl site o
- GST dalyuthione S-transferase
- pGEX-4T-2 Ame rsham Biosciences
- TCS1 cDNA (DDBJ / GenBank / EMBL accession number AB031280; the sequence described in JP-A-2001-37490) derived from Japanese cypress coding for caffeine synthase was determined by PCR using Pyrobest MA Polymerase. Amplified. For type III, a plasmid clone containing TCS1 cDNA was used. As primers, TCS1-EcoRI primer (5-GA ATTCATGAACAGGGGGGAAG-3) and TCS1-Xhol primer (5-CT CGAGTGGCATATATGTGATAGGGAC-3) to which a restriction enzyme recognition sequence was added were used.
- the amplified TCS1 cDNA fragment was inserted into the EcoRV site of pBluescript II KS-, and base sequencing was performed to confirm that there was no base substitution or deletion.
- the TCS1 cDNA fragment was excised from pBluescript II KS- using the restriction enzymes EcoRI and Xhol, and inserted into the EcoRI / XhoI site of pGEX-4T-1 (Amersham Biosciences; 0 or more).
- a pGEX-TCS1 vector for expressing a fusion protein of GST protein and TCS1 protein (GST-TCS1) in E. coli was constructed.
- the Escherichia coli that produced the recombinant protein was recovered by centrifugation, and suspended in a 300 ⁇ 1 disrupted solution (50 mM Tris-HCl [H8.0], ImM EDTA, 5 mM dithiothreitol). Subsequent operations were performed on ice or at 4 ° C. The suspension was sonicated, Triton X-100 was added to a final concentration of 1, and the mixture was incubated for 30 minutes. The crushed liquid was separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation, and the supernatant was used as a recombinant protein sample.
- the enzyme reaction solution of 21 was mixed with 2 ⁇ 1 of methanol, and the resulting mixture was spotted on a TLC plate (Silicagel 60 F254; erck).
- TLC plate Silicagel 60 F254; erck.
- a recombinant protein sample containing GST-TCS1 and a recombinant protein sample containing GST were used instead of the recombinant protein sample containing GST-Nl. I got it.
- a mixture of standard 21 and methanol 2 ⁇ 1 was applied to a TLC plate in the same manner as above, except that caffeine (ImM aqueous solution) was used as the standard instead of the enzyme reaction solution. I wore it. A methanol solution containing SAM was also spotted on the TLC plate.
- the fusion protein GST-TCS1 which was used as a control protein sample having caffeine synthesizing activity, had an activity to generate caffeine using theopromin as a methyl group receptor. Showed sex. Similarly, the fusion protein GST-N1 also showed the activity of generating caffeine using theobine min as a methyl group receptor. That is, GST-N1 catalyzes the methylation of theopromin at position 1 of the purine ring. In contrast, protein GST did not show such activity. From the above results, it was clarified that Nl cDNA derived from coffee tree encoded caffeine synthase (3,7-dimethylxanthine methylylase). Industrial applicability
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Description
明 細 書 カフユイ ン合成酵素及びその用途 技術分野
本発明は、 コーヒーノキにおける、 キサン ト シンから 7 — メ チルキサン ト シン、 7 —メ チルキサンチン、 テオプロ ミ ン ( 3, 7 —ジメ チルキサンチン) を経てカフェイ ン ( 1, 3, 7 — ト リ メ チルキサンチン) が生合成される一連の反応にお いて、 テオプロ ミ ンからカフヱイ ンを生成する活性を有する カフェイ ン合成酵素 ( 3, 7—ジメ チルキサンチンメ チル化 酵素) 及びその変異体、 これらのいずれかをコー ドする塩基 配列を有する DNA分子又は RNA分子、 これらの分子を用いたベ クタ一、 該ベクタ一による形質転換生物及びこれらの用途に 関する。 背景技術
コー ヒーノキ (Cof fea)、 チヤ ノ キ (Camel lia sinensis)^ コラ (Cola acuminataリ、 マテ (Ilex paraguariensisノは 丄, 3, 7 — ト リ メ チルキサンチン(カフェイ ン)を、 カカオ(The obroma cacao)、 コラは 3, 7 —ジメ チルキサンチン(テオプ 口 ミ ン)を生合成する植物である。 これらの植物種の葉ゃ果 実は嗜好品と して飲料や食品に加工され、 人々に摂取されて いる。 また、 これらの植物種から抽出されたカフヱイ ンは、 中枢神経興奮作用などの様々な薬理作用を有するため医薬品 と して利用されている。
カフヱイ ンは世界中で莫大な需要があるが、 これらを生合 成する植物種の多く は特定の地域でのみ栽培される。 そこで、
遺伝子組換え技術を利用して微生物や栽培の簡単な植物種に それらを生合成させる技術の開発が望まれている。
他方、 カフユイ ンの過剰な摂取は不眠、 不整脈、 震顫など の副作用を引き起こすため、 遺伝子組換え技術を利用して力 フユイ ン生合成機能を抑制した植物種を育種し、 カフェイ ン 含量の低い飲料や食品を製造する技術が望まれている。 これ らの技術を開発するためには、 力フユイ ンの生合成に関与す る遺伝子あるいはその cDNAを単離するこ とが必要である。 コーヒーノキ及びチヤノキでは、 アデニンヌ ク レオチ ド及 びグァニンヌ ク レオチ ドの異化代謝中間産物であるキサン ト シンを出発材料と し、 7 —メチルキサン ト シン、 7—メチル キサンチン、 テオプロ ミ ンを経てカフヱイ ンが生合成される (後述の文献(1)、 図 1参照)。
コーヒーノキから 7 —メ チルキサンチンメチル化酵素 (テ ォプロ ミ ン合成酵素) をコ— ドする CaMXMT cDNA (後述の文献 (2) )、 はすでに単離されている。
また、 特開 2 0 0 1 — 3 7 4 9 0号公報には、 カフヱイ ン 生合成の最終反応である 7 —メチルキサンチン—テオプロ ミ ン—カフヱイ ンの 2段階のメチル化反応を触媒する N —メチ ル小ラ ンスフヱラ一ゼのァ ミ ノ酸配列及びそのァミ ノ酸配列 をコー ドするチヤノキ由来の DNA配列が記載されている。 更に同公報では、 該発明にかかる DNAをア ンチセ ンスの形 で植物に導入し、 ホス ト細胞の代謝を改変してメチルキサン チン類 ( 7—メチルキサンチン、 パラキサンチン、 テオプロ ミ ン及びカフ · イ ン) の生成比を改変することができると述 ベられており、 そのための植物細胞、 植物組織又は植物体の 供給源と して、 チヤ ノキなどのツバキ (Came l l ia) 属植物の
他にコ一ヒ一ノキ (Cof fea) 属植物を好ま しいものと して例 示している。
しかし、 ツバキ属植物とコーヒーノキ属植物は系統的に遠 縁であり、 N —メチル ト ラ ンスフ ヱラーゼのァ ミ ノ酸配列及 びそのア ミ ノ酸配列をコー ドする MA配列も両者の間で著し く異なっていることが予測されている。 従って、 同公報に記 載の MAをァンチセンスの形でコーヒーノ キ属植物に導入し た場合、 メ チルキサンチン類の生成比を改変できるかどうか は疑わし く 、 できたと しても効果は非常に弱いものと考えら れる。 本発明は、 コーヒーノキにおける、 キサン ト シンから 7— メ チルキサン ト シン、 7 —メ チルキサンチン、 テオプロ ミ ン を経てカフヱイ ンが生合成される一連の反応において、 テオ プロ ミ ンからカフ ェイ ンを生成する活性を有するカフヱイ ン 合成酵素、 微生物や植物におけるメ チルキサンチン類 (本明 細書において、 7 —メ チルキサン ト シン、 7 —メ チルキサン チン、 テオプロ ミ ン、 ハ°ラキサンチン、 カフヱイ ンを 「メ チ ルキサンチン類」 と呼ぶ) の生産制御に有用なカフェイ ン合 成酵素をコ一 ドする DNA又は RNA分子、 及びそれを用いたべク ター等を提供するこ とを目的とする。 例えば、 本発明による DNA分子の全部も しく は一部を、 微生物又は植物に、 セ ンス 又はアンチセ ンスの形で組み込むことにより、 以下の目的を 達成するこ とが可能になる。 (1) 工業用、 食品用、 医療用と して利用できるカフ ェイ ン合成酵素を効率よく生産し、 これ を用いて酵素反応によってカフェイ ンを製造する。 (2) メチ ルキサンチン類を生合成する植物体、 植物組織、 植物細胞の メチルキサンチン類生合成代謝を改変して、 カフェイ ンを効
率よく生産する。 (3) メチルキサンチン類を生合成する植物 体、 植物組織、 植物細胞のメ チルキサンチン類生合成代謝を 改変して、 カフヱイ ンの生産を抑制又は停止、 及びメ チルキ サンチン類の生成比を変化させる。 発明の開示
本発明者らは、 上記課題を解決すべく研究を重ねた結果、 配列表の配列番号 : 2 に示す MA断片を PCE法により増幅し、 次に、 この DM分子を発現ベクターに組み込んだ後、 大腸菌 に導入し、 当該 DNA分子に由来するポ リ ペプチ ドを大量に発 現させ、 発現したポリべプチ ドを回収してその酵素学的性質 を調べたところ、 これが、 テオプロ ミ ンのメ チル化による力 フェイ ンの生成反応を触媒するこ とを認めた。 すなわち、 当 該 MA分子が力フェイ ン合成系を構成する酵素の一つである カフェイ ン合成酵素をコー ドする こ とが確認された。
上記発現べクタ一に上記 DNAを組み込む方法には、 既知の いずれの方法も適用し得る。 例えば適当な制限酵素を選択し、 これで該 DNAを処理して切断し、 次いで同様に処理した発現 ベクタ一と混合し、 リガーゼによつて再結合する方法が用い られる。 この様にして得られた該 DNAと発現べク タ一の結合 物を、 形質転換法によつて微生物の菌体、 好ま しく は大腸菌 に導入し、 遺伝形質と して安定するまで増殖すると、 目的の 遺伝形質とべクタ一 DNAの形質を併せもつ形質転換株が得ら れる。 形質転換株の培養、 形質転換株から組換えタンパク質 の取得 (必要ならばその精製) は、 いずれも常法に従って行 つてよい。
S —アデノ シルメチォニン (SAM) をメ チル基供与体と し てメチルキサンチン類を生合成する植物であれば、 本発明に
よるカフヱイ ン合成酵素あるいはそれと同一の酵素活性を有 するポリペプチ ド、 更にはこれらをコ一 ドする DNAが含まれ ている と推測され、 本発明に記載の方法を用いれば、 それら の植物からも、 本発明によるカフユイ ン合成酵素あるいはそ れと実質的に同一の酵素、 更にはこれらをコ一 ドする MA分 子又は RNA分子を得るこ とができる。
本発明は以上の様な知見に基づいて完成されたものである。 以下、 本発明を説明する。
本発明による DNA分子は、 下記の塩基配列(a) (b)のいずれ かを有する DNA分子である。
(a)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列を有し、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメ チル化を触媒する酵素活性 を有するポリべプチ ドであるカフエイ ン合成酵素をコ一 ドす る塩基配列、
(b)上記塩基配列(a)に、 該塩基配列(a)がコー ドするポ リ べ プチ ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、 塩基の置換、 欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。
変異塩基配列(b)と しては、 上記塩基配列(a)とス ト リ ンジ ェン トな条件下でハイプリ ダイズし得る ものが好ま しい。 本発明による DNA分子の具体例は、 配列番号 : 2 の塩基配 列からなる。
本発明による RNA分子は、 下記の塩基配列(a) (b)のいずれ かを有する ENA分子である。
(a)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列を有し、 プ リ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメチル化を触媒する酵素活性 を有するポ リべプチ ドであるカフヱイ ン合成酵素をコー ドす る塩基配列、
(b)上記塩基配列(a)に、 該塩基配列(a)がコー ドするポ リ べ
プチ ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、 塩基の置換、 欠失又は挿入を行って得られた変異塩基配列。
変異塩基配列(b)と しては、 上記塩基配列(a)とス ト リ ンジ ェ ン トな条件下でハイプリ ダイズし得るものが好ま しい。 本発明による RNA分子の具体例は、 配列番号 : 3 の塩基配 列からなる。
本発明による DNA分子の他の態様は、 上記の DM分子の有す る塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列であつて、 前 記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、 該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る。
本発明による RNA分子の他の態様は、 上記の RNA分子の有す る塩基配列の全部又は一部に相補的な塩基配列であつて、 前 記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場合に、 該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る。
本発明によるベクターの一態様は、 上記の DNA分子及び ENA 分子のいずれかを含む。 このベクターは、 例えば、 微生物及 び Z又は植物の細胞内で、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ン のメチル化を触媒する酵素活性を有するカフユイ ン合成酵素 を発現させることができるか、 も しく は該カフヱイン合成酵 素の発現を阻害する機能を有する ものと して提供する ことが できる。 このベクターを用いて、 微生物、 植物細胞、 植物組 織又は植物体を形質転換するこ とができ、 得られた形質転換 体も本発明に含まれる。
また、 上記の微生物、 植物体、 植物組織又は植物細胞を用 いてカフヱイ ン合成酵素を製造するこ とができる。
また、 上記の植物体、 植物組織又は植物細胞を用いてカフ ヱイ ンを効率よく生成するこ とができる。
また、 上記の植物体、 植物組織又は植物細胞を用いてカフ
エイ ンの生成を抑制又は停止すること、 及びメ チルキサンチ ン類の生成比を改変することができる。 本明細書において、 メ チルキサンチン類とは、 7 —メ チルキサン ト シン、 7 —メ チルキサンチ ン、 パラキサンチン、 テオプロ ミ ン及びカフ ヱ イ ンからなる群から選ばれる少なく とも 1つの化合物を言う。
力フ イ ンを効率よく生成するために用いる植物体、 植物 組織又は植物細胞の供給源としては、 コーヒーノキ (Coffea) 属植物、 ツバキ (Came l l ia) 属植物、 コラノ キ (Col a) 属植 物、 モチノキ (I l ex) 属植物、 ネエア (Neea) 属植物、 ァォ ギリ (Fi rmiana) 属植物、 ポー リニア (Pau l l inia ) 属植物 又はカカオノキ (Theobroma ) 属植物を挙げることができる。
カフェイ ンの生成を抑制又は停止するため、 及びメ チルキ サンチン類の生成比を改変するために用いる植物体、 植物組 織又は植物細胞の供給源と しては、 上記の力フユイ ンを効率 よ く生成するために用いる ものと同一の群を挙げるこ とがで きるが、 コーヒーノキ属植物が最も適している。
本発明によるカフエイ ン合成酵素は、 下記のァ ミ ノ酸配列 (a) (b)のいずれかを有するタ ンパク質からなり、 かつ、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメ チル化を触媒する酵素活性 を有する。
(a)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列、
(b)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列に、 上記酵素 活性を損なわない範囲内でのァ ミ ノ酸の置換、 挿入又は欠失 を行つて得られた変異ァミ ノ酸配列。
この変異ァ ミ ノ酸配列(b)と しては、 上記ァ ミ ノ酸配列(a) をコ— ドする塩基配列及び上記変異ァ ミ ノ酸配列(b)をコ一 ドする塩基配列がス ト リ ンジェ ン 卜な条件下でハイプリダイ ズし得る ものが好ま しい。
本発明は、 上記力フヱイ ン合成酵素と、 テオプロ ミ ンと、
S —アデノ シルメチォニンとを含む混合液をィ ンキュベ一シ ヨ ン して、 カ フェイ ンを生成させる、 カ フ ヱイ ンの製造法を 含む。
この様に、 本発明により、 カフヱイ ンの生産に用いるカフ ェイ ン合成酵素の製造、 植物において生産されるメチルキサ ンチン類の組成の改変などに有用な、 カフ ェイ ン合成酵素を コ一 ドする DNA分子及び RNA分子が提供される。 本発明の力フェイ ン合成酵素は、 配列番号 : 1 に示したァ ミ ノ酸配列を有しているもの、 又は、 配列番号 : 1 のァ ミ ノ 酸配列に、 目的とするカフ イ ン合成酵素活性を損なわない 範囲で、 ア ミ ノ酸の置換、 挿入又は欠失を行って得られた変 異アミ ノ酸配列を有しているものである。 本明細書では、 上 記力フ ユイ ン合成酵素活性を有する配列番号 : 1 のア ミ ノ酸 配列及びその変異配列を有するポリペプチ ドをカフェイ ン合 成酵素と総称する。
上記の変異ァ ミ ノ酸配列を有するポリペプチ ドは、 好ま し く は、 それ自身が実質的にコーヒーノキ由来の力フユイ ン合 成酵素と同等の機能を有し、 且つ配列番号 : 1のアミ ノ酸配 列と酵素活性に関する部位において高い相同性を有している ものである。
一般に同等の機能を有する複数の酵素間において、 酵素活 性に必須である部位以外のァミ ノ酸配列の相同性は非常に低 いこと力 ある ( Kawagoe et al . , Proc. Nat l. Acad. Sci. USA, 93, 12082- (1996)参照) 。 従って、 全体と しての相同性が低 い場合でも、 活性に関する部位において高い相同性を有する ものは本発明によるカフ イ ン合成酵素と して分類できる。
ァ ミ ノ酸配列全体と して比較した場合における変異アミ ノ 酸配列は、 この、 配列番号 : 1のア ミ ノ酸配列に対して、 1 5 %以上の相同性、 好ま しく は 3 0 %以上の相同性、 より好 ま しく は 4 5 %以上の相同性、 更に好ま しく は 6 0 %以上の 相同性、 更により好ま しく は 7 5 %以上の相同性、 更により 一層好ま しく は 9 0 %以上の相同性、 最も好ま し く は 9 5 % 以上の相同性を有し、 かつ目的のカフェイ ン合成酵素活性を 有するポ リペプチ ドを提供できる変異ア ミ ノ酸配列である。
なお、 配列番号 : 1 のア ミ ノ酸配列を基準と した変異を、 これらをコ— ドする塩基配列のレベルで表現した場合、 変異 ァ ミ ノ酸配列をコ— ドする変異塩基配列は、 配列番号 : 1 の ァミ ノ酸配列をコ一ドする塩基配列に対して、 3 5 %以上の 相同性、 好ま しく は 6 0 %以上の相同性、 より好ま し く は 7 5 %以上の相同性、 更に好ま しく は 9 0 %以上の相同性、 更 に好ま し く は 9 5 %以上の相同性を有する変異塩基配列であ る
本発明によるカフ イ ン合成酵素をコ一ドする塩基配列、 すなわちカフ イ ン合成酵素遺伝子と しては、 配列番号 : 1 のァ ミ ノ酸配列をコ一ドする塩基配列を挙げる こ とができ、 その具体例と しては、 配列番号 : 2 の DNA配列、 配列番号 : 3の RNA配列を挙げる こ とができる。 これらのカ フ ェイ ン合 成酵素遺伝子に対して、 上記で規定される相同性を有する塩 基配列も本発明におけるカフユイ ン合成酵素をコー ドする遺 伝子に含まれる。
目的とするカフユイ ン合成酵素活性を維持した変異ァミ ノ 酸配列と しては、 この変異アミ ノ酸配列をコー ドする変異塩 基配列と、 配列番号 : 1 のアミ ノ酸配列をコー ドする塩基配 列とがス ト リ ンジェ ン トな条件下でハイブリ ダィズし得る も
のが実用上好適に利用し得る。
また、 変異カフ イ ン合成酵素遺伝子としても、 配列番号:
1のア ミ ノ酸配列をコ一 ドする塩基配列とス ト リ ンジ ン ト な条件下でハイプリ ダイズし得る ものが実用上好適に利用し 得る。 その具体例と しては、 配列番号 : 2の塩基配列にス ト リ ンジヱン トな条件下でハィブリ ダイズし得る DNA分子及び 配列番号 : 3の塩基配列にス ト リ ンジユ ン トな条件下でハイ プリ ダイズし得る RNA分子を挙げるこ とができる。
このス ト リ ンジヱ ン トな条件下でのハイプリ ダイゼ一ショ ンは、 例えば、 Molecular Cloning: Cold Spring Harbor La boratory Press, Current Protocols inMolecular Biology; Wiley Interscience に記載の方法によって行うことができ、 市販のシステムと しては、 Gene Image システム (アマシ ャ ム) を挙げるこ とができる。 具体的には以下の操作によって ハイプリ ダイゼーショ ンを行う こ とができる。
試験すべき DM分子又は RNA分子を転写した膜を、 製品プロ トコ一ルに従つて、 標識したプローブとプロ トコール指定の ハイブリ ダィゼーシ ョ ンパ、ッ フ ァ ー中でハィプリ ダィズさせ る。 ノヽ ィプリ ダイゼ一シヨ ンノ ッ フ ァーの組成は、 0. 1重 量% S D S、 5重量%デキス トラ ン硫酸、 1 Z2 0容のキッ ト添付のブロ ッキング試薬及び 2〜 7 S S Cからなる。 プ ロ ッキング試薬と しては、 例えば、 1 0 0 xDenhardt's sol ution ヽ 2 % (重量 Z容量リ Bovine serum albumin 2 % 愈 量/容量) FicllTM400、 2 % (重量 Z容量) ポリ ビニルピロ リ ドンを 5培濃度で調製したものを 1Z2 0に希釈して使用 することができる。 2 0 X S S Cは、 3 M塩化ナ ト リ ウム、 0. 3 Mクェン酸溶液であり、 S S Cは、 より好ま しく は、 3〜 6 X S S C、 更に好ま し く は、 4〜 5 X S S Cの濃度で
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使用する。
ハイプリ ダイゼーシヨ ンの温度は、 4 0〜 8 0で、 より好 ま しく は 5 0〜 7 0 °C、 更に好ま し く は 5 5〜 6 5 °Cの範囲 であり、 数時間から一晩のイ ンキュベーショ ンを行った後、 洗浄バッ フ ァ一で洗浄する。 洗浄の温度は、 好ましく は室温、 より好ま しく はハイプリ ダイゼ一シヨ ン時の温度である。 洗 浄バッ フ ァ ーの組成は、 6 X S S C + 0. 1重量% S D S溶 液、 より好ま しく は 4 X S S C + 0. 1重量% S D S溶液、 更に好ま し く は 2 X S S C + 0. 1重量% S D S溶液、 更に 好ま し く は 1 X S S C + 0. 1重量% S D S溶液、 最も好ま しく は 0. 1 X S S C + 0. 1重量% S D S溶液である。 こ の様な洗浄バッ フ ァ ーで膜を洗浄し、 プロ一プがハイプリ ダ ィズした DNA分子又は ENA分子を、 プロープに用いた標識を利 用して識別することができる。
なお、 変異は、 自然界において生じたものでもよく 、 塩基 配列における部位突然変異により人工的に起こ したものでも 良い。
本発明の力フェイ ン合成酵素遺伝子を有する MA分子は、 例えば、 カフユイ ン合成酵素をコー ドする DNA分子に特異的 にハイプリ ダイズするォリ ゴ塩基をプライマーと して用いた PCR技術 (植物の PCR実験プロ ト コール (細胞工学別冊、 植物 細胞工学シリ ーズ 2 ) 秀潤社(1995)) を利用して、 本発明に よるカフニイ ン合成酵素を生産する細胞から分離する ことが できる。
具体的には、 mRNAから合成した cDNAにリ ンカ一を結合させ、 カフエイ ン合成酵素を構成するアミ ノ酸配列をコー ドする DN Aと リ ンカ一間で PCRを行う こと等により、 目的 cDNAの全長配 列を単離する ことができる。
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この様なハイブリ ダィゼ一ショ ン技術や PCE技術によ り得 られるカフヱイ ン合成酵素をコ一 ドする DNA分子は、 少な く とも単離に使用した部位においては、 配列番号 : 2に記載の 力フ ユイ ン合成酵素遺伝子と相同性を有する。 こ こで相同性 とは、 それぞれのカフヱイ ン合成酵素遺伝子がコー ドするァ ミ ノ酸配列の比較において 1 5 %以上の相同性、 好ま しく は 3 0 %以上の相同性、 より好ま し く は 4 5 %以上の相同性、 更に好ま し く は 6 0 %以上の相同性、 更により好ま し く は 7 5 %以上の相同性、 更によ り一層好ま し く は 9 0 %以上の相 同性、 最も好ま し く は 9 5 %以上の相同性を指す。 ただし、 得られるカフヱイ ン合成酵素遺伝子によっては、 コー ドする ァ ミ ノ酸の複数の残基が欠失、 付加、 置換された結果として、 カフ イ ン合成酵素との相同性が 1 5 %以下となってもなお、 カフ イ ン合成酵素の機能に必須な領域を保持し、 実質的に カフユイ ン合成酵素と同等の機能を有するタ ンパク質をコー ドしているこ とも想定される。
本発明によるカフ ニイ ン合成酵素をコ一 ドする塩基配列 (遺伝子) を有する DNA分子又は A分子を単離するために用 いる生物は、 メチルキサンチン類を生成する生物であればい ずれも使用できるが、 中でもコーヒーノ キなどのァカネ科コ —ヒ一ノキ (Coffea) 属植物、 チヤノキなどのツバキ科ツバ キ (Came l l ia) 属植物、 コラノキなどのァオギリ科コラノキ ( Col a) 属植物などが好ま しい。
本発明によるカフ イ ン合成酵素遺伝子を有する RNA分子 は、 S p 6 プロモーターや T 7プロモータ一と いっ た BNAポ リメ ラーゼが認識するプロモータ一の下流に、 上記方法で得 たカフェイ ン合成酵素 DNAを所望の向きで、 機能し得る位置 に接続して組換え分子を調製し、 これを S p 6 ENAポ リ メ ラ
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ーゼゃ T 7 RNAポリ メ ラ一ゼなどの RNAポリ メ ラーゼで転写さ せて得るこ とができる。 また、 植物ウィルスにカフェイ ン合 成酵素 Aないし RNAを導入するか、 後で述べる様に適当な DN A発現カセ ッ トにカフエイ ン合成酵素遺伝子を有する DNAを所 望の向きで機能し得る位置に接続して組換え分子を形成し、 この組換え分子を微生物や植物等の宿主に導入するこ とによ り宿主の転写活性を利用して得る こともできる。
カフ イ ン合成酵素遺伝子を有する DNA分子の全部又は一 部と相補性を有する DNA分子、 あるいはカ フ ェイ ン合成酵素 遺伝子を有する RNA分子の全部又は一部と相補性を有する RNA 分子であって、 カフ Xイ ンを生成する宿主細胞中において発 現した際に宿主細胞におけるカフエイ ン合成酵素の発現を阻 害する機能を有するものは、 宿主細胞におけるカフ イ ン合 成酵素発現の阻害又は抑制用の A分子又は ENA分子と して用 いるこ とができる。
こ こで、 カフ ェイ ン合成酵素遺伝子の一部とは、 その部分 に相補性を有する配列を基礎と して得られる阻害用の mRNA、 すなわちアンチセンス Aが宿主細胞中で形成された際に、 これが宿主細胞におけるカフ イ ン合成酵素を発現させるた めの mENAと結合して、 宿主細胞におけるカフヱイ ン合成酵素 の発現が阻害される部分である。 この部分と しては、 この様 なアンチセンス m Aの形成に必要となる部分であり、 例えば 少なく と も 1 4塩基長の長さの部分を挙げるこ とができる。
アンチセンス mRNA形成用の MA分子と しては、 例えば、 配 列番号 : 2の塩基配列の全部又は一部と相補性を有している MA分子を挙げることができ、 アンチセンス 分子としては、 配列番号 : 3の塩基配列の全部又は一部と相補性を有してい る A分子を挙げるこ とができる。 これらの塩基配列とス ト
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リ ンジユ ン トな条件下でハイプリ ダイズし得る変異配列の全 部又は一部と相補性を有している]) NA分子又は BNA分子もこの 様な目的に用いるこ とができる。
なお、 これらの阻害用の DNA分子又は RNA分子に対して、 高 い相同性を有し、 目的とする阻害又は抑制機能を発揮できる ものも利用できる。 こ こで高い相同性とはそれぞれの塩基配 列の比較において 6 0 %以上の相同性、 好ま し く は 7 5 %以 上の相同性、 更に好ま しく は 9 0 %以上の相同性、 最も好ま しく は 9 5 %以上の相同性を指す。
これらの阻害用の MA分子又は RNA分子自体は、 必ずしも本 発明によるカフエイ ン合成酵素をコ一 ドするものでな く ても よい。
本発明によるカフ イ ン合成酵素阻害用の塩基配列の他の 態様と しては、 力フ ユイ ン合成酵素遺伝子と相同性を有する 部分を有するが、 カフェイ ン合成酵素をコー ドしていない塩 基配列で、 宿主細胞の有するカフェイ ン合成酵素遺伝子と置 換されることで、 宿主のカフヱイ ン合成酵素活性を消失させ 得る ものを挙げることができる。
これらカフ ユイ ン合成酵素遺伝子又は力フ ェイ ン合成酵素 の発現を阻害又は抑制する機能を有する DNA分子の宿主細胞 内での発現について、 宿主細胞と して植物細胞を利用 した例 について以下に説明する。
植物細胞での発現は、 ( i ) 宿主細胞内での DNAから mKNA への転写を可能とするプロモーター、 (ii) プロモーターの 下流にセンス方向又はアンチセンス方向に連結したカフエイ ン合成酵素遺伝子を含む DNA断片、 又はカ フ ェイ ン合成酵素 の発現を阻害する機能を有する DNA断片、 (iii) 必要に応じ てこれら MA断片の下流に連結された転写産物の安定化に必
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要なポ リアデニレーショ ン部位を含むタ一 ミ ネ一ター配列、 などを含む発現カセッ トを宿主である植物細胞に導入して、 これを形質転換する方法が利用できる。
この様な発現カセッ ト、 及びこれを含むベクターも本発明 の対象である。
発現カセッ トは、 揷入されている DNAを恒常的又は誘導的 に発現させるためのプロモーターを含有し得る。 また、 この 発現カセッ トは、 必要に応じて、 植物細胞内での複製のため の複製オリ ジンを有することができる。
恒常的に発現させるためのプロモーターとしては、 例えば、 カ リ フラワーモザイクウィルスの 3 5 Sプロモータ一、 イネ のァクチンプロモーターなどが挙げられる。 また、 誘導的に 発現させるためのプロモータ一と しては、 例えば糸状菌、 細 菌、 ウィルスの感染や侵入、 低温、 高温、 乾燥、 嫌気的条件、 特定の化合物の散布等の外因によつて発現するこ とが知られ ているプロモーター等が挙げられる。 この様なプロモータ一 と しては、 例えば、 糸状菌、 細菌、 ウィルスの感染や侵入に よつて発現するィネのキチナーゼ遺伝子のプロモーターゃタ ノ コの P Rタ ンパク質遺伝子のプ口モータ一、 低温によって 誘導されるイネの 「 l i p l 9」 遺伝子のプロモータ一、 高 温によって誘導されるシロイ ヌナズナの 「H S P 1 8 . 2」 遺伝子のプロモータ一、 乾燥によって誘導されるイネの 「 r a b」 遺伝子のプロモータ—、 嫌気的条件で誘導される トゥ モロコシのアルコールデヒ ドロゲナーゼ遺伝子のプロモータ 一等が挙げられる。 またイネのキチナーゼ遺伝子のプロモー ターとタノ コの P Rタ ンパク質遺伝子のプ口モータ一はサリ チル酸等の特定の化合物によって、 イネの 「 r a b」 遺伝子 プロモーターは植物ホルモンのァプシジン酸の散布によって
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も誘導される。
或いはまた、 発現カセッ トに揷入されている DNAを発現さ せるためのプロモーターと しては、 カフヱイ ン合成酵素遺伝 子のプロモータ一を単離して利用する方法も挙げられる。
具体的なプロモータ一の単離方法の一例には、 カフヱイ ン 合成酵素遺伝子の少なく と も一部をプロ一プと したハイブリ ダイゼ一ショ ン技術の利用により、 ゲノム] NA断片を選択し、 該遺伝子の上流部 DNAを特定する方法を挙げることができる。
発現カセッ ト中の組み換え DNA分子の植物への導入に備え るために、 大腸菌の複製シグナル及び形質転換された細菌の 細胞を選抜するためのマー力一遺伝子を含むク ローニングべ クタ一が数多く利用できる。 この様なベクタ一の例には、 P B R 3 2 2、 p U C系、 M 13 m p系等がある。 適当な制限酵 素切断部位で、 目的の配列をべクタ一に導入することができ る。 得られたプラス ミ ド DNAの特徴を明らかにするため、 制 限酵素切断部位分析、 ゲル電気泳動、 及びその他の生化学的 一分子生物学的方法が一般に用いられる。 各々の操作を終え た後、 プラス ミ ド DNAを切断して、 別の MAに結合させること ができる。 各プラス ミ ド DNAの配列を、 同じプラス ミ ド又は 別のプラス ミ ド中にク ローニングする こ とができる。
植物細胞の中に発現カセッ トを導入するためには、 さまざ まな手法を用いるこ とができる。 これらの手法には、 形質転 換因子と してァグロバクテリ ウム · ッメ フ ァ シエンス (Agro bacterium tumefaciens ) 又は、 ァグ、 クテリ ウム · リ ゾ ゲネス ( Agrobacterium rhizogenes) 用 ヽた T一 DNA }こよ る 植物細胞の形質転換、 プロ トプラス トへの直接導入 (イ ンジ ェ ク シ ヨ ン法、 エレク トロポレーシ ヨ ン法等) 、 テイ ク ルガン法等やその他の可能性が含まれる。
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4601 プロ トプラス 卜への直接導入では、 特別に必要とされるベ クタ一はない。 例えば、 p U C誘導体の様な単純なプラス ミ ドを用いるこ とができる。 目的の遺伝子を植物細胞に導入す る方法によっては、 他の DNA配列が必要になる こ と もある。 例えば T i 又は R i プラス ミ ドを植物細胞の形質転換に用い る場合には、 T i及び R i プラス ミ ドの T- DNA領域の少な く とも右端の配列、 大抵は両端の配列を、 導入されるべき遺伝 子の隣接領域となる様に接続するのが好ま しい。
ァグロパクテリ ゥム属菌を形質転換に用いる場合には、 導 入すべき発現カセッ トを、 特別のプラス ミ ド、 すなわち中間 ベクター又はバイナ リーベクター中にク ローニングする必要 がある。 中間べクタ一はァグロバクテリ ウム属菌の中では複 製されない。 中間ベクターは、 ヘルパープラス ミ ドあるいは エレク ト口ポレーシ ヨ ンによってァグロ ノ クテリ ウム属菌の 中に移行される。 中間べクタ一は、 T - DNAの配列と相同な領 域をもっため、 相同組換えによって、 ァグロバクテリ ウム属 菌の T i又は R i プラス ミ ド中に取り込まれる。 宿主と して 使われるァグロバクテリ ウム属菌には、 V i r領域が含まれ ている必要がある。 通常 T i 又は R i プラス ミ ドに V i r領 域が含まれており、 その働きにより、 T- MAを植物細胞に移 行させるこ とができる。
一方、 バイナリーベクターはァグロバクテリ ゥム属菌の中 で複製、 維持され得るので、 ヘルパープラス ミ ドあるいはェ レク トロポレーショ ン法によってァグロバクテリ ウム属菌中 に取り込まれると、 宿主の V i r領域の働きによって、 バイ ナリ 一ベクタ一上の T-DNAを植物細胞に移行させる こ とがで さる。
この様にして得られた発現カセッ トを含む中間ベク ター又
はバイナリ ーベクタ一、 及びこれを含む大腸菌ゃァグロバク テリ ゥム属菌等の微生物も本発明の対象である。
形質転換された植物細胞は、 再生過程を経るこ とにより植 物組織又は植物体に変換する こ とができる。 再生の方法は植 物細胞の種類により異なるが、 例えばコーヒーノキでは Hata nakaら (Plant Cell Rep. , 19, 106- ( 1999) ) の方法、 ィ ネでは Fujimuraら (Plant Tissue Culture Lett. , 2, 74— (1995) ) の方法、 ト ウモロコシでは、 Shillitoら (Bio/Te chnology, 7, 581- (1989) ) の方法、 シロイ ヌナズナでは Akama らの方法 (Plant Cell Rep., 12, 7- (1992) ) など 力 ある。
本発明において、 「植物体」 とは植物に分類される生物個 体の全体も し く は一部の器官 (例えば、 葉、 茎、 根、 花、 果 実、 種子等) を指す。
これらの方法によ り作出された植物体又はその繁殖媒体 (例えば種子、 塊茎、 切穂など) から得た植物体は、 メチル キサンチン類を生成する野生型の植物体と比較して本発明の 力フ イ ン合成酵素の発現量が変化し、 ホス ト植物の代謝の 改変によるメ チルキサンチン類の生成量の変化や、 ホス ト植 物の代謝の改変によるメチルキサンチン類の生成比の変化が 起こる。 この様にして得られた形質転換植物は本発明の対象 である。 本発明でいう植物には、 葉、 花、 果実、 種子などの 植物の特定の組織又は細胞も含まれる。
また、 近年植物のポス ト トラ ンスレ一ショナルなジーンサ ィ レンシングの研究から、 ウィルス等の外来核酸に対して植 物が本来備えている防御機能を利用して、 目的遺伝子の発現 を抑制するこ とが可能なこ とがわかってきた (Cell, 95, 177 - 187(1998) 、 化学と生物、 37、 532 -(1999)、 蛋白質核酸酵素、
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44、 1396 -(1999) ) 。 これによれば、 DNAウィルスや RNAウイ ルス等が植物に進入した場合、 植物はこれらの铸型からアベ ラン ト RNAを転写し、 植物が本来持っている配列の転写産物 と配列特異的に二本鎖 RNAを形成する。 この二本鎖 RNAは R N a s e により分解されるこ とにより、 目的の遺伝子の発現を 抑制する ことが可能となる (Ce l l , 96, 303- C1999) ) 。 本方 法の重要な特徴のひとつは、 発現を抑制したい配列を目的植 物に必ずしも形質転換させる必要がない点にある。 また本方 法のさ らなる特徴は、 植物の一部 (下位葉等) に目的の核酸 を感染等により導入すれば、 その効果が植物体全体に広がる ことである。 具体的な発現抑制方法は、 目的遺伝子の配列又 はそれと高い相同性を持つ配列の全部又は一部を含む二本鎖 RNAや、 二本鎖 DNAを持つァグロバクテリ ウムを植物の下位葉 に感染させる。 こ こで高い相同性とはそれぞれの塩基配列の 比較において 6 0 %以上の相同性、 好ま しく は 7 5 %以上の 相同性、 更に好ま し く は 9 0 %以上の相同性、 最も好ま し く は 9 5 %以上の相同性を指す。
この方法を施された植物体は、 メ チルキサンチン類を生成 する野生型の植物体と比較して本発明のカフ イ ン合成酵素 タ ンパク質の発現量が変化し、 ホス ト植物の代謝の改変によ るメチルキサンチン類の生成量の変化や、 ホス ト植物の代謝 の改変によるメチルキサンチン類の生成比の変化が起こる。 この様にして得られた植物は本発明の対象である。 本発明で いう植物には、 葉、 花、 果実、 種子などの植物の特定の組織 又は細胞も含まれる。
上記のメチルキサンチン類を生成する植物と しては、 コ一 ヒ一ノキなどのァカネ科コーヒーノキ (Coffea) 属植物、 チ ヤノキなどのツバキ科ッパキ (Came l lia) 属植物、 コラノキ
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などのァオギリ科コラノキ (Cola) 属植物などを例示するこ とができる。 図面の簡単な説明
図 1 はコーヒーノキ及びチヤノキにおける主要なカフエイ ン生合成経路を示すフローシ一 トである。 右側に各化合物の 名称を併記し、 左側に各反応を触媒する酵素の名称を併記す る。 SAMは S —アデノ シル一 L —メチォニン、 SAHは S —アデ ノ シル一 L —ホモシスティ ンを意味する。
図 2 は pGEX- N1ベクタ一 (図 2 A) 及び pGEX-TCSlベク タ一 (図 2 B) を模式的に示す図である。 前者は tacプロモーター (Ptac) によって制御されるダルタチオン S — トランスフエ ラーゼ遺伝子 (GST) の下流に Nl cDNA (配列番号: 2 ) を連 結して構築したベクターであり、 後者は同ダルタチオ ン S— ト ラ ンスフヱラーゼ遺伝子 (GST) の下流に TCS1 cDNA ( DDBJ /GenBank/EMBL accession number AB031280 ; 特開 200ト 3749 0号公報に記載の配列) を連結して構築したベクタ一である。 ア ンピシリ ン耐性遺伝子 (Amp 、 ラ ッ ク リ プレサ一遺伝子 ( lacl q) 、 pBR322複製起点 (pBR322ori) 、 制限酵素認識部 位 (Smal、 NotI、 EcoRI及び Xhol) を図中に示す。
図 3 は薄層ク ロマ トグラフィ ー (TLC) による酵素反応生 成物の検出を示もので、 展開後、 TLCプレー トをパネル (A) とパネル (B) に 2分した。 パネル (A) は、 展開後、 オー ト ラ ジオグラフィ 一によつてメ チル基 (メ チルー 1 4 C ) が付加 された酵素反応生成物のスポッ トを検出した状態を示す。 パ ネル (A) の左側には各生成物の位置を示す。 パネル (B) は、 展開後、 紫外光によって標品のスポッ トを検出した状態を示 す。 パネル (A) とパネル (B) の間にスポッ トの原点と移動
率 (B値) を示す。 GSTはグルタチォン S — トラ ンスフェラ一 ゼ、 N1は GSTと N1の融合タ ンパク質 (GST- Nl) 、 TCS1は GSTと TCS1の融合タ ンパク質 (GST-TCS1) 、 SAMは S —アデノ シル - L - (メ チルー 1 4 C ) メ チォニン、 Tbはテオプロ ミ ン、 Cf はカフ ェイ ン、 星印は非特異的生成物をそれぞれ意味する。 発明を実施するための最良の形態
本発明を下記の実施例により具体的に説明する。 ただし、 本発明の範囲は実施例に限定される ものではない。
(1)コーヒーノキ由来 mRNAからの二重鎖 cMAの合成
5gのコーヒーノキ (Coffea arabica) 未熟果実から CTAB法 ( Chang et a l ., P lant Mo l. Biol. Rep., 11, 113- ( 1993) 参照) を用いて total RNAを抽出した。 100 /z g の tota l RNA から PolyATtract mRNA Isolation System II I (Promega ) を用いて mRNAを精製した。 5〃 gの mRNAと ZAP- cDNA Synthesi s Kit ( Stratagene) を'用いて二重鎖 cMAを合成した。
(2) CaMXMT cDNA及び CaMTL3 cDNAと相同性を有する新規 cDNA の単離
CaMXMT cDNA ( DDBJ/GenBank/EMBL accession number AB04 8794 ) 及び CaMTL3 cDNA ( DDBJ/GenBank/EMBL accession nu mber AB048793 ) の保存配列を基に設計した CaCS- N2プライ マ一 (5— ATGGAGCTCCAAGAAGTCCT— 3) と CaCS-Clプライ マー ( 5-CTTTTACACGTCTGACTTCTCTG-3 ) を合成した。 上記 cDNAヽ 上記プライマー及び Pyrobest DNA Po lymerase (宝酒造) を 用いて PCRを行い、 cDNA断片を増幅した。 この cDNA断片を pBl uescript II KS - ( Stratagene) の EcoRVサイ 卜へ挿入しヽ プ ラスミ ドク ローンを作成した。 無作為に選択したクローンに ついて塩基配列決定を行い、 CaMXMT cDNA及び CaMTL3 cMAと
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相同性を有する新規な cDNA (配列番号 : 2 ) が揷入されたク ローンを選抜した。 新規な cDNAには便宜的に N1と命名した。
(3) GST- N1融合タ ンパク質発現べクタ—の構築
Nl cDNA断片を、 制限酵素 Smal 及び制限酵素 Not l を用い て pBl uescript II KS-から切り出し、 ダル夕チオン S-ト ラ ンスフ ェラ一ゼ (GST) 発現ベクターである pGEX- 4T- 2 ( Ame rsham Biosciences) © Smal/Notl サイ 卜へ挿入した o 以上 の操作によつて、 GSTタ ンパク質と Nl cDNAがコ一ドするタ ン パク質との融合タ ンパク質(GST - N1)を大腸菌において発現さ せるための pGEX- N1ベクター (図 2 A参照) を構築した。
(4) GST- TCS1融合タンパク質発現べクタ一の構築
カフヱイ ン合成酵素をコー ドするチヤ ノ キ由来 TCS1 cDNA ( DDBJ/GenBank/EMBL accession number AB031280 ; 特開 200 1 - 37490号公報に記載の配列) のコー ド配列を Pyrobest MA Polymeraseを用いて PCRによって増幅した。 铸型には TCS1 cD NAが挿入されたプラス ミ ドク ローンを用いた。 プライマーは 制限酵素の認識配列を付加した TCSl-EcoRIブライマ— (5-GA ATTCATGAACAGGGGGGAAG-3) 及び TCS1- Xholプライマ— (5- CT CGAGTGGCATATATGTGATAGGGAC-3 ) を用いた。 増幅した TCS1 c DNA断片を pBluescript II KS-の EcoRVサイ トへ揷入し、 塩 基配列決定を行う ことによって塩基置換や欠失が無いこ とを 確認した。 TCS1 cDNA断片を、 制限酵素 EcoRI及び制限酵素 Xh olを用いて pB l uescript I I KS-から切り 出 し、 pGEX - 4T- 1 ( Amersham Biosciences; の EcoRI/XhoIサイ 卜へ揷入した 0 以上の操作によって、 GST タ ンパク質と TCS1タ ンパク質の融 合タ ンパク質(GST-TCS1)を大腸菌において発現させるための pGEX- TCS1ベクター (図 2 B参照) を構築した。
(5)組換えタ ンパク質の生産
各べク夕一pGEX - Nl、 pGEX- TCS1及び pGEX- 4T- 2によ って大 腸菌 BL21株を形質転換した。 いずれの形質転換株も 3mlの 2χΥ Τ液体培地(100 mg/1のアンピシ リ ンを含む)において、 培養 の吸光度(A600)が約 0.8になるまで 37°Cで振盪培養を行つた。 この培養に終濃度が 1 mM になるようにイソプロ ピル - ^ チォガラク トシ ドを添加し、 更に 20°Cで 6時間の振盪培養 を行った。 以上の操作によって、 大腸菌において組換えタ ン パク質 (GST - Nl、 GST - TCS1、 GST) の生産を行った。
(6)組換え夕 ンパク質試料の調製
組換えタ ンパク質を生産した大腸菌を遠心分離によつて回 収し、 300 ^ 1の破砕液 (50mM Tris-HCl [ H 8.0]、 ImM EDTA、 5mM ジチオスレィ トール) に懸濁した 。 以降の操作は氷上 あるいは 4°Cで行った。 懸濁液を超音波破砕し、 終濃度が 1 になるように Triton X- 100 を加えて 30分間ィ ンキュベーシ ヨ ンした。 破砕液を遠心分離によって上清と沈殿に分離し、 この上清を組換えタ ンパク質試料と した。
(7)薄層ク ロマ トグラフ ィ ー (TLC) による酵素反応生成物の 検出
lOOmM Tris-HCl [pH 8.0]、 200 M MgCl2 、 200 M テオプ 口 ミ ン (メ チル基受容体) 、 16.8 « M S-アデノ シル- L - [メチ ノレ]メ チォニン [SAM] [2.2GBq/mmQl; Amersham Biosciences] (メチル基供与体) 、 及び 5 1の組換えタ ンパク質試料 (GS T-N1を含む) からなる混合液 25 1を 27°Cで終夜ィ ンキュベ ーショ ンした。 得られた酵素反応液をフィ ルターカップ (ϋ LTRAFREE-MC 10, 000 NMWL; illipore) によって濾過した。
2 1の酵素反応液を 2^ 1のメ タノ ールと混合して、 得られた 混合液を TLCプレー ト (Silicagel 60 F254; erck) に点着し た。
GST- Nlを含む組換えタンパク質試料の代わりに、 GST- TCS1 を含む組換えタ ンパク質試料、 GSTを含む組換えタ ンパク質 試料を用いた点を除いて、 それぞれ上記と同様の操作を行つ た。
酵素反応液の代わりに標品と してカフェイ ン (ImM水溶液) を用いた点を除いて、 上記と同様に標品 2 1とメ タノ ール 2 β 1の混合液を TLCプレー トに点着した。 TLCプレー トに SAMを 含むメ タノ 一ル溶液も点着した。
その後、 展開溶媒と して水/酢酸 /n-プタノ 一ル(2 : l : 4,v/v /v)を用いて 1. 5時間展開を行った。 酵素反応液を展開した部 分に増感剤 (En3 Hance ; Dupont NEN) を噴霧し、 X線フィ ルム ( BioMax MS ; Kodak) を用いてオー ト ラ ジオグラ フィ 一 (マ ィナス 80 °Cで 3日間の露光) を行い、 1 4 Cレーベル化されたメ チル基が付加された酵素反応生成物のスポッ トを検出した。 標品を展開した部分に紫外光を照射して標品のスポッ トを検 出した。 TLCによる解析の結果を図 3 に示す。
図 3から分かるよ うに、 カフエイ ン合成活性を有する対照 タ ンパク質試料と して用いた融合タ ンパク質 GST- TCS1は、 テ ォプロ ミ ンをメチル基受容体と してカフヱイ ンを生成する活 性を示した。 これと同様に、 融合タ ンパク質 GST- N1もテオブ 口 ミ ンをメ チル基受容体と してカフヱイ ンを生成する活性を 示した。 すなわち、 GST-N1は、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメ チル化を触媒する。 これに対し、 タ ンパク質 GSTは その様な活性を示さなかった。 以上の結果から、 コーヒーノ キ由来 Nl cDNAはカフェイ ン合成酵素 (3,7-ジメ チルキサン チンメ チル化酵素) をコー ドしていることが明らかになった。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 下記の様な効果が発揮される。
(1) 工業用、 食品用、 医療用と して利用でき.る力フ イ ン合 成酵素を効率よく生産し、 これを用いて酵素反応によって力 フェイ ンを製造するこ とが可能になる。
(2) メチルキサンチン類を生合成する植物、 植物組織、 植物 細胞のメ チルキサンチン類生合成代謝を改変して、 カ フエイ ンを効率よく生産する ことが可能になる。
(3) メチルキサンチン類を生合成する植物、 植物組織、 植物 細胞のメ チルキサンチン類生合成代謝を改変して、 カフエイ ンの生産を抑制又は停止させるこ と、 及びメチルキサンチン 類の生成比を変化させるこ とが可能になる。 引用文献
U_) Ashihara, H. and Crozier, A. (2001) Caffeine: a wel 1 known but little mentioned compound in plant science. Trends Plant Sci. 6, 407-413
(2) Ogawa, M., Herai, Y., Koizumi, N., usano, T. and Sano, H. (2001) 7-Methy lxanthine methyl transferase of coffee plants. Gene isolation and enzymatic properties. J. Biol. Chem. 276, 8213-8218
Claims
請求の範囲
1 · 下記の塩基配列(a) (b)のいずれかを有する DN
A分子。
(a)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列を有し、 プ リ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメ チル化を触媒する酵素活性 を有するポリべプチ ドであるカフヱイ ン合成酵素をコー ドす る塩基配列、
(b)上記塩基配列(a)に、 該塩基配列(a)がコ― ドするポ リ べ プチ ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、 塩基の置換、 欠失又は挿入を行つて得られた変異塩基配列。
2 . 上記塩基配列(a)及び上記変異塩基配列(b)が ス ト リ ンジユ ン トな条件下でハイブリダィズし得るものであ る請求項 1 に記載の DNA分子。
3 . 上記塩基配列(a)が、 配列表の配列番号 : 2 の塩基配列からなる請求項 1又は 2に記載の DM分子。
4 . 下記の塩基配列(a) (b)のいずれかを有する RN
A分子。
(a)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列を有し、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメ チル化を触媒する酵素活性 を有するポ リべプチ ドであるカフエイ ン合成酵素をコー ドす る塩基配列、
(b)上記塩基配列(a)に、 該塩基配列(a)がコ一 ドするポ リ べ プチ ドが上記酵素活性を維持し得る範囲内で、 塩基の置換、 欠失又は挿入を行つて得られた変異塩基配列。
5 . 上記塩基配列(a)及び上記変異塩基配列(b)が ス ト リ ンジェン トな条件下でハイプリダイズし得るものであ る請求項 4に記載の A分子。
6 . 上記塩基配列(a)が、 配列表の配列番号 : 3 の塩基配列からなる請求項 4又は 5に記載の RNA分子。
7 . 請求項 1〜 3のいずれかに記載の DNA分子の 有する塩基配列の少なく と も一部に相捕的な塩基配列であつ て、 上記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場 合に、 該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る DNA分子。
8 . 請求項 4〜 6のいずれかに記載の RNA分子の 有する塩基配列の少なく と も一部に相補的な塩基配列であつ て、 上記酵素活性を有する植物細胞に導入されて発現した場 合に、 該植物細胞の該酵素活性を阻害し得る RNA分子。
9 . 請求項 1 〜 8のいずれかに記載の DNA分子又 は BNA分子を含むべク夕一。
1 0 . 微生物及び植物の少なく とも一方の細胞内で、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメチル化を触媒する酵素 活性を有するカフ イ ン合成酵素を発現させることができる か、 も し く は該カフ ェイ ン合成酵素の発現を阻害する機能を 有する請求項 9 に記載のベクタ一。
1 1 . 請求項 9又は 1 0 に記載のべクタ—で形質転 換された微生物、 植物体、 植物組織又は植物細胞。
1 2 . 請求項 9又は 1 0 に記載のベクターが、 感染 により導入された微生物、 植物体、 植物組織又は植物細胞。
1 3 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、 植物体、 植物組織又は植物細胞を用いて、 カフェイ ン合成酵素を製造 する方法。
1 4 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、 植物組 織又は植物細胞を培養するか、 植物体を栽培して、 カフ イ ン合成酵素を製造する方法。
1 5 . 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、 植物体、
植物組織又は植物細胞を用いて力フ イ ンを製造する方法。
1 6. 請求項 1 1又は 1 2 に記載の微生物、 植物組 織又は植物細胞を培養するか、 植物体を栽培して、 カ フ イ ンを製造する方法。
1 7. 請求項 1 1又は 1 2に記載の微生物、 植物体、 植物組織又は植物細胞を用いてメチルキサンチン類の組成を 改変する方法。
1 8. 請求項 1 1又は 1 2 に記載の微生物、 植物組 織又は植物細胞を培養するか、 植物体を栽培して、 メ チルキ サンチン類の組成を改変する方法。
1 9. メ チルキサンチン類が、 7 —メ チルキサン ト シン、 7 —メ チルキサンチン、 ハ。ラキサンチン、 テオプロ ミ ン及びカフェイ ンからなる群から選ばれる少なく と も 1つの 化合物である請求項 1 7又は 1 8 に記載の方法。
2 0. 上記形質変換体が、 コー ヒーノキ (Coffea) 属植物、 ツバキ (Camellia) 属植物、 コラノ キ (Cola) 属植 物、 モチノキ (Ilex) 属植物、 ネエア (Neea) 属植物、 ァォ ギリ (Firmiana) 属植物、 ポーリニア (Paullinia ) 属植物 又はカカオノキ (Theobroma ) 属植物である請求項 1 7又は 1 8に記載の方法。
2 1. 下記のア ミ ノ酸配列(a) (b)のいずれかを有す るタ ンパク質からなり、 かつ、 プリ ン環の 1位でのテオプロ ミ ンのメ チル化を触媒する酵素活性を有するカフ ェイ ン合成 酵素。
(a)配列表の配列番号 : 1 に示すア ミ ノ酸配列、
(b)配列表の配列番号 : 1に示すア ミ ノ酸配列に、 上記酵素 活性を損なわない範囲内でのアミ ノ酸の置換、 揷入又は欠失 を行って得られた変異ア ミ ノ酸配列。
2 2 . 上記ア ミ ノ酸配列(a)をコー ドする塩基配列 及び上記変異ァ ミ ノ酸配列(b)をコ— ドする塩基配列がス ト リ ンジェ ン 卜な条件下でハイプリダィズし得る ものである請 求項 2 1 に記載のカフユイ ン合成酵素。
2 3 . 請求項 2 1又は 2 2 に記載のカフヱイ ン合成 酵素と、 テオプロ ミ ンと、 S —アデノ シルメ チォニンとを含 む混合液をイ ンキュベーシ ョ ン して、 カフェイ ンを生成させ る、 カフ ヱイ ンの製造法。
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JP2001037490A (ja) * | 1999-05-26 | 2001-02-13 | Mitsui Chemicals Inc | カフェイン合成系関連酵素をコードする遺伝子及びその用途 |
JP2002112785A (ja) * | 2000-10-06 | 2002-04-16 | Nara Institute Of Science & Technology | コーヒー属植物のテオブロミン合成酵素ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする遺伝子 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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OGAWA M. ET AL.: "7-Methylxanthine methyltransferase of coffee plants", J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 11, 2001, pages 8213 - 8218, XP002215148 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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