JP2002112785A

JP2002112785A - コーヒー属植物のテオブロミン合成酵素ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする遺伝子

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Publication number: JP2002112785A
Application number: JP2000307149A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Sano; 浩佐野; Tomonobu Kusano; 友延草野; Nozomi Koizumi; 望小泉
Original assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC
Current assignee: Nara Institute of Science and Technology NUC
Priority date: 2000-10-06
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2002-04-16
Anticipated expiration: 2020-10-06
Also published as: US20020108143A1; US20040154055A1; AU769898B2; JP3520328B2; AU7729701A; EP1197558A3; CA2363064A1; EP1197558A2; US6734342B2

Abstract

(57)【要約】【課題】カフェインレスコーヒーを得る為に、カフェ
インの生合成に関与する酵素を得る。【解決手段】本発明により、コーヒーアラビカにおけ
るテオブロミン合成酵素のポリペプチド及び当該ポリペ
プチドをコードする遺伝子が与えられた。テオブロミン
合成酵素はカフェインの生合成に関与する酵素であり、
当該酵素の遺伝子発現を抑制した形質転換植物を作製す
ることにより、カフェインレスコーヒーを得ることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、テオブロミン合成
酵素のポリペプチド及び当該酵素をコードする遺伝子に
関する。

【０００２】

【従来の技術】コーヒーは、世界の至るところで愛好さ
れている飲料であり、その有用性は非常に大きい。一
方、コーヒーに含まれているカフェインは、コーヒーを
過剰に摂取した場合に害を及ぼす原因となる物質であ
る。カフェインはキサンチン誘導体の一種であり、キサ
ンチン誘導体にはカフェインの他にテオフィリン、テオ
ブロミンが含まれる。これらキサンチン誘導体は、ホス
ホジエステラーゼを阻害してcAMP量を増加させる事によ
り、中枢興奮作用及び循環機能の亢進作用を有する事が
知られている。キサンチン誘導体が有するこの様な作用
は、適量の摂取では精神の高揚など有用に働くが、上述
した様に過剰量では有害となるために、カフェインレス
コーヒーが世の中で広く求められていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】カフェインレスコーヒ
ーを得るためにカフェインの生合成を人為的に抑制する
目的で、キサンチン誘導体の生合成に関与する遺伝子の
採取が試みられてきた。図１（Advances in Botanical
Research, Vol.30, Academic Press (1999) p149より掲
載）に、コーヒー属植物におけるカフェイン生合成の経
路を示す。図１において、実線の矢印はカフェイン合成
の主要経路を、点線の矢印はカフェイン合成のマイナー
な経路を、それぞれ示す。図１の２段目に示される様
に、キサントシンから７−メチルキサンチン、テオブロ
ミンを経由してカフェインを生成する生合成経路が知ら
れており、この経路はコーヒー属植物におけるカフェイ
ン生合成の主要経路である。このカフェインの主要生合
成経路の後半は３段階のＮ−メチル化反応であり、これ
らのＮ−メチル化反応はＳ−アデノシルメチオニン依存
的な反応である事が知られている。７−メチルキサンチ
ンからパラキサンチンを経由してカフェインを生合成す
る経路（図１の３段目）も存在しているが、この経路の
寄与は大きなものではない。７−メチルキサンチンを合
成する最初のメチル化反応については、当該反応を担う
酵素の遺伝子が採取され、既に報告されている（国際公
開番号 WO 97/35960 ）。しかし、第２段階、第３段階
のメチル化反応に関与する遺伝子は、まだ知られていな
かった。効率的かつ確実に、カフェインの生合成経路を
操作するには、カフェイン生合成に関与する酵素の遺伝
子について、より多くの知見を得る必要がある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らはカ
フェインの生合成において、テオブロミンの生合成を担
っている第２段階のメチル化反応に関与する酵素に注目
し、当該酵素をコードする遺伝子の採取を行った。当該
酵素は７−メチルキサンチンからテオブロミンを生合成
する反応を触媒する酵素であるために、当該酵素の遺伝
子の発現を抑制すると、テオブロミンの生合成が抑制さ
れる。カフェインの生合成経路において、テオブロミン
のＮ−メチル化反応によりカフェインが生成するため
に、テオブロミンの生合成が抑制されると、カフェイン
の生合成もまた抑制される。上述した様に、テオブロミ
ンとカフェインとは共にキサンチン誘導体として類似の
薬理作用を有するために、テオブロミンとカフェインの
両者の生合成を同時に操作できる酵素の遺伝子を採取す
る事には大きな意義がある。即ち、第３段階のメチル化
反応に関与し、カフェインの最終的な生合成に関与する
酵素をコードする遺伝子を採取してその発現を抑制する
と、カフェインの生合成は抑制されるがテオブロミン量
は減少せず、代謝が抑制される為に逆にテオブロミンが
蓄積されると考えられる。よってテオブロミンがカフェ
インと類似の薬理活性を有している事を考えると、テオ
ブロミン合成酵素の遺伝子を採取した本発明の効果は大
きいと考えられる。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明は、配列表の配列番号２に
示す、塩基番号１−１２９８で示される塩基配列からな
ることを特徴とする、コーヒーアラビカ（Coffea arabi
ca）由来のテオブロミン合成酵素遺伝子である。テオブ
ロミン合成酵素は上述したように、コーヒー属植物にお
いて、７−メチルキサンチンを基質としてテオブロミン
を合成する、メチル化反応を触媒する酵素である。配列
表の配列番号２記載の塩基配列で示される遺伝子は、そ
の様なテオブロミン合成酵素をコードする遺伝子であ
る。

【０００６】遺伝子組み換え技術によれば、基本となる
DNA の特定の部位に、当該DNA の基本的な特性を変化さ
せることなく、あるいはその特性を改善する様に、人為
的に変異を起こすことができる。本発明により提供され
る天然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のもの
とは異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に
人為的に挿入、欠失、置換を行う事により、天然の遺伝
子と同等のあるいは改善された特性を有するものとする
ことが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含
むものである。即ち、配列表の配列番号２に示す遺伝子
の一部が欠失、置換若しくは付加された遺伝子とは、配
列番号２に示す塩基配列において１０個以下、好ましく
は７個以下、更に好ましくは３個以下の塩基が欠失、置
換若しくは付加された配列を有する遺伝子である。ま
た、その様な遺伝子は、配列表の配列番号１に示す遺伝
子と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましく
は９９％以上の相同性を有する。また、その様な遺伝子
は、ストリンジェントな条件下で、配列表の配列番号２
に示す遺伝子とハイブリッドを形成する。その様な遺伝
子も、７−メチルキサンチンを基質としてテオブロミン
を生合成する、テオブロミン合成酵素の特徴を有するポ
リペプチドをコードする限り、本発明の範囲内である。

【０００７】更に本発明は、配列表の配列番号１に示
す、アミノ酸番号１−３７８で示されるアミノ酸配列か
らなることを特徴とする、コーヒーアラビカ（Coffea a
rabica）由来のテオブロミン合成酵素のポリペプチドで
ある。配列番号１に示すポリペプチドの一部が欠失、置
換若しくは付加されたポリペプチドとは、配列番号１に
示すアミノ酸配列において１０個以下、好ましくは７個
以下、更に好ましくは３個以下のアミノ酸が欠失、置換
若しくは付加された配列を有するポリペプチドである。
また、その様なポリペプチドは、配列表の配列番号１に
示すポリペプチドと９０％以上、好ましくは９５％以
上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する。その
様なポリペプチドも、７−メチルキサンチンを基質とし
てテオブロミンを合成するというテオブロミン合成酵素
の特徴を有する限り、本発明の範囲内である。尚、配列
表の配列番号３、配列番号５、配列番号７に示すポリペ
プチドは、コーヒーアラビカ（Coffea arabica）から得
られ、配列表の配列番号１のアミノ酸配列と８０％の相
同性を有するポリペプチドである。これら３つのポリペ
プチドは、配列表の配列番号１と高い相同性を有してい
るにも関わらず、テオブロミン合成酵素活性を示さなか
った。

【０００８】配列表の配列番号２記載のテオブロミン合
成酵素遺伝子の発現を抑制し、テオブロミンの生合成量
を低下させた形質転換植物もまた、本発明の範囲内であ
る。。本発明のテオブロミン合成酵素遺伝子は、上述し
た様にコーヒーアラビカのテオブロミン生合成に関与す
る酵素をコードする遺伝子である。よって本発明の遺伝
子の発現を抑制することにより、植物においてテオブロ
ミンの生合成を抑制して、植物においてテオブロミンと
カフェインの含量を低下させることが可能である。本発
明のテオブロミン合成酵素遺伝子の発現を抑制する植物
としては、コーヒーアラビカ（Coffea arabica）、コー
ヒーカネフォーラ（Coffea canephora）、コーヒーリベ
リカ（Coffea liberica ）及びコーヒーデウェブレイ
（Coffea dewevrei ）等のコーヒー属植物が挙げられ
る。

【０００９】それらの植物において、本発明の遺伝子の
発現を抑制する事により、テオブロミンとカフェインの
生合成を抑制することができる。遺伝子の発現を抑制す
る手段として、本発明の遺伝子のアンチセンス遺伝子を
導入する方法を用いることができる。アンチセンス遺伝
子とは、ある遺伝子を構成しているDNA の転写産物であ
るmRNAと、相補的な塩基配列を発現する遺伝子である。
アンチセンス遺伝子の転写産物は、本来のmRNAと相補性
を有するために、アンチセンス遺伝子は翻訳段階で遺伝
子発現を抑制する。この技術を利用することにより、テ
オブロミン合成酵素遺伝子の発現を抑制することが可能
である。

【００１０】その他にも、遺伝子発現抑制の方法がいく
つか知られている。目的遺伝子の遺伝子破壊により、目
的遺伝子の発現を抑制する事ができる。また、植物にお
いては、センス遺伝子を導入して過剰発現しても遺伝子
干渉現象により目的遺伝子の発現が抑制される、という
コサプレッション技術（トランスウィッチ技術）が知ら
れており、その様な方法を用いても目的遺伝子の発現を
抑制することができる。また、二本鎖RNA を用いるDoub
le-stranded RNA interference（RNAi）法が遺伝子発現
の抑制に有効であることが、近年言われてきている（Ch
iou-Fen Chuanget al. PNAS (2000) vol.97,4985-4990
）。二本鎖RNA は配列特異的に遺伝子発現を抑えると
いうことが、線虫やショウジョウバエを中心に明らかに
されてきた。この様な二本鎖RNA を用いる方法がRNAi法
であり、本方法が線虫やショウジョウバエのみならず、
シロイヌナズナ等の植物でも有効であることが最近示さ
れてきている。RNAi法により遺伝子発現が抑制される機
構はまだ知られていないが、本法は上記のアンチセンス
法に比べて効率良く遺伝子発現を抑制することができる
と言われている。

【００１１】ところで、カフェイン、テオブロミン等の
プリンアルカロイドは、昆虫忌避作用があり、それが植
物にとってのプリンアルカロイドの意義であると考えら
れている。そこで、本発明の遺伝子を導入してテオブロ
ミンの生合成を促進させる事により、昆虫忌避活性を有
する植物体を作製することができる。本発明の酵素が、
７−メチルキサンチンを基質としてテオブロミンを生合
成する活性を担っていることを考えると、前述の７−メ
チルキサンチンを合成する酵素の遺伝子（国際公開番号
WO 97/35960 ）と共に本発明の遺伝子を植物に導入す
ることは、特に有効であると思われる。７−メチルキサ
ンチンを合成する酵素の活性が促進されると、本発明の
酵素の基質が増加して、目的産物であるテオブロミンの
蓄積が期待される。

【００１２】形質転換体の作製方法としては、本技術分
野において知られている通常の方法を用いる事ができ
る。本発明において使用可能なベクターはプラスミドベ
クターであり、例えばpBI121等が挙げられるが、それら
に限定されるものではない。そのようなベクターを、例
えばアグロバクテリウム菌に導入して、カルス又は幼植
物に感染させることにより、形質転換植物を作製する事
が可能であり、更に、そのような形質転換植物に由来す
る種子を得る事が可能である。本発明者らは特開2000-2
45485 において、コーヒー属植物の胚発生カルスをアグ
ロバクテリウムツメファシエンスEHA101に感染させるこ
とにより、高い効率で形質転換できる方法を報告してお
り、特開2000-245485 に記載した形質転換方法は特に有
用であると思われる。

【００１３】

【実施例】（PCR による増幅）一対のディジェネレート
・オリゴヌクレオチド（Forward プライマー, GGITGYDS
IDSIGGICCIAAYAC; Reverse プライマー, ARIYKIYYRTRR
AAISWICCIGG ）を、TCS1（Kato et al 2000, GenBank a
ccession no. AB031280 ）と２つのシロイヌナズナの機
能未知のタンパク質（Z99708及びAC008153）の間で保存
された領域に基づいて合成した。これらのオリゴヌクレ
オチドは、GC(A/S)(A/S)GPNTと、PGSF(H/Y)(G/K)(R/N)L
F というアミノ酸配列に、それぞれ相当する。コーヒー
・アラビカ（Coffea arabica）のcDNA及び上記の１組の
プライマーを含む25μl の反応混合液中で、以下の条件
下でPCR を行った。即ち、94℃で１分間反応した後、94
℃で30秒間の変性反応、52℃で30秒間のアニーリング、
72℃で１分間の伸長反応の繰り返しを30サイクル行い、
更に72℃で７分間の最終伸長反応を行うという条件で、
PCR を行った。増幅された約270 塩基対のcDNA断片を用
いて、cDNAライブラリーのスクリーニングに使用した。

【００１４】（cDNAライブラリーの構築および目的cDNA
のスクリーニング）コーヒー（Coffea arabica）の若い
葉から全RNA を抽出し、oligo-dTカラム（Pharmacia ）
によりmRNAに精製した。ZAPII cDNA synthesis kit (St
ratagene）を用いてmRNAからcDNAを合成し、λZAPII ベ
クターへ導入し、ファージライブラリーを作製した。上
記の増幅された断片をプローブにcDNAライブラリーをス
クリーニングした。得られたポジティブプラークをラン
ダムに３５ヶ選択し、プラスミドに変換した後、物理地
図および部分シーケンシングを行ったところ、これらは
４つの独立したクローンに帰属することが明らかとなっ
た。

【００１５】それぞれの代表であり、もっとも全長cDNA
に近いクローン＃１、＃６、＃３５および＃４５につ
き、その塩基配列を決定した。また、その塩基配列のオ
ープンリーディングフレームによりコードされる、推定
アミノ酸配列を決定した。図２に、シークエンシングを
行った遺伝子配列を示す。クローン＃４５について得ら
れたcDNAの塩基配列を、配列表の配列番号２及び図２Ｄ
に示す。当該遺伝子のオープンリーディングフレームは
塩基番号３２−１１６８であり、その領域によりコード
される推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号１に示
す。また、クローン＃１について得られたcDNAの塩基配
列を、配列表の配列番号４及び図２Ａに示す。当該遺伝
子のオープンリーディングフレームは塩基番号１４−１
１７１であり、その領域によりコードされる推定アミノ
酸配列を、配列表の配列番号３に示す。また、クローン
＃６について得られたcDNAの塩基配列を、配列表の配列
番号６及び図２Ｂに示す。当該遺伝子のオープンリーデ
ィングフレームは塩基番号４４−１２０１であり、その
領域によりコードされる推定アミノ酸配列を、配列表の
配列番号５に示す。また、クローン＃３５について得ら
れたcDNAの塩基配列を、配列表の配列番号８及び図２Ｃ
に示す。当該遺伝子のオープンリーディングフレームは
塩基番号４５−１１６３であり、その領域によりコード
される推定アミノ酸配列を、配列表の配列番号７に示
す。以下、クローン＃４５をMXMT1 と、クローン＃１を
MTL1と、クローン＃６をMTL2と、クローン＃３５をMTL3
と、遺伝子をそれぞれ命名した。

【００１６】MXMT1 、MTL1、MTL2、及びMTL3がコードす
るアミノ酸配列のアラインメントを比較した結果を、図
３に示す。その結果、これら４つの配列の相同性が非常
に高い事が示された。これらのポリペプチドの機能を確
認するために、対応するクローンの遺伝子を大腸菌で発
現させて、酵素活性の確認を行った。

【００１７】（GST 融合タンパク質の発現）MTL1（クロ
ーン＃１）、MTL2（クローン＃６）、MTL3（クローン＃
３５）およびMXMT1 （クローン＃４５）のオープンリー
ディングフレームを含む領域をPCR(polymerase chain r
eaction)で増幅し、それらをpGEX 4T-2 ベクター（Phar
macia ）へ適宜クローニングし、大腸菌（JM109 ）を形
質転換した。得られた大腸菌をアンピシリンを含むLB液
体培地で培養後、OD600 が0.5 に達した後、終濃度が1m
M になるようにIPTG（isopropyl thio- β-D-galactosi
de）を加え、さらに16℃で６時間培養した。大腸菌を超
音波破砕し、グルタチオン・セファロース4Bを用いてGS
T （glutathione S-transferase ）融合タンパク質とし
て精製した。タンパク質濃度はBradford法により測定し
た。各GST 融合タンパク質（500 ng）をSDS-PAGE（ドデ
シル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）
で分離した後にCBB （クマシーブリリアンドブルー）染
色をおこない、精製されたことを確認した。得られたGS
T 融合タンパク質につき、SDS-PAGEにより純度を解析し
た結果を図４に示す。図４において、レーン１はMTL2由
来の融合蛋白質を、レーン２はMTL3由来の融合蛋白質
を、レーン３はMXMT1 由来の融合蛋白質をそれぞれ示
す。その結果、得られた３つの融合蛋白質はほぼ純粋で
あることが示された。

【００１８】（薄層クロマトグラフによる酵素活性の測
定）薄層クロマトグラフ（TLC ）により、酵素活性の測
定を行った。加藤ら（Plant Physiol., 1996, 98, 629-
636 ）の方法に基づき、酵素活性の測定を行った。具体
的には 100μl の反応液（100 mM Tris-HCl (pH7.5) 、
200μM の基質（キサンチン、７−メチルキサンチン、
テオブロミン、パラキサンチン、テオフォリン）、 4μ
M ¹⁴C 標識Ｓ−アデノシルメチオニン、 200μM MgCl
₂ 、200 ng GST融合タンパク質）を27℃で2 時間反応
後、1 mlのクロロホルムで抽出し、クロロホルム層を回
収し、スピードバックコンセントレーターでクロロホル
ムをとばした。 5μl の50% メタノールに溶解後、TLC
で展開した（展開溶媒は水：酢酸：n-ブタノール＝2 ：
1 ：4 、v/v/v ）。展開後、画像解析装置（FujiBAS200
0)で放射能シグナルを検出した。キサンチン（X ）、７
−メチルキサンチン（7-Mx）、テオブロミン（Tb）、パ
ラキサンチン（Px）、テオフォリン（Tp）を基質とし
て、MTL2、MTL3及びMXMT1 由来の融合蛋白質の酵素活性
を測定した結果を、図５に示す。図５よりMXMT1 由来の
融合蛋白質は、７−メチルキサンチンを基質としてテオ
ブロミンを合成する強力な活性を有していた。MXMT1 由
来の融合蛋白質は、パラキサンチンを基質としてカフェ
インを合成する活性も有していたが、その相対活性は前
述の活性の15% であった。一方、MTL2及びMTL3由来の融
合蛋白質は、上記の化合物を基質として用いてメチル基
転移活性を示すことはなかった。

【００１９】（高速液体クロマトグラフによる酵素活性
の測定と生産物の同定）高速液体クロマトグラフ（HPL
C）により、MXMT1 の融合蛋白質の酵素活性の測定と、
酵素反応による酵素反応生産物の同定を行った。 100μ
l の反応液（100mM Tris-HCl (pH7.5) 、 200μM の基
質（７−メチルキサンチン、パラキサンチン、テオブロ
ミン）、50μM Ｓ−アデノシルメチオニン、 200μM Mg
Cl₂ 、200ng GST融合タンパク質）を27℃で2 時間イン
キュベート後、1 mlのクロロホルムで抽出し、クロロホ
ルム層を回収し、スピードバックコンセントレーターで
クロロホルムをとばした。50μl の12% アセトニトリル
に溶解後、UV検出系を備えたHPLC（Shodex RSpak DS-61
3 column）で分画した。展開溶媒は12% のアセトニトリ
ルを用い、A₂₅₄でシグナルを検出した。

【００２０】その結果を、図６に示す。図６Ａは、MXMT
1 の融合蛋白質を、Ｓ−アデノシルメチオニンと７−メ
チルキサンチンを基質と反応させ、その反応産物をHPLC
で解析したチャートである。図６Ｂは、標品としてテオ
ブロミンをHPLCで解析したチャートである。図６Ｃは、
ネガティブコントロールとして、MXMT1 の融合蛋白質、
Ｓ−アデノシルメチオニン、７−メチルキサンチンを混
合した後にすぐに反応を止め、その混合液をHPLCで解析
したチャートである。図６Ｄは、標品として、７−メチ
ルキサンチン、テオブロミン、パラキサンチン、カフェ
インをHPLCで解析したチャートである。図６Ｅは、Ｓ−
アデノシルメチオニンと７−メチルキサンチンをMXMT1
の融合蛋白質と反応させた反応液に、テオブロミンを添
加してHPLCで解析したチャートである。図６Ａで検出さ
れた反応生成物のピーク位置は、標品として加えたテオ
ブロミンの位置と一致し、また酵素反応液にテオブロミ
ンを添加しても１つのピークしか検出されなかった事か
ら、MXMT1 の融合蛋白質の酵素反応により、７−メチル
キサンチンを基質としてテオブロミンが生成する事が示
された。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、コーヒーアラビカにおけ
るテオブロミン合成酵素のポリペプチド及び当該ポリペ
プチドをコードする遺伝子が与えられた。テオブロミン
合成酵素はカフェインの生合成に関与する酵素であり、
当該酵素の遺伝子発現を抑制した形質転換植物を作製す
ることにより、カフェインレスコーヒーを得ることがで
きる。

【００２２】

【配列表】＜１１０＞出願人氏名：奈良先端化学技術大学院大学長＜１２０＞発明の名称：コーヒー属植物のテオブロミン合成酵素ポリペプチド及び当該ポリペプチドをコードする遺伝子＜１６０＞配列の数：８＜２１０＞配列番号：１＜２１１＞配列の長さ：３７８＜２１２＞配列の型：アミノ酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 MELQEVLHMN EGEGDTSYAK NASYNLALAK VKPFLEQCIR ELLRANLPNI NKCIKVADLG 60 CASGPNTLLT VRDIVQSIDK VGQEEKNELE RPTIQIFLND LFQNDFNSVF KLLPSFYRKL 120 EKENGRKIGS CLISAMPGSF YGRLFPEESM HFLHSCYSVH WLSQVPSGLV IELGIGANKG 180 SIYSSKGCRP PVQKAYLDQF TKDFTTFLRI HSKELFSRGR MLLTCICKVD EFDEPNPLDL 240 LDMAINDLIV EGLLEEEKLD SFNIPFFTPS AEEVKCIVEE EGSCEILYLE TFKAHYDAAF 300 SIDDDYPVRS HEQIKAEYVA SLIRSVYEPI LASHFGEAIM PDLFHRLAKH AAKVLHMGKG 360 CYNNLIISLA KKPEKSDV 378 ＜２１０＞配列番号：２＜２１１＞配列の長さ：１２９８＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 AGCAGTCGCA ATTCGATTGT CCTGCATATG AATGGAGCTC CAAGAAGTCC TGCATATGAA 60 TGAAGGTGAA GGCGATACAA GCTACGCCAA GAATGCATCC TACAATCTGG CTCTTGCCAA 120 GGTGAAACCT TTCCTTGAAC AATGCATACG AGAATTGTTG CGGGCCAACT TGCCCAACAT 180 CAACAAGTGC ATTAAAGTTG CGGATTTGGG ATGCGCTTCT GGACCAAACA CACTTTTAAC 240 AGTGCGGGAC ATTGTGCAAA GTATTGACAA AGTTGGCCAG GAAGAGAAGA ATGAATTAGA 300 ACGTCCCACC ATTCAGATTT TTCTGAATGA TCTTTTCCAA AATGATTTCA ATTCGGTTTT 360 CAAGTTGCTG CCAAGCTTCT ACCGCAAACT CGAGAAAGAA AATGGACGCA AGATAGGATC 420 GTGCCTAATA AGCGCAATGC CTGGCTCTTT CTACGGCAGA CTCTTCCCCG AGGAGTCCAT 480 GCATTTTTTG CACTCTTGTT ACAGTGTTCA TTGGTTATCT CAGGTTCCCA GCGGTTTGGT 540 GATTGAATTG GGGATTGGTG CAAACAAAGG GAGTATTTAC TCTTCCAAAG GATGTCGTCC 600 GCCCGTCCAG AAGGCATATT TGGATCAATT TACGAAAGAT TTTACCACAT TTCTAAGGAT 660 TCATTCGAAA GAGTTGTTTT CACGTGGCCG AATGCTCCTT ACCTGCATTT GTAAAGTAGA 720 TGAATTCGAC GAACCGAATC CCCTAGACTT ACTTGACATG GCAATAAACG ACTTGATTGT 780 TGAGGGACTT CTGGAGGAAG AAAAATTGGA TAGTTTCAAT ATTCCATTCT TTACACCTTC 840 AGCAGAAGAA GTAAAGTGCA TAGTTGAGGA GGAAGGTTCT TGCGAAATTT TATATCTGGA 900 GACTTTTAAG GCCCATTATG ATGCTGCCTT CTCTATTGAT GATGATTACC CAGTAAGATC 960 CCATGAACAA ATTAAAGCAG AGTATGTGGC ATCATTAATT AGATCAGTTT ACGAACCCAT 1020 CCTCGCAAGT CATTTTGGAG AAGCTATTAT GCCTGACTTA TTCCACAGGC TTGCGAAGCA 1080 TGCAGCAAAG GTTCTCCACA TGGGCAAAGG CTGCTATAAT AATCTTATCA TTTCTCTCGC 1140 CAAAAAGCCA GAGAAGTCAG ACGTGTAAAA GTTTGTTTTT AGTTGGTTTT TGTGCCGTTG 1200 GGGGTCTTTC GGGTATTGTC GTTTTGTATT CGTAATAAAA GTGATGTGCA AGAATAAGAT 1260 ATTTAGTACA ATATTTTCAT AAAAAAAAAA AAAAAAAA 1298 ＜２１０＞配列番号：３＜２１１＞配列の長さ：３８５＜２１２＞配列の型：アミノ酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 MELQEVLHMN GGEGEASYAK NSSFNQLVLA KVKPVLEQCV RELLRANLPN INKCIKVADL 60 GCASGPNTLL TVWDTVQSID KVKQEMKNEL ERPTIQVFLT DLFQNDFNSV FMLLPSFYRK 120 LEKENGRKIG SCLIAAMPGS FHGRLFPEES MHFLHSSYSL QFLSQVPSGL VTELGITANK 180 RSIYSSKASP PPVQKAYLDQ FTKDFTTFLR MRSEELLSRG RMLLTCICKG DECDGPNTMD 240 LLEMAINDLV AEGRLGEEKL DSFNVPIYTA SVEEVKCMVE EEGSFEILYL QTFKLRYDAG 300 FSIDDDCQVR SHSPVYSDEH ARAAHVASLI RSVYEPILAS HFGEAIIPDI FHRFATNAAK 360 VIRLGKGFYN NLIISLAKKP EKSDI 385 ＜２１０＞配列番号：４＜２１１＞配列の長さ：１３６０＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 GTCCTGCATA TGAATGGAGC TCCAAGAAGT CCTGCATATG AATGGAGGCG AAGGCGAAGC 60 AAGCTACGCC AAGAATTCAT CCTTCAATCA ACTGGTTCTC GCCAAGGTGA AACCTGTCCT 120 TGAACAATGC GTACGGGAAT TGTTGCGGGC CAACTTGCCC AACATCAACA AGTGCATTAA 180 AGTTGCAGAT TTGGGATGCG CTTCCGGACC AAACACACTT TTAACCGTTT GGGACACTGT 240 ACAAAGTATT GACAAAGTTA AGCAAGAAAT GAAGAATGAA TTAGAACGTC CCACCATTCA 300 GGTTTTTCTG ACTGATCTTT TCCAAAATGA TTTCAATTCG GTTTTCATGC TGCTGCCAAG 360 CTTCTACCGC AAACTTGAGA AAGAAAATGG ACGCAAAATA GGATCGTGCC TAATAGCCGC 420 AATGCCTGGC TCTTTCCACG GCAGACTCTT CCCCGAGGAG TCCATGCATT TTTTACACTC 480 TTCTTACAGT CTTCAGTTTT TATCCCAGGT TCCCAGCGGT TTGGTGACTG AATTGGGGAT 540 CACTGCGAAC AAAAGGAGCA TTTACTCTTC CAAAGCAAGT CCTCCGCCCG TCCAGAAGGC 600 ATATTTGGAT CAATTTACGA AAGATTTTAC CACATTTTTA AGGATGCGTT CGGAAGAGTT 660 GCTTTCACGT GGCCGAATGC TCCTTACTTG CATTTGTAAA GGAGATGAAT GCGACGGCCC 720 GAATACCATG GACTTACTTG AGATGGCAAT AAACGACTTG GTTGCTGAGG GACGTCTGGG 780 GGAAGAAAAA TTGGACAGTT TCAATGTTCC AATCTATACA GCTTCAGTAG AAGAAGTAAA 840 GTGCATGGTT GAGGAGGAAG GTTCTTTTGA AATTTTATAC TTGCAGACTT TTAAGCTCCG 900 TTATGATGCT GGCTTCTCTA TTGATGATGA TTGCCAAGTA AGATCCCATT CCCCAGTATA 960 CAGCGATGAA CATGCTAGAG CAGCGCATGT GGCATCATTA ATTAGATCAG TTTACGAACC 1020 CATCCTAGCA AGTCATTTTG GAGAAGCTAT TATACCTGAC ATATTCCACA GGTTTGCGAC 1080 GAATGCAGCA AAGGTTATCC GCTTGGGCAA AGGCTTCTAT AATAATCTTA TCATTTCTCT 1140 TGCCAAAAAA CCAGAGAAGT CAGACATATA AAAGCTTGTT TTTAGTTGGT TTTTGTGTTA 1200 TGGGTTGTTT TCTGATACGG GGAAAGGATT CAGTGCGGTT GGGGTTCTAT CCGAGTATTG 1260 TACTTTTTAT ATTATTAGTT GGTGTATAAT TATTATGTTA CATTGTTATA TTCGTAATAA 1320 AAGTGACGTA CAAAAATAAA ATATTTTCAT AAAAAAAAAA 1360 ＜２１０＞配列番号：５＜２１１＞配列の長さ：３８５＜２１２＞配列の型：アミノ酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 MELQEVLHMN GGEGDASYAK NSSFNQLVLA KVKPVLEQCV GELLRANLPN INKCIKVADL 60 GCASGPNTLL TVRDIVQSID KVRQEMKNEL ERPTIQVFLT DLFQNDFNSV FMLLPSFYRK 120 LEKENGRKIG SCLIAAMPGS FHGRLFPEES MHFLHSSYSL QFLSQVPSGL VTELGITANK 180 RSIYSSKASP PPVQKAYLDQ FTKDFTTFLR IRSEELLSRG RMLLTCICKG DEFDGPNTMD 240 LLEMAINDLV VEGHLEEEKL DSFNVPIYAA SVEELKCIVE EEGSFEILYL ETFKLRYDAG 300 FSIDDDCQVR SHSPEYSDEH ARAAHVASLL RSVYEPILAN HFGEAIIPDI FHRFATNAAK 360 VIRLGKGFYN NLIISLAKKP EKSDI 385 ＜２１０＞配列番号：６＜２１１＞配列の長さ：１３０４＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 TTTAGCAGTC CCAATTCGAT TTATGTACAA GTCCTGCATA TGAATGGAGC TCCAAGAAGT 60 CCTGCATATG AATGGAGGCG AAGGCGATGC AAGCTACGCC AAGAATTCAT CCTTCAATCA 120 ACTGGTTCTC GCCAAGGTGA AACCTGTCCT TGAACAATGC GTAGGGGAAT TGTTGCGGGC 180 CAACTTGCCC AACATCAACA AGTGCATTAA AGTTGCGGAT TTGGGATGCG CTTCCGGACC 240 AAACACACTT TTAACAGTTC GGGACATTGT ACAAAGTATT GACAAAGTTA GGCAAGAAAT 300 GAAGAATGAA TTAGAACGTC CCACCATTCA GGTTTTTCTG ACTGATCTTT TCCAAAATGA 360 TTTCAATTCG GTTTTCATGT TGCTGCCAAG TTTCTACCGC AAACTTGAGA AAGAAAATGG 420 ACGCAAGATA GGATCGTGCC TAATAGCCGC AATGCCTGGC TCTTTCCACG GCAGACTCTT 480 CCCCGAGGAG TCAATGCATT TTTTACACTC TTCTTACAGT CTTCAATTTT TATCCCAGGT 540 TCCCAGCGGT TTGGTGACTG AATTGGGGAT CACTGCGAAC AAAAGGAGCA TTTACTCTTC 600 CAAAGCAAGT CCTCCGCCCG TCCAGAAGGC ATATTTGGAT CAATTTACGA AAGATTTTAC 660 CACATTTTTA AGGATTCGTT CGGAAGAGTT GCTTTCACGC GGCCGAATGC TCCTTACTTG 720 CATTTGCAAA GGAGATGAAT TCGACGGCCC GAATACCATG GACTTACTTG AGATGGCAAT 780 AAACGACTTG GTTGTTGAGG GACATCTGGA GGAAGAAAAA TTGGACAGTT TCAATGTTCC 840 AATCTATGCA GCTTCAGTAG AAGAATTAAA GTGCATAGTT GAGGAGGAAG GTTCTTTTGA 900 AATTTTGTAC TTGGAGACTT TTAAGCTCCG TTATGATGCT GGCTTCTCTA TTGATGATGA 960 TTGCCAAGTA AGATCCCATT CCCCAGAATA CAGCGATGAA CATGCTAGAG CAGCGCATGT 1020 GGCATCATTA CTTAGATCAG TTTACGAACC CATCCTCGCA AATCATTTTG GAGAAGCTAT 1080 TATACCTGAC ATATTCCACA GGTTTGCGAC GAATGCAGCA AAGGTTATCC GCTTGGGCAA 1140 AGGCTTCTAT AATAATCTTA TCATTTCTCT TGCCAAAAAA CCAGAGAAGT CAGACATATA 1200 AAAGCTTGTT TATAGTTGGT TTTTGTGCTA TGGTTTGTTT TCTGATACGG GGAAAGGATT 1260 TAGTGCGGTT GGGGTTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 1304 ＜２１０＞配列番号：７＜２１１＞配列の長さ：３７２＜２１２＞配列の型：アミノ酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 MELQEVLRMN GGEGDTSYAK NSAYNQLVLA KVKPVLEQCV RELLRANLPN INKCIKVADL 60 GCASGPNTLL TVRDIVQSID KVGQEKKNEL ERPTIQIFLN DLFPNDFNSV FKLLPSFYRK 120 LEKENGRKIG SCLIGAMPGS FYSRLFPEES MHFLHSCYCL QWLSQVPSGL VTELGISTNK 180 GSIYSSKASR LPVQKAYLDQ FTKDFTTFLR IHSEELFSHG RMLLTCICKG VELDARNAID 240 LLEMAINDLV VEGHLEEEKL DSFNLPVYIP SAEEVKCIVE EEGSFEILYL ETFKVLYDAG 300 FSIDDEHIKA EYVASSVRAV YEPILASHFG EAIIPDIFHR FAKHAAKVLP LGKGFYNNLI 360 ISLAKKPEKS DV 372 ＜２１０＞配列番号：８＜２１１＞配列の長さ：１３１６＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：Caffea arabica ＜４００＞配列 CTTTGGCAGT CCCAATTTGA TTTATGTACA AGTCCTGCAT ATGAATGGAG CTCCAAGAAG 60 TCCTGCGGAT GAATGGAGGC GAAGGCGATA CAAGCTACGC CAAGAATTCA GCCTACAATC 120 AACTGGTTCT CGCCAAGGTG AAACCTGTCC TTGAACAATG CGTACGGGAA TTGTTGCGGG 180 CCAACTTGCC CAACATCAAC AAGTGCATTA AAGTTGCGGA TTTGGGATGC GCTTCTGGAC 240 CAAACACACT TTTAACAGTT CGGGACATTG TCCAAAGTAT TGACAAAGTT GGCCAGGAAA 300 AGAAGAATGA ATTAGAACGT CCCACCATTC AGATTTTTCT GAATGATCTT TTCCCAAATG 360 ATTTCAATTC GGTTTTCAAG TTGCTGCCAA GCTTCTACCG CAAACTTGAG AAAGAAAATG 420 GACGCAAAAT AGGATCGTGC CTAATAGGGG CAATGCCCGG CTCTTTCTAC AGCAGACTCT 480 TCCCCGAGGA GTCCATGCAT TTTTTACACT CTTGTTACTG TCTTCAATGG TTATCTCAGG 540 TTCCTAGCGG TTTGGTGACT GAATTGGGGA TCAGTACGAA CAAAGGGAGC ATTTACTCTT 600 CCAAAGCAAG TCGTCTGCCC GTCCAGAAGG CATATTTGGA TCAATTTACG AAAGATTTTA 660 CCACATTTCT AAGGATTCAT TCGGAAGAGT TGTTTTCACA TGGCCGAATG CTCCTTACTT 720 GCATTTGTAA AGGAGTTGAA TTAGACGCCC GGAATGCCAT AGACTTACTT GAGATGGCAA 780 TAAACGACTT GGTTGTTGAG GGACATCTGG AGGAAGAAAA ATTGGATAGT TTCAATCTTC 840 CAGTCTATAT ACCTTCAGCA GAAGAAGTAA AGTGCATAGT TGAGGAGGAA GGTTCTTTTG 900 AAATTTTATA CCTGGAGACT TTTAAGGTCC TTTACGATGC TGGCTTCTCT ATTGACGATG 960 AACATATTAA AGCAGAGTAT GTTGCATCTT CCGTTAGAGC AGTTTACGAA CCCATCCTCG 1020 CAAGTCATTT TGGAGAAGCT ATTATACCTG ACATATTCCA CAGGTTTGCG AAGCATGCAG 1080 CAAAGGTTCT CCCCTTGGGC AAAGGCTTCT ATAATAATCT TATCATTTCT CTCGCCAAAA 1140 AGCCAGAGAA GTCAGACGTG TAAAAGTTTG TTTTTGTGTT GGGGAAAGGA ATAAGTGCCG 1200 TTGGGGGTCT TTCGGGTATT GTGCTTTTTA TATTATATTG TTTTGTATCC GTAATAAAAG 1260 TGGTGTGTAA GAATAAGATA TTTGACATAT ATTATTTTCA AAAAAAAAAA AAAAAA 1316

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、カフェイン生合成の経路を示す図であ
る。

【図２】図２は、MTL1、MTL2、MTL3及びMXMT1 より得た
cDNAの塩基配列を示す図である。

【図３】図３は、MXMT1 、MTL2及びMTL3より得たアミノ
酸配列のアラインメントを示す図である。

【図４】図４は、MTL2、MTL3及びMXMT1 より得た融合蛋
白質をSDS-PAGEで解析した結果を示す写真である。

【図５】図５は、MTL2、MTL3及びMXMT1 より得た融合蛋
白質の酵素活性を、TLC で解析した結果を示す写真であ
る。

【図６】図６は、MXMT1 より得た融合蛋白質の酵素反応
生成物をHPLCで同定した結果を示すチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 9/00 5/00 ＣＣ１２Ｒ 1:91）Ｃ１２Ｒ 1:91）Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD08 CA14 4B024 AA05 AA08 BA07 BA79 CA04 CA07 CA09 CA20 DA02 DA06 EA04 GA11 GA19 HA03 HA13 HA14 4B050 CC01 CC03 DD13 EE01 FF14E LL02 LL05 4B065 AA26X AA88X AA88Y AB01 AC14 AC20 BA02 BB01 BC03 BD01 BD14 CA27 CA41 CA53

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）に示すアミノ
酸配列からなることを特徴とする、ポリペプチド。（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−３
７８で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、ポリペプチド。（ｂ）７−メチルキサンチンを基質としてテオブロミン
を生合成する活性を有し、（ａ）のアミノ酸の一部が欠
失、置換若しくは付加された、ポリペプチド。
【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードす
る、遺伝子。
【請求項３】以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配
列からなることを特徴とする、遺伝子。（ｃ）配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１２９
８で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
子。（ｄ）７−メチルキサンチンを基質としてテオブロミン
を生合成する活性を有するポリペプチドをコードし、
（ｃ）の塩基配列の一部が欠失、置換若しくは付加され
た、遺伝子。
【請求項４】請求項２又は３記載の遺伝子の発現を抑
制することにより、テオブロミンの生合成量が低下し
た、形質転換植物。
【請求項５】請求項４記載の形質転換植物より採取し
た種子。
【請求項６】請求項２又は３記載の遺伝子を導入する
ことにより、テオブロミンの生合成量が増加した、形質
転換植物。
【請求項７】請求項６記載の形質転換植物より採取し
た種子。
【請求項８】請求項２又３記載の遺伝子の発現を抑制
することにより、テオブロミンの生合成量が低下した形
質転換植物を作製する方法。