KR101612590B1 - 증진된 병충해 저항성을 가지는 카페인 생합성 유전자가 도입된 형질전환 벼 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 커피나무 유래 메틸전이효소를 발현하는 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는 병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법 및 커피나무 유래 메틸전이효소가 도입된 카페인 생합성 형질전환 벼에 관한 것이다. 본 발명은 벼에 내재적으로 존재하지 않는 카페인 생합성 관련 유전자를 삽입함으로써, 박테리아 병원균에 대해 강력한 저항성을 갖는 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.

Description

증진된 병충해 저항성을 가지는 카페인 생합성 유전자가 도입된 형질전환 벼{A caffeine-synthesis transgenic rice having enhanced resistance to the disease and the pest}
본 발명은 커피나무 유래 메틸전이효소를 발현하는 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는 병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법 및 커피나무 유래 메틸전이효소가 도입된 카페인 생합성 형질전환 벼에 관한 것이다.
벼 흰잎 마름병은 산토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae pv . oryzae)에 의해서 발생되는 세균성 도관병으로, 발병시기는 7월 초∼수확기이나 주로 7월 상순∼8월 중순에 발병한다. 중간 기주식물인 줄풀 및 겨풀 등의 땅속줄기 또는 뿌리주위나 병든 볏짚 및 벼 그루터기에서 세균의 월동이 가능하다. 세균이 편모(鞭毛)에 의해 물을 따라 전염하고 벼잎의 물구멍과 공기구멍 부위 및 절단된 뿌리로 침입한다. 병 발생은 해마다 발생이 많은 상습발생지 위주로 발생하나 침관수지역이 아닌 지역에서도 발생이 많다.
보통 출수기 전후에 나타나나 상습발생지나 다발생 발생지에는 본답 초기에 발병하며, 드물게는 묘판에서도 발병된다. 국내에서 최초 발병보고는 1930년 전라남도 해남군에서 처음 발견된 이래 1960년까지 남부 일부 지역에 제한적인 발생을 보이다 이병성 품종인 금남풍의 재배 확대로 전국적인 발생을 나타내었으며, 이후 다수계 품종 재배에 의한 밀양 23호에 의해 피해가 확대되어 재배기간 중 후기에 발생되는 잎에서의 발병 뿐만 아니라 이앙 후 분얼기까지 주 전체가 발생되는 금성형 증상을 보여 벼의 3대 병해의 하나로 간주된다.
벼 흰잎 마름병균은 그람음성세균으로 분류되고 벼의 세균성 위조병을 유발하는 식물병원세균으로 세계적으로 널리 분포하여 벼에 큰 피해를 주지만, 병원균이 벼의 도관 내에서 증식하므로 약제방제 효과는 매우 낮으며, 현재까지 이 병에 특이적인 살균제 또한 없는 실정이다.
한편, 벼 도열병은 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe gresea)에 의하여 유발되는 병으로 전세계적으로 가장 파괴적인 질병 중의 하나이다. 병원균인 마그나포르테 그리세아는 불완전균류에 속하며 분생포자를 형성하는데, 균사 발육 온도는 16~40℃이고 최적 온도는 27~29℃이다. 분생포자의 발아 최적온도는 25~28℃이다. 도열병균은 피해짚의 목 가지 마디에서 균사의 상태로 월동하거나, 잡초에서 월동한 후 다음해 전염원이 된다. 일단 벼 도열병균의 분생자경이 형성되고 분생포자 형성, 분생포자 이탈, 분생포자의 비산, 식물체에의 부착, 발아, 부착기 형성, 침입, 병반형성의 과정을 거친다. 병발생 환경을 살펴보면 온도는 27~29℃와 90%이상의 습도에서 발병이 높다.
이에 대해 질병 저항성(R) 유전자를 사용하는 것이 상기 질병의 통제를 위한 가장 효과적이며 환경친화적인 방식이다. 벼 도열병 저항성은 일반적으로 하기의 2 가지 유형으로 분류된다; 질적 (완전 또는 주요) 및 양적 (부분 또는 QTL) (Bonman 및 Mackill 1988, Oryza 25: 103-110). 현재까지 벼 도열병에 대한 50 개를 초과하는 많은 수의 주요 저항성 유전자가 맵핑되었으며 (Jeung 등 2007, Theor. Appl. Genet. 115:1163-1177), 저항성 유전자에 밀접하게 연관된 DNA 마커가 개발되었다.
마그나포르테 그리세아에 대해 완전 저항성(complete resistance)을 가진 벼 재배종이 최근에 개발되었으나, 많은 경우에 보다 더 강력한 악성 균주의 출현으로 상기 저항성은 해당 계통의 초기 재배 수년 내에 소실된 실정이다(Bonman 및 Mackill 1988, Oryza 25: 103-110).
한편, 동진벼는 내병, 양질, 다수성 신품종육성을 목표로 1975년에 농촌진흥청에서 금남풍과 낙동벼 그리고 사도미노리를 교배하여 개발된 품종으로, 병해 저항성의 경우 줄무늬잎마름병에 강하고, 도열병에는 중간 정도의 저항성을 가지며, 흰잎 마름병과 기타 병충해에는 약한 편이다. 이에, 동진벼의 흰잎 마름병과 도열병에 대한 저항성 연구와 개량된 품종에 대한 육성 전략이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 아직 극복되지 못한 벼 흰잎 마름병 및 도열병에 대한 저항성을 갖는 형질전환 벼를 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 커피나무에서 동정된 3가지의 N-methyltransferase 유전자의 도입을 통해 카페인을 생합성하는 벼를 제조하였으며, 해당 벼가 흰잎 마름병 및 기타 박테리아 병원균에 대한 저항성을 가지는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 커피나무 유래 메틸전이효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는 병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 커피나무 유래 메틸전이효소가 도입된 병 저항성이 증진된 카페인 생합성 형질전환 벼를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 커피나무 유래 메틸전이효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터로 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는 병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서는 야생형 벼에 내재적으로 존재하지 않는 카페인 생합성 관련 유전자인 커피나무 유래 메틸전이효소를 코딩하는 유전자를 삽입함으로써, 해당 유전자를 발현하여 박테리아 병원균에 대해 저항성을 갖춘 형질전환 벼를 제조하였다.
구체적으로는, 본 발명은 야생형 벼에 내재적으로 존재하지 않는 카페인 생합성 관련 유전자인 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1(xanthosine methyltransferase, XMT), CaMXMT1(7-methylxanthosine methyltransferase,MXMT) 및 CaDXMT1(3,7-dimethylxanthine methyltransferase, DXMT)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 벼 잎을 감염시키는 단계 및 감염된 벼 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 제조방법은 상기 캘러스화하여 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계에서 제조한 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화 유도하는 단계를 추가로 포함하는 방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, "벼"는 일반적으로 Oriza sp.에 속하는 벼를 의미할 수 있으며, 특히 자포니카(japonica) 품종인 동진벼(Dong-jin)일 수 있다. 본 발명에서 벼는 카페인 생합성에 관련된 커피나무 유래 메틸전이효소를 도입함으로써, 카페인을 생산할 수 있는 능력이 있는 한, 그 벼가 야생형이든 형질전환체이든 제한이 없이 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 벼 잎은 상기 벼로부터 채취한 것일 수 있으며, 특히 동진벼로부터 채취한 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 동진벼로부터 채취한 벼 잎에 벼 형질전환용 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움을 감염시켜, 캘러스를 제조하였다. 즉, 동진벼를 바탕으로 형질전환하여 형질전환 벼를 제조하였다.
본 발명에서 용어, "커피나무 유래 메틸전이효소"는 커피나무에서 유래한 메틸전이효소 중에서 카페인 생합성에 관련된 N-메틸전이효소(N-methyltransferase)를 의미하고, 이는 CaXMT1(xanthosine methyltransferase, XMT), CaMXMT1(7-methylxanthosine methyltransferase,MXMT), 및 CaDXMT1(3,7-dimethylxanthine methyltransferase, DXMT)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소일 수 있으며, 바람직하게는 2종 이상, 가장 바람직하게는 3종일 수 있다. 특히, 본 발명의 형질전환 벼에는 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1, CaMXMT1, 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자가 모두 도입될 수 있다. 상기 본 발명의 형질전환 벼에 도입되는 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1, CaMXMT1, 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 유전자일 수 있다.
본 발명에서는 커피나무에서 카페인을 생합성하는 경로에 관여하는 N-메틸전이효소를 벼에 도입하여, 카페인을 생합성하는 벼를 제조하고자 하였다. 이를 위하여 커피나무의 생합성 경로에 관여하는 N-메틸전이효소인 CaXMT1(xanthosine methyltransferase, XMT), CaMXMT1(7-methylxanthosine methyltransferase,MXMT), 및 CaDXMT1(3,7-dimethylxanthine methyltransferase, DXMT)를 선택하였다(도 1).
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 커피나무에서 유래한 서열번호 1의 염기서열을 갖는 CaXMT1 유전자, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 CaMXMT1 유전자 및 서열번호 3의 염기서열을 갖는 CaDXMT1 유전자를 벼에 도입하여, 카페인 생합성 형질전환 벼를 제조하였다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 형절전환 벼에서 상기 도입한 커피나무 유래 메틸전이효소 유전자가 발현하는지 여부는 상기 CaXMT1 유전자, CaMXMT1 유전자 및 CaDXMT1 유전자에 대한 RNA 존재여부를 확인하는 역전사 효소 PCR(reverse transcriptase PCR)을 이용하여 확인하였다. 그 결과, 야생형에서는 발현을 확인할 수 없었던 상기 유전자들이 본 발명의 형질전환 벼에서는 발현되고 있는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 형질전환 벼에서 카페인이 생합성 되는지 여부는 HPLC로 분석한 결과 야생형 동진벼에서는 합성되지 않던 카페인이 본 발명의 형질전환 벼에서 합성되는 것을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "아그로박테리움"은 그람양성의 세균으로, 식물의 뿌리나 줄기의 상처를 통해 식물세포에 감염되어, 자신이 가지고 있는 유전자를 식물 세포의 유전체에 삽입하여 식물세포의 형질전환을 일으키는 암종세균의 일종이다. 본 발명에서 상기 아그로박테리움은 바람직하게는 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)일 수 있다.
본 발명에서 용어, "캘러스(callus)"란, 식물에 상처가 났을 때 생기는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 즉, 미분화세포를 의미하며, 특히, 본 발명에서는 식물의 잘린 부위에 아그로박테리움 등 형질전환용 암종세균을 감염시켰을 때 감염된 세포가 미분화상태로 상처부위에 덩어리진 것을 의미한다. 즉, 본 발명에서는 암종세균에 감염되어 형질전환된 세포만이 암종 덩어리를 생성하는 특징을 이용하여 형질전환된 미분화세포를 얻을 수 있는데 이것이 캘러스 형태로 생성되게 된다.
상기 병 저항성이 증진된 형질전환체의 제조방법은, 바람직하게는 수득된 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 캘러스는 상기 설명한대로 미분화된 상태의 세포 덩어리에 불과하기 때문에, 이를 온전한 종자로 수득하기 위해서는 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하는 것이 필요할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 수득된 캘러스를 루트-인덕션 배지에서 배양하여 뿌리 및 성체로 분화하는 것을 유도하였다.
본 발명에서 용어, "병 저항성"은 각종 질병에 대해 발병이 잘 일어나지 않거나, 발병되더라도 병 진행의 속도가 현저히 느리거나, 회복이 되는 능력이 뛰어난 것을 의미한다. 본 발명에서 병 저항성은 각종 곰팡이 및 박테리아 병원균에 의하여 일어나는 병에 대한 저항성일 수 있으며, 특히 흰잎 마름병에 대한 저항성을 의미할 수 있다. 또한, 상기 흰잎 마름병의 원인균인 산토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)에 대한 저항성을 가지는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는 본 발명의 형질전환 벼의 흰잎 마름병에 대한 저항성을 확인하기 위해서, 6주간 생장시킨 벼에 흰잎 마름병의 원인균인 산토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae pv . oryzae, PXO99Az)를 가위 접종법으로 접종한 뒤 2주 후 병증을 측정하였다(도 6). 그 결과, 형질전환 벼는 평균 파괴된 상처 길이가 천연형 동진벼의 34.4 %에 불과하여, 흰잎 마름병에 대한 강력한 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다(도 6).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 커피나무 유래 메틸전이효소가 도입된 병 저항성이 증진된 카페인 생합성 형질전환 벼를 제공한다. 특히, 본 발명의 형질전환 벼는 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 도입된 병 저항성이 증진된 카페인 생합성 형질전환 벼일 수 있으며, 바람직하게는 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자가 모두 도입된 형질전환 벼일 수 있다.
본 발명에서 벼, 커피나무 유래 메틸전이효소, 병 저항성 및 형질전환은 상기 설명된 바와 동일하다.
본 발명은 벼에 내재적으로 존재하지 않는 카페인 생합성 관련 유전자를 삽입함으로써, 박테리아 병원균에 대해 강력한 저항성을 갖는 형질전환 벼에 대한 것으로, 본 발명의 형질전환 벼를 이용하면 병 저항성을 통해 농약사용 절감, 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하게 되어 널리 이용될 수 있다.
도 1은 커피나무의 카페인 생합성 경로와 본 발명에서 사용한 3가지 N-methyltransferase 유전자를 나타낸 도이다.
도 2는 형질전환 벼 제조를 위한 벡터(pBIN-NM777)에 도입을 위해 삽입된 카페인 합성 관련 메틸전이효소 (CaXMT1: xanthosine methyltransferase, CaMXMT1: 7-methylxanthine methyltransferase, CaDXMT1: 3,7-dimethylxanthine methyltransferase)를 코딩하는 유전자가 삽입된 구조를 나타낸 도이다. 구체적으로, 도에서 사용된 약자의 의미는 다음과 같다 : LB, left border; RB, right border; p, promoter; t, terminator; NOS, nopaline synthase; 35S, CaMV 35S RNA; NPT II, neomycin phosphotransferase; HPT, hygromycin phosphotransferase.
도 3은 야생형 동진벼와 본 발명의 카페인 생합성 형질전환 벼의 표현형을 관찰한 사진이다.
도 4는 제조된 형질전환 벼에서 도입한 3가지 N-methyltransferase 유전자의 발현을 역전사 효소 PCR로 측정한 결과이다.
도 5는 야생형 동진벼와 본 발명의 카페인 생합성 형질전환 벼에서의 카페인 합성량을 HPLC로 측정한 결과이다.
도 6은 야생형 동진벼와 본 발명의 카페인 생합성 형질전환 벼에 대하여 흰잎마름병 균의 저항성을 확인 결과이다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 카페인 생합성 관련 N- 메틸전이효소 유전자
본 발명자들은 야생형 벼가 가지지 않는 커피나무의 카페인 생합성 경로에 관여하는 효소들로 3개의 N-메틸전이효소(N-methyl transferase)를 카페인 생합성 형질전환 벼를 제조하는데 선택하였다. 이에 커피나무 유래의 3개 N-메틸전이효소인 CaXMT1(xanthosine methyltransferase, XMT), CaMXMT1(7-methylxanthosine methyltransferase,MXMT), CaDXMT1(3,7-dimethylxanthine methyltransferase, DXMT)를 이용하였다(도 1).
상기 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1는 Hiroshino Sano 교수로부터 벡터(Hirotaka et al., Plant Molecular Biology, 59:221-227, 2005)를 받아 이용하였다. 구체적인 벡터는 하기 실시예 2와 같이 제조되었다.
실시예 2 : 벼 형질전환용 재조합 벡터 제조
커피나무 유래 카페인 생합성 관련 유전자를 벼에 삽입하기 위한 벡터 pBIN-NMT777을 제조하였다.
구체적으로는 기존의 벡터 pBIN에 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자를 삽입하였으며, 각각의 유전자 별로 발현을 위한 35s 프로모터를 5'에 결합시켜 도입하였다. 구체적으로는 5'에서 3'의 순서로 35s 프로모터-CaDXMT1 코딩 유전자 -> 35s 프로모터-CaMXMT1 코딩 유전자 -> 35s 프로모터-CaXMT1 코딩 유전자가 되도록 벡터에 삽입하였으며, 이를 통해 카페인 생합성 벼 생산을 위한 벼 형질전환용 벡터 pBIN-NMT777를 제조하였다(도 2). 또한, 형질전환 식물체 선별을 위하여 항생제 하이그로마이신과 네오마이신 저항성 유전자를 이용하였다.
상기 제조한 pBIN-NMT777벡터는 서열번호 10의 염기서열을 가진다.
실시예 3 : 형질전환 벼 제조
상기 수득한 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1 발현용 벡터를 전기충격 방법(electroporation)을 이용하여 아그로박테리움 투메파키엔스(Agrobacterium tumefaciens)에 도입하였다. 형질전환 벼를 제조하기 위하여 야생형 동진벼 종자를 사용하여 종자의 소독은 50% chlorox로 1시간 가량 소독한 후 멸균수로 10~15회 세척하였다. 소독된 종자는 N6D medium(4g/l-1 N6 powder (Duchefa,Netherland), 30g/l-1 Sucrose, 2.878g/l-1 L-proline, 0.3g/l-1 Casamino acid, 0.1g/l-1 Myo-inositol, 1mL 2,4D (2mg/mL), 4g/l-1 Gelrite, pH5.8)에 치상하여 32℃를 유지하는 배양기에 암 조건으로 5일간 캘러스를 유도하였다.
유도된 캘러스는 상기 유전자가 형질도입된 아그로박테리아(LBA4404)를 접종하여 형질전환된 캘러스를 만들었다. 형질전환된 캘러스는 2N6-AS(4g/l-1 N6 powder(Duchefa,Netherland), 30g/l-1 Sucrose, 2.878g/l-1, 10g/l-1 D-glucose, 1mL 2,4D (2mg/mL), 4g/l-1 Gelrite, 100mM Acetosyringone, pH5.2) 치상하여 28℃ 1일/23.5℃ 4일 동안 암조건에서 배양하였다. 저항성 캘러스 선별을 위해 Hygromycin 항생제가 첨가된 사용한 N6D medium에 캘러스를 치상하여 빛 조건 28℃ 2주간 배양하였다. 선별된 캘러스를 REIII-CP medium (4.41g/l-1 MS vitamin powder, 30g/l-1 Sucrose, 30g/l-1 Sorbitol, 2g/l-1 Casamino acid, 0.02mL NAA (1mg/mL), 1mL Kinetine (2mg/mL), 0.1g/l-1 Myo-inositol, 4g/l-1 Gelrite, pH5.8)에 계대하여 빛 조건 28℃ 2주 재분화 과정을 실시하였다. 재분화된 개체를 MS(Murashige and Skoog) medium으로 옮겨 28℃ 7일 동안 빛 조건에서 재분화를 실시 하였다. 순화과정을 위해 water, 28℃ 빛 조건에서 5일동안 순화과정을 거쳐 식물체를 토양으로 옮겨 식물체를 제조하였다.
상기 제조한 형질전환 벼를 생장시켜 벼의 표현형을 관찰한 결과, 야생형 동진벼와 큰 차이를 보이지 않고 온전히 생장할 수 있음을 확인하였다(도 3).
실시예 4. 형질전환 벼의 N- 메틸전이효소 발현 검증
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 동진벼에서 커피나무 유래의 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1 효소가 발현되는지 여부를 역전사 효소 PCR(RT-PCR, reverse transcriptase-PCR)로 확인하였다.
구체적으로는, 형질전환 벼인 #1 실험체 및 #2 실험체의 잎 0.1g에서 total RNA를 추출하였다. 이를 주형으로 하여 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1 효소의 발현을 확인할 수 있는 RNA 역전사용 프라이머와 역전사 효소(reverse transcriptase DNA polymerase)를 이용하여 역전사 효소 PCR을 행하였다. 해당 실험에서 사용한 RNA 역전사용 프라이머는 하기 표 1과 같다.
CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1 발현 확인을 위한 RT-PCR용 프라이머 서열
유전자 프라이머 종류 서열
CaXMT1 CaXMT1_rt_primer_forward
(서열번호 4)		 5`-ATCAACTGGTTCTCGCCAAG-3`
CaXMT1_rt_primer_reverse
(서열번호 5)		 5`-CTGCTCTAACGGAAGATGCA-3`
CaMXMT1 CaMXMT1_rt_primer_forward
(서열번호 6)		 5`-TCCTACAATCTGGCTCTTGC-3`
CaMXMT1_rt_primer_reverse
(서열번호 7)		 5`-TGCTTTAATTTGTTCATGGGATC-3`
CaDXMT1 CaDXMT1_rt_primer_forward
(서열번호 8)		 5`-TCATTCTACAATCTGTTTCTCATCAG-3`
CaDXMT1_rt_primer_reverse
(서열번호 9)		 5`-TATGGAATTCGGGTTCTCGA-3`
도 4에서 확인할 수 있듯이, 야생형의 동진벼에서는 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1이 전혀 발현되지 않는데에 비하여 본 발명의 형질전환 벼에서는 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 형질전환 벼의 카페인 합성 검정
상기 실시예 3에서 제조한 형질전환 동진벼에서 도입한 커피나무의 카페인 생합성 경로에 작용하는 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1 유전자가 발현하는 것은 상기 실시예 4에서 확인하였으나, 벼의 식물체 내에서도 문제없이 카페인이 합성되는지 여부를 HPLC로 확인하였다.
구체적으로는, 대조군으로의 야생형 동진벼와 본 발명의 카페인 생합성 형질전환 벼를 각각 생장시켜 6주차에 잎을 채취하였다. 채취한 벼잎 0.15 g을 액체 질소를 사용하여 마쇄한 뒤, 70% 메탄올 1mL을 첨가하여 60 ℃에서 1시간 온도 유지하여 성분을 추출하였다. 이후, 원심분리를 통하여 상등액을 채취하여 HPLC sample을 제작하여, HPLC를 진행하였다.
한편, HPLC를 진행한 조건은 하기 표 2와 같다.
HPLC 진행조건
·시간에 따른 농도구배 0~4 분 : B to 2%/
4~21 분 : B 2 to 9%/
21~32 분 B 9 to 23 %,
32~45 분 B to 23%
·Post-run 시간 10 분
·유속 0.8 ml/분
·샘플량 20 ㎕
·용매 조성 A 용매- 0.05% Trichloroacetic acid
B 용매- Acetronitrile
·컬럼 Agilent Eclipse XDB-C18 5um
·측정 UV 210 nm
상기 카페인 합성량 검정 결과, 야생형 동진벼에서는 카페인이 전혀 측정되지 않았으며, 본 발명의 카페인 생합성 형질전환 벼에서 카페인이 과량 합성되는 것을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 5. 형질전환 벼의 병 저항성 검정
상기 실시예 3에서 제조된 형질전환 벼가 흰잎 마름병에 대해 저항성을 보이는지 확인하기 위해, 대조군으로 천연형 동진벼 및 형질전환 벼를 6주간 키웠다. 28℃ 배양기에서 3∼4일 키운 흰잎마름병을 유발하는 균주인 Xanthomonas oryzae pv. oryzae(strain : PXO99Az) 물 10ml에 CFU 109 양을 희석시켜 가위를 그 균주를 희석시킨 물에 담궈 접종하는 가위 접종법을 사용하여 접종한 뒤 2주 후 병증을 측정하였다(도 6).
병증 측정은 접종한 부위로부터 감염되어 파괴된 상처 길이(Lesion Lengths)를 측정하였으며, 천연형 동진벼 및 형질전환 벼의 측정값을 비교하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, 평균 파괴된 상처 길이를 측정한 결과 천연형 동진벼는 평균 16 cm에 달하는데 반하여, 형질전환 벼는 평균 5.5 cm로 병증이 약 34.4 %에 불과하여, 흰잎 마름병에 대한 강력한 저항성을 가짐을 확인할 수 있었다.
이와 같은 결과를 통하여, 벼에 커피나무 유래의 3 종류의 N-메틸전이 효소를 도입시킴으로써, 카페인을 생합성하는 형질전환 벼를 제조하였으며, 해당 형질전환 벼가 흰잎 마름병을 포함하는 박테리아 병원균에 대한 저항성을 가질 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> A caffeine-synthesis transgenic rice having enhanced resistance to the disease and the pest <130> PA130757KR <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1316 <212> DNA <213> CaXMT- Xanthosine methyltransferase(XMT) <400> 1 cacgaggctt tggcagtccc aattcgattt atgtgcaagt cctgcatatg aatggagctc 60 caagaagtcc tgcggatgaa tggaggcgaa ggcgatacaa gctacgccaa gaattcagcc 120 tacaatcaac tggttctcgc caaggtgaaa cctgtccttg aacaatgcgt acgggaattg 180 ttgcgggcca acttgcccaa catcaacaag tgcattaaag ttgcggattt gggatgcgct 240 tctggaccaa acacactttt aacggttcgg gacattgtcc aaagtattga caaagttggc 300 caggaaaaga agaatgaatt agaacgtccc accattcaga tttttctgaa tgatcttttc 360 ccaaatgatt tcaattcggt tttcaagttg ctgccaagct tctaccgcaa acttgagaaa 420 gaaaatggac gcaaaatagg atcgtgccta ataggggcaa tgcccggctc tttctacagc 480 agactcttcc ccgaggagtc catgcatttt ttacactctt gttactgtct tcaatggtta 540 tctcaggttc ctagcggttt ggtgactgaa ttggggatcg gcacgaacaa agggagcatt 600 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tgaaggtgaa ggcgatacaa gctacgccaa gaatgcatcc tacaatctgg ctcttgccaa 120 ggtgaaacct ttccttgaac aatgcatacg agaattgttg cgggccaact tgcccaacat 180 caacaagtgc attaaagttg cggatttggg atgcgcttct ggaccaaaca cacttttaac 240 agtgcgggac attgtgcaaa gtattgacaa agttggccag gaagagaaga atgaattaga 300 acgtcccacc attcagattt ttctgaatga tcttttccaa aatgatttca attcggtttt 360 caagttgctg ccaagcttct accgcaaact cgagaaagaa aatggacgca agataggatc 420 gtgcctaata agcgcaatgc ctggctcttt ctacggcaga ctcttccccg aggagtccat 480 gcattttttg cactcttgtt acagtgttca ttggttatct caggttccca gcggtttggt 540 gattgaattg gggattggtg caaacaaagg gagtatttac tcttccaaag gatgtcgtcc 600 gcccgtccag aaggcatatt tggatcaatt tacgaaagat tttaccacat ttctaaggat 660 tcattcgaaa gagttgtttt cacgtggccg aatgctcctt acctgcattt gtaaagtaga 720 tgaattcgac gaaccgaatc ccctagactt acttgacatg gcaataaacg acttgattgt 780 tgagggactt ctggaggaag aaaaattgga tagtttcaat attccattct ttacaccttc 840 agcagaagaa gtaaagtgca tagttgagga ggaaggttct tgcgaaattt tatatctgga 900 gacttttaag 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aactttgtgt agaccaagtt caccgtaaat cagatggtag taacctttaa 1260 ttggaagtta ggtcacacaa ctccaataca gttaagataa ttctttcaag ttagaaatat 1320 agggggattt aatttgtcat ctatcttttt ttccccccca ttttggttaa aaaggtattg 1380 gaaaaaataa taatatgaac taaaagcaca agtaataata atatattcat attgaaatta 1440 aggaaaaaaa ctgttcgttt ttttttccta gagttgacgt tttagcaaat tggctgattt 1500 ccaagtcttg tacgtccagt aattcgaatt gacttgctga ttggcatatg tatgtataca 1560 ggggcatctg gaggaagaaa aattggacag tttcaatgtt ccagtctatg cagcttcagc 1620 agaagaagta aagcgcatag ttgaggagga aggttctttt gaaattttat acctggagac 1680 ttttaaggcc ccttatgatg ctggcttctc tattgatgat gattaccaag gaagatccca 1740 ttccccagta tcctgcgatg aacatgctag agcagcgcat gtggcatctg tcgttagatc 1800 agtttacgaa cccatcctcg caggtcattt tggagaagct attttacctg acttatccca 1860 caggattgag aagaatgcag caaaggttct ccgctcgggc aaaggcttct atgatagtct 1920 tatcatttct ctcgccaaaa agccagagaa gtcagacgtg taa 1963 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CaXMT1_rt_primer_forward <400> 4 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tcatggtgga aaatggccgc 1080 ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg 1140 ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 1200 ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag 1260 ttcttctgag cgggactctg gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat 1320 cacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc 1380 gggacgccgg ctggatgatc ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacg 1440 ggatctctgc ggaacaggcg gtcgaaggtg ccgatatcat tacgacagca acggccgaca 1500 agcacaacgc cacgatcctg agcgacaata tgatcgggcc cggcgtccac atcaacggcg 1560 tcggcggcga ctgcccaggc aagaccgaga tgcaccgcga tatcttgctg cgttcggata 1620 ttttcgtgga gttcccgcca cagacccgga tgatccccga tcgttcaaac atttggcaat 1680 aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 1740 tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 1800 tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 1860 gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgggcctcct 1920 gtcaatgctg gcggcggctc tggtggtggt tctggtggcg gctctgaggg tggtggctct 1980 gagggtggcg gttctgaggg tggcggctct gagggaggcg gttccggtgg tggctctggt 2040 tccggtgatt ttgattatga aaagatggca aacgctaata agggggctat gaccgaaaat 2100 gccgatgaaa acgcgctaca gtctgacgct aaaggcaaac ttgattctgt cgctactgat 2160 tacggtgctg ctatcgatgg tttcattggt gacgtttccg gccttgctaa tggtaatggt 2220 gctactggtg attttgctgg ctctaattcc caaatggctc aagtcggtga cggtgataat 2280 tcacctttaa tgaataattt ccgtcaatat ttaccttccc tccctcaatc ggttgaatgt 2340 cgcccttttg tctttggccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat 2400 taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 2460 aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 2520 atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat 2580 tacgccaagc ttgcatgcct gcaggtcccc agattagcct tttcaatttc agaaagaatg 2640 ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg cagcaggtct catcaagacg atctacccga 2700 gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc ccaagaaggt 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atccttgaac aatgcataca 3600 agaattgttg cgggccaact tgcccaacat caacaagtgc attaaagttg cggatttggg 3660 atgcgcttct ggaccaaaca cacttttaac agttcgggac attgtacaaa gtattgacaa 3720 agttggccag gaaaagaaga atgaattaga acgtcccacc attcagattt ttctgaatga 3780 tcttttccaa aatgatttca attcggtttt caagtcgctg ccaagcttct accgcaaact 3840 tgagaaagaa aatggacgca aaataggatc atgcctgata ggcgcaatgc ctggctcttt 3900 ctacggcaga ctcttccccg aggagtccat gcatttttta cactcttgtt actgtttgca 3960 ttggttatct caggttccca gcggtttggt gactgaattg gggatcagtg cgaacaaagg 4020 gtgcatttac tcttccaaag caagtcgtcc gcccatccag aaggcatatt tggatcaatt 4080 tacgaaagat tttaccacat ttcttaggat tcattcggaa gagttgattt cacgtggccg 4140 aatgctcctt acttggattt gcaaagaaga tgaattcgag aacccgaatt ccatagactt 4200 acttgagatg tcaataaacg acttggttat tgagggacat ctggaggaag aaaaattgga 4260 cagtttcaat gttccaatct atgcaccttc aacagaagaa gtaaagtgca tagttgagga 4320 ggaaggttct tttgaaattt tatacctgga gacttttaag gtcccttatg atgctggctt 4380 ctctattgat gatgattacc aaggaagatc ccattcccca gtatcctgcg atgaacatgc 4440 tagagcagcg catgtggcat ctgtcgttag atcaattttc gaacccatcg tcgcaagtca 4500 ttttggagaa gctatcatgc ctgacttatc ccacaggatt gcgaagaatg cagcaaaggt 4560 tcttcgctcc ggcaaaggct tctatgatag tcttatcatt tctctcgcca aaaagccaga 4620 gaagtcagac gtgtaaatca acaactctcc tggcgcacca tcgtcggcta cagcctcggg 4680 aattgctacc gagctcgaat ttccccgatc gttcaaacat ttggcaataa agtttcttaa 4740 gattgaatcc tgttgccggt cttgcgatga ttatcatata atttctgttg aattacgtta 4800 agcatgtaat aattaacatg taatgcatga cgttatttat gagatgggtt tttatgatta 4860 gagtcccgca attatacatt taatacgcga tagaaaacaa aatatagcgc gcaaactagg 4920 ataaattatc gcgcgcggtg tcatctatgt tactagatca agcttgcatg cctgcaggtc 4980 cccagattag ccttttcaat ttcagaaaga atgctaaccc acagatggtt agagaggctt 5040 acgcagcagg tctcatcaag acgatctacc cgagcaataa tctccaggaa atcaaatacc 5100 ttcccaagaa ggttaaagat gcagtcaaaa gattcaggac taactgcatc aagaacacag 5160 agaaagatat atttctcaag atcagaagta ctattccagt atggacgatt caaggcttgc 5220 ttcacaaacc aaggcaagta atagagattg gagtctctaa aaaggtagtt cccactgaat 5280 caaaggccat ggagtcaaag attcaaatag aggacctaac agaactcgcc gtaaagactg 5340 gcgaacagtt catacagagt ctcttacgac tcaatgacaa gaagaaaatc ttcgtcaaca 5400 tggtggagca cgacacactt gtctactcca aaaatatcaa agatacagtc tcagaagacc 5460 aaagggcaat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg aaacctcctc ggattccatt 5520 gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa ggaaggtggc tcctacaaat 5580 gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc ctctgccgac agtggtccca 5640 aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 5700 caaagcaagt ggattgatgt gatatctcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact 5760 atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag agaacacggg 5820 ggactctaga ggatccccgg gtggtcagtc ccttatggag ctccaagaag tcctgcatat 5880 gaatgaaggt gaaggcgata caagctacgc caagaatgca tcctacaatc tggctcttgc 5940 caaggtgaaa cctttccttg aacaatgcat acgagaattg ttgcgggcca acttgcccaa 6000 catcaacaag tgcattaaag ttgcggattt gggatgcgct tctggaccaa acacactttt 6060 aacagtgcgg gacattgtgc aaagtattga caaagttggc caggaagaga agaatgaatt 6120 agaacgtccc accattcaga tttttctgaa tgatcttttc caaaatgatt tcaattcggt 6180 tttcaagttg ctgccaagct tctaccgcaa actcgagaaa gaaaatggac gcaagatagg 6240 atcgtgccta ataagcgcaa tgcctggctc tttctacggc agactcttcc ccgaggagtc 6300 catgcatttt ttgcactctt gttacagtgt tcattggtta tctcaggttc ccagcggttt 6360 ggtgattgaa ttggggattg gtgcaaacaa agggagtatt tactcttcca aaggatgtcg 6420 tccgcccgtc cagaaggcat atttggatca atttacgaaa gattttacca catttctaag 6480 gattcattcg aaagagttgt tttcacgtgg ccgaatgctc cttacctgca tttgtaaagt 6540 agatgaattc gacgaaccga atcccctaga cttacttgac atggcaataa acgacttgat 6600 tgttgaggga cttctggagg aagaaaaatt ggatagtttc aatattccat tctttacacc 6660 ttcagcagaa gaagtaaagt gcatagttga ggaggaaggt tcttgcgaaa ttttatatct 6720 ggagactttt aaggcccatt atgatgctgc cttctctatt gatgatgatt acccagtaag 6780 atcccatgaa caaattaaag cagagtatgt ggcatcatta attagatcag tttacgaacc 6840 catcctcgca agtcattttg gagaagctat tatgcctgac ttattccaca ggcttgcgaa 6900 gcatgcagca aaggttctcc acatgggcaa aggctgctat aataatctta tcatttctct 6960 cgccaaaaag ccagagaagt cagacgtgta aatcaacaac tctcctggcg caccatcgtc 7020 ggctacagcc tcgggaattg ctaccgagct cgaatttccc cgatcgttca aacatttggc 7080 aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 7140 tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 7200 gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 7260 agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gatcaagctt 7320 gcatgcctgc aggtccccag attagccttt tcaatttcag aaagaatgct aacccacaga 7380 tggttagaga ggcttacgca gcaggtctca tcaagacgat ctacccgagc aataatctcc 7440 aggaaatcaa ataccttccc aagaaggtta aagatgcagt caaaagattc aggactaact 7500 gcatcaagaa cacagagaaa gatatatttc tcaagatcag aagtactatt ccagtatgga 7560 cgattcaagg cttgcttcac aaaccaaggc aagtaataga gattggagtc tctaaaaagg 7620 tagttcccac tgaatcaaag gccatggagt caaagattca aatagaggac ctaacagaac 7680 tcgccgtaaa gactggcgaa cagttcatac agagtctctt acgactcaat gacaagaaga 7740 aaatcttcgt caacatggtg gagcacgaca cacttgtcta ctccaaaaat atcaaagata 7800 cagtctcaga agaccaaagg gcaattgaga cttttcaaca aagggtaata tccggaaacc 7860 tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc actttattgt gaagatagtg gaaaaggaag 7920 gtggctccta caaatgccat cattgcgata aaggaaaggc catcgttgaa gatgcctctg 7980 ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg 8040 ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg 8100 acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt 8160 tggagagaac acgggggact ctagaggatc cccgggtggt cagtccctta tggagctcca 8220 agaagtcctg cggatgaatg gaggcgaagg cgatacaagc tacgccaaga attcagccta 8280 caatcaactg gttctcgcca aggtgaaacc tgtccttgaa caatgcgtac gggaattgtt 8340 gcgggccaac ttgcccaaca tcaacaagtg cattaaagtt gcggatttgg gatgcgcttc 8400 tggaccaaac acacttttaa cagttcggga cattgtccaa agtattgaca aagttggcca 8460 ggaaaagaag aatgaattag aacgtcccac cattcagatt tttctgaatg atcttttccc 8520 aaatgatttc aattcggttt tcaagttgct gccaagcttc taccgcaaac ttgagaaaga 8580 aaatggacgc aaaataggat cgtgcctaat aggggcaatg cccggctctt tctacagcag 8640 actcttcccc gaggagtcca tgcatttttt acactcttgt tactgtcttc aatggttatc 8700 tcaggttcct agcggtttgg tgactgaatt ggggatcagt acgaacaaag ggagcattta 8760 ctcttccaaa gcaagtcgtc tgcccgtcca gaaggcatat ttggatcaat ttacgaaaga 8820 ttttaccaca tttctaagga ttcattcgga agagttgttt tcacatggcc gaatgctcct 8880 tacttgcatt tgtaaaggag ttgaattaga cgcccggaat gccatagact tacttgagat 8940 ggcaataaac gacttggttg ttgagggaca tctggaggaa gaaaaattgg atagtttcaa 9000 tcttccagtc tatatacctt cagcagaaga agtaaagtgc atagttgagg aggaaggttc 9060 ttttgaaatt ttatacctgg agacttttaa ggtcctttac gatgctggct tctctattga 9120 cgatgaacat attaaagcag agtatgttgc atcttccgtt agagcagttt acgaacccat 9180 cctcgcaagt cattttggag aagctattat acctgacata ttccacaggt ttgcgaagca 9240 tgcagcaaag gttctcccct tgggcaaagg cttctataat aatcttatca tttctctcgc 9300 caaaaagcca gagaagtcag acgtgtaaat caacaactct cctggcgcac catcgtcggc 9360 tacagcctcg ggaattgcta ccgagctcga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat 9420 aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 9480 tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 9540 tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 9600 gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat caattagctt 9660 ctaggacgcg tcgacgcgtc gacgcgtcga cgcgtcgacg cgtcctagag atccgtcaac 9720 atggtggagc acgacactct cgtctactcc aagaatatca aagatacagt ctcagaagac 9780 caaagggcta ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatcgg gaaacctcct cggattccat 9840 tgcccagcta tctgtcactt catcaaaagg acagtagaaa aggaaggtgg cacctacaaa 9900 tgccatcatt gcgataaagg aaaggctatc gttcaagatg cctctgccga cagtggtccc 9960 aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct 10020 tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac 10080 tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gaggacgacc 10140 ccgatatgaa aaagcctgaa ctcaccgcga cgtctgtcga gaagtttctg atcgaaaagt 10200 tcgacagcgt ctccgacctg atgcagctct cggagggcga agaatctcgt gctttcagct 10260 tcgatgtagg agggcgtgga tatgtcctgc gggtaaatag ctgcgccgat ggtttctaca 10320 aagatcgtta tgtttatcgg cactttgcat cggccgcgct cccgattccg gaagtgcttg 10380 acattgggga attcagcgag agcctgacct attgcatctc ccgccgtgca cagggtgtca 10440 cgttgcaaga cctgcctgaa accgaactgc ccgctgttct gcagccggtc gcggaggcca 10500 tggatgcgat cgctgcggcc gatcttagcc agacgagcgg gttcggccca ttcggaccgc 10560 aaggaatcgg tcaatacact acatggcgtg atttcatatg cgcgattgct gatccccatg 10620 tgtatcactg gcaaactgtg atggacgaca ccgtcagtgc gtccgtcgcg caggctctcg 10680 aggagctgat gctttgggcc gaggactgcc ccgaagtccg gcacctcgtg cacgcggatt 10740 tcggctccaa caatgtcctg acggacaatg gccgcataac agcggtcatt gactggagcg 10800 aggcgatgtt cggggattcc caatacgagg tcgccaacat cttcttctgg aggccgtggt 10860 tggcttgtat ggagcagcag acgcgctact tcgagcggag gcatccggag cttgcaggat 10920 cgccgcggct ccgggcgtat atgctccgca ttggtcttga ccaactctat cagagcttgg 10980 ttgacggcaa tttcgatgat gcagcttggg cgcagggtcg atgcgacgca atcgtccgat 11040 ccggagccgg gactgtcggg cgtacacaaa tcgcccgcag aagcgcggcc gtctggaccg 11100 atggctgtgt agaagtactc gccgatagtg gaaaccgacg ccccagcact cgtccgaggg 11160 caaaggaata gagtagatgc cgaccgggat ccaacactta cgtttgcaac gtccaagagc 11220 aaatagacca cgaacgccgg aaggttgccg cagcgtgtgg attgcgtctc aattctctct 11280 tgcaggaatg caatgatgaa tatgatactg actatgaaac tttgagggaa tactgcctag 11340 caccgtcacc tcataacgtg catcatgcat gccctgacaa catggaacat cgctattttt 11400 ctgaagaatt atgctcgttg gaggatgtcg cggcaattgc agctattgcc aaaatcgaaa 11460 tacccctcac gcatgcattc atcaatatta ttcatgcggg gaaaggcaag attaatccaa 11520 ctggcaaatc atccagcgtg attggtaact tcagttccag cgacttgatt cgttttggtg 11580 ctacccacgt tttcaataag gacgagatgg tggagtaaag aaggagtgcg tcgaagcaga 11640 tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat 11700 gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat 11760 gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc 11820 gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat 11880 gttactagat cgatcaaact tcggtactgt gtaatgacga tgagcaatcg agaggctgac 11940 taacaaaagg tatgcccaaa aacaacctct ccaaactgtt tcgaattgga agtttctgct 12000 catgccgaca ggcataactt agatattcgc gggctattcc cactaattcg tcctgctggt 12060 ttgcgccaag ataaatcagt gcatctcctt acaagttcct ctgtcttgtg aaatgaactg 12120 ctgactgccc cccaagaaag cctcctcatc tcccagttgg cggcggctga tacaccatcg 12180 aaaacccacg tccgaacact tgatacatgt gcctgagaaa taggcctacg tccaagagca 12240 agtcctttct gtgctcgtcg gaaattcctc tcctgtcaga cggtcgtgcg catgtcttgc 12300 gttgatgaag ctaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc 12360 gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa 12420 gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcgc ccgctccttt 12480 cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 12540 ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 12600 tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 12660 gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 12720 tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaaa 12780 caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 12840 caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcactgg tgaaaagaaa aaccacccca 12900 gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta agcgtcaatt tgtttacacc 12960 acaatatatc ctgccaccag ccagccaaca gctccccgac cggcagctcg gcacaaaatc 13020 accactcgat acaggcagcc catcagtccg ggacggcgtc agcgggagag ccgttgtaag 13080 13080

Claims (10)

  1. (a) 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1(xanthosine methyltransferase, XMT), CaMXMT1(7-methylxanthosine methyltransferase,MXMT) 및 CaDXMT1(3,7-dimethylxanthine methyltransferase, DXMT)를 코딩하는 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 재조합 벡터가 도입된 아그로박테리움으로 벼 잎을 감염시키는 단계; 및,
    (b) 상기 (a) 단계에 감염된 벼 세포를 캘러스(callus)화하여 형질전환된 벼 세포를 수득하는 단계를 포함하는, 흰잎 마름병 저항성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 캘러스를 뿌리 및 성체로 분화 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 형질전환 벼의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 벼 잎은 동진벼(Dong-jin)로부터 채취한 것인, 형질전환 벼의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1, CaMXMT1, 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 유전자인 것인, 형질전환 벼의 제조방법.
  6. 커피나무 유래 메틸전이효소인 CaXMT1, CaMXMT1 및 CaDXMT1를 코딩하는 유전자가 도입된 흰잎 마름병 저항성이 증진된 카페인 생합성 형질전환 벼.
  7. 제6항에 있어서, 상기 커피나무 유래 메틸전이효소는 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 염기서열로 구성된 유전자인 것인, 카페인 생합성 형질전환 벼.
  8. 제6항에 있어서, 상기 형질전환 벼는 박테리아 병원균에 대하여 저항성을 갖는 것인 형질전환 벼.
  9. 제8항에 있어서, 상기 박테리아 병원균은 산토모나스 오리자에(Xanthomonas oryzae)에 대하여 저항성을 갖는 것인 형질전환 벼.
  10. 제6항에 있어서, 상기 형질전환 벼는 동진벼를 바탕으로 형질전환된 것인, 형질전환 벼.





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KR1020130128144A KR101612590B1 (ko) 2013-10-25 2013-10-25 증진된 병충해 저항성을 가지는 카페인 생합성 유전자가 도입된 형질전환 벼

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US6734342B2 (en) 2000-10-06 2004-05-11 Nara Institute Of Science And Technology Theobromine synthase polypeptide of coffee plant and the gene encoding said polypeptide
KR101120458B1 (ko) 2009-10-19 2012-06-27 대한민국 벼 줄무늬잎마름병에 대한 저항성을 증진시키는 유전자 및 이의 용도

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